CN102127529B - 一种在枯草芽孢杆菌中以整合型的方式重组表达β-淀粉酶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种在枯草芽孢杆菌中以整合型的方式重组表达β-淀粉酶的方法。具体是将β-淀粉酶表达元件整合到枯草芽孢杆菌染色体中构建整合型重组枯草芽孢杆菌，以此重组枯草芽孢杆菌为菌种，在营养培养基中发酵生产β-淀粉酶。本发明的优点是：本发明利用食品安全的表达系统表达生产β-淀粉酶，整合型表达的菌株所含的外源基因能够稳定传代和表达，产品达到食品要求，产品无抗菌活性。

Description

一种在枯草芽孢杆菌中以整合型的方式重组表达β-淀粉酶的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体是一种在枯草芽孢杆菌中以整合型的方式重组表达β-淀粉酶的方法。

背景技术

β-淀粉酶(EC3.2.1.2)又称淀粉1，4-麦芽糖苷酶，作用于淀粉和糖原时可切断非还原性末端的α-1，4糖苷键，分解得到麦芽糖。β-淀粉酶主要用于代替部分麦芽生产啤酒，或用于生产啤酒发酵用淀粉糖浆，以及用于生产高麦芽糖浆、超高麦芽糖浆、结晶麦芽糖、医用针剂麦芽糖、麦芽糖醇等。

β-淀粉酶可从植物和微生物中制取获得。目前商品化的β-淀粉酶主要是从植物中制取。植物来源的β-淀粉酶多从一些高等植物如大麦、小麦、黑麦、大豆的种子和甘薯的块茎中提取。从大麦中提取β-淀粉酶的主要缺点是需要耗费大量的粮食，因此通过微生物发酵生产β-淀粉酶是另一种较好的选择。一种微生物发酵生产β-淀粉酶的方法是利用本身能够分泌β-淀粉酶的细菌如芽孢杆菌属的Bacillus megaterium，Bacillus polymyxa，Bacillus cereus等发酵产生β-淀粉酶，并通过物理、化学诱变提高菌株产酶活力和酶的热稳定性，通过优化菌种的发酵条件来提高酶产量。然而这种方法随机性大，不容易获得既高产又能产酶学性质优异的β-淀粉酶的菌株。另一种微生物发酵生产β-淀粉酶的方法则是通过基因工程的方法将不同来源的β-淀粉酶克隆到表达宿主构建重组菌进行生产。王银定等从诺卡氏菌Nocarida sp.中选育高产菌株，周蓓芸、王峥等和高温放线菌Thermoactinomyces sp.中选育高产菌株，并克隆到大肠杆菌中表达β-淀粉酶，得到最适温度60℃，产酶活力1000U/ml的结果。但大肠杆菌表达系统存在一些缺陷，如含有内毒素、肠毒素、难以分泌表达，产物需要破胞提取等，而且为了保持质粒的稳定性，在生产过程中一般需要使用抗生素。为了避免重组微生物发酵过程中残留的抗生素类物质对于食品安全的影响，国际上对微生物来源的酶制剂的抗菌活性有严格限制，JECFA(Joint FAO/WHOExpert Committee on Food Additives，联合国粮农组织和世界卫生组织下的食品添加剂联合专家委员会)和AOAC(Association of Analytical Communities，美国官方分析化学师协会)等国际组织将抗菌活性列为食品用酶制剂的重要检验要求，这对酶制剂生产企业提出了更高的要求。

枯草芽孢杆菌有长期制备发酵食品的历史，是非致病的，不产内毒素和致热致敏蛋白质，是一种食品安全的菌种。另外，枯草芽孢杆菌表达系统还具有以下优点：1具有很强的蛋白质分泌功能，不需要破碎细胞来提取蛋白质，只需要较简单地处理发酵上清液即可得到较纯的目标蛋白质；2没有明显的密码子偏爱性，同时表达产物也不容易形成包函体；3发酵条件简单；因此，开发利用枯草芽孢杆菌表达系统生产食品添加剂具有深远的意义和广阔和市场前景。根据所采用载体类型不同，枯草芽孢杆菌表达模式可分为可复制质粒表达和染色体整合表达。染色体整合表达是使用枯草芽孢杆菌整合质粒，将外源基因整合到枯草芽孢杆菌染色体中，外源基因随染色体的复制而复制和表达，这样外源基因在宿主中可保持较好的稳定性。

发明内容

本发明的目的是提供一种在枯草芽孢杆菌中以整合型的方式重组表达β-淀粉酶的方法。利用整合质粒将β-淀粉酶表达元件整合到枯草芽孢杆菌染色体基因组中，构建整合型重组枯草芽孢杆菌，利用该菌在液体培养基中进行发酵，得到β-淀粉酶。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

1.一种在枯草芽孢杆菌中以整合型的方式重组表达β-淀粉酶的方法，该方法的步骤为：将β-淀粉酶表达元件克隆到枯草芽孢杆菌整合质粒上，得到的重组质粒转化宿主枯草芽孢杆菌，挑选外源基因通过双交换整合到枯草芽孢杆菌染色体中的重组枯草芽孢杆菌，用重组枯草芽孢杆菌在液体营养培养基中表达β-淀粉酶。

上述的β-淀粉酶表达元件，包含如下组分：能够在枯草芽孢杆菌中高效启动基因表达的启动子，能在枯草芽孢杆菌中高效分泌表达蛋白的信号肽DNA片断和β-淀粉酶基因。

能够在枯草芽孢杆菌中高效启动基因表达的启动子，可以是来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)重叠启动子P43，或来源于地衣芽孢杆菌(Baclicuslincheniformis)麦芽糖淀粉酶基因amyM的启动子。

能在枯草芽孢杆菌中高效分泌表达蛋白的信号肽DNA片断，可以是来源于高温产硫化氢梭状芽孢杆菌(Clostridium thermosulfurogenes)的β-淀粉酶基因信号肽DNA片断，或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AmyX基因信号肽DNA片断，或枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因SacB信号肽DNA片断。

β-淀粉酶基因，可以是来源于高温产硫化氢梭状芽孢杆菌(Clostridiumthermosulfurogenes)的β-淀粉酶基因，或来源于大麦(Hordeum vulgare)的β-淀粉酶基因。

枯草芽孢杆菌整合质粒能够将外源基因整合到枯草芽孢杆菌染色体中。美国俄亥俄州立大学Bacillus遗传保藏中心(BGSC，http://www.bgsc.org)收藏了大量的枯草芽孢杆菌整合质粒。这些质粒大部分可以用于本发明。其中一个优选特例是整合质粒pMLK83。该质粒有两段与枯草芽孢杆菌淀粉酶基因同源的DNA序列(同源臂)，在这两段同源臂中有新霉素抗性基因。质粒转化到枯草芽孢杆菌时，通过新霉素抗性选择，只有整合到枯草芽孢杆菌染色体中的重组菌才能生长，从而筛选出重组子。

方法中所述的宿主枯草芽孢杆菌，最常用的是枯草芽孢杆菌168衍生菌株，例如1A751，WB600，或WB800。

2.一种以整合型重组枯草芽孢杆菌为菌种生产β-淀粉酶的方法，是以整合型重组枯草芽孢杆菌为菌种在营养培养基中发酵生产β-淀粉酶。

所述的营养培养基是常规的发酵生产方法采用的营养培养基，例如包含1～50g/L胰化蛋白胨，1～50g/L酵母提取物，5～20g/L NaCl的液体培养基，或相同蛋白质含量的水解酪蛋白代替胰化蛋白胨的液体培养基。

发酵生产方法，是常规的发酵生产方法，包括接种、培养、分离、浓缩和包装等步骤。

本发明首次将β-淀粉酶表达元件整合到枯草芽孢杆菌染色体中，以该菌作为菌种，常规的生产工艺，发酵生产β-淀粉酶。

本发明的优点是：本发明利用食品安全的表达系统生产β-淀粉酶，整合型表达的菌株所含的外源基因能够稳定传代和表达，产品达到食品要求，产品无抗菌活性。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述。但需要说明的是，实施例并不构成对本发明要求保护范围的限制。

实施例1

本实例将包含来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)重叠启动子P43启动子，来源于短芽孢杆菌(Bacillus brevis)的a-乙酰乳酸脱羧酶基因信号肽DNA片断和来源于高温产硫化氢梭状芽孢杆菌(Clostridium thermosulfurogenes)的β-淀粉酶基因单顺反子的β-淀粉酶表达元件克隆到整合质粒pMLK83，然后转化宿主菌WB600构建整合型重组枯草芽孢杆菌，最终在LB液体培养基中发酵生产β-淀粉酶。

1.构建重组质粒pMLK83-P43

根据Genbank中注释的启动子P43序列，设计上游引物为5’attgctggacgcttatggac 3’和下游引物为5’cgggatccattcctctcttacctataat 3’。PCR反应体系100ul：DNA模板(枯草芽孢杆菌1A751总DNA)1ul(约20ng)，5×PrimeSTAR Buffer 20ul，10pmol/ul dNTP 2ul，10pmol/ul正反向引物各为2ul，2.5U/ul PrimeSTAR HS DNA聚合酶1ul，添加ddH₂O至100ul。PCR反应程序：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min；4℃保存。PCR片段和质粒pMLK83用限制性内切酶BamH I、Hind III分别进行双酶切后用T4连接酶进行连接，转化到大肠杆菌DH5α中，经筛选鉴定获得重组质粒pMLK83-P43。

2.构建重组质粒pMLK83-P43-CTBA

以全基因合成的方式合成如下DNA片断：

 1  GGATCCATGA AAAAAAATAT CATCACTTCT ATCACATCTC TGGCTCTGGT

 51 TGCCGGGCTG TCTTTGACTG CTTTTGCAGC TACAACGGCT AGCATAGCAC

101 CAAATTTCAA AGTTTTTGTA ATGGGTCCAT TAGAAAAAGT CACAGATTTT

151 AATGCATTCA AAGATCAATT GATAACTTTA AAGAATAATG GTGTTTATGG

201 TATAACAACA GATATTTGGT GGGGCTATGT TGAAAATGCA GGTGAAAATC

251 AATTTGACTG GAGTTATTAT AAGACATATG CTGATACCGT ACGCGCTGCG

301 GGATTGAAGT GGGTTCCAAT AATGTCAACG CATGCCTGTG GAGGTAATGT

351 TGGTGATACA GTAAATATAC CTATTCCGTC ATGGGTATGG ACAAAAGATA

401 CCCAAGATAA TATGCAGTAT AAGGATGAAG CCGGAAATTG GGATAATGAA

451 GCAGTAAGTC CATGGTATTC TGGCTTAACC CAACTCTATA ATGAATTTTA

501 TTCATCTTTT GCATCAAATT TTAGCAGCTA TAAAGATATA ATTACTAAAA

551 TATATATATC TGGAGGCCCT TCTGGAGAAT TAAGATATCC TTCATATAAT

 601 CCTTCGCATG GATGGACATA TCCTGGACGT GGCTCGCTGC AGTGCTATAG

 651 TAAAGCGGCT ATAACAAGTT TTCAAAATGC TATGAAGTCT AAATATGGAA

 701 CTATAGCAGC AGTTAATAGT GCATGGGGTA CAAGCCTAAC TGATTTTTCT

 751 CAAATTAGTC CACCTACAGA TGGTGATAAT TTCTTTACAA ATGGTTATAA

 801 AACTACTTAT GGTAATGACT TTTTGACATG GTATCAAAGT GTTTTGACTA

 851 ATGAGTTAGC CAATATTGCT TCTGTAGCTC ATAGCTGCTT TGATCCAGTA

 901 TTTAATGTTC CAATAGGAGC AAAAATAGCT GGAGTGCATT GGCTATATAA

 951 TAGTCCGACA ATGCCACATG CTGCAGAATA TTGTGCCGGT TATTATAATT

1001 ATAGCACGCT ACTCGATCAA TTTAAGGCAT CTAATCTTGC TATGACATTT

1051 ACATGTCTTG AAATGGATGA TTCTAATGCA TATGTAAGTC CATATTATTC

1101 TGCACCTATG ACGTTAGTCC ATTATGTAGC TAATCTTGCT AATAATAAAG

1151 GTATAGTCCA CAATGGAGAA AATGCTTTGG CTATATCCAA CAACAATCAA

1201 GCTTATGTGA ATTGTGCAAA TGAATTAACA GGATATAATT TTTCTGGATT

1251 TACACTTTTA AGACTTTCGA ATATTGTAAA TAGTGATGGA TCTGTGACAT

1301 CAGAGATGGC TCCTTTTGTA ATTAATATAG TTACACTAAC GCCTAACGGT

1351 ACGATACCAG TTACATTTAC AATAAACAAT GCGACAACTT ATTATGGACA

1401 AAATGTATAT ATTGTTGGTA GTACATCTGA TCTTGGAAAT TGGAATACAA

1451 CCTATGCCCG TGGTCCTGCA TCATGCCCTA ATTATCCTAC TTGGACAATA

1501 ACGCTTAATC TATTACCTGG TGAGCAGATA CAGTTTAAAG CTGTAAAAAT

1551 TGATAGTTCA GGAAATGTAA CTTGGGAAGG TGGCTCGAAT CATACTTATA

1601 CTGTGCCGAC ATCTGGGACT GGTAGTGTCA CCATTACATG GCAAAATTAA

1651 TCAATAAAAT GTTACACATA GAACAAATTG TAAACACTGG AATATATTCC

1701 GGTGTTTTTT TGTATATTAT GGGCGTTTAA TCCGCGG

将合成的DNA片段和质粒pMLK83-P43用限制性内切酶BamH I和Sac II进行双酶切后用T4连接酶进行连接，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经筛选鉴定获得重组质粒pMLK83-P43-CTBA。

3.整合型质粒pMLK83-P43-CTBA在枯草芽孢杆菌中的转化

取一满环枯草芽孢杆菌WB600甘油保藏菌种划LB平板，37℃培养箱培养过夜。转化前一天晚间挑单菌落至3ml LB培养基中，37℃，250rpm培养过夜，第二天上午取160μl培养液转接至8ml SPI培养基中(SPI培养基：SP盐加1％体积浓度为50％(W/V)葡萄糖溶液和1％(V/V)体积100×CAYE溶液；SP盐溶液：含1.96g/L(NH₂)₂SO₄，13.72g/L K₂HPO₄，5.88g/L KH₂PO₄，0.196g/L MgSO₄7H₂O(单独灭菌)和0.98g/L柠檬酸钠；100×CAYE溶液：含20g/L酪蛋白氨基酸和100g/L酵母抽提物。)，37℃，250rpm培养至对数生长末期(约4～5小时)；取0.2ml生长至对数末期的培养液至2ml SPII培养基中(SPII培养基：SPI培养基加入1％体积50mmol/L CaCl₂溶液，1％体积250mmol/L MgCl₂溶液)，37℃，100rpm培养90分钟；在上述SPII培养基的菌体中加入20ul 10mmol/L EGTA，再于37℃，100rpm培养10分钟；将上述处理后的菌液分装成0.5ml每管，加入5ul质粒pMLK83-P43-CTBA(50ng/ul)，再于37℃，250rpm培养90分钟，取菌液涂布新霉素(20ug/ml)LB平板。用PCR方法筛选α-淀粉酶缺失的转化子即得到枯草芽孢杆菌基因工程菌株WB600[CTBA]。筛选α-淀粉酶缺失转化子的PCR方法如下：

合成如下引物：aam1：5’ggtctgatcgatgggatgtc 3’；aam2：5’tcatcatcgctcatccatgt3’；w2p：5’actgacgattaccttgcg 3’；baci-p1：5’cttccaatcacccgctctt 3’.将转化子在LB培养基中过夜培养后，提取总DNA.然后分别用引物对aam1/aam2和w2p/baci-p1进行PCR.PCR反应条件分别如下：

aam1/aam2：PCR反应体系20ul：DNA模板(转化子总DNA)1ul(约20ng)，10×Taq Buffer 2ul，10pmol/ul dNTP 0.4ul，10pmol/ul正反向引物各为0.5ul，2.5U/ul Taq DNA聚合酶1ul，添加ddH₂O至20ul。PCR反应程序：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，30个循环；72℃10min；4℃保存；

w2p/baci-p1：PCR反应体系20ul：DNA模板(转化子总DNA)1ul(约20ng)，10×Taq Buffer 2ul，10pmol/ul dNTP 0.4ul，10pmol/ul正反向引物各为0.5ul，2.5U/ul Taq DNA聚合酶1ul，添加ddH₂O至20ul。PCR反应程序：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃70s，30个循环；72℃10min；4℃保存；

如果某一转化子用w2p/baci-p1引物对做PCR得到大约1.1kb的产物，而用aam1/aam2引物对做PCR得不到大约450bp的产物，则这个转化子是α-淀粉酶缺失的转化子。

4.β-淀粉酶的生产，操作步骤如下：

1)一级种的制备：从含新霉素20ug/ml的LB平板(LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl1g/L，平板加15g/LAgar)上接WB600[CTBA]单菌落在4ml LB液体培养基37℃、220rpm培养过夜，所得的菌种为一级种。

2)二级种的制备：一级种接种于800ml LB液体培养基，于37℃，220rpm培养至OD600为0.6左右(约4～5小时)。

3)三级种的制备：将二级种接种到80L LB液体发酵罐中，37℃，以柠檬酸、NaOH控pH 7.0左右，通风搅拌，溶氧控制在20～30％，培养至OD600为0.6左右(约5～6小时)。

4)生产罐发酵：将三级种接种到3T发酵罐中，LB液体培养基，36～38℃，通风搅拌，溶氧控制在20～30％，以柠檬酸、NaOH控pH 6～8，培养约26小时，10000g离心力离心除菌，用截留分子量5000～10000超滤膜浓缩上清液后，即得β-淀粉酶浓缩原液。

β-淀粉酶酶活的测定按如下方法进行：吸取9ml 10g/L淀粉溶液于70℃±0.5℃恒温水浴预热5min后，加入1.0mlβ-淀粉酶粗酶液混匀，置于70℃±0.5℃恒温水浴准确反应30min，置于冰水浴2min终止反应，混匀，吸取1.0ml溶液至10ml具塞试管，加入1.0ml DNS试剂(甲液：称取6.9g结晶酚溶于15.2ml 100g/L的NaOH溶液，用蒸馏水稀释至69ml，再加入6.9g亚硫酸氢钠。乙液：称取255g酒石酸钾钠溶于300ml 100g/L的NaOH溶液，再加入880ml 10g/L的3，5-二硝基水杨酸溶液。甲液和乙液混合得黄色试剂贮于棕色瓶内，室温下避光放置7天后作标准曲线)，置沸水浴中加热5min，流动水冷却至室温，用蒸馏水稀释至10ml，混匀，以空白对照调零，用分光光度计在540nm波长下进行比色，记录吸光度。空白对照由灭活后的样品溶液代替样品溶液。酶活定义为：1ml酶液在70℃、pH6.0条件下，1小时水解10g/L淀粉液生成1mg麦芽糖，即为1个酶活力单位，以U/ml表示。

经测定，发酵原液离心后，上清液的酶活为6000U/ml左右。

实施例2

本实例将包含来源于地衣芽孢杆菌(Baclicus lincheniformis)麦芽糖淀粉酶基因amyM的启动子，来源于短芽孢杆菌(Bacillus brevis)的α-乙酰乳酸脱羧酶基因信号肽DNA片断和来源于大麦(Hordeum vulgare)的β-淀粉酶基因的单顺反子的β-淀粉酶表达元件克隆到整合质粒pMLK83，然后转化宿主菌WB600构建整合型重组枯草芽孢杆菌，最终在LB液体培养基中发酵生产β-淀粉酶。

1.构建重组质粒pMLK83-amyM

根据Genbank中注释的启动子amyM序列，设计上游引物为5’cccaagcttctgtacacttgcgtcctcca 3’和下游引物为5’cgggatcctctcctcccctttcaatgtg 3’。PCR反应体系100ul：DNA模板(Baclicus licheniformis ATCC 14580总DNA)1ul(约20ng)，5×PrimeSTAR Buffer 20ul，10pmol/ul dNTP 2ul，10pmol/ul正反向引物各为2ul，2.5U/ul PrimeSTAR HS DNA聚合酶1ul，添加ddH₂O至100ul。PCR反应程序：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，30个循环；72℃10min；4℃保存。PCR片段和质粒pMLK83用限制性内切酶BamH I、Hind III分别进行双酶切后用T4连接酶进行连接，转化到大肠杆菌DH5α中，经筛选鉴定获得重组质粒pMLK83-amyM。

2.构建重组质粒pMLK83-amyM-BBA

以全基因合成的方式合成如下DNA片断：

 1 GGATCCATGA AAAAAAATAT CATCACTTCT ATCACATCTC TGGCTCTGGT

51 TGCCGGGCTG TCTTTGACTG CTTTTGCAGC TACAACGGCT GTGAAAGGCA

 101 ACTATGTCCA AGTCTACGTC ATGCTCCCTC TGGACGCCGT GAGCGTGAAC

 151 AACAGGTTCG AGAAGGGCGA CGAGCTGAGG GCGCAATTGA GGAAGCTGGT

 201 AGAGGCCGGT GTGGATGGTG TCATGGTAGA CGTCTGGTGG GGCTTGGTGG

 251 AGGGCAAGGG CCCCAAGGCG TATGACTGGT CCGCCTACAA GCAGTTGTTT

 301 GAGCTGGTGC AGAAGGCTGG GCTGAAGCTA CAGGCCATCA TGTCGTTCCA

 351 CCAGTGTGGT GGCAACGTCG GCGACGCCGT CAACATCCCA ATCCCACAGT

 401 GGGTGCGGGA CGTCGGCACG CGTGATCCCG ACATTTTCTA CACCGACGGT

 451 CACGGGACTA GGAACATTGA GTACCTCACT CTTGGAGTTG ATAACCAGCC

 501 TCTCTTCCAT GGAAGATCTG CCGTCCAGAT GTATGCCGAT TACATGACAA

 551 GCTTCAGGGA GAACATGAAA GACTTCTTGG ATGCTGGTGT TATCGTCGAC

 601 ATTGAAGTGG GACTTGGCCC AGCTGGAGAG ATGAGGTACC CATCATATCC

 651 TCAGAGCCAC GGATGGTCGT TCCCAGGCAT CGGAGAATTC ATCTGCTATG

 701 ATAAATACCT ACAAGCAGAC TTCAAAGCAG CAGCAGCGGC GGTCGGCCAT

 751 CCTGAGTGGG AATTTCCTAA CGATGCCGGA CAGTACAATG ACACTCCCGA

 801 GAGAACTCAA TTCTTCAGGG ACAACGGGAC ATACCTAAGT GAGAAGGGGA

 851 GGTTTTTCCT TGCATGGTAC TCCAACAATC TGATCAAGCA CGGTGACAGG

 901 ATCTTGGATG AAGCAAACAA GGTCTTCTTG GGATACAAGG TGCAATTGGC

 951 AATCAAGATC TCTGGCATTC ACTGGTGGTA CAAGGTTCCA AGCCATGCAG

1001 CCGAGCTCAC AGCTGGGTAC TATAACTTAC ATGATAGAGA CGGCTACAGA

1051 ACCATAGCAC GCATGCTCAA AAGGCACCGT GCTAGCATTA ACTTCACTTG

1101 CGCGGAGATG AGGGATTCGG AGCAAAGCTC GCAGGCGATG AGCGCACCAG

1151 AAGAACTAGT CCAACAGGTG TTGAGTGCTG GATGGAGAGA GGGCCTAAAT

1201 GTGGCATGCG AAAACGCGCT TCCACGATAT GATCCAACTG CTTACAACAC

1251 CATACTCAGG AATGCGAGGC CTCATGGAAT CAACCAGAGC GGCCCTCCTG

1301 AGCACAAGCT GTTTGGATTC ACCTACCTTC GGCTGTCGAA TCAGCTGGTG

1351 GAGGGACAAA ACTATGTCAA CTTCAAGACC TTTGTCGACA GAATGCATGC

1401 CAACCTGCCT CGTGACCCAT ATGTTGATCC AATGGCGCCT TTGCCAAGAT

1451 CAGGGCCAGA AATATCGATT GAGATGATCC TACAAGCAGC ACAGCCAAAA

1501 CTGCAGCCAT TCCCCTTCCA GGAGCACACC GACCTGCCAG TAGGCCCTAC

1551 TGGTGGCATG GGTGGGCAGG CTGAAGGCCC CACCTGTGGC ATGGGTGGGC

1601 AAGTTAAAGG CCCTACTGGT GGCATGGGTG GGCAGGCTGA AGACCCTACT

1651 AGTGGCATGG GTGGGGAGCT CCCTGCCACC ATGTAATCAA TAAAATGTTA

1701 CACATAGAAC AAATTGTAAA CACTGGAATA TATTCCGGTG TTTTTTTGTA

1751 TATTATGGGC GTTTAATCCG CGG

将合成的DNA片段和质粒pMLK83-P43用限制性内切酶BamH I和Sac II进行双酶切后用T4连接酶进行连接，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经筛选鉴定获得重组质粒pMLK83-amyM-BBA.

3.整合型质粒pMLK83-amyM-BBA在枯草芽孢杆菌中的转化以及用获得的重组菌株进行β-淀粉酶的生产同实施例1。此菌株发酵原液离心后，上清液的酶活为4500U/ml左右。

Claims (6)

1.一种在枯草芽孢杆菌中以整合型的方式重组表达β-淀粉酶的方法，其特征在于，该方法的步骤为：将β-淀粉酶表达元件克隆到枯草芽孢杆菌整合质粒上，得到的重组质粒转化宿主枯草芽孢杆菌，挑选外源基因通过双交换整合到枯草芽孢杆菌染色体中的重组枯草芽孢杆菌，用重组枯草芽孢杆菌在液体营养培养基中表达β-淀粉酶；

所述的β-淀粉酶表达元件包含如下组分：能够在枯草芽孢杆菌中高效启动基因表达的启动子，能在枯草芽孢杆菌中高效分泌表达蛋白的信号肽DNA片断和β-淀粉酶基因。

2.根据权利要求1所述一种在枯草芽孢杆菌中以整合型的方式重组表达β-淀粉酶的方法，其特征在于，所述的能够在枯草芽孢杆菌中高效启动基因表达的启动子为来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)重叠启动子P43，或来源于地衣芽孢杆菌(Bacillus lincheniformis)麦芽糖淀粉酶基因amyM的启动子。

3.根据权利要求1所述一种在枯草芽孢杆菌中以整合型的方式重组表达β-淀粉酶的方法，其特征在于，所述的能在枯草芽孢杆菌中高效分泌表达蛋白的信号肽DNA片断为来源于高温产硫化氢梭状芽孢杆菌(Clostridiumthermosulfurogenes)的β-淀粉酶基因信号肽DNA片断，或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AmyX基因信号肽DNA片断，或枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因SacB信号肽DNA片断。

4.根据权利要求1所述一种在枯草芽孢杆菌中以整合型的方式重组表达3-淀粉酶的方法，其特征在于，所述的β-淀粉酶基因为来源于高温产硫化氢梭状芽孢杆菌(Clostridium thermosulfurogenes)的β-淀粉酶基因，或来源于大麦(Hordeum vulgare)的β-淀粉酶基因。

5.根据权利要求1所述一种在枯草芽孢杆菌中以整合型的方式重组表达β-淀粉酶的方法，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌整合质粒为整合质粒pMLK83及其衍生质粒。

6.根据权利要求1所述一种在枯草芽孢杆菌中以整合型的方式重组表达β-淀粉酶的方法，其特征在于，所述的宿主枯草芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌168衍生菌株，包括1A751，WB600，或WB800。