CN109628478A - 稳定表达cd63-gfp的pk-15细胞株及其构建和应用 - Google Patents

稳定表达cd63-gfp的pk-15细胞株及其构建和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及稳定表达CD63‑GFP的PK‑15细胞株及其构建和应用，所述细胞株的保藏编号为：CCTCC NO:C2018253。构建方法包括以下步骤：目的基因合成、目的基因和慢病毒载体双酶切、重组质粒构建和鉴定、转染293T细胞、感染PK‑15细胞、细胞株筛选验证。采用本发明方法构建的稳定表达CD63‑GFP的PK‑15细胞株可用于细胞内、外的外泌体含量评估。利用本发明构建的稳定表达CD63‑GFP融合蛋白的PK‑15细胞株，可用荧光观察绿色荧光蛋白或通过流式细胞仪方便地评估外泌体的分泌量。该细胞株的建立为研究外泌体在病毒感染PK‑15细胞时的应用提供了可靠材料。

Description

稳定表达CD63-GFP的PK-15细胞株及其构建和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及稳定表达CD63-GFP的PK-15细胞株及其构建和应用。
背景技术
外泌体是细胞内生成并分泌到胞外的一类直径30～150nm的双层膜囊泡，其主要成分为蛋白质、脂质、核苷酸。外泌体最初被认为是从细胞中排泄细胞废物的载体，但是，越来越多的证据支持外泌体通过转运核酸、脂质和蛋白质等多种物质，影响受体细胞的命运，在细胞间通讯中起作用。2007年首次研究发现外泌体可作为细胞间信息交流的信使，后续研究发现外泌体在宿主免疫应答、病原感染以及肿瘤的发生发展中扮演重要角色。外泌体携带病原体相关成分促进病原体的传播，或者诱发机体天然免疫或适应性免疫反应。
评价外泌体含量的方法主要有WB、ELISA检测外泌体标志蛋白，纳米粒径计数，流式计数，ACHE活性检测，检测总蛋白量。上述方法均需要先将外泌体分离、浓缩、纯化，中间步骤繁琐，增加了实验结果的不确定性。
目前大量研究集中于外泌体的分离鉴定方法以及功能研究，但病毒感染过程中，外泌体可以携带病毒基因组、蛋白或相关核酸，免受中和抗体干扰和受体限制，进入细胞发挥作用。但很少有研究报道病毒感染对外泌体分泌量的影响。并且，外泌体大小差不多涵盖了病毒本身的大小，加上很多病毒是裂解性复制，很难鉴定外泌体是由细胞分泌还是由细胞裂解产生，对外泌体的分离纯化造成极大干扰。
关于外泌体的定量方法目前没有金标准，外泌体精确定量是研究外泌体生物功能的基础，简单、快捷的外泌体定量方法，将有利于外泌体的研究和应用。因此如何直观、精确评估外泌体分泌量显得尤为重要。CD63被称为溶酶体相关膜蛋白3，是跨膜蛋白，其大量存在于晚期内体或多泡小体中，参与膜组织和与病毒相互作用是外泌体的一个标志蛋白。
中国发明专利(CN105671082A)公开了“一种表达外泌体标记物的慢病毒载体及其构建方法和应用”，其是在pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro的多克隆位点XbaI和NotI区域分别引入带SBP标签的CD63和CD9基因，同时在引入的CD63和CD9基因后面添加荧光能力极强的绿色荧光蛋白基因ZsGreen1，构建pCDH-CMV-CD63-SBP-ZsGreen1-EF1-Puro和pCDH-CMV-CD9-SBP-ZsGreen1-EF1-Puro重组慢病毒载体；并公开了该慢病毒载体在细胞系构建以及CD63和CD9外泌体SBP亲和纯化上的应用，但并没有应用于外泌体的定量分析。
傅煜轩构建了能够稳定表达CD63-荧光素酶融合蛋白的Hela和HT-29细胞系用来检测病毒感染细胞后的外泌体分泌情况，与WB和纳米粒径计数方法结果一致(傅煜轩.外泌体介导的miR-146a通过抑制Ⅰ型干扰素产生进而促进肠道病毒71型复制[D]；南京大学,2018.)，该文章建立的是Hela和HT-29细胞系，未涉及到PK-15细胞系；另外该文章中与CD63融合表达的是荧光素酶，荧光素酶必须使用特定仪器检测，无法直接观察。
发明内容
本发明目的在于提供稳定表达CD63-GFP的PK-15细胞株及其构建和应用。该细胞株可用于评估细胞外泌体的分泌量。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
稳定表达CD63-GFP的PK-15细胞株的构建方法，包括以下步骤：
步骤1：合成两端分别为限制性内切酶1识别位点和限制性内切酶2识别位点的猪源CD63基因，得目的基因；
步骤2：使用限制性内切酶1和限制性内切酶2双酶切步骤1合成的目的基因和Lv-pLVX慢病毒载体，所述Lv-pLVX慢病毒载体为pLVX-AcGFP1-N1；
步骤3：将步骤2酶切后的目的基因和慢病毒载体连接，构建重组质粒Lv-CD63；通过双酶切和测序进行重组质粒鉴定；
步骤4：将Lv-CD63慢病毒载体转染293T细胞，培养48h后收集病毒上清，过滤、保存备用；
步骤5：将步骤4得到的慢病毒Lv-CD63感染PK-15细胞，8h后终止，48h后使用间接免疫荧光显微镜判断病毒感染情况，感染成功的为细胞株PK-15-CD63-GFP；
步骤6：利用含有3μg/ml嘌呤霉素的DMEM培养基对步骤5得到的细胞株PK-15-CD63-GFP进行培养，48小时后更换培养基并传代，继续培养得到的细胞株即为阳性PK-15-CD63-GFP细胞株。
进一步地，上述方法还包括利用qRT-PCR方法对步骤6所得的阳性PK-15-CD63-GFP细胞株中CD63表达量进行验证。
进一步地，所述限制性内切酶1和限制性内切酶2分别为EcoR I和BamH I。
进一步地，步骤5中判断病毒感染情况具体为，当PK-15细胞有绿色荧光信号时表明包装后的慢病毒Lv-CD63成功感染了PK-15细胞。
本发明还将Lv-pLVX慢病毒载体直接感染PK-15细胞，构建了LVX-PK-15细胞株；并利用qRT-PCR验证了LVX-PK-15、PK-15-CD63-GFP细胞株中CD63的表达量，结果显示PK-15-CD63-GFP细胞株中CD63表达量远高于对照细胞株LVX-PK-15。然后利用核酸电泳技术对qRT-PCR的产物进行检测，结果显示：对于CD63基因，PK-15-CD63-GFP细胞株的qRT-PCR扩增产物的条带与LVX-PK-15细胞株的相比，差异显著；对于β-actin基因，两个细胞株的qRT-PCR扩增产物的条带基本相当。这表明通过以上步骤筛选到了表达CD63-GFP的PK-15细胞株，且CD63在该细胞株中能够高效、稳定表达。
因此利用上述的构建方法可以构建稳定表达CD63-GFP的PK-15细胞株，该细胞株在本发明的保护范围内。本发明构建的稳定表达CD63-GFP的PK-15细胞株的保藏编号为：CCTCC NO:C2018253，命名：PK-15-CD63-GFP。
本发明还进行了外泌体抑制剂作用下的胞外外泌体western blotting(WB)验证和荧光验证，western blotting验证结果表明，细胞株中GW4869的加入抑制了外泌体向细胞外的分泌。荧光观察并分析外泌体抑制剂对胞内、外泌体分泌的影响发现，细胞株中加入GW4869后，外泌体的分泌也减少。
对于外泌体抑制剂作用下的胞内、外泌体分泌情况，荧光检测和WB检测结果一致，这表明可以用荧光点的多少来判断外泌体量的多少，因此稳定表达CD63-GFP的PK-15细胞株PK-15-CD63-GFP能够用来进行外泌体含量的评估。利用上述的构建方法构建的稳定表达CD63-GFP的PK-15细胞株在细胞内、外外泌体含量评估中的应用，也在本发明的保护范围内。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1、本发明利用慢病毒系统构建了稳定表达CD63-GFP融合蛋白的PK-15细胞株，让外泌体标志性蛋白CD63带上了绿色荧光标签，可以更加方便、快捷且准确的评估外泌体含量。该细胞株的建立为研究外泌体在病毒感染PK-15细胞中的应用提供了可靠材料。
2、本发明构建的带有GFP标签的稳定表达CD63-GFP的PK-15细胞株，利用荧光观察绿色荧光蛋白或者通过流式细胞仪均能方便地评估外泌体的分泌量，不必借助特定仪器进行检测。
附图说明
图1为间接免疫荧光显微镜观察慢病毒Lv-pLVX、Lv-CD63感染PK-15细胞的情况，图中pLVX表示慢病毒Lv-pLVX，CD63表示慢病毒Lv-CD63。
图2为LVX-PK-15和PK-15-CD63-GFP细胞株中CD63的mRNA相对表达含量比较图，图中plvx-PK15表示LVX-PK-15细胞株，CD63-PK15表示PK-15-CD63-GFP细胞株。
图3为WB检测在外泌体抑制剂介导下的外泌体分泌量，图中CD63-PK-15+DMSO表示加了DMSO的PK-15-CD63-GFP细胞组，CD63-PK-15+GW4869表示加了GW4869的PK-15-CD63-GFP细胞组，PK-15+DMSO表示加了DMSO的LVX-PK-15细胞组，PK-15+GW4869表示加了GW4869的LVX-PK-15细胞组。
图4为在外泌体抑制剂的作用下细胞和外泌体荧光检测情况图。
保藏信息：
保藏时间：2018年12月2日；
保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；
保藏编号：CCTCC NO:C2018253；
保藏单位地址：中国武汉武汉大学；
分类命名：PK-15-CD63-GFP。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限定本发明的保护范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例中所用材料来源：293T细胞、pLVX-AcGFP1-N1(Lv-pLVX)慢病毒载体保存于中国农业科学院兰州兽医研究所；PK-15细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会昆明细胞库；EcoR I和BamH I限制性内切酶、T4DNA连接酶等均购自TaKaRa公司；大肠杆菌DH5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；Lipfectamine3000转染试剂购自Invitrogen公司；GW4869、polybrene购自SIGMA-ALDRICH公司。DAPI购自碧云天。ALix一抗购自Cell Signaling Technology，二抗购自武汉三鹰。
实施例1慢病毒载体的构建及病毒包装具体包括以下内容：
(1)参考Genebank中公开的猪源CD63基因(XM_005663878.2)，设计两端分别添加有限制性内切酶EcoR I和BamH I识别位点的猪源CD63基因，并由南京晶白生物合成。本发明中所用猪源CD63基因序列与Genebank中登录号为XM_013980209.2的序列一致。
(2)使用EcoR I和BamH I分别双酶切步骤(1)中合成的目的基因和pLVX-AcGFP1-N1(Lv-pLVX)慢病毒载体。
(3)将目的基因和酶切后的质粒载体使用T4DNA连接酶连接，构建重组质粒并命名为Lv-CD63；通过双酶切和测序进行重组质粒鉴定。
(4)将293T细胞接种于10cm平皿(平皿中的培养液为含有10％胎牛血清的DMEM培养液)中，待细胞长至80％左右，在Lipfectamine3000转染试剂介导下将Lv-pLVX、Lv-CD63两个质粒分别转染293T细胞，转染过程参照Lipfectamine3000转染试剂盒说明书；培养48h后收集病毒上清，利用0.45μm滤器过滤、保存备用。
实施例2稳定表达CD63-GFP的PK-15细胞株的筛选及鉴定具体包括以下内容：
慢病毒感染PK-15细胞：
将通过实施例1得到的慢病毒Lv-pLVX、Lv-CD63分别感染6孔板PK-15细胞，感染体系中病毒体积为200μl，病毒数量约2×107，感染时6孔板中PK-15细胞约80％，用完全培养基将感染体系补足至2ml，在感染体系中加入2μL转染增强剂polybrene，8h后终止。
间接免疫荧光显微镜观察病毒感染情况：
48h后使用间接免疫荧光显微镜观察，如图1所示，构建的两个细胞株均有较强的绿色荧光信号，这表明包装后的慢病毒Lv-pLVX、Lv-CD63成功感染了PK-15细胞，两组细胞分别记为LVX-PK-15和PK-15-CD63-GFP。
LVX-PK-15、PK-15-CD63-GFP细胞株的筛选：
利用含有3μg/ml嘌呤霉素的DMEM培养基对上述得到的两个细胞株LVX-PK-15和PK-15-CD63-GFP进行培养，48小时后更换培养基并传代，继续培养。培养2代后得到的细胞株即为阳性LVX-PK-15、PK-15-CD63-GFP细胞株。
通过上述嘌呤霉素抗性筛选培养，最终获得稳定表达CD63-GFP的PK-15细胞株。
验证LVX-PK-15、PK-15-CD63-GFP细胞株中CD63的表达量：
(1)合成猪源CD63基因和β-actin基因的定量扩增引物，引物序列见表1。
(2)Trizol提取两个阳性LVX-PK-15、PK-15-CD63-GFP细胞株的RNA，并测定RNA的浓度。
(3)按500ng RNA逆转录成10μl体系cDNA的标准进行逆转录，将逆转录成功的cDNA作为模板，以步骤1合成的引物作为扩增引物进行qRT-PCR检测。反应体系为：Green Master Mix 10μl，灭菌ddH2O 7.2μl，Primer1(10μM)0.4μl，Primer2(10μM)0.4μl，模板cDNA 2μl。扩增程序为：95℃5min；95℃10s，60℃30s，40个循环；95℃15s，60℃60s，95℃15s。qRT-PCR结果显示PK-15-CD63-GFP细胞株中CD63表达量约为对照细胞株LVX-PK-15的70倍，如图2所示。
(4)qRT-PCR实验结束后，利用核酸电泳技术对qRT-PCR的产物进行检测，结果显示：对于CD63基因，PK-15-CD63-GFP细胞株的qRT-PCR扩增产物的条带与LVX-PK-15细胞株的相比，差异显著；对于β-actin基因，两个细胞株的qRT-PCR扩增产物的条带基本相当。
qRT-PCR检测和电泳结果说明：通过以上步骤筛选到了表达CD63-GFP的PK-15细胞株，且CD63在该细胞株中能够高效、稳定表达。
表1猪源CD63和β-actin定量引物序列信息
引物名称 引物序列(5'-3') 序列编号
CD63-pig-F-4 GCTGTCACCCAAGCGAGTC SEQ ID NO:1
CD63-pig-R-4 AGGCAGCAAGCAAAGACAAT SEQ ID NO:2
β-actin-pig-F TCCCTGGAGAAGAGCTACGA SEQ ID NO:3
β-actin-pig-R CGCACTTCATGATCGAGTTG SEQ ID NO:4
实施例3外泌体抑制剂作用下的胞外外泌体western blotting验证
将LVX-PK-15和PK-15-CD63-GFP细胞分别培养于含有DMEM培养液(培养液中含有10％胎牛血清)的平皿中，在细胞长至约80％时加入10μM GW4869，同时在对照组中加入等量DMSO。36h后取细胞上清。细胞上清经过差速离心、超速离心，PBS重悬沉淀，变性样品后用于western blotting验证。western blotting验证步骤如下：配制10％聚丙烯酰胺凝胶蛋白胶；取适量的蛋白样品上样，同时加入蛋白预染marker作为分子量指示；电压80V直至电泳结束；电泳结束后，200mA，转膜2h；转膜结束后，5％脱脂奶粉封闭1h，之后4℃孵育一抗(Alix)过夜，室温孵育HRP标记二抗2h；用高分辨率图像采集系统进行ECL显影并分析结果。
如图3所示，加DMSO的PK-15-CD63-GFP细胞组(CD63-PK-15+DMSO)中外泌体分泌量明显大于加GW4869的PK-15-CD63-GFP细胞组(CD63-PK-15+GW4869)；加DMSO的LVX-PK-15细胞组(PK-15+DMSO)的外泌体分泌量明显大于加GW4869的LVX-PK-15细胞组(PK-15+GW4869)，这表明，GW4869的加入抑制了外泌体向细胞外的分泌。
另外，加DMSO的PK-15-CD63-GFP细胞组远大于加DMSO的LVX-PK-15细胞组；加GW4869的PK-15-CD63-GFP细胞组远大于加GW4869的LVX-PK-15细胞组，这进一步说明构建的PK-15-CD63-GFP细胞株能稳定高表达CD63基因，产生更多外泌体。
实施例4外泌体抑制剂作用下的胞内外泌体荧光验证
将LVX-PK-15和PK-15-CD63-GFP细胞分别培养于含有DMEM培养液(培养液中含有10％胎牛血清)的平皿中，在细胞长至约80％时加入10μM GW4869，同样设置等量DMSO作为对照，36h后吸去上清，4％多聚甲醛固定过夜，DAPI染色5min，荧光观察并分析外泌体抑制剂对胞内外泌体分泌的影响。
结果显示，不论是LVX-PK-15还是PK-15-CD63-GFP细胞，加入GW4869后的胞内绿色荧光点比加入DMSO的更多，加入GW4869和加入DMSO的蓝色荧光点的数量相当，如图4所示。这说明加入GW4869后，外泌体的分泌减少。
实施例5PK-15-CD63-GFP细胞株的应用
实施例3和实施例4的结果显示，对于外泌体抑制剂作用下的胞内、外泌体分泌情况，荧光检测和WB检测结果一致，这表明可以用荧光点的多少来判断外泌体量的多少，即稳定表达CD63-GFP的PK-15细胞株PK-15-CD63-GFP能够用来进行外泌体相对含量的评估。
以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理及工艺条件所做的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> 稳定表达CD63-GFP的PK-15细胞株及其构建和应用
<130> 无
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 1
gctgtcaccc aagcgagtc 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 2
aggcagcaag caaagacaat 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 3
tccctggaga agagctacga 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 4
cgcacttcat gatcgagttg 20

Claims (6)

1.稳定表达CD63-GFP的PK-15细胞株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：合成两端分别为限制性内切酶1识别位点和限制性内切酶2识别位点的猪源CD63基因，得目的基因；
步骤2：使用限制性内切酶1和限制性内切酶2双酶切步骤1合成的目的基因和Lv-pLVX慢病毒载体，所述Lv-pLVX慢病毒载体为pLVX-AcGFP1-N1；
步骤3：将步骤2酶切后的目的基因和慢病毒载体连接，构建重组质粒Lv-CD63；通过双酶切和测序进行重组质粒鉴定；
步骤4：将Lv-CD63慢病毒载体转染293T细胞，培养48 h后收集病毒上清，过滤、保存备用；
步骤5：将步骤4得到的慢病毒Lv-CD63感染PK-15细胞，8h后终止，48h后使用间接免疫荧光显微镜判断病毒感染情况，感染成功的为细胞株LVX-CD63-PK-15；
步骤6：利用含有3μg/ml嘌呤霉素的DMEM培养基对步骤5得到的细胞株LVX-CD63-PK-15进行培养，48小时后更换培养基并传代，继续培养得到的细胞株即为阳性LVX-CD63-PK-15细胞株。
2.根据权利要求1所述的稳定表达CD63-GFP的PK-15细胞株的构建方法，其特征在于，所述构建方法还包括利用qRT-PCR方法对步骤6所得的阳性LVX-CD63-PK-15细胞株中CD63表达量进行验证。
3.根据权利要求1所述的稳定表达CD63-GFP的PK-15细胞株的构建方法，其特征在于，所述限制性内切酶1和限制性内切酶2分别为EcoR I和BamH I。
4.根据权利要求1所述的稳定表达CD63-GFP的PK-15细胞株的构建方法，其特征在于，步骤5中判断病毒感染情况具体为，当PK-15细胞有绿色荧光信号时表明包装后的慢病毒Lv-CD63成功感染了PK-15细胞。
5.一种利用权利要求1所述的构建方法构建的稳定表达CD63-GFP的PK-15细胞株，其特征在于，该细胞株的保藏编号为：CCTCC NO:C2018253。
6.利用权利要求1所述的构建方法构建的稳定表达CD63-GFP的PK-15细胞株在细胞内、外的外泌体含量评估中的应用。
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