CN116731949A - 一种表达融合蛋白的芽孢及其在群体感应抑制中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及农业及环境技术领域，具体提供一种表达融合蛋白的芽孢及其在群体感应抑制中的应用。本发明利用枯草芽孢杆菌的芽孢外壳蛋白cotG基因连接柔性接头蛋白（linker）与AHL‑内酯酶蛋白aiiA基因，获得能够在芽孢外壳表面表达AiiA蛋白的菌株CotG‑linker‑AiiA，与未连接linker接头蛋白的芽孢和野生型芽孢相比，CotG‑linker‑AiiA芽孢可以对50μg/mL的C4和2μg/mL的C6两种短链AHLs信号分子实现明显的猝灭效果，且可以回收后重复利用。
Description
技术领域
本发明涉及农业及环境技术领域，尤其涉及一种表达融合蛋白的芽孢及其在群体感应抑制中的应用。
背景技术
群体感应（quorum sensing，QS）是细菌通过分泌信号分子（如N-酰基高丝氨酸内酯类化合物（N-acyl homoserine lactone，AHLs））调控相关基因表达从而适应环境的一种信号交流机制，细菌使用群体感应来调节它们的生长、发育和代谢等多种生理活动，包括毒力因子合成、生物被膜、质粒的结合转移、抗生素的合成等行为。其危害如下：一些细菌如烟草青枯病菌，会利用群体感应产生黏附于植物表面的生物被膜，阻碍植物的光合作用和呼吸作用，从而导致植物生长缓慢或死亡；同时，还有一些细菌如铜绿假单胞菌，利用群体感应来释放外毒素，可以破坏植物细胞的细胞膜和细胞壁，导致组织坏死和死亡。
由于传统的抗菌化合物（如抗生素）是通过干扰细菌的必需功能来杀死或抑制细菌，会导致抗生素耐药细菌的产生和传播，因此需要不断开发新的抗菌药物以抑制抗性菌株。而群体感应抑制剂可以抑制QS，具有高度特异性且不会引发细菌的耐药性增强，例如AHL-内酯酶 (AiiA) 是一种由蜡样芽孢杆菌等芽孢菌产生的金属-β-内酰胺酶，可特异性水解革兰氏阴性菌分泌的AHL以抑制微生物的QS，从而消除或减轻病原体引起的症状。
枯草芽孢杆菌作为一种在自然界中广泛存在的细菌，具有多种优点，例如可以作为生物杀虫剂，产生溶菌酶等物质以防治害虫；也可以作为生物除草剂，产生杀草酮等防治多种草本植物；还具备固氮和磷酸化的功能，用以制备生物肥料，提高土壤肥力和作物产量。而芽孢是枯草芽孢杆菌在营养缺乏条件下形成的休眠体，可以在极端的环境条件下生存，因此可以在自然界中长期存活和繁殖。
发明内容
本发明提供一种表达融合蛋白的芽孢及其在群体感应抑制中的应用。本发明利用枯草芽孢杆菌的芽孢外壳蛋白cotG基因连接柔性接头蛋白（linker）与AHL-内酯酶蛋白aiiA基因，能够在芽孢外壳表面表达AiiA蛋白。
为了实现本发明的目的，第一方面，本发明提供一种表达融合蛋白的芽孢，所述融合蛋白的编码基因由aiiA与cotG基因间添加linker基因构成；所述芽孢在芽孢外壳表面表达AiiA蛋白。
本发明所提供的表达融合蛋白的芽孢中，所述linker基因的序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明所提供的芽孢为枯草芽孢杆菌的芽孢。
第二方面，本发明提供表达融合蛋白的芽孢的构建方法，基于Gibson Assembly技术对线性DNA片段进行组装，同源重组至野生型枯草芽孢杆菌中；所述线性DNA片段按照3‘-5‘的顺序，由cotG基因片段、linker基因片段、aiiA基因片段、Spec抗生素片段和cotGDS片段组成，所述cotGDS片段为cotG基因下游0.8-1.2Kb序列。
本发明发现，cotGDS片段的选择是非常重要的，选择不同的cotGDS片段进行组装后，构建成功率显著不同。
在本发明所提供的构建方法中，扩增所述cotG基因片段的引物对如SEQ ID NO.4-5所示；扩增所述linker基因片段的引物对如SEQ ID NO.8-9所示；扩增所述aiiA基因片段的引物对如SEQ ID NO.2-3所示；扩增所述Spec抗生素片段的引物对如SEQ ID NO.10-11所示；扩增所述cotGDS片段的引物对如SEQ ID NO.6-7所示。
在本发明所提供的构建方法中，所述SEQ ID NO.2的前25bp为cotG基因片段末端同源序列；所述SEQ ID NO.3的前21bp为Spec抗生素片段首端同源序列；所述SEQ ID NO.6的前18bp为Spec抗生素片段末端同源序列。
第三方面，本发明提供一种枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌由上述构建方法构建得到，所述枯草芽孢杆菌的芽孢在芽孢外壳表面表达AiiA蛋白。
第四方面，本发明提供上述芽孢或上述枯草芽孢杆菌在制备群体感应抑制剂中的应用。
第五方面，本发明提供一种群体感应抑制剂，含有上述芽孢或上述枯草芽孢杆菌。
第六方面，本发明提供上述芽孢或上述枯草芽孢杆菌或上述的群体感应抑制剂在制备生物肥料中的应用。
以及，上述芽孢或上述枯草芽孢杆菌或上述的群体感应抑制剂在制备生物防治剂中的应用。
本发明的有益效果在于：
（1）现有技术中，制备细菌群体感应抑制剂需要高度专业的技能和设备，并且生产成本较高。本发明通过将AHL-内酯酶连接于芽孢外壳蛋白上，实现对细菌群体感应信号分子的猝灭，将CotG-linker-AiiA菌株培养为CotG-linker-AiiA芽孢后即可发挥效果，相较于传统的制备方法，成本较低且操作简单。
（2）本发明中，AHL-内酯酶连接在芽孢外壳蛋白上能够稳定存在，芽孢起到固定AHL-内酯酶的作用，通过离心的方法将表达AHL-内酯酶的芽孢收集后可以重复利用，可以节约使用成本。
（3）本发明在AiiA蛋白与CotG外壳蛋白之间添加了linker柔性接头蛋白，使AHL-内酯酶有效发挥作用。
（4）本发明所提供的表达外源基因后的枯草芽孢杆菌的芽孢不仅可以干扰对植物有害的细菌群体感应，还具备生物防治和生产生物肥料等优点，可以用于农业和环境等领域，在未来具有广阔的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明中cotG-aiiA线性片段。
图2是本发明中cotG-linker-aiiA线性片段。
图3是本发明提供的短链AHLsC4淬灭效果图。
图4是本发明提供的短链AHLsC6淬灭效果图。
图5是本发明实施例1所得到的CotG-linker-AiiA突变菌株片段扩增结果图。
图6是本发明对比例1得到的CotG-linker-AiiA突变菌株片段扩增结果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1 菌株CotG-linker-AiiA的制备
本实施例根据蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）的DNA序列设计aiiA上下游引物A1-F和A1-R（下述A1-F下划线部分为cotG末端同源序列，A1-R下划线部分为Spec基因首端同源序列，用于Gibson Assembly连接）。
A1-F：ATGACAGTAAAGAAACTTTATTTCATC（SEQ ID NO.2）；
A1-R：CTGAGCGAGGGAGCAGAATCACTATATATACTCAGGGAACACTCTA（SEQ ID NO.3）。
根据枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）的DNA序列设计cotG上下游引物A2-F和A2-R，以及距离cotG下游1Kb序列（cotGDS）的上下游引物A3-F和A3-R（下述A3-F下划线部分为Spec基因末端同源序列）
A2-F：ATAAGCGATATCAATATCCAGC（SEQ ID NO.4）；
A2-R：TTTGTATTTCTTTTTGACTACCCAG（SEQ ID NO.5）；
A3-F：GTTGACCAGTGCTCCCTGTCTAAGTTTTCATTGTTTCAATAGGC（SEQ ID NO.6）；
A3-R：GCATTAAAATCCAAAAGTTTGTCA（SEQ ID NO.7）。
向A1-F前端添加linker柔性蛋白获得引物A1-F-linker，向A2-R前端添加linker柔性蛋白首段部分序列（下划线部分）获得引物A2-R-linker。
linker序列：（SEQ ID NO.1所示）GGTGGAGGTAGTGGTGGCGGAGGTAGCGGAGGCGGTGGATCGGCGCGCCGT。
A1-F-linker：GGTGGAGGTAGTGGTGGCGGAGGTAGCGGAGGCGGTGGATCGGCGCGCCGTATGACAGTAAAGAAACTTTATTTCATC（SEQ ID NO.8）。
A2-R-linker：TCCGCCACCACTACCTCCACCTCCTTTGTATTTCTTTTTGACTACCCAG（SEQ IDNO.9）。
根据大观霉素（Spec）抗生素的DNA序列设计上下游引物A4-F和A4-R，从含有Spec抗生素的菌株RU98（实验室先前构建的菌株）扩增Spec抗生素片段。
A4-F：TTCTGCTCCCTCGCTCAG（SEQ ID NO.10）；
A4-R：CAGGGAGCACTGGTCAAC（SEQ ID NO.11）。
利用Gibson Assembly技术对上述引物扩增出的线性DNA片段进行组装，获得如图1所示的cotG-aiiA片段和如图2所示的cotG-linker-aiiA片段，在aiiA与cotG基因间添加柔性接头蛋白（linker）基因，以确保两侧的蛋白完成各自独立的功能。
将上述两组片段分别与野生型枯草芽孢杆菌PY79进行同源重组，并将融合基因在野生型枯草芽孢杆菌芽孢中表达获得芽孢CotG-AiiA和CotG-linker-AiiA，使AiiA蛋白在芽孢外壳表面进行表达。
采用实施例1提供的方法，芽孢CotG-linker-AiiA构建成功率为80%。
实施例2 芽孢CotG-linker-AiiA对短链AHLs信号分子C4和C6的淬灭效果
本实施例中，验证芽孢CotG-linker-AiiA对短链AHLs信号分子C4和C6的淬灭效果。具体步骤如下：
取200μL 实施例1制备得到的CotG-AiiA、CotG-linker-AiiA菌株芽孢（OD600=5）和野生型枯草芽孢杆菌芽孢（OD600=5）分别与短链AHLs信号分子C4（浓度：50 μg/ml）和短链AHLs信号分子C6（浓度：2 μg/ml）于37 ℃培养12 h，吸取10 μL指示菌CV026（OD600=1）滴于培养基上，再吸取10 μL培养后的液体滴于指示菌CV026上，37 ℃培养12 h。指示菌CV026能够与AHLs信号分子结合产生紫色，通过其颜色深浅反映猝灭效果，AHLs信号分子C4猝灭结果如图3所示；AHLs信号分子C6猝灭结果如图4所示。
图3的A中，1代表短链AHLs信号分子C4（50 μg/ml）37 ℃培养12 h，取10 μL培养液体滴于10 μL指示菌CV026（OD600=1）上，37 ℃培养12 h；
2代表短链AHLs信号分子C4（50 μg/ml）与野生型枯草芽孢杆菌的芽孢（OD600=5）37℃培养12 h，取10 μL培养液体滴于10 μL指示菌CV026（OD600=1）上，37 ℃培养12 h；
3代表短链AHLs信号分子C4（50 μg/ml）与CotG-AiiA芽孢（OD600=5）37 ℃培养12h，取10 μL培养液体滴于10 μL指示菌CV026（OD600=1）上，37 ℃培养12 h；
4代表短链AHLs信号分子C4（50 μg/ml）与CotG-linker-AiiA芽孢（OD600=5）37 ℃培养12 h，取10 μL培养液体滴于10 μL指示菌CV026（OD600=1）上，37 ℃培养12 h。
图4的C中，1代表短链AHLs信号分子C6（50 μg/ml）37 ℃培养12 h，取10 μL培养液体滴于10 μL指示菌CV026（OD600=1）上，37 ℃培养12 h。
2代表短链AHLs信号分子C6（50 μg/ml）与野生型枯草芽孢杆菌的芽孢（OD600=5）37℃培养12 h，取10 μL培养液体滴于10 μL指示菌CV026（OD600=1）上，37 ℃培养12 h。
3代表短链AHLs信号分子C6（50 μg/ml）与CotG-AiiA芽孢（OD600=5）37 ℃培养12h，取10 μL培养液体滴于10 μL指示菌CV026（OD600=1）上，37 ℃培养12 h。
4代表短链AHLs信号分子C6（50 μg/ml）与CotG-linker-AiiA芽孢（OD600=5）37 ℃培养12 h，取10 μL培养液体滴于10 μL指示菌CV026（OD600=1）上，37 ℃培养12 h。
实施例3 回收利用芽孢CotG-linker-AiiA对短链AHLs信号分子C4和C6的淬灭效果
本实施例中，对芽孢CotG-linker-AiiA进行回收利用，并验证重复利用的芽孢CotG-linker-AiiA对短链AHLs信号分子C4和C6的淬灭效果，步骤如下：
将与AHLs信号分子C4或AHLs信号分子C6孵育后的芽孢悬液15000 x g，25 ℃，离心10 min，将芽孢与AHLs信号分子分开，收集底部沉淀，重复上述实验过程，观察回收利用的芽孢对短链AHLs信号分子C4和C6的猝灭效果，见图3的B和图4的D。
图3的B中，1代表短链AHLs信号分子C4（50 μg/ml）37 ℃培养12 h，取10 μL培养液体滴于10 μL指示菌CV026（OD600=1）上，37 ℃培养12 h；
2代表将实施例2中与AHLs信号分子一起培养的野生型枯草芽孢杆菌芽孢悬液15000 x g，25 ℃，离心10 min；将所得沉淀再与短链AHLs信号分子C4（50 μg/ml）37 ℃培养12 h，取10 μL培养液体滴于10 μL指示菌CV026（OD600=1）上，37 ℃培养12 h；
3代表将实施例2中与AHLs信号分子一起培养的CotG-AiiA芽孢悬液15000 x g，25℃，离心10 min；将所得沉淀再与短链AHLs信号分子C4（50 μg/ml）37 ℃培养12 h，取10 μL培养液体滴于10 μL指示菌CV026（OD600=1）上，37 ℃培养12 h；
4代表将实施例2中与AHLs信号分子一起培养的CotG-linker-AiiA芽孢悬液15000x g，25 ℃，离心10 min；将所得沉淀再与短链AHLs信号分子C4（50 μg/ml）37 ℃培养12 h，取10 μL培养液体滴于10 μL指示菌CV026（OD600=1）上，37 ℃培养12 h。
图4的D中，1代表短链AHLs信号分子C6（50 μg/ml）37 ℃培养12 h，取10 μL培养液体滴于10 μL指示菌CV026（OD600=1）上，37 ℃培养12 h；
2代表将实施例2中与AHLs信号分子一起培养的野生型枯草芽孢杆菌芽孢悬液15000 x g，25 ℃，离心10 min；将所得沉淀再与短链AHLs信号分子C6（50 μg/ml）37 ℃培养12 h，取10 μL培养液体滴于10 μL指示菌CV026（OD600=1）上，37 ℃培养12 h；
3代表将实施例2中与AHLs信号分子一起培养的CotG-AiiA芽孢悬液15000 x g，25℃，离心10 min，将所得沉淀再与短链AHLs信号分子C6（50 μg/ml）37 ℃培养12 h，取10 μL培养液体滴于10 μL指示菌CV026（OD600=1）上，37 ℃培养12 h；
4代表将实施例2中与AHLs信号分子一起培养的CotG-linker-AiiA芽孢悬液15000x g，25 ℃，离心10 min，将所得沉淀再与短链AHLs信号分子C6（50 μg/ml）37 ℃培养12 h，取10 μL培养液体滴于10 μL指示菌CV026（OD600=1）上，37 ℃培养12 h。
由图3和图4结果可知，本发明提供的芽孢CotG-linker-AiiA对短链AHLs信号分子C4和C6均能起到猝灭效果；并且，对本发明提供的芽孢CotG-linker-AiiA进行回收再利用，依然能够实现对短链AHLs信号分子C4和C6的猝灭效果。
实施例4 使用CotG-linker-AiiA制备生物肥料
本发明实施例所制备得到的CotG-linker-AiiA菌株及芽孢的应用具有普适性，无论营养丰富还是营养缺乏，均能起到良好的生物肥料作用。
一方面，将该菌株制成芽孢后，可以应用于营养丰富的环境时，芽孢会萌发生长繁殖，消耗营养物质，当营养消耗殆尽，会再次形成芽孢，此时其他有害微生物正好开始进入稳定期，正是群体感应产生的时期，芽孢此时能通过阻断群体感应发挥作用；另一方面，将芽孢应用于营养缺乏的环境时，芽孢不会萌发生长，能一直起到抑制其他有害微生物群体感应的作用。
对比例1 不同CotG下游片段的选择
在本发明实施例1中，选取的CotG下游片段（cotG DS-1）为1000bp左右时，共挑取10株进行验证，有8株成功扩增出对应片段，成功率为80%。
图5为实施例1所得到的CotG-linker-AiiA突变菌株片段扩增结果图，总片段长度为4000bp左右：cotG UP (872bp) +aiiA (753bp) +linker(50bp)+ Spec(1300bp) +cotGDS-1 (993bp)。
本对比例与实施例1相同，区别在于，本对比例选取的CotG下游片段（cotG DS-2）为500bp左右，共挑取10株进行验证，未扩增出对应的片段。其中，扩增cotG DS-2片段的上游引物与cotG DS-1相同，为A3-F，下游引物为A5-R：TTCAACAGGATGAAGCGAGGT。图6为对比例1得到的CotG-linker-AiiA突变菌株片段扩增结果图，总片段长度为3500bp左右：cotG UP(872bp) +aiiA (753bp) +linker(50bp)+ Spec(1300bp) +cotG DS-2 (524bp)。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种表达融合蛋白的芽孢，其特征在于，所述融合蛋白的编码基因包括aiiA基因、cotG基因和linker基因，所述linker基因连接aiiA基因和cotG基因；所述芽孢在芽孢外壳表面表达AiiA蛋白。
2.根据权利要求1所述的芽孢，其特征在于，所述linker基因的序列如SEQ ID NO.1所示。
3.权利要求1-2任一项所述芽孢的构建方法，其特征在于，基于Gibson Assembly技术对线性DNA片段进行组装，同源重组至野生型枯草芽孢杆菌中；所述线性DNA片段按照3‘-5‘的顺序，由cotG基因片段、linker基因片段、aiiA基因片段、Spec抗生素片段和cotG DS片段组成，所述cotG DS片段为cotG基因下游0.8-1.2Kb序列。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，
扩增所述cotG基因片段的引物对如SEQ ID NO.4-5所示；
扩增所述linker基因片段的引物对如SEQ ID NO.8-9所示；
扩增所述aiiA基因片段的引物对如SEQ ID NO.2-3所示；
扩增所述Spec抗生素片段的引物对如SEQ ID NO.10-11所示；
扩增所述cotG DS片段的引物对如SEQ ID NO.6-7所示。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，
所述SEQ ID NO.2的前25bp为cotG基因片段末端同源序列；
所述SEQ ID NO.3的前21bp为Spec抗生素片段首端同源序列；
所述SEQ ID NO.6的前18bp为Spec抗生素片段末端同源序列。
6.一种枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌由权利要求3-5任一项所述构建方法构建得到，所述枯草芽孢杆菌的芽孢在芽孢外壳表面表达AiiA蛋白。
7.权利要求1-2任一项所述的芽孢或权利要求6所述的枯草芽孢杆菌在制备群体感应抑制剂中的应用。
8.一种群体感应抑制剂，其特征在于，含有权利要求1-2任一项所述的芽孢或权利要求6所述的枯草芽孢杆菌。
9.权利要求1-2任一项所述的芽孢或权利要求6所述的枯草芽孢杆菌或权利要求8所述的群体感应抑制剂在制备生物肥料中的应用。
10.权利要求1-2任一项所述的芽孢或权利要求6所述的枯草芽孢杆菌或权利要求8所述的群体感应抑制剂在制备生物防治剂中的应用。
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