CN103014054A - 枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotZ作为分子载体在芽孢表面展示外源蛋白的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学领域，涉及枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)芽孢衣壳蛋白CotZ作为分子载体在芽孢表面展示外源蛋白的方法，具体是通过芽孢表面展示技术构建表面展示外源蛋白的重组芽孢。分子载体的编码基因cotZ与外源目的蛋白基因进行融合重组，构建融合表达的整合型重组质粒，并转化枯草芽孢杆菌。得到的重组菌经诱导产生芽孢，此时外源目的蛋白已成功展示在芽孢表面。

Description

枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotZ作为分子载体在芽孢表面展示外源蛋白的应用

技术领域

本发明涉及一种利用枯草芽孢杆菌芽孢表面展示目的蛋白的方法。更特殊地涉及枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotZ作为分子载体实现芽孢表面展示目的蛋白。

背景技术

芽孢表面展示技术是指通过基因工程的手段将外源蛋白或抗原固定在芽孢表面并实现活性表达的技术。相对于噬菌体表面展示技术、酵母表面展示技术和细菌表面展示技术，芽孢表面展示技术虽起步较晚，但由于其稳定性和安全性高的特点已引起了越来越多学者的关注。由于对枯草芽孢杆菌的遗传学背景和芽孢结构组成了解地很透彻，所以通常选择枯草芽孢杆菌的芽孢作为展示载体，而不是苏云金芽孢杆菌或炭疽芽孢杆菌。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)作为GARS(Generally Recognized as Safe)菌种之一，因而它被广泛应用于生物和食品等领域。枯草芽孢杆菌在营养缺乏等逆环境诱导下，自身营养细胞会分化形成一种休眠体即芽孢。芽孢一般由核心、皮层、芽孢衣壳和芽孢外壁组成，其中芽孢衣壳又由基底层、内层、外层和壳构成。外层的芽孢衣壳主要由疏水的衣壳蛋白构成，目前发现有超过70种以上的衣壳蛋白。截止目前，已报道了芽孢衣壳蛋白CotB、CotC、CotG、CotX和OxdD可被用作分子载体实现外源蛋白在芽孢表面展示。CotB和CotC一般用来锚定抗原在芽孢表面制备重组芽孢疫苗，而CotG则常被用来锚定外源酶蛋白在芽孢表面制备全细胞催化剂。尽管已经报道了四种芽孢衣壳蛋白可用作分子载体，但是为了扩大芽孢表面展示技术的应用领域，探索新的芽孢衣壳蛋白作为分子载体已成为制约该技术进一步发展的关键因素之一。

Hinc等(Hinc K，Isticato R，Dembek M，et al.Micro Cell Fact，2010，9：2)利用芽孢衣壳蛋白CotB、CotC和CotG分别融合幽门螺杆菌尿素酶A单位使其锚定在枯草芽孢杆菌芽孢表面。试验结果发现：当与CotB融合时，每个芽孢中融合蛋白的分子数约是1×10³；而当与CotC融合时，每个芽孢中融合蛋白的分子数高达7～15×10³，但是融合蛋白却不能展示在芽孢表面；尿素酶A单位与CotG融合的结果同CotC差不多，而且融合蛋白的某些部位似乎发生了再加工的现象。

不同的芽孢衣壳蛋白的分子结构以及在芽孢中的存在形式的差异，导致不同芽孢衣壳蛋白做为分子载体展示外源蛋白的能力和效率也不一样。此外，为了实现芽孢表面展示技术同时展示多种抗原或酶以制备多价重组疫苗或几种酶协调作用的全细胞催化剂，也需要更多的芽孢衣壳蛋白作为分子载体。所以，筛选或发现新的能高效展示外源蛋白的芽孢衣壳蛋白用作分子载体则尤为重要。

发明内容

本发明的目的是筛选新的芽孢衣壳蛋白CotZ作为分子载体，通过芽孢表面展示技术将外源蛋白展示在枯草芽孢杆菌芽孢表面，以制备枯草芽孢杆菌重组芽孢。

本发明所采用的技术方案是：

枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotZ作为分子载体在芽孢表面展示外源蛋白的应用。具体的，是将作为分子载体的枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotZ的编码基因cotZ，与外源目的蛋白基因的编码序列进行融合，构建能够融合表达重组蛋白的整合型质粒，并转化枯草芽孢杆菌得到枯草芽孢杆菌重组菌株，诱导重组菌株产生表面能够展示外源目的蛋白的重组芽孢。

本发明选择芽孢衣壳蛋白基因cotZ(Genbank序列号：Q08312)作为表面展示外源目的蛋白的分子载体，选择具有保护性抗原和具有催化活性的酶蛋白基因为外源基因，以具有转化能力且可产生芽孢的枯草芽孢杆菌菌株作为重组质粒的转化菌株，如Bacillus subtilis 168及其衍生菌株(BGSC，department of Biochemistry，The Ohio State University，West 12^th Avenue，Columbus，Ohio，43210，USA)。

本发明涉及芽孢衣壳蛋白基因cotZ，该基因与外源目的蛋白基因的编码序列融合后构建整合型重组质粒，该质粒中含有芽孢衣壳蛋白基因cotZ的启动子、不含终止密码子的编码序列以及与外源目的蛋白基因融合的重组片段，它可在枯草芽孢杆菌形成芽孢时分别表达融合蛋白。

本发明涉及的构建的融合表达重组蛋白的重组质粒转化枯草芽孢杆菌后得到的重组菌株，经诱导形成的重组芽孢表面能够展示外源目的蛋白，可通过免疫荧光显微镜或其它手段检测芽孢表面展示的重组蛋白。

本发明还涉及本发明构建的融合表达CotZ-β-Gal的重组质粒转化枯草芽孢杆菌后得到的重组菌株经诱导后形成的重组芽孢，其表面展示的β-半乳糖苷酶的催化活性以测定水解邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷产生黄色的邻硝基苯在420nm下的吸光值。

本发明涉及芽孢衣壳蛋白基因cotZ启动子及不含终止密码子的编码序列扩增的引物序列：

cotZ-f：CGCTCTAGAAGCAACAAATACACTCGTAGC

cotZ-r：CGTGGTACCTGATGATGTGTACGATTGATT

与本领域已知的方法相比，本发明是利用一种新的芽孢衣壳蛋白CotZ作为芽孢表面展示外源蛋白的分子载体，通过基因技术将外源目的蛋白或酶展示于枯草芽孢杆菌芽孢表面。

附图说明

图1融合表达CotZ-GFP整合型重组质粒pJS-cotZ-gfp结构示意图。amyE 5’和amyE 3’端分别表示枯草芽孢杆菌淀粉酶基因编码序列的5’端和3’端，它意味着外源目的蛋白基因可以通过同源片段发生双交换事件被整合到枯草芽孢杆菌染色体上的淀粉酶基因中；Em^r和Ap^r分别表示红霉素和氨苄青霉素抗性基因，用于筛选大肠杆菌或枯草芽孢杆菌转化子；cotZ-gfp为芽孢衣壳蛋白CotZ基因与绿色荧光蛋白GFP基因的融合片段，该片段含有cotZ启动子序列、不含终止密码子的编码序列，以及绿色荧光蛋白基因的编码序列；oriC为大肠杆菌复制子。

图2菌株PZG102芽孢表面展示GFP的重组芽孢免疫荧光显微镜分析。A可见光下观察菌株PZG102芽孢；B荧光下观察菌株PZG102芽孢。

图3融合表达CotZ-β-Gal整合型重组质粒pJS-cotZ-bgaB结构示意图。amyE 5’和amyE 3’端分别表示枯草芽孢杆菌淀粉酶基因编码序列的5’端和3’端，它意味着外源目的蛋白基因可以通过同源片段发生双交换事件被整合到枯草芽孢杆菌染色体上的淀粉酶基因中；Em^r和Ap^r分别表示红霉素和氨苄青霉素抗性基因，用于筛选大肠杆菌或枯草芽孢杆菌转化子；cotZ-bgaB为芽孢衣壳蛋白基因cotZ与β-半乳糖苷酶基因bgaB的融合片段，该片段含有cotZ启动子序列、不含终止密码子的编码序列，以及β-半乳糖苷酶基因的编码序列；oriC为大肠杆菌复制子。

图4Western blot检测重组菌株PZB104中表达的β-半乳糖苷酶。泳道1：重组枯草芽孢杆菌PZ103；泳道2：重组枯草芽孢杆菌PZB104；泳道3：来自大肠杆菌中表达的β-半乳糖苷酶。

图5重组菌株PZB 104重组芽孢β-半乳糖苷酶活性的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷比色法测定。重组菌株PZ103为不含重组β-半乳糖苷酶的重组芽孢；重组菌株PZB104为表面展示β-半乳糖苷酶的重组芽孢。

具体实施方式

实施例1

以CotZ为分子载体在枯草芽孢杆菌芽孢表面展示绿色荧光蛋白GFP的重组芽孢的制备。

1.枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotZ基因的获得

将培养好的枯草芽孢杆菌菌液按照细菌基因组快速提取试剂盒说明书提取基因组DNA。另根据NCBI数据库中cotZ(Genbank序列号：Q08312)基因的编码序列设计引物，在上游和下游引物中分别引入XbaI和KpnI酶切位点，引物由铂尚生物技术(上海)有限公司。采用宝生物工程(大连)有限公司的

HS DNA聚合酶，以提取的枯草芽孢杆菌基因组DNA为模板扩增cotZ。引物序列如下，其中下划线代表的是酶切位点。

cotZ-f：CGCTCTAGAAGCAACAAATACACTCGTAGC

cotZ-r：CGTGGTACCTGATGATGTGTACGATTGATT

克隆得到的PCR产物进行胶回收，-20℃冻存。

2.基本质粒pJS-cotZ的构建

采用XbaI和KpnI双酶切实施例1中1的PCR产物cotZ，经胶回收后克隆于pJS700a(李倩，宁德刚，吴春笃.以CotX为分子载体在枯草芽孢杆菌芽孢表面展示绿色荧光蛋白.生物工程学报，2010，26(2)：264-269)的相应位点，得到整合型重组质粒pJS-cotZ。

3.表面展示系统pJS-cotZ-gfp的构建

本发明实例中所用的绿色荧光蛋白基因gfp来源于质粒pEGFP-N1(Clontech，Palo Alto，CA，USA)，并根据该质粒中gfp基因序列(Genbank序列号：U55762.1)设计并合成以下引物，其中下划线代表的是酶切位点：

gfp-f：CGGGGTACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA

gfp-r：CCGGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTCCA

为便于克隆，上游和下游引物分别引入KpnI和EcoRI酶切位点。以质粒pEGFP-N1为模板进行PCR扩增，回收得到的PCR产物用KpnI和EcoRI进行双酶切，经胶回收后克隆于pJS-cotZ相应的位点，得到的整合型重组质粒命名为pJS-cotZ-gfp，见图1。

4.重组质粒转化枯草芽孢杆菌与转化子的筛选鉴定

采用Spizizen法将整合型重组质粒pJS-cotZ和pJS-cotZ-gfp分别转化枯草芽孢杆菌，涂布含10μg/mL红霉素的LB平板。过夜培养后，从平板上挑取单菌落点接在含1％淀粉的LB平板上，继续培养，通过碘液显色方式进行转化子鉴定。碘液的配制：称取2g碘化钾溶于少量蒸馏水中，待完全溶解后加入1g碘，继续震荡溶解，最后用蒸馏水定容到300mL，置于棕色瓶中保存。取上述配好的碘液2mL喷洒于LB/淀粉平板上，进行显色。菌落自身及周围颜色为蓝色的表明重组基因插入到枯草芽孢杆菌染色体上淀粉酶基因中，而菌落自身及周围颜色变白的表明重组基因没有插入到枯草芽孢杆菌染色体上淀粉酶基因中。鉴定为阳性的菌株分别命名为PZ101和PZG102。

5.枯草芽孢杆菌重组芽孢的诱导及芽孢表面展示GFP的检测

以DSM(Difco Sporulation Medium)培养基诱导重组菌株PZG102产生芽孢。DSM的配方如下：取重组菌株PZG102的单菌落点接于4mL的LB培养基中，37℃过夜培养。按1％(V/V)接种量转接于含50mL DSM培养基的250mL摇瓶中，37℃继续培养48h。8500rpm离心15min收集菌体，重悬于等体积的无菌水中。加入终浓度为5mg/mL的溶菌酶，37℃水浴保温1h，8500rpm离心15min去上清，沉淀分别用等体积的1M NaCl、1M KCl和无菌水进行洗涤，最后用无菌水重悬即芽孢悬浮液。取10μL芽孢悬浮液置于载玻片上，荧光显微镜下观察结果(图2)。在荧光显微镜下，所观察到的芽孢均呈现绿色，表明外源蛋白GFP通过芽孢衣壳蛋白CotZ被成功锚定在枯草芽孢杆菌芽孢表面。

本发明利用一种新的芽孢衣壳蛋白CotZ作为分子载体在枯草芽孢杆菌芽孢表面展示GFP，试验结果表明它与现有报道的CotB、CotC、CotG和CotX都具有运载外源蛋白固定在芽孢表面的能力。此外，本发明所涉及的CotZ作为一种新的分子载体，使得实现芽孢表面展示技术的操作过程中载体蛋白的选择上有了更多的余地，而且它的发现对于实现共展示多种抗原或多种酶蛋白提供了可能。

实施例2

以CotZ为分子载体在枯草芽孢杆菌芽孢表面展示β-半乳糖苷酶

1.枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotZ基因的获得

具体操作方法同实施例1中1枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotZ基因的获得。

2.基本质粒pJS-cotZ的构建

具体操作方法同实施例1中2基本质粒pJS-cotZ的构建。

3.表面展示系统pJS-cotZ-bgaB的构建

本发明实例中所用的β-半乳糖苷酶基因bgaB来源于嗜热脂肪芽孢杆菌IAM11001(Bacillus stearothermophilus IAM11001)，并根据NCBI数据库中bgaB基因序列(Genbank序列号：AAA22262.1)设计并合成以下引物：

bgaB-f：CGCGGTACCATGAATGTGTTATCCTCAATTTG

bgaB-r：CCGGAATTCCTAAACCTTCCCGGCTTC

为便于克隆，上游和下游引物分别引入KpnI和EcoRI酶切位点。以嗜热脂肪芽孢杆菌IAM11001基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到的PCR产物用KpnI和EcoRI进行双酶切，经胶回收后克隆于pJS-cotZ，得到的整合型重组质粒命名为pJS-cotZ-bgaB，见图3。

4.重组质粒转化枯草芽孢杆菌与转化子的筛选鉴定

采用Spizizen法将整合型重组质粒pJS-cotZ和pJS-cotZ-bgaB转化枯草芽孢杆菌，涂布含10μg/mL红霉素的LB平板。过夜培养后，从平板上挑取单菌落点接在含1％淀粉的LB平板上，继续培养。通过淀粉平板碘液染色法鉴定重组菌株，操作方法同本发明实施例1中4。菌落自身及周围颜色为蓝色的表明重组基因cotZ-bgaB插入到枯草芽孢杆菌染色体上淀粉酶基因中，而菌落自身及周围颜色变白的表明重组基因cotZ-bgaB没有插入到枯草芽孢杆菌染色体上淀粉酶基因中。鉴定为阳性的菌株分别命名为PZ103和PZB104。

5.枯草芽孢杆菌重组芽孢的诱导及western blot检测芽孢表面展示β-半乳糖苷酶

诱导重组菌株PZ103和PZB104产生芽孢及芽孢悬浮液制备的操作方法同本发明实施例1中5。芽孢衣壳蛋白参照SDS-DTT法提取(Cutting SM，Vander-Horn PB.Genetic analysis.In：Harwood CR，Cutting SM editors.Molecular Biological Methods for Bacillus.Chichester：JohnWiley & Sons；1990.p.27-74)。取1mL芽孢衣壳蛋白溶液，加入等体积的上样缓冲液煮沸5～10min，离心取上清进行SDS-PAGE。蛋白电泳完毕，将分离胶浸在TBST缓冲液中平衡10min，电转条件：80V，2h。电转使蛋白质转移到硝酸纤维素膜上(NC)，然后将膜浸在封闭液中4℃过夜。封闭后，分别加入一抗兔抗β-半乳糖苷酶血清，室温反应2h，然后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗，最后用增强型的HRP-DAB底物试剂盒进行显色反应，结果见图4。从图4看出，重组菌株PZB104会出现一条在85kDa附近的杂交条带，而空白对照菌株PZ103则无任何杂交条带，来自大肠杆菌表达的β-半乳糖苷酶在图上显示了分子量偏低的条带。Western blot结果表明β-半乳糖苷酶利用芽孢衣壳蛋白CotZ可以被锚定在芽孢的表面。

6.重组菌株PZB104芽孢表面展示β-半乳糖苷酶水解邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)的活性分析

重组菌株PZ103和PZB104分别按本发明实施例1中5制备重组芽孢，最后用20mM的磷酸氢二钾-柠檬酸缓冲液(pH6.5)悬浮。重组菌株PZB104芽孢表面展示β-半乳糖苷酶通过水解ONPG产生黄色物质邻硝基苯(ONP)，ONP在420nn可见光下有最大吸收值，利用分光光度计测定ONP的吸光值即OD420nm。具体地，按如下操作步骤完成：

底物ONPG的配制：称取0.25g ONPG置于容量瓶中，用20mM的磷酸氢二钟-柠檬酸缓冲液(pH6.5)定容到100mL。

重组芽孢表面展示β-半乳糖苷酶水解ONPG的反应步骤：在20mL试管中加入800μLONPG，置于75℃水浴中预热，然后加入200μL重组菌株PZB104芽孢悬浮液，反应5min，加入1mL的10％(V/W)碳酸钠终止反应。阴性对照则在上述反应体系中用重组菌株PZ103芽孢悬浮液替代重组菌株PZB104芽孢悬浮液，其余组分不变。

重组芽孢β-半乳糖苷酶活性测定：用枯草芽孢杆菌芽孢悬浮液来充当重组芽孢的反应混合物作为空白对照，然后利用分光光度计测定上述反应产物在420nh下的吸光值。菌株PZB104重组芽孢和菌株PZ103重组芽孢β-半乳糖苷酶活性测定结果见本发明图5。

Claims (7)

1.利用枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotZ作为分子载体在芽孢表面展示外源蛋白的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，利用枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotZ作为分子载体，与外源目的蛋白基因融合，构建整合型重组质粒，并转化枯草芽孢杆菌得到枯草芽孢杆菌重组菌，经诱导后重组菌株产生表面展示外源目的蛋白的重组芽孢。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，外源目的蛋白基因为编码具有生物活性的蛋白或酶。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，外源目的蛋白基因为编码具有保护性抗原蛋白或具有催化活性的酶蛋白基因的编码序列。

5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的整合型重组质粒是将枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因cotZ与外源目的蛋白基因融合得到的质粒，重组质粒中含有整合基因amyE片段、适用于大肠杆菌或枯草芽孢杆菌的抗性选择标记基因、芽孢衣壳蛋白CotZ的启动子和不含终止密码子的编码序列与目的蛋白编码序列融合后的基因。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌重组菌株是整合型重组质粒转化枯草芽孢杆菌的所得菌株，该菌株染色体上含有适用于枯草芽孢杆菌的抗性选择标记基因、芽孢衣壳蛋白CotZ基因的启动子和不含终止密码子的编码序列与目的蛋白基因的编码序列的融合基因，这些基因通过同源双交换被整合到染色体上的淀粉酶基因中并致使重组菌株的淀粉酶失活。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的重组芽孢是重组枯草芽孢杆菌经诱导后形成的，重组芽孢表面展示有目的蛋白。

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