CN105132450A - 枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白Cot表面展示海藻糖合酶的方法 - Google Patents
枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白Cot表面展示海藻糖合酶的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白Cot表面展示海藻糖合酶的方法。本发明利用Cot系列芽孢衣壳蛋白作为芽孢表面展示外源蛋白的分子载体，设计出Cot分子载体的系列引物，通过双酶切既可以替换分子载体又可以更改外源目的蛋白，最后通过基因技术将海藻糖合酶展示于枯草芽孢杆菌芽孢表面，筛选出可以高效展示海藻糖合酶的芽孢衣壳蛋白。高效展示在芽孢表面的海藻糖合酶，无抗菌活性，达到食品应用酶制剂要求，有利于下一步海藻糖的生产制造。
Description
技术领域
本发明涉及一种枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白Cot表面展示海藻糖合酶的方法，本发明特别涉及几种新型的芽孢衣壳蛋白为分子载体将外源蛋白基因与其整合到一起，从而筛选出能够高通量展示目的蛋白量的分子载体，属于分子生物学技术领域。
背景技术
海藻糖是由两个葡萄糖分子以α，α，1,1－糖苷键构成的非还原性糖，在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下能稳定细胞膜和蛋白质的结构，有效地保护细胞膜和蛋白质分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程和生物特征。在海藻糖的工业生产中,海藻糖合酶与其它海藻糖合成酶相比具有更大的优势,海藻糖合酶海藻糖合酶(TreS)是一类分子内转糖苷酶，专一性地以生产原料为更加廉价的麦芽糖为底物，一步转化生成海藻糖，操作工艺简单、底物价格低廉、应用前景良好。
芽胞表面展示技术是将外源蛋白基因与含有自身启动子的芽胞衣壳蛋白基因融合，构建融合基因表达载体，然后将这种载体转化到产芽胞的宿主菌株，得到的重组菌株在生孢培养基中培养时，外源目的基因就会在外套蛋白基因启动子的启动下表达，并通过与外套蛋白偶联的作用将外源蛋白展示在芽胞的表面。在面临营养缺乏和其他逆境胁迫时，B.subtilis会自发形成特殊的休眠体——芽孢，抵御不良环境带来的危害。当外界环境适宜后，芽孢萌发形成具有正常生理活性的营养体。芽孢一般由核心、皮层、芽孢衣壳和芽孢外壁组成。芽胞表面展示系统由载体蛋白、目的蛋白和宿主3部分组成，每一部分都是表面展示系统构建成功的关键。在选定芽胞外套蛋白作为锚定蛋白时不仅要考虑它所处的位置还要考虑其丰度。
芽胞杆菌中高效表达外源蛋白的最大障碍是构建的重组表达质粒在宿主菌中通常不稳定，解决这一问题的最有效途径是使用整合型质粒。整合型质粒只在大肠杆菌中有复制功能，转入革兰氏阳性细菌如枯草芽胞杆菌中则无此功能，因此只有整合到宿主菌的基因组才能正常的表达目的基因。该发明所用的芽胞杆菌标记基因是抗生素抗性基因。
海藻糖合酶已经被广泛应用于海藻糖的工业生产，并大大降低了海藻糖生产的成本。但如何进一步提高海藻糖合酶的酶活力和转化率仍然是目前研究的热点。利用生物信息学的知识，通过饱和突变或定点突变技术对海藻糖合酶基因进行遗传学改造，改变酶活性中心附近以及与热稳定性相关的氨基酸序列，极有可能获得酶活更高和稳定性更高的海藻糖合酶。因此，通过构建融合表达载体，将海藻糖合酶基因通过芽孢表面展示技术展示在芽孢表面，可以通过酶活观察目的蛋白的生成量，成为研究解决上述问题的一种途径。
由于不同的芽孢衣壳蛋白的分子结构，以及在芽孢中的组成存在差异，单只不同的芽孢衣壳蛋白做为分子载体，表面展示外源蛋白的重组芽孢的生物学活性也不同。目前已经有20多种报道出来的枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白，但是部分蛋白可能只起到调控或是运输其他衣壳蛋白的作用，并不具备作为分子载体表面展示外源蛋白的作用。现如今已经报道出来用作分子载体的Cot芽孢衣壳蛋白有CotB、CotC、CotG、CotX、CotZ等。但由于酶受空间结构影响较大，这些Cot芽孢衣壳蛋白与目的蛋白结合后是否会影响目的蛋白的表面展示，目前还没有研究报道。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白Cot表面展示海藻糖合酶的方法。该方法通过筛选不同的芽孢衣壳蛋白作为载体蛋白，经芽孢表面展示技术将外源蛋白海藻糖合酶展示在枯草芽孢杆菌的芽孢表面，筛选出具有高展示量的载体蛋白。
本发明的技术方案如下：
一种枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白Cot表面展示海藻糖合酶的方法，包括如下步骤：
(1)提取枯草芽孢杆菌的基因组DNA，然后以基因组DNA为模板PCR扩增枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因，PCR扩增过程中，在上游和下游引物中分别引入BamHI和XbaI酶切位点，制得枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因Cot；
所述枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因为枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因CotG、枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因CotB、枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因CotC、枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因CotD、枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因CotH、枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因CotX、枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因CotY或枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因CotZ；
(2)以恶臭假单胞杆菌基因组为模板，经PCR扩增，制得海藻糖合成酶TreS的核苷酸序列；
(3)去除步骤(1)制得的枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因Cot的终止子，然后采用融合PCR与步骤(2)制得的TreS基因进行融合，融合PCR过程中，在上游和下游中分别引入限制性内切酶BamHI和AatII的酶切位点，制得融合基因Cot-TreS；
(4)将步骤(3)制得的融合基因Cot-TreS经BamHI和AatII双酶切后，与同样经BamHI和AatII双酶切的表达载体pHT01连接，制得重组质粒pHT01-Cot-TreS；
(5)将步骤(4)制得的重组质粒pHT01-Cot-TreS转化枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)168(trp)，转化后经涂布含氯霉素的LB平板进行筛选，然后经碘液显色方式进行转化子鉴定，获得阳性菌株；
(6)将步骤(5)制得的阳性菌株经DSM培养基35～37℃诱导培养45～50h，制得表面展示海藻糖合酶的重组芽孢。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因为枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因CotG；
进一步优选的，所述枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因CotG的PCR扩增引物，核苷酸序列如下：
CotG-F：GGATCCATGGGCCACTATTCCCAT
CotG-R：GCTGGGTCATTCTAGATTTGTATTTCTTTTTGACTACC
PCR扩增体系如下，总体积50μL：
2×HiFi-PCRMaster25μL，引物CotG-F2.5μL，引物CotG-R2.5μL，Bacillussubtilis168基因组2.5μL，ddH2O17.5μL；
PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，48℃退火30s，72℃延伸1min10s，共30个循环；72℃继续延伸10min。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)168；
根据本发明优选的，所述步骤(2)中PCR的扩增引物，核苷酸序列如下：
TreS-F：TAAGTATTTTATCTAGAATGACCCAGCCCGACCC
TreS-R：CTCACCATGACGTCAACATGCCCGCTGCTGT；
PCR扩增体系，总体积50μl：
2×HiFi-PCRMaster25μL，引物TreS-F2.5μL，引物TreS-R2.5μL，pET15b-TreS2.5μL，ddH2O17.5μL；
PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min30s，共30个循环；72℃继续延伸10min。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)来源于美国模式培养物集存库，保藏编号：ATCC47054。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中去除枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因CotG的终止子的步骤如下：
在设计引物时，人为的去除枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因CotG的终止密码子，插入酶切位点AatII。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中去除TreS基因的终止子的步骤如下：
在设计引物时，人为的去除海藻糖合酶基因TreS的终止密码子TGA，插入酶切位点AatII。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中融合PCR采用二次融合PCR扩增，扩增引物核苷酸序列如下：
CotG-F：GGATCCATGGGCCACTATTCCCAT
TreS-R：CTCACCATGACGTCAACATGCCCGCTGCTGT；
第一轮融合PCR扩增体系如下，总体积25μl：
2×HiFi-PCRMaster12.5μL，胶回收产物CotG2μL，胶回收产物TreS2μL，ddH2O8.5μL；
第一轮融合PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸4min，5个循环；72℃继续延伸10min。
第二轮融合PCR扩增体系为在第一轮PCR体系的基础上补加如下试剂：
2×HiFi-PCRMaster12.5μL，引物CotG-F1μL，引物TreS-R1μL，ddH2O10.5μL；
第二轮融合PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸5min30s，共30个循环；72℃继续延伸10min。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中连接体系如下，总体积10μL：
CotG-TreS4μL，表达载体pHT013μL，5×T4buffer2μL，T4连接酶1μL；
连接条件为：16℃连接过夜。
根据本发明优选的，所述步骤(6)中的DSM培养基组分如下：
0.8wt％肉汤培养液，0.1wt％KCl，0.025wt％MgSO4·7H2O，1.0MmCa(NO3)2，10μMFeSO4。
以CotG为分子载体时，每毫升芽孢悬浮液的酶活力为0.63U/mg，表明CotG可以作为表面展示海藻糖合酶的分子载体。
有益效果
1、本发明利用Cot系列芽孢衣壳蛋白作为芽孢表面展示外源蛋白的分子载体，设计出Cot分子载体的系列引物，通过双酶切既可以替换分子载体又可以更改外源目的蛋白，最后通过基因技术将海藻糖合酶展示于枯草芽孢杆菌芽孢表面，筛选出可以高效展示海藻糖合酶的芽孢衣壳蛋白。高效展示在芽孢表面的海藻糖合酶，无抗菌活性，达到食品应用酶制剂要求，有利于下一步海藻糖的生产制造。
2、本方法选择的Cot系列的芽孢衣壳蛋白基因作为表面展示蛋白的分子载体，选择具有保护性抗原蛋白和具有催化活性的海藻糖合酶基因为目的基因，以具有转化能力、安全性高且可产生芽孢的枯草芽孢杆菌菌株(如Bacillussubtilis168菌株)作为重组质粒的转化菌株，可通过测定酶活或其他手段检测芽孢表面展示的海藻糖合酶量。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。
本方法中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
在以下的实施例中，未详细描述的和各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名称以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
菌株来源：
实施例中的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)168，购自杭州宝赛生物有限公司。
实施例中的恶臭假单孢菌(Pseudomonasputida)购自美国模式培养物集存库(Americantypeculturecollection)，菌种编号ATCC47054。
表达载体pHT01购自杭州宝赛生物有限公司。
实施例1
以CotB为分子载体在枯草芽孢杆菌芽孢表面展示海藻糖合酶TreS的重组芽孢的制备。
枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotB基因的获得
将培养好的枯草芽孢杆菌菌液按照Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒说明书提取枯草芽孢杆菌168基因组DNA。另外根据NCBI数据库中CotB基因的编码序列设计引物，在上游和下游引物中分别引入BamHI和XbaI酶切位点，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司。采用宝生物工程有限公司的2×HiFi-PCRMaster聚合酶，以提取的枯草芽孢杆菌基因组DNA为模板扩增CotH。引物核苷酸序列如下，其中下划线代表的是酶切位点。
CotB-F：GGATCCATGAGCAAGAGGAGAATGAAA
CotB-R：TGGGTCATAAATTTACGTCTAGATTTCCAGT；
PCR扩增体系如下，总体积50μl：
2×HiFi-PCRMaster25μL，引物CotB-F2.5μL，引物CotB-R2.5μL，Bacillussubtilis168基因组2.5μL，ddH2O17.5μL；
PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，48℃退火30s，72℃延伸1min10s，共30个循环；72℃继续延伸10min。
将克隆得到的PCR产物CotB使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行胶回收，将所得到的DNA溶液置于-20℃保存用于后续试验。
目的基因TreS基因的获得
以恶臭假单胞杆菌基因组为模板，经PCR扩增得到海藻糖合成酶TreS的核苷酸序列。
所述步骤(2)中PCR扩增引物，核苷酸序列如下：
TreS-F：AAATACAAATCTAGAATGACCCAGCCCGACCC
TreS-R：CTCACCATGACGTCAACATGCCCGCTGCTGT
PCR扩增体系，总体积50μl：
2×HiFi-PCRMaster25μL，引物TreS-F2.5μL，引物TreS-R2.5μL，pET15b-TreS2.5μL，ddH2O17.5μL；
PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min30s，共30个循环；72℃继续延伸10min。
将克隆得到的PCR产物TreS使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行胶回收，将所得到的DNA溶液置于-20℃保存用于后续实验。
将去掉终止密码子的CotB基因与TreS基因融合，在上游和下游中分别引入BamHI和AatII酶切位点，所设计的引物序列如下：
CotB-F：GGATCCATGAGCAAGAGGAGAATGAAA
TreS-R：CTCACCATGACGTCAACATGCCCGCTGCTGT
第一轮融合PCR扩增体系如下，总体积25μL：
2×HiFi-PCRMaster12.5μL，胶回收产物CotB2μL，胶回收产物TreS2μL，ddH2O8.5μL；
第一轮融合PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸4min，5个循环；72℃继续延伸10min。
第二轮融合PCR扩增体系为在第一轮PCR体系的基础上补加如下试剂：
2×HiFi-PCRMaster12.5μL，引物CotB-F1μL，引物TreS-R1μL，ddH2O10.5μL；
第二轮融合PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸5min30s，共30个循环；72℃继续延伸10min。
同样，将克隆的PCR产物CotB-TreS使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行胶回收，将所得到的DNA溶液置于-20℃保存用于后续试验。
基于大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒的表达载体pHT01可以在枯草芽孢杆菌中高效表达重组外源蛋白。所以使用表达质粒pHT01质粒构建表面展示系统pHT01-CotH-TreS。
采用限制性内切酶BamHI和AatII双酶切实施例1中的PCR产物CotB-TreS，胶回收后与同样经过BamHI和AatII双酶切的胶回收产物pHT01质粒连接，得到整合型重组质粒命名为pHT01-CotB-TreS。
重组质粒转化枯草芽孢杆菌与转化子的筛选鉴定
将整合型重组质粒pHT01-CotB-TreS转化到Bacillussubtilis168(trp)，涂布含氯霉素的LB平板。过夜培养后，从平板上挑取单菌落用接种针接在平板上。过夜培养后，从平板上挑取单菌落点接在含有质量百分比1％的淀粉LB平板上，继续培养，通过碘液显色方式进行转化子鉴定。菌落自身及周围颜色为蓝色的表明重组基因插入到枯草芽孢杆菌染色体上的淀粉酶基因中，若菌落自身及周围颜色为白色的表明重组基因没有插入到枯草芽孢杆菌染色体上的淀粉酶基因中，鉴定为阳性的菌株命名为CotBT-01。
表面展示CotB-TreS重组芽孢的诱导及其产海藻糖合酶酶活测定
利用饥饿法在DSM培养基上诱导重组菌株CotBT-01形成芽孢。
DSM培养基配方：0.8％肉汤培养液，0.1％KCl，0.025％MgSO4·7H2O，1.0MmCa(NO3)2，10μMFeSO4。
取重组菌株PGTE01的单菌落分别接于5mL的LB培养基中，37℃过夜培养。按1％接种量转接于含50mLDSM培养基的250mL摇瓶中，37℃继续培养48h。此时所得的菌液有超过90％以上的芽孢存在。8000r/min离心20min，弃上清，沉淀用无菌去离子水洗涤2次，并用去离子水悬浮。加入溶菌酶使其终浓度为2mg/Ml，37℃水浴2h，用浓度分别是1M的无菌NaCl和无菌HCL各洗涤一次，最后沉淀用无菌去离子水悬浮制成芽孢悬浮液。对照为加热灭活经同样处理的芽孢悬浮液。
海藻糖合酶酶活单位定义为在磷酸盐缓冲液中，以10％麦芽糖为底物，1h生成1mg海藻糖为一个酶活单位。取1mL芽孢悬浮液与1mL底物反应，采用薄层层析法验证，以及高箱液相色谱法分析，与标准曲线作对比，可以精确得到样品中海藻糖的含量。以CotB为分子载体时，每毫升芽孢悬浮液的酶活力为0.58U/mg，表明CotB可以作为表面展示海藻糖合酶的分子载体。
实施例2
以CotC为分子载体在枯草芽孢杆菌芽孢表面展示海藻糖合酶TreS的重组芽孢的制备。
枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotC基因的获得
将培养好的枯草芽孢杆菌菌液按照Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒说明书提取枯草芽孢杆菌168基因组DNA。另外根据NCBI数据库中CotH因的编码序列设计引物，在上游和下游引物中分别引入BamHI和XbaI酶切位点，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司。采用宝生物工程有限公司的2×HiFi-PCRMaster聚合酶，以提取的枯草芽孢杆菌基因组DNA为模板扩增CotC。引物核苷酸序列如下，其中下划线代表的是酶切位点。
CotC-F：GGATCCATGGGTTATTACAAAAAATAC
CotC-R：GTCGGGCTGGGTCATTCTAGAGTAGTGTTTTTTATGCTT；
PCR扩增体系如下，总体积50μL：
2×HiFi-PCRMaster25μL，CotC-F2.5μL，引物CotC-R2.5μL，Bacillussubtilis168基因组2.5μL，ddH2O17.5μL；
PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，48℃退火30s，72℃延伸1min10s，共30个循环；72℃继续延伸10min。
将克隆得到的PCR产物CotC使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行胶回收，将所得到的DNA溶液置于-20℃保存用于后续试验。
目的基因TreS基因的获得
以恶臭假单胞杆菌基因组为模板，经PCR扩增得到海藻糖合成酶TreS的核苷酸序列。
所述步骤(2)中PCR扩增引物，核苷酸序列如下：
TreS-F：AAATACAAATCTAGAATGACCCAGCCCGACCC
TreS-R：CTCACCATGACGTCAACATGCCCGCTGCTGT
PCR扩增体系，总体积50μL：
2×HiFi-PCRMaster25μL，引物TreS-F2.5μL，引物TreS-R2.5μL，pET15b-TreS2.5μL，ddH2O17.5μL；
PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min30s，共30个循环；72℃继续延伸10min。
将克隆得到的PCR产物TreS使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行胶回收，将所得到的DNA溶液置于-20℃保存用于后续实验。
将去掉终止密码子的CotC基因与TreS基因融合，在上游和下游中分别引入BamHI和AatII酶切位点，所设计的引物序列如下：
CotC-F：GGATCCATGGGTTATTACAAAAAATAC
TreS-R：CTCACCATGACGTCAACATGCCCGCTGCTGT
第一轮融合PCR扩增体系如下，总体积25μL：
2×HiFi-PCRMaster12.5μL，胶回收产物CotC2μL，胶回收产物TreS2μL，ddH2O8.5μL；
第一轮融合PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸4min，5个循环；72℃继续延伸10min。
第二轮融合PCR扩增体系为在第一轮PCR体系的基础上补加如下试剂：
2×HiFi-PCRMaster12.5μL，引物CotC-F1μL，引物TreS-R1μL，ddH2O10.5μL；
第二轮融合PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸5min30s，共30个循环；72℃继续延伸10min。
同样，将克隆的PCR产物CotC-TreS使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行胶回收，将所得到的DNA溶液置于-20℃保存用于后续试验。
基于大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒的表达载体pHT01可以在枯草芽孢杆菌中高效表达重组外源蛋白。所以使用表达质粒pHT01质粒构建表面展示系统pHT01-CotC-TreS。
采用限制性内切酶BamHI和AatII双酶切实施例1中的PCR产物CotC-TreS，胶回收后与同样经过BamHI和AatII双酶切的胶回收产物pHT01质粒连接，得到整合型重组质粒命名为pHT01-CotC-TreS。
重组质粒转化枯草芽孢杆菌与转化子的筛选鉴定
将整合型重组质粒pHT01-CotC-TreS转化到Bacillussubtilis168(trp)，涂布含氯霉素的LB平板。过夜培养后，从平板上挑取单菌落用接种针接在平板上。过夜培养后，从平板上挑取单菌落点接含有质量百分比1％的淀粉LB平板上，继续培养，通过碘液显色方式进行转化子鉴定。菌落自身及周围颜色为蓝色的表明重组基因插入到枯草芽孢杆菌染色体上的淀粉酶基因中，若菌落自身及周围颜色为白色的表明重组基因没有插入到枯草芽孢杆菌染色体上的淀粉酶基因中，鉴定为阳性的菌株命名为CotCT-01。
表面展示CotC-TreS重组芽孢的诱导及其产海藻糖合酶酶活测定
具体实验步骤参照实施例1。
以CotC为分子载体时，每毫升芽孢悬浮液的酶活力为0.46U/mg，表明CotC可以作为表面展示海藻糖合酶的分子载体。
实施例3
以CotD为分子载体在枯草芽孢杆菌芽孢表面展示海藻糖合酶TreS的重组芽孢的制备。
枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白cotD基因的获得
将培养好的枯草芽孢杆菌菌液按照Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒说明书提取枯草芽孢杆菌168基因组DNA。另外根据NCBI数据库中CotD因的编码序列设计引物，在上游和下游引物中分别引入BamHI和XbaI酶切位点，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司。采用宝生物工程有限公司的2×HiFi-PCRMaster聚合酶，以提取的枯草芽孢杆菌基因组DNA为模板扩增CotD。引物核苷酸序列如下，其中下划线代表的是酶切位点。
CotD-F：GGATCCATGCATCACTGCAGACCGCATA
CotD-R：GGGTCATGTAGTCGTCTAGATCGGGCT；
PCR扩增体系如下，总体积50μL：
2×HiFi-PCRMaster25μL，引物CotD-F2.5μL，引物CotD-R2.5μL，Bacillussubtilis168基因组2.5μL，ddH2O17.5μL；
PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，48℃退火30s，72℃延伸1min10s，共30个循环；72℃继续延伸10min。
将克隆得到的PCR产物CotD使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行胶回收，将所得到的DNA溶液置于-20℃保存用于后续试验。
目的基因TreS基因的获得
以恶臭假单胞杆菌基因组为模板，经PCR扩增得到海藻糖合成酶TreS的核苷酸序列。
所述步骤(2)中PCR扩增引物，核苷酸序列如下：
TreS-F：AAATACAAATCTAGAATGACCCAGCCCGACCC
TreS-R：CTCACCATGACGTCAACATGCCCGCTGCTGT
PCR扩增体系，总体积50μL：
2×HiFi-PCRMaster25μL，引物TreS-F2.5μL，引物TreS-R2.5μL，pET15b-TreS2.5μL，ddH2O17.5μL；
PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min30s，共30个循环；72℃继续延伸10min。
将克隆得到的PCR产物TreS使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行胶回收，将所得到的DNA溶液置于-20℃保存用于后续实验。
将去掉终止密码子的CotD基因与TreS基因融合，在上游和下游中分别引入BamHI和AatII酶切位点，所设计的引物序列如下：
CotD-F：GGATCCATGCATCACTGCAGACCGCATA
TreS-R：CTCACCATGACGTCAACATGCCCGCTGCTGT
第一轮融合PCR扩增体系如下，总体积25μL：
2×HiFi-PCRMaster12.5μL，胶回收产物CotD2μL，胶回收产物TreS2μL，ddH2O8.5μL；
第一轮融合PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸4min，5个循环；72℃继续延伸10min。
第二轮融合PCR扩增体系为在第一轮PCR体系的基础上补加如下试剂：
2×HiFi-PCRMaster12.5μL，引物CotD-F1μL，引物TreS-R1μL，ddH2O10.5μL；
第二轮融合PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸5min30s，共30个循环；72℃继续延伸10min。
同样，将克隆的PCR产物CotD-TreS使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行胶回收，将所得到的DNA溶液置于-20℃保存用于后续试验。
基于大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒的表达载体pHT01可以在枯草芽孢杆菌中高效表达重组外源蛋白。所以使用表达质粒pHT01质粒构建表面展示系统pHT01-CotD-TreS。
采用BamHI和AatII双酶切实施例1中的PCR产物CotD-TreS，胶回收后与同样经过BamHI和AatII双酶切的胶回收产物pHT01质粒连接，得到整合型重组质粒命名为pHT01-CotD-TreS。
重组质粒转化枯草芽孢杆菌与转化子的筛选鉴定
将整合型重组质粒pHT01-CotD-TreS转化到Bacillussubtilis168(trp)，涂布含氯霉素的LB平板。过夜培养后，从平板上挑取单菌落用接种针接在平板上。过夜培养后，从平板上挑取单菌落点接在含有质量百分比1％的淀粉LB平板上，继续培养，通过碘液显色方式进行转化子鉴定。菌落自身及周围颜色为蓝色的表明重组基因插入到枯草芽孢杆菌染色体上的淀粉酶基因中，若菌落自身及周围颜色为白色的表明重组基因没有插入到枯草芽孢杆菌染色体上的淀粉酶基因中，鉴定为阳性的菌株命名为CotDT-01。
表面展示CotD-TreS重组芽孢的诱导及其产海藻糖合酶酶活测定
具体实验步骤参照实施例1。
以CotD为分子载体时，每毫升芽孢悬浮液的酶活力为0.23U/mg，表明CotD可以作为表面展示海藻糖合酶的分子载体。
实施例4
以CotH为分子载体在枯草芽孢杆菌芽孢表面展示海藻糖合酶TreS的重组芽孢的制备。
枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotH基因的获得
将培养好的枯草芽孢杆菌菌液按照Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒说明书提取枯草芽孢杆菌168基因组DNA。另外根据NCBI数据库中cotH因的编码序列设计引物，在上游和下游引物中分别引入BamHI和XbaI酶切位点，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司。采用宝生物工程有限公司的2×HiFi-PCRMaster聚合酶，以提取的枯草芽孢杆菌基因组DNA为模板扩增CotH。引物核苷酸序列如下，其中下划线代表的是酶切位点。
CotH-F：GGATCCATGAAGAATCAATCCAATTTACCG
CotH-R：CGGGCTGGGTCATTCTAGATAAAATACTTA；
PCR扩增体系如下，总体积50μL：
2×HiFi-PCRMaster25μL，引物cotH-F2.5μL，引物CotD-R2.5μL，Bacillussubtilis168基因组2.5μL，ddH2O17.5μL；
PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，48℃退火30s，72℃延伸1min10s，共30个循环；72℃继续延伸10min。
将克隆得到的PCR产物CotH使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行胶回收，将所得到的DNA溶液置于-20℃保存用于后续试验。
目的基因TreS基因的获得
以恶臭假单胞杆菌基因组为模板，经PCR扩增得到海藻糖合成酶TreS的核苷酸序列。
所述步骤(2)中PCR扩增引物，核苷酸序列如下：
TreS-F：AAATACAAATCTAGAATGACCCAGCCCGACCC
TreS-R：CTCACCATGACGTCAACATGCCCGCTGCTGT
PCR扩增体系，总体积50μL：
2×HiFi-PCRMaster25μL，引物TreS-F2.5μL，引物TreS-R2.5μL，pET15b-TreS2.5μL，ddH2O17.5μL；
PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min30s，共30个循环；72℃继续延伸10min。
将克隆得到的PCR产物TreS使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行胶回收，将所得到的DNA溶液置于-20℃保存用于后续实验。
将去掉终止密码子的CotH基因与TreS基因融合，在上游和下游中分别引入BamHI和AatII酶切位点，所设计的引物序列如下：
CotH-F：GGATCCATGAAGAATCAATCCAATTTACCG
TreS-R：CTCACCATGACGTCAACATGCCCGCTGCTGT
第一轮融合PCR扩增体系如下，总体积25μL：
2×HiFi-PCRMaster12.5μL，胶回收产物CotH2μL，胶回收产物TreS2μL，ddH2O8.5μL；
第一轮融合PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸4min，5个循环；72℃继续延伸10min。
第二轮融合PCR扩增体系为在第一轮PCR体系的基础上补加如下试剂：
2×HiFi-PCRMaster12.5μL，引物CotH-F1μL，引物TreS-R1μL，ddH2O10.5μL；
第二轮融合PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸5min30s，共30个循环；72℃继续延伸10min。
同样，将克隆的PCR产物CotH-TreS使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行胶回收，将所得到的DNA溶液置于-20℃保存用于后续试验。
基于大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒的表达载体pHT01可以在枯草芽孢杆菌中高效表达重组外源蛋白。所以使用表达质粒pHT01质粒构建表面展示系统pHT01-CotH-TreS。
采用BamHI和AatII双酶切实施例1中的PCR产物CotH-TreS，胶回收后与同样经过BamHI和AatII双酶切的胶回收产物pHT01质粒连接，得到整合型重组质粒命名为pHT01-CotH-TreS。
重组质粒转化枯草芽孢杆菌与转化子的筛选鉴定
将整合型重组质粒pHT01-CotH-TreS转化到Bacillussubtilis168(trp)，涂布含氯霉素的LB平板。过夜培养后，从平板上挑取单菌落用接种针接在平板上。过夜培养后，从平板上挑取单菌落点接在含有质量百分比1％的淀粉LB平板上，继续培养，通过碘液显色方式进行转化子鉴定。菌落自身及周围颜色为蓝色的表明重组基因插入到枯草芽孢杆菌染色体上的淀粉酶基因中，若菌落自身及周围颜色为白色的表明重组基因没有插入到枯草芽孢杆菌染色体上的淀粉酶基因中，鉴定为阳性的菌株命名为CotHT-01。
表面展示CotH-TreS重组芽孢的诱导及其产海藻糖合酶酶活测定
具体实验步骤参照实施例1。
以CotH为分子载体时，每毫升芽孢悬浮液的酶活力为0.08U/mg，表明CotH可以作为表面展示海藻糖合酶的分子载体。
实施例5
以CotG为分子载体在枯草芽孢杆菌芽孢表面展示海藻糖合酶TreS的重组芽孢的制备。
枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotG基因的获得
将培养好的枯草芽孢杆菌菌液按照Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒说明书提取枯草芽孢杆菌168基因组DNA。另外根据NCBI数据库中CotG因的编码序列设计引物，在上游和下游引物中分别引入BamHI和XbaI酶切位点，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司。采用宝生物工程有限公司的2×HiFi-PCRMaster聚合酶，以提取的枯草芽孢杆菌基因组DNA为模板扩增CotG。引物核苷酸序列如下，其中下划线代表的是酶切位点。
CotG-F：GGATCCATGGGCCACTATTCCCAT
CotG-R：GCTGGGTCATTCTAGATTTGTATTTCTTTTTGACTACC
PCR扩增体系如下，总体积50μL：
2×HiFi-PCRMaster25μL，引物CotG-F2.5μL，引物CotG-R2.5μL，Bacillussubtilis168基因组2.5μL，ddH2O17.5μL；
PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，48℃退火30s，72℃延伸1min10s，共30个循环；72℃继续延伸10min。
将克隆得到的PCR产物CotG使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行胶回收，将所得到的DNA溶液置于-20℃保存用于后续试验。
目的基因TreS基因的获得
以恶臭假单胞杆菌基因组为模板，经PCR扩增得到海藻糖合成酶TreS的核苷酸序列。
所述步骤(2)中PCR扩增引物，核苷酸序列如下：
TreS-F：AAATACAAATCTAGAATGACCCAGCCCGACCC
TreS-R：CTCACCATGACGTCAACATGCCCGCTGCTGT
PCR扩增体系，总体积50μL：
2×HiFi-PCRMaster25μl，引物TreS-F2.5μl，引物TreS-R2.5μl，pET15b-TreS2.5μl，ddH2O17.5μl；
PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min30s，共30个循环；72℃继续延伸10min。
将克隆得到的PCR产物TreS使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行胶回收，将所得到的DNA溶液置于-20℃保存用于后续实验。
将去掉终止密码子的CotD基因与TreS基因融合，在上游和下游中分别引入BamHI和AatII酶切位点，所设计的引物序列如下：
CotG-F：GGATCCATGGGCCACTATTCCCAT
TreS-R：CTCACCATGACGTCAACATGCCCGCTGCTGT
第一轮融合PCR扩增体系如下，总体积25μl：
2×HiFi-PCRMaster12.5μL，胶回收产物CotG2μL，胶回收产物TreS2μL，ddH2O8.5μL；
第一轮融合PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸4min，5个循环；72℃继续延伸10min。
第二轮融合PCR扩增体系为在第一轮PCR体系的基础上补加如下试剂：
2×HiFi-PCRMaster12.5μL，引物CotG-F1μL，引物TreS-R1μL，ddH2O10.5μL；
第二轮融合PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸5min30s，共30个循环；72℃继续延伸10min。
同样，将克隆的PCR产物CotG-TreS使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行胶回收，将所得到的DNA溶液置于-20℃保存用于后续试验。
基于大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒的表达载体pHT01可以在枯草芽孢杆菌中高效表达重组外源蛋白。所以使用表达质粒pHT01质粒构建表面展示系统pHT01-CotG-TreS。
采用BamHI和AatII双酶切实施例1中的PCR产物CotG-TreS，胶回收后与同样经过BamHI和AatII双酶切的胶回收产物pHT01质粒连接，得到整合型重组质粒命名为pHT01-CotG-TreS。
重组质粒转化枯草芽孢杆菌与转化子的筛选鉴定
将整合型重组质粒pHT01-CotG-TreS转化到Bacillussubtilis168(trp)，涂布含氯霉素的LB平板。过夜培养后，从平板上挑取单菌落用接种针接在平板上。过夜培养后，从平板上挑取单菌落点接在含有质量百分比1％的淀粉LB平板上，继续培养，通过碘液显色方式进行转化子鉴定。菌落自身及周围颜色为蓝色的表明重组基因插入到枯草芽孢杆菌染色体上的淀粉酶基因中，若菌落自身及周围颜色为白色的表明重组基因没有插入到枯草芽孢杆菌染色体上的淀粉酶基因中，鉴定为阳性的菌株命名为CotGT-01。
表面展示CotG-TreS重组芽孢的诱导及其产海藻糖合酶酶活测定
具体实验步骤参照实施例1。
以CotG为分子载体时，每毫升芽孢悬浮液的酶活力为0.23U/mg，表明CotG可以作为表面展示海藻糖合酶的分子载体。
实施例6
以CotX为分子载体在枯草芽孢杆菌芽孢表面展示海藻糖合酶TreS的重组芽孢的制备。
枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白cotX基因的获得
将培养好的枯草芽孢杆菌菌液按照Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒说明书提取枯草芽孢杆菌168基因组DNA。另外根据NCBI数据库中CotX因的编码序列设计引物，在上游和下游引物中分别引入BamHI和XbaI酶切位点，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司。采用宝生物工程有限公司的2×HiFi-PCRMaster聚合酶，以提取的枯草芽孢杆菌基因组DNA为模板扩增CotX。引物核苷酸序列如下，其中下划线代表的是酶切位点。
CotX-F：GGATCCATGGAAAGCAGACCATATTCT
CotX-R：GGTCATTCTAGAGAGGACAAGAGTGATAAC；
PCR扩增体系如下，总体积50μL：
2×HiFi-PCRMaster25μL，引物CotX-F2.5μL，引物CotX-R2.5μL，Bacillussubtilis168基因组2.5μL，ddH2O17.5μL；
PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，48℃退火30s，72℃延伸1min10s，共30个循环；72℃继续延伸10min。
将克隆得到的PCR产物CotX使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行胶回收，将所得到的DNA溶液置于-20℃保存用于后续试验。
目的基因TreS基因的获得
以恶臭假单胞杆菌基因组为模板，经PCR扩增得到海藻糖合成酶TreS的核苷酸序列。
所述步骤(2)中PCR扩增引物，核苷酸序列如下：
TreS-F：AAATACAAATCTAGAATGACCCAGCCCGACCC
TreS-R：CTCACCATGACGTCAACATGCCCGCTGCTGT
PCR扩增体系，总体积50μl：
2×HiFi-PCRMaster25μL，引物TreS-F2.5μL，引物TreS-R2.5μL，pET15b-TreS2.5μL，ddH2O17.5μL；
PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min30s，共30个循环；72℃继续延伸10min。
将克隆得到的PCR产物TreS使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行胶回收，将所得到的DNA溶液置于-20℃保存用于后续实验。
将去掉终止密码子的CotX基因与TreS基因融合，在上游和下游中分别引入BamHI和AatII酶切位点，所设计的引物序列如下：
CotX-F：GGATCCATGGAAAGCAGACCATATTCT
TreS-R：CTCACCATGACGTCAACATGCCCGCTGCTGT
第一轮融合PCR扩增体系如下，总体积25μL：
2×HiFi-PCRMaster12.5μL，胶回收产物CotX2μL，胶回收产物TreS2μL，ddH2O8.5μL；
第一轮融合PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸4min，5个循环；72℃继续延伸10min。
第二轮融合PCR扩增体系为在第一轮PCR体系的基础上补加如下试剂：
2×HiFi-PCRMaster12.5μL，引物CotX-F1μL，引物TreS-R1μL，ddH2O10.5μL；
第二轮融合PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸5min30s，共30个循环；72℃继续延伸10min。
同样，将克隆的PCR产物CotX-TreS使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行胶回收，将所得到的DNA溶液置于-20℃保存用于后续试验。
基于大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒的表达载体pHT01可以在枯草芽孢杆菌中高效表达重组外源蛋白。所以使用表达质粒pHT01质粒构建表面展示系统pHT01-CotX-TreS。
采用限制性内切酶BamHI和AatII双酶切实施例1中的PCR产物CotX-TreS，胶回收后与同样经过BamHI和AatII双酶切的胶回收产物pHT01质粒连接，得到整合型重组质粒命名为pHT01-cotX-TreS。
重组质粒转化枯草芽孢杆菌与转化子的筛选鉴定
将整合型重组质粒pHT01-cotX-TreS转化到Bacillussubtilis168(trp)，涂布含氯霉素的LB平板。过夜培养后，从平板上挑取单菌落用接种针接在平板上。过夜培养后，从平板上挑取单菌落点接在含有质量百分比1％的淀粉LB平板上，继续培养，通过碘液显色方式进行转化子鉴定。菌落自身及周围颜色为蓝色的表明重组基因插入到枯草芽孢杆菌染色体上的淀粉酶基因中，若菌落自身及周围颜色为白色的表明重组基因没有插入到枯草芽孢杆菌染色体上的淀粉酶基因中，鉴定为阳性的菌株命名为CotXT-01。
表面展示CotX-TreS重组芽孢的诱导及其产海藻糖合酶酶活测定
具体实验步骤参照实施例1。
以CotX为分子载体时，每毫升芽孢悬浮液的酶活力为0.60U/mg，表明CotX可以作为表面展示海藻糖合酶的分子载体。
实施例6
以CotY为分子载体在枯草芽孢杆菌芽孢表面展示海藻糖合酶TreS的重组芽孢的制备。
枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白cotY基因的获得
将培养好的枯草芽孢杆菌菌液按照Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒说明书提取枯草芽孢杆菌168基因组DNA。另外根据NCBI数据库中CotY因的编码序列设计引物，在上游和下游引物中分别引入BamHI和XbaI酶切位点，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司。采用宝生物工程有限公司的2×HiFi-PCRMaster聚合酶，以提取的枯草芽孢杆菌基因组DNA为模板扩增CotY。引物序列如下，其中下划线代表的是酶切位点。
CotY-F：GGATCCATGAGCTGCGGAAAAACCC
CotY-R：GGTCATTCTAGATCCATTGTGATGATGCTT；
PCR扩增体系如下，总体积50μL：
2×HiFi-PCRMaster25μL，引物CotY-F2.5μL，引物CotY-R2.5μL，Bacillussubtilis168基因组2.5μL，ddH2O17.5μL；
PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，48℃退火30s，72℃延伸1min10s，共30个循环；72℃继续延伸10min。
将克隆得到的PCR产物CotY使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行胶回收，将所得到的DNA溶液置于-20℃保存用于后续试验。
目的基因TreS基因的获得
以恶臭假单胞杆菌基因组为模板，经PCR扩增得到海藻糖合成酶TreS的核苷酸序列。
所述步骤(2)中PCR扩增引物，核苷酸序列如下：
TreS-F：AAATACAAATCTAGAATGACCCAGCCCGACCC
TreS-R：CTCACCATGACGTCAACATGCCCGCTGCTGT
PCR扩增体系，总体积50μl：
2×HiFi-PCRMaster25μL，引物TreS-F2.5μL，引物TreS-R2.5μL，pET15b-TreS2.5μL，ddH2O17.5μL；
PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min30s，共30个循环；72℃继续延伸10min。
将克隆得到的PCR产物TreS使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行胶回收，将所得到的DNA溶液置于-20℃保存用于后续实验。
将去掉终止密码子的CotY基因与TreS基因融合，在上游和下游中分别引入BamHI和AatII酶切位点，所设计的引物序列如下：
CotY-F：GGATCCATGAGCTGCGGAAAAACCC
TreS-R：CTCACCATGACGTCAACATGCCCGCTGCTGT
第一轮融合PCR扩增体系如下，总体积25μL：
2×HiFi-PCRMaster12.5μL，胶回收产物CotY2μL，胶回收产物TreS2μL，ddH2O8.5μL；
第一轮融合PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸4min，5个循环；72℃继续延伸10min。
第二轮融合PCR扩增体系为在第一轮PCR体系的基础上补加如下试剂：
2×HiFi-PCRMaster12.5μL，引物CotY-F1μL，引物TreS-R1μL，ddH2O10.5μL；
第二轮融合PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸5min30s，共30个循环；72℃继续延伸10min。
同样，将克隆的PCR产物CotY-TreS使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行胶回收，将所得到的DNA溶液置于-20℃保存用于后续试验。
基于大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒的表达载体pHT01可以在枯草芽孢杆菌中高效表达重组外源蛋白。所以使用表达质粒pHT01质粒构建表面展示系统pHT01-cotY-TreS。
采用限制性内切酶BamHI和AatII双酶切实施例1中的PCR产物CotY-TreS，胶回收后与同样经过BamHI和AatII双酶切的胶回收产物pHT01质粒连接，得到整合型重组质粒命名为pHT01-CotY-TreS。
重组质粒转化枯草芽孢杆菌与转化子的筛选鉴定
将整合型重组质粒pHT01-CotY-TreS转化到Bacillussubtilis168(trp)，涂布含氯霉素的LB平板。过夜培养后，从平板上挑取单菌落用接种针接在平板上。过夜培养后，从平板上挑取单菌落点接在含有质量百分比1％的淀粉LB平板上，继续培养，通过碘液显色方式进行转化子鉴定。菌落自身及周围颜色为蓝色的表明重组基因插入到枯草芽孢杆菌染色体上的淀粉酶基因中，若菌落自身及周围颜色为白色的表明重组基因没有插入到枯草芽孢杆菌染色体上的淀粉酶基因中，鉴定为阳性的菌株命名为CotYT-01。
表面展示CotY-TreS重组芽孢的诱导及其产海藻糖合酶酶活测定
具体实验步骤参照实施例1。
以CotY为分子载体时，每毫升芽孢悬浮液的酶活力为0.31U/mg，表明CotY可以作为表面展示海藻糖合酶的分子载体。
实施例7
以CotZ为分子载体在枯草芽孢杆菌芽孢表面展示海藻糖合酶TreS的重组芽孢的制备。
枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotZ基因的获得
将培养好的枯草芽孢杆菌菌液按照Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒说明书提取枯草芽孢杆菌168基因组DNA。另外根据NCBI数据库中CotZ因的编码序列设计引物，在上游和下游引物中分别引入BamHI和XbaI酶切位点，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司。采用宝生物工程有限公司的2×HiFi-PCRMaster聚合酶，以提取的枯草芽孢杆菌基因组DNA为模板扩增CotZ。引物序列如下，其中下划线代表的是酶切位点。
CotZ-F：GGATCCATGAGCCAGAAAACATCAAG
CotZ-R：GGTCGTCTAGAGGCTGGGTCATATGAT；
PCR扩增体系如下，总体积50μL：
2×HiFi-PCRMaster25μL，引物CotZ-F2.5μL，引物CotZ-R2.5μL，Bacillussubtilis168基因组2.5μL，ddH2O17.5μL；
PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，48℃退火30s，72℃延伸1min10s，共30个循环；72℃继续延伸10min。
将克隆得到的PCR产物CotZ使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行胶回收，将所得到的DNA溶液置于-20℃保存用于后续试验。
目的基因TreS基因的获得
以恶臭假单胞杆菌基因组为模板，经PCR扩增得到海藻糖合成酶TreS的核苷酸序列。
所述步骤(2)中PCR扩增引物，核苷酸序列如下：
TreS-F：AAATACAAATCTAGAATGACCCAGCCCGACCC
TreS-R：CTCACCATGACGTCAACATGCCCGCTGCTGT
PCR扩增体系，总体积50μL：
2×HiFi-PCRMaster25μL，引物TreS-F2.5μL，引物TreS-R2.5μL，pET15b-TreS2.5μL，ddH2O17.5μL；
PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min30s，共30个循环；72℃继续延伸10min。
将克隆得到的PCR产物TreS使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行胶回收，将所得到的DNA溶液置于-20℃保存用于后续实验。
将去掉终止密码子的CotZ基因与TreS基因融合，在上游和下游中分别引入BamHI和AatII酶切位点，所设计的引物序列如下：
CotZ-F：GGATCCATGAGCCAGAAAACATCAAG
TreS-R：CTCACCATGACGTCAACATGCCCGCTGCTGT
第一轮融合PCR扩增体系如下，总体积25μL：
2×HiFi-PCRMaster12.5μL，胶回收产物CotZ2μL，胶回收产物TreS2μL，ddH2O8.5μL；
第一轮融合PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸4min，5个循环；72℃继续延伸10min。
第二轮融合PCR扩增体系为在第一轮PCR体系的基础上补加如下试剂：
2×HiFi-PCRMaster12.5μL，引物CotZ-F1μL，引物TreS-R1μL，ddH2O10.5μL；
第二轮融合PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸5min30s，共30个循环；72℃继续延伸10min。
同样，将克隆的PCR产物CotZ-TreS使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行胶回收，将所得到的DNA溶液置于-20℃保存用于后续试验。
基于大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒的表达载体pHT01可以在枯草芽孢杆菌中高效表达重组外源蛋白。所以使用表达质粒pHT01质粒构建表面展示系统pHT01-CotZ-TreS。
采用BamHI和AatII双酶切实施例1中的PCR产物CotZ-TreS，胶回收后与同样经过BamHI和AatII双酶切的胶回收产物pHT01质粒连接，得到整合型重组质粒命名为pHT01-CotZ-TreS。
重组质粒转化枯草芽孢杆菌与转化子的筛选鉴定
将整合型重组质粒pHT01-CotZ-TreS转化到Bacillussubtilis168(trp)，涂布含氯霉素的LB平板。过夜培养后，从平板上挑取单菌落用接种针接在平板上。过夜培养后，从平板上挑取单菌落点接在1％淀粉的LB平板上，继续培养，通过碘液显色方式进行转化子鉴定。菌落自身及周围颜色为蓝色的表明重组基因插入到枯草芽孢杆菌染色体上的淀粉酶基因中，若菌落自身及周围颜色为白色的表明重组基因没有插入到枯草芽孢杆菌染色体上的淀粉酶基因中，鉴定为阳性的菌株命名为CotZT-01。
表面展示CotZ-TreS重组芽孢的诱导及其产海藻糖合酶酶活测定
具体实验步骤参照实施例1。
以CotZ为分子载体时，每毫升芽孢悬浮液的酶活力为0.38U/mg，表明CotZ可以作为表面展示海藻糖合酶的分子载体。
通过测定酶活，以上选用的Cot系列的芽孢衣壳蛋白均可以有效地锚定海藻糖合酶在芽孢表面，并且可以获得较高的酶活，其中以CotG、CotX为分子载体所构建的重组菌株获得的酶活最高，分别为0.63U/mg和0.60U/mg。
Claims (10)
1.一种枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白Cot表面展示海藻糖合酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取枯草芽孢杆菌的基因组DNA，然后以基因组DNA为模板PCR扩增枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因，PCR扩增过程中，在上游和下游引物中分别引入BamHI和XbaI酶切位点，制得枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因Cot；
所述枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因为枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因CotG、枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因CotB、枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因CotC、枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因CotD、枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因CotH、枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因CotX、枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因CotY或枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因CotZ；
(2)以恶臭假单胞杆菌基因组为模板，经PCR扩增，制得海藻糖合成酶TreS的核苷酸序列；
(3)去除步骤(1)制得的枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因Cot的终止子，然后采用融合PCR与步骤(2)制得的TreS基因进行融合，融合PCR过程中，在上游和下游中分别引入限制性内切酶BamHI和AatII的酶切位点，制得融合基因Cot-TreS；
(4)将步骤(3)制得的融合基因Cot-TreS经BamHI和AatII双酶切后，与同样经BamHI和AatII双酶切的表达载体pHT01连接，制得重组质粒pHT01-Cot-TreS；
(5)将步骤(4)制得的重组质粒pHT01-Cot-TreS转化枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)168，转化后经涂布含氯霉素的LB平板进行筛选，然后经碘液显色方式进行转化子鉴定，获得阳性菌株；
(6)将步骤(5)制得的阳性菌株经DSM培养基35～37℃诱导培养45～50h，制得表面展示海藻糖合酶的重组芽孢。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因为枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因CotG。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因CotG的PCR扩增引物，核苷酸序列如下：
CotG-F：GGATCCATGGGCCACTATTCCCAT
CotG-R：GCTGGGTCATTCTAGATTTGTATTTCTTTTTGACTACC
PCR扩增体系如下，总体积50μL：
2×HiFi-PCRMaster25μL，引物CotG-F2.5μL，引物CotG-R2.5μL，Bacillussubtilis168基因组2.5μL，ddH2O17.5μL；
PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，48℃退火30s，72℃延伸1min10s，共30个循环；72℃继续延伸10min。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)168。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中PCR的扩增引物，核苷酸序列如下：
TreS-F：TAAGTATTTTATCTAGAATGACCCAGCCCGACCC
TreS-R：CTCACCATGACGTCAACATGCCCGCTGCTGT；
PCR扩增体系，总体积50μl：
2×HiFi-PCRMaster25μL，引物TreS-F2.5μL，引物TreS-R2.5μL，pET15b-TreS2.5μL，ddH2O17.5μL；
PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min30s，共30个循环；72℃继续延伸10min。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)来源于美国模式培养物集存库，保藏编号：ATCC47054。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中去除枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因CotG的终止子的步骤如下：
在设计引物时，人为的去除枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因CotG的终止密码子，插入酶切位点AatII。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中去除TreS基因的终止子的步骤如下：
在设计引物时，人为的去除海藻糖合酶基因TreS的终止密码子TGA，插入酶切位点AatII；
优选的，所述步骤(3)中融合PCR采用二次融合PCR扩增，扩增引物核苷酸序列如下：
CotG-F：GGATCCATGGGCCACTATTCCCAT
TreS-R：CTCACCATGACGTCAACATGCCCGCTGCTGT；
第一轮融合PCR扩增体系如下，总体积25μl：
2×HiFi-PCRMaster12.5μL，胶回收产物CotG2μL，胶回收产物TreS2μL，ddH2O8.5μL；
第一轮融合PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸4min，5个循环；72℃继续延伸10min。
第二轮融合PCR扩增体系为在第一轮PCR体系的基础上补加如下试剂：
2×HiFi-PCRMaster12.5μL，引物CotG-F1μL，引物TreS-R1μL，ddH2O10.5μL；
第二轮融合PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸5min30s，共30个循环；72℃继续延伸10min。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中连接体系如下，总体积10μL：
CotG-TreS4μL，表达载体pHT013μL，5×T4buffer2μL，T4连接酶1μL；
连接条件为：16℃连接过夜。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(6)中的DSM培养基组分如下：0.8wt％肉汤培养液，0.1wt％KCl，0.025wt％MgSO4·7H2O，1.0MmCa(NO3)2，10μMFeSO4。
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