CN110257375A - 一种表达系统及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种表达系统及其制备方法和应用，本申请扩增磷脂酶C基因、构建重组质粒pETB2‑O、构建转座整合质粒、转化大肠杆菌感受态细胞、诱导转座整合和重组菌表达的步骤，将重组质粒pETB2‑O中的磷脂酶C基因用于构建转座整合质粒，再将磷脂酶C基因整合到大肠杆菌的染色体上，从而获得重组大肠杆菌，重组大肠杆菌表达获得外源蛋白，该重组大肠杆菌不含有抗生素抗性基因，且遗传稳定性高，该方法应用于制备食品工业用酶上。

Description

一种表达系统及其制备方法和应用
【技术领域】
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种表达系统及其制备方法和应用。
【背景技术】
在食品和药品用活性蛋白质的生产中，采用基因工程技术对活性蛋白质基因进行异源表达已经被证明是提高产量和纯度的有效方法。目前，大肠杆菌作为常用的基因工程宿主菌，其生长繁殖迅速，培养简单，发酵成本较低，也没有复杂的蛋白酶系，重组蛋白较稳定，因而成为生产重组蛋白质的良好宿主。然而，大肠杆菌用于生产食品工业用酶仍存在一些缺陷，主要有：在重组大肠杆菌的高密度发酵中，表达质粒往往由于结构不稳定性和分离不稳定性而易于丢失。为了保持重组大肠杆菌表达质粒的遗传稳定性，往往需要施加选择压力，目前最常用的选择压力是添加抗生素。添加抗生素选择压力无疑会增加菌体的代谢负荷，增加生产成本，引起终产品中抗生素残留，引起抗性基因在环境中的扩散。对于食品和药物用重组蛋白质，产品中残留抗生素已逐渐被世界各国禁止。将外源基因整合到染色体上可采用同源重组和转座重组的方法，与同源重组法相比，转座重组不需要将抗生素抗性基因整合到大肠杆菌染色体，并且可以将含有抗性基因和转座酶的整合质粒驱除出宿主菌，得到遗传稳定的外源基因整合表达。
磷脂酶C(Phospholipase C，PLC)是作用于磷脂C3位点，水解磷脂生成甘油二酯和磷酸单脂的一种水解酶，根据水解底物的特异性，细菌来源的PLC可以分为磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)及磷脂酰胆碱偏爱性磷脂酶C(PC-PLC)。它在抗血小板新药研究、高血压等病理研究，以及食品添加剂、油脂精炼等方面都有应用，特别是在油脂酶法脱胶的应用具有广阔的前景。由于野生微生物菌株产PLC量较低，并大多数微生物来源的PLC都以毒素因子的形式存在于致病菌，导致PLC的工业应用受到限制。
因此，有必要提供一种简单、高效、安全的利用含有完整Tn7转座元件的整合重组载体系统的方法，构建食品安全的产磷脂酶C的重组大肠杆菌整合表达系统，用于生产食品工业用酶，从而促进磷脂酶C的发酵产业化及工业应用具有重要的学术和实践价值。
【发明内容】
鉴于上述内容，本发明提供一种表达系统及其制备方法和应用，通过构建携带磷脂酶C基因的重组质粒pETB2-O，再用于构建转座整合质粒pGRG36-T7lac-plc，从而将磷脂酶C基因整合到大肠杆菌的染色体上，进而获得不含有抗生素抗性基因，且遗传稳定的重组大肠杆菌，重组菌表达获得外源蛋白，该方法应用于制备食品工业用酶，实际应用价值大。
本发明提供用于从链霉菌中扩增磷脂酶C基因的引物对，所述引物对的上游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，所述引物对的下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。
一种包含所述磷脂酶C基因的载体。
一种包含所述磷脂酶C基因或所述载体的表达系统。
进一步的，所述表达系统为微生物：大肠杆菌。
进一步的，所述微生物可产磷脂酶C且不具备抗性。
一种制备所述微生物的方法，所述方法为：将磷脂酶C基因与含Tn7转座酶TnsABCD的Tn7转座质粒pGRG36结合，构建插入磷脂酶C外源蛋白基因的转座整合质粒
pGRG36-T7lac-plc；通过变温培养，将磷脂酶C基因导入大肠杆菌的染色体上，得到重组大肠杆菌。
进一步的，所述质粒pGRG36-T7lac-plc的制备方法为：以链霉菌DNA为模板，在磷脂酶C基因的引物对下，经PCR扩增反应获得磷脂酶C基因，再克隆到pET22b(+)上，获得重组质粒pETB2；以pETB2为模板，在ompA信号肽的引物对下，经PCR扩增获得ompA信号肽，ompA信号肽整合到pETB2上，获得重组质粒pETB2-O；pETB2-O和质粒pGRG3用于制备pETB2-O/DH5α和pGRG36/DH5α；提取pETB2-O DNA、pGRG36DNA，通过T4DNA连接酶将经单酶切、去磷酸化的pGRG36DNA与经双酶切和酶切粘性末端位点填平的pETB2-O DNA连接，获得转座整合质粒pGRG36-T7lac-plc。
进一步的，所述ompA信号肽的引物对的上游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO.3所示，所述引物对的下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示。
一种测试所述微生物为重组微生物的方法，方法为测定微生物在不含抗生素的LB液体培养基上磷脂酶C的总酶活力为75.4U/mL～83.0U/mL。
微生物在食品工业用酶的制备上的用途。
本发明的有益效果是：
1、本发明通过将来源于链霉菌的磷脂酶C基因用于重组质粒pETB2-O，质粒pGRG36和重组质粒pETB2-O分别转化变异的大肠杆菌DH5α制备获得pETB2-O/DH5α和pGRG36/DH5α，使磷脂酶C基因插入到后续的宿主细胞中不产生排异，使外源基因能存在于大肠杆菌中；而重组质粒pETB2-O上磷脂酶C基因整合位点与质粒pGRG36具有相同复制方向和相同位点，使磷脂酶C基因整合到质粒pGRG36的两个转座子Tn7左臂和右臂之间的多克隆位点上，获得磷脂酶C外源蛋白基因的转座整合质粒pGRG36-T7lac-plc；再通过与大肠杆菌表达宿主感受态细胞变温培养，使携带有转座酶的载体不再复制，可以将含有抗性基因和转座酶的整合质粒驱除出宿主菌，进而获得不含有抗生素抗性基因的重组大肠杆菌，在不含抗生素的液体培养基上培养，能表达出活性蛋白磷脂酶C的菌株，即为所需的转座整合表达磷脂酶C外源蛋白的重组大肠杆菌。
2、本申请构建的重组载体能将外源基因整合到含Tn7转座子的载体pGRG36上，构建的重组菌能将外源目的基因直接整合到宿主菌基因组大肠杆菌染色体上，不仅可以明显克服现有技术中表达质粒遗传不稳定性的这一局限，获得遗传稳定的重组大肠杆菌，而且不需要将抗生素抗性基因整合到大肠杆菌染色体，能减少抗生素对人类社会和环境的危害。
【附图说明】
图1是重组质粒pETB2-O中T7lac-Ba的片段图谱；
图2是质粒pGRG36的图谱；
图3是抗性质粒消除的对比图；
图4每代重组菌的发酵液总酶活力和菌体密度的折线图；
图5是重组大肠杆菌外源蛋白plc表达的总蛋白SDS-PAGE图。
【具体实施方式】
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
实施例1
本发明提供用于从链霉菌中扩增磷脂酶C基因的引物对，所述引物对的上游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，所述引物对的下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。
一种包含上述磷脂酶C基因的载体。
一种包含上述磷脂酶C基因的表达系统；上述表达系统为微生物：大肠杆菌；上述微生物可产磷脂酶C且不具备抗性。
一种制备上述微生物的方法，该方法为：将磷脂酶C基因与含Tn7转座酶TnsABCD的Tn7转座质粒pGRG36结合，构建插入磷脂酶C外源蛋白基因的转座整合质粒pGRG36-T7lac-plc；通过变温培养，将磷脂酶C基因导入大肠杆菌的染色体上，得到重组大肠杆菌。
上述质粒pGRG36-T7lac-plc的制备方法为：(1)构建重组质粒pETB2：根据NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上报道的蜡状芽孢杆菌ATCC10987的pcplc基因为模板设计PCR引物对，引物对的上游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，引物对的下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示，以南宁新科健生物技术有限公司保藏的链霉菌XKJ09为模板，克隆得到磷脂酶C基因，将该基因克隆至大肠杆菌表达载体pET22b(+)上，构建重组质粒pETB2；
(2)构建重组质粒pETB2-O：以步骤(1)的重组质粒pETB2为模板克隆ompA信号肽，采用的PCR引物对其上游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.3所示，所述引物对的下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示，按以下条件进行PCR反应：95℃4min，95℃60s，52℃30s，72℃30s，重复30个循环，72℃延伸7min；PCR产物用琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化；将纯化的PCR产物插入SbfI和BstBI双酶切的质粒pETB2，经筛选鉴定获得重组质粒pETB2-O；
(3)将步骤(2)构建的重组质粒pETB2-O和含有Tn7转座酶TnsABCD的质粒pGRG36分别转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，冰浴30min后，42℃热激90s，再冰浴30min，分别加入LB培养基于32℃、220rpm下孵育1h后，涂布于含有100μg/mL氨苄西林钠的LB平板上，于37℃下培养过夜，获得pETB2-O/DH5α和pGRG36/DH5α；
(4)载体质粒pGRG36SmaI单酶切、去磷酸化：将步骤(3)的pGRG36/DH5α单菌落接至LB+100μg/mL氨苄西林钠+0.1％葡萄糖的液体培养基中，于32℃恒温摇床上220r/min下振荡培养过夜，提取质粒pGRG36DNA进行SmaI单酶切，酶切反应体系为30μL：10×BufferTango 3μL，pGRG36 5μL，SmaI(10U/μL)1μL，ddH2O 21μL，于30℃下水浴反应3h；去磷酸化：在上述30μL酶切体系基础上，将总体系扩大至40μL，加入10×Buffer Tango 1μL，去磷酸化酶FastAP(1U/μL)1μL，无菌ddH2O 8μL，37℃下水浴反应25min，再于75℃下水浴20min对酶进行灭活处理；
(5)质粒pETB2-O双酶切、酶切粘性末端位点填平：挑取步骤(3)的新鲜制备划线板上的pETB2-O/DH5α接至10mL LB+100μg/mL氨苄西林钠，于37℃恒温摇床上220r/min下振荡培养过夜，提取质粒pETB2-O进行双酶切，双酶切反应体系为50μL：10×Buffer Tango10μL，pETB2-O 10μL，ddH2O 28μL，BglII(10U/μL)1μL，XhoI(10U/μL)1μL，于37℃下水浴反应3h；酶切粘性末端位点填平：反应总体系在双酶切的基础上，扩大至60μL，加入10×BufferTango 2μL，2.5mmol/L的dNTP Mix 0.792μL，Klenow fragment(1U/μL)0.5μL，无菌ddH2O6.708μL，于25℃水浴反应15min，再加入EDTA(pH8.0，0.5mol/L)1.2μL，于75℃下水浴对酶进行灭活处理；
(6)构建转座整合质粒pGRG36-T7lac-plc：胶回收步骤(5)的质粒pETB2-O酶切产物、纯化后，通过T4DNA Ligase与步骤(4)的pGRG36SmaI酶切产物进行连接，连接反应：20μL体系：10×T4DNA Ligase Buffer 2μL，50％pEG4000solution 2μL，pGRG36SmaI酶切产物3μL，pETB2-O双酶切胶回收片段12μL，T4DNA Ligase(4U/μL)1μL，于16℃下水浴，反应过夜，获得转座整合质粒pGRG36-T7lac-plc。
上述通过转座整合质粒pGRG36-T7lac-plc获得重组大肠杆菌的方法为：S1)步骤(6)的转座整合质粒pGRG36-T7lac-plc转化BL21(DE3)感受态细胞：用移液枪吸取10μL步骤(6)的连接产物加入到感受态细胞管内，轻轻吹打混匀，盖上离心管盖，冰浴30min，42℃热激90s，再冰浴30min，加入到900μL LB培养基上于32℃、220rpm下孵育1h后，取300μL菌液涂布于100μg/mL氨苄西林钠+0.1％葡萄糖的固体平板上，放置于32℃恒温培养箱中，培养过夜；
S2)诱导转座整合：挑取步骤S1)含质粒pGRG36-T7lac-plc的重组菌单菌落，接到5mL LB+0.1％阿拉伯糖液体培养基中，于32℃恒温培养摇床，220r/min下诱导培养过夜；
S3)抗性质粒消除：取步骤S2)经诱导的转座整合菌液100μL，稀释105倍，吸取100μL稀释液涂布于LB+0.1％葡萄糖固体培养基平板上，于42℃下过夜培养；挑取平板上的10个单菌落，分别于另一新鲜制备的LB+0.1％葡萄糖固体培养基平板上划线，于42℃下过夜培养；挑取上述10个划线平板上的单菌落各2个，转点至另一LB+0.1％葡萄糖固体培养基平板上，于32℃下过夜培养；将转点板上的20个转点的单菌落转划至含有0.1％葡萄糖的LB平板上，再于32℃下过夜培养；
S4)重组菌诱导表达：挑取步骤S3)诱导转座整合的菌液经抗性质粒消除后，挑选长出的重组大肠杆菌单菌落，接种到不含抗生素的50mL LB液体培养基上，于32℃、220r/min下培养6h，加入100μmol/L IPTG诱导，继续发酵36h，取1ml菌液超声破碎后，采用NPPC法测定磷脂酶C的总酶活力。
一种测试所述微生物为重组微生物的方法，方法为测定微生物在不含抗生素的LB液体培养基上磷脂酶C的总酶活力为75.4U/mL。
微生物在食品工业用酶的制备上的用途。
实施例2
本发明提供用于从链霉菌中扩增磷脂酶C基因的引物对，所述引物对的上游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，所述引物对的下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。
一种包含上述磷脂酶C基因的载体。
一种包含上述载体的表达系统；上述表达系统为微生物：大肠杆菌；上述微生物可产磷脂酶C且不具备抗性。
一种制备上述微生物的方法，该方法为：将磷脂酶C基因与含Tn7转座酶TnsABCD的Tn7转座质粒pGRG36结合，构建插入磷脂酶C外源蛋白基因的转座整合质粒pGRG36-T7lac-plc；通过变温培养，将磷脂酶C基因导入大肠杆菌的染色体上，得到重组大肠杆菌。
上述质粒pGRG36-T7lac-plc的制备方法为：(1)构建重组质粒pETB2：根据NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上报道的蜡状芽孢杆菌ATCC10987的pcplc基因为模板设计PCR引物对，引物对的上游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，引物对的下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示，以南宁新科健生物技术有限公司保藏的链霉菌XKJ09为模板，克隆得到磷脂酶C基因，将该基因克隆至大肠杆菌表达载体pET22b(+)上，构建重组质粒pETB2；
(2)构建重组质粒pETB2-O：以步骤(1)的重组质粒pETB2为模板克隆ompA信号肽，采用的PCR引物对其上游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.3所示，所述引物对的下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示，按以下条件进行PCR反应：95℃4min，95℃60s，52℃30s，72℃30s，重复30个循环，72℃延伸7min；PCR产物用琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化；将纯化的PCR产物插入SbfI和BstBI双酶切的质粒pETB2，经筛选鉴定获得重组质粒pETB2-O；
(3)将步骤(2)构建的重组质粒pETB2-O和含有Tn7转座酶TnsABCD的质粒pGRG36分别转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，冰浴30min后，42℃热激90s，再冰浴30min，分别加入LB培养基于32℃、220rpm下孵育1h后，涂布于含有100μg/mL氨苄西林钠的LB平板上，于37℃下培养过夜，获得pETB2-O/DH5α和pGRG36/DH5α；
(4)载体质粒pGRG36SmaI单酶切、去磷酸化：将步骤(3)的pGRG36/DH5α单菌落接至LB+100μg/mL氨苄西林钠+0.1％葡萄糖的液体培养基中，于32℃恒温摇床上220r/min下振荡培养过夜，提取质粒pGRG36DNA进行SmaI单酶切，酶切反应体系为30μL：10×BufferTango 3μL，pGRG36 5μL，SmaI(10U/μL)1μL，ddH2O 21μL，于30℃下水浴反应3h；去磷酸化：在上述30μL酶切体系基础上，将总体系扩大至40μL，加入10×Buffer Tango 1μL，去磷酸化酶FastAP(1U/μL)1μL，无菌ddH2O 8μL，37℃下水浴反应25min，再于75℃下水浴20min对酶进行灭活处理；
(5)质粒pETB2-O双酶切、酶切粘性末端位点填平：挑取步骤(3)的新鲜制备划线板上的pETB2-O/DH5α接至10mL LB+100μg/mL氨苄西林钠，于37℃恒温摇床上220r/min下振荡培养过夜，提取质粒pETB2-O进行双酶切，双酶切反应体系为50μL：10×Buffer Tango10μL，pETB2-O 10μL，ddH2O 28μL，BglII(10U/μL)1μL，XhoI(10U/μL)1μL，于37℃下水浴反应3h；酶切粘性末端位点填平：反应总体系在双酶切的基础上，扩大至60μL，加入10×BufferTango 2μL，2.5mmol/L的dNTP Mix 0.792μL，Klenow fragment(1U/μL)0.5μL，无菌ddH2O6.708μL，于25℃水浴反应15min，再加入EDTA(pH8.0，0.5mol/L)1.2μL，于75℃下水浴对酶进行灭活处理；
(6)构建转座整合质粒pGRG36-T7lac-plc：胶回收步骤(5)的质粒pETB2-O酶切产物、纯化后，通过T4DNA Ligase与步骤(4)的pGRG36SmaI酶切产物进行连接，连接反应：20μL体系：10×T4DNA Ligase Buffer 2μL，50％pEG4000solution 2μL，pGRG36SmaI酶切产物3μL，pETB2-O双酶切胶回收片段12μL，T4DNA Ligase(4U/μL)1μL，于16℃下水浴，反应过夜，获得转座整合质粒pGRG36-T7lac-plc。
上述通过转座整合质粒pGRG36-T7lac-plc获得重组大肠杆菌的方法为：S1)步骤(6)的转座整合质粒pGRG36-T7lac-plc转化BL21(DE3)感受态细胞：用移液枪吸取10μL步骤(6)的连接产物加入到感受态细胞管内，轻轻吹打混匀，盖上离心管盖，冰浴30min，42℃热激90s，再冰浴30min，加入到900μL LB培养基上于32℃、220rpm下孵育1h后，取300μL菌液涂布于100μg/mL氨苄西林钠+0.1％葡萄糖的固体平板上，放置于32℃恒温培养箱中，培养过夜；
S2)诱导转座整合：挑取步骤S1)含质粒pGRG36-T7lac-plc的重组菌单菌落，接到5mL LB+0.1％阿拉伯糖液体培养基中，于32℃恒温培养摇床，220r/min下诱导培养过夜；
S3)抗性质粒消除：取步骤S2)经诱导的转座整合菌液100μL，稀释105倍，吸取100μL稀释液涂布于LB+0.1％葡萄糖固体培养基平板上，于42℃下过夜培养；挑取平板上的10个单菌落，分别于另一新鲜制备的LB+0.1％葡萄糖固体培养基平板上划线，于42℃下过夜培养；挑取上述10个划线平板上的单菌落各2个，转点至另一LB+0.1％葡萄糖固体培养基平板上，于32℃下过夜培养；将转点板上的20个转点的单菌落转划至含有0.1％葡萄糖的LB平板上，再于32℃下过夜培养；
S4)重组菌诱导表达：挑取步骤S3)诱导转座整合的菌液经抗性质粒消除后，挑选长出的重组大肠杆菌单菌落，接种到不含抗生素的50mL LB液体培养基上，于32℃、220r/min下培养6h，加入100μmol/L IPTG诱导，继续发酵36h，取1ml菌液超声破碎后，采用NPPC法测定磷脂酶C的总酶活力。
一种测试所述微生物为重组微生物的方法，方法为测定微生物在不含抗生素的LB液体培养基上磷脂酶C的总酶活力为83.0U/mL。
微生物在食品工业用酶的制备上的用途。
如图1、图2所示，由重组质粒pETB2-O中T7lac-Ba的片段图谱可知，plc基因插入的位置在Xhol位点与BɡШ位点之间，该区间的复制方向从BɡШ经plc复制到Xhol，该位点及其复制方向与质粒pGRG36图谱(图2所示)上位于两个Tn7左臂右臂(多克隆位点)中的Xhol与BɡШ及其复制方向相同(从BɡШ位点复制到Xhol位点)，该多克隆位点能使重组质粒pETB2-O中的磷脂酶C基因能整合到质粒pGRG36上位于两个Tn7左臂右臂上Xhol与BɡШ之间。
如图3所示，由抗性质粒消除的对比图可知，重组大肠杆菌的BL21(ED3)-plc在不含抗生素的LB固体培养基中，能够正常生长，而在含有氨苄西林钠抗生素的BL固体培养基中，不生长，这说明，本申请的重组大肠杆菌BL21(ED3)-plc不含抗生素抗性基因。
图4所示，在每代重组菌的发酵液总酶活力和菌体密度的折线图中，在无氨苄西林钠的LB液体培养基中，对重组菌BL21(DE3)-plc进行连续传代培养和诱导表达，横坐标表示的是对转座整合重组菌进行连续传代培养10次，由图可以看出，NO.1～NO.10每一代重组菌的酶活力与菌体密度变化趋势一致，数值(75.4U/mL～83.0U/mL)变化有小范围波动，但幅度不大，这说明，本发明重组菌BL21(DE3)-plc的遗传稳定性高。
如图5所示，重组大肠杆菌BL21(ED3)-plc外源蛋白plc表达的总蛋白SDS-PAGE图中，条带M表示Marker，条带0表示BL21(DE3)的总蛋白，条带1-10表示重组菌BL21(DE3)-plc表达的总蛋白量，在菌体密度值相同的情况下，NO.1～NO.10传代培养中，plc的表达量无明显变化，与图4的酶活力变化趋势一致，这说明，重组菌株BL21(DE3)-plc的遗传稳定性高。
序列表
<110> 南宁新科健生物技术有限公司，广西医科大学
<120> 一种表达系统及其制备方法和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(28)
<400> 1
ccacatgtgg atctcatgag ataagaag 28
<210> 2
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(41)
<400> 2
cgacatgtct ctggagtatc gctatctggc tactctctta c 41
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(30)
<400> 3
aatcctgcag gtgaaaaaga cagctatcgc 30
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(26)
<400> 4
actttcgaac atagcttgcg caacgg 26

Claims (10)

1.用于从链霉菌中扩增磷脂酶C基因的引物对，其特征在于，所述引物对的上游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，所述引物对的下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。
2.一种包含权利要求1所述磷脂酶C基因的载体。
3.一种包含权利要求1所述磷脂酶C基因或权利要求2载体的表达系统。
4.根据权利要求3所述表达系统，其特征在于，所述表达系统为微生物：大肠杆菌。
5.根据权利要求4所述微生物，其特征在于，所述微生物可产磷脂酶C且不具备抗性。
6.一种制备如权利要求4-5任意一项所述微生物的方法，其特征在于，所述方法为：将磷脂酶C基因与含Tn7转座酶TnsABCD的Tn7转座质粒pGRG36结合，构建插入磷脂酶C外源蛋白基因的转座整合质粒pGRG36-T7lac-plc；通过变温培养，将磷脂酶C基因导入大肠杆菌的染色体上，得到重组大肠杆菌。
7.根据权利要求6所述制备微生物的方法，其特征在于，所述质粒pGRG36-T7lac-plc的制备方法为：以链霉菌DNA为模板，在磷脂酶C基因的引物对下，经PCR扩增反应获得磷脂酶C基因，再克隆到pET22b(+)上，获得重组质粒pETB2；以pETB2为模板，在ompA信号肽的引物对下，经PCR扩增获得ompA信号肽，ompA信号肽整合到pETB2上，获得重组质粒pETB2-O；pETB2-O和质粒pGRG3用于制备pETB2-O/DH5α和pGRG36/DH5α；提取pETB2-O DNA、pGRG36 DNA，通过T4 DNA连接酶将经单酶切、去磷酸化的pGRG36 DNA与经双酶切和酶切粘性末端位点填平的pETB2-O DNA连接，获得转座整合质粒pGRG36-T7lac-plc。
8.根据权利要求7所述ompA信号肽的引物对，其特征在于，所述引物对的上游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.3所示，所述引物对的下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示。
9.一种测试如权利要求4-5任意一项所述微生物为重组微生物的方法，其特征在于，所方法为测定微生物在不含抗生素的LB液体培养基上磷脂酶C的总酶活力为75.4U/mL～83.0U/mL。
10.如权利要求4-5任意一项所述微生物在食品工业用酶的制备上的用途。
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