CN102703509A - 一种提高改良的Shewanella oneidensis MR-1遗传转化的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明一种提高改良的ShewanellaoneidensisMR-1遗传转化的方法,属于突变或基因工程领域。将纳米二氧化钛颗粒添加到外源基因的供体菌EscherichiacoliWM3064和受体菌S.oneidensisMR-1等比例混合的溶液中，静置培养，能够有效促进该外源基因从供体菌向受体菌的转移，显著提高外源基因对S.oneidensisMR-1中遗传转化效率。该发明还为纳米材料在基因工程领域的新应用提供了试验依据，具有潜在的实际应用价值，符合国家可持续发展战略的要求。
Description
技术领域
本发明涉及一种通过纳米二氧化钛为介质，提高外源基因对S. oneidensis MR-1遗传转化的高效改良方法，属于突变或基因工程领域。
背景技术
Shewanella（希瓦氏菌）是一种重要的环境微生物，在自然界，尤其在水环境有广泛的分布。Shewanella不仅是一种多功能金属还原细菌，以环境中的金属氧化物作为电子受体，还能够利用环境中很多污染物质进行厌氧呼吸，包括亚硝酸盐、亚硫酸盐等无机氧化物以及锝、镎、钚、Cr（VI）、U（VI）和钒酸盐等放射性或重金属化合物等。近些年来的研究发现，Shewanella菌还能够将人工染料作为电子受体进行厌氧脱色降解。由于其代谢多样性和独特的生理生化特性，Shewanella在地质的生物矿化、环境废水处理、染料降解中都具有重要的应用前景，从而受到日益广泛的关注。
目前，研究人员已经对Shewanella菌的遗传背景、分子机理、菌种性状改良等方面做了大量的基础研究工作。但是，这些研究均需要涉及到的基因敲除、基因回补以及外源基因重组表达等基因工程操作。而这些方法通常通过基因接合转移法进行。传统的操作方法多使用E. coli宿主细菌携带外源基因，通过其与Shewanella细胞的结合转化从而实现外源载体进入细胞内。但是对转化子的筛选中，发现这种直接转化法的转化成功率较低。因此，本发明在传统的接合转移法的技术基础上，通过添加纳米二氧化钛颗粒做介导，使得Shewanella菌的接合转化效率得到大幅提高。
发明内容
本发明的目的在于针对传统Shewanella菌的接合转化方法效率低的问题，通过在转化体系中添加纳米二氧化钛作为介质，建立起一种高效接合转化的改良方法。
本发明的技术方案如下：
一种提高改良的Shewanella oneidensis MR-1遗传转化的方法，按照下述步骤进行：
一、供体菌体菌的制备：
（1） 配置添加了庆大霉素和二氨基庚二酸盐的固体平板酵母膏蛋白胨培养基，对携带抗Gm表达质粒pBBR1MCS-5的E. coli WM3064进行37 oC下过夜培养活化；
（2）挑取（1）中活化菌体所形成的单克隆菌落，接种于添加了庆大霉素和二氨基庚二酸盐的LB液体培养基中，37 oC、200 rpm过夜培养到对数期；取对数期菌液，7000 rpm离心10 min，取沉淀，加0.01 M PBS（磷酸盐缓冲液，pH=7.0）将细菌重悬液调成l×109 CFU/ml的密度。
二、受体菌S. oneidensis MR-1的制备：
（1）配置固体平板LB培养基，对S. oneidensis MR-1进行30 oC下过夜培养；
（2）将活化的菌体接种于 LB液体培养基中，30 oC、200 rpm过夜培养到对数期，取对数期菌液，7000 rpm离心10 min，取沉淀，加0.01 M PBS（pH=7.0）重悬细胞，并将细菌重悬浮液调成l×109 CFU/ml。
三、纳米二氧化钛悬浮液的制备：
（1）称取5 nm粒径的纳米二氧化钛，利用无菌超纯水将其制备成0. 5 M悬浮液，并充分涡旋混合；
（2）将一定体积的悬浮液放入无菌密封试管中，然后置于超声波仪中超声15 min备用；
四、纳二米氧化钛作用于细菌接合转化体系：
（1）将供体菌悬浮液和受体菌悬浮液以1:1比例混合，并充分涡旋；
（2）按照体积比为1：9分别取纳米二氧化钛悬浮液，加入混合菌液，使最终纳米二氧化钛浓度为0.05 mM，充分涡旋。
其中步骤一（1）中所述的配置添加了庆大霉素和二氨基庚二酸盐的固体平板酵母膏蛋白胨培养基中含有酵母提取物5 g/l、蛋白胨10 g/l、NaCl 10 g/l， 15 μg/ml的庆大霉素（Gm），终浓度为100 μg/ml的二氨基庚二酸盐（DAP）。
其中步骤一（2）中所述的添加了庆大霉素和二氨基庚二酸盐的LB液体培养基中其中含有酵母提取物5 g/l、蛋白胨10 g/l、NaCl 10 g/l， 15 μg/ml的庆大霉素（Gm），100 μg/ml的二氨基庚二酸盐（DAP），其余为水。
本发明的优点
本发明具有操作简单，成本低廉，能够显著提高外源基因对希瓦氏菌的结合转化效率，从而使操作者收获更多的转化子，为希瓦氏的基因敲除、基因回补等相关分子生物学实验提供更便捷高效的基因转化技术。
附图说明
图1为纳米氧化钛处理组与同体积水处理空白对照组对于供体菌和受体菌接合转化效率的影响对比。实验结果表明处理组转化效率明显提高了12.6倍。
具体实施方式
本发明所述供体菌E. coli WM3064是一种分子生物学常用菌株，由中国科学技术大学武超博士赠送，其携带的具有Gm抗性的表达质粒pBBR1MCS-5 (该表达质粒购于中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心)由本实验室自行转化；受体菌S. oneidensis MR-1由美国加利福尼亚大学尼尔森教授赠送。
一 、（一）Gm抗性的表达质粒pBBR1MCS-5转化入大肠杆菌:
（1）取100 μl WM3064感受态细胞（使用上海生工生物工程有限公司生产的超级感受态细胞制备试剂盒提前制备）于冰浴上融化；
（2）加入5 μl 纯pBBR1MCS-5质粒，轻轻吹打混匀，冰浴30 min。
（3）将菌液放入42 oC水浴中热激90 秒，立即放入冰浴中2 min。
（4）加入0.9 ml LB液体（提前37℃预热），于37 oC恒温摇床上200 rpm，50 min 温育。
（5）将菌液5000 rpm 离心5 min，留200 μl上清将菌体打散，均匀涂布于含含有终浓度为15 μg/ml Gm和终浓度为100 μg/ml DAP的琼脂平板表面（已提前涂布好抗生素，并预热），平板于37℃倒置培养过夜。
（6）挑取（5）中过夜的平板上的单克隆至新鲜LB培养基培养至对数中期，用高压灭菌后的用含20%甘油的冻存管-80 oC保存转化后菌液。（上述菌株为细菌结合转化中的通用菌株，由中国科学技术大学武超博士赠送）
（二）供体菌与受体菌的接合转化：
（1）将保存在甘油中的E. coli WM3064划线于含Gm 15 μg/ml和DAP 100 μg/ml的 LB平板上，37 oC过夜培养培养；
（2）用牙签挑取活化好的单菌落，接种于50 ml LB（含Gm 15 μg/ml和DAP 100 μg/ml）液体培养基中，37 oC、200 rpm摇至对数期，取对数期菌液，7000 rpm离心10 min，取沉淀，加PBS将菌体重悬，用分光光度计将细菌悬浮液调成l×109 CFU/ ml，待用；
二、受体菌S. oneidensis MR-1的制备：
（1） 配置固体平板LB培养基，对MR-1进行30 oC下过夜培养；
（2）将活化的菌体接种于50 ml LB液体培养基中，30 oC、200 rpm过夜培养到对数期，取对数期菌液，7000 rpm离心10 min，取沉淀，加0.01 M PBS（pH=7.0）重悬细胞，并将细菌重悬浮液调成l×109 CFU/ml。
三、纳米二氧化钛悬浮液的制备：
（1）称取0.004 g 5 nm粒径的纳米二氧化钛，利用无菌超纯水将其制备成1 ml 0. 5 M悬浮液，并充分涡旋混合；
（2）将一定体积的悬浮液放入无菌密封试管中，然后置于超声波仪中超声15 min备用；
四、纳二米氧化钛作用于细菌接合转化体系：
（1）将供体菌悬浮液和受体菌悬浮液以1:1比例混合，并充分涡旋；
（2）分别取100 μl纳米二氧化钛悬浮液，加入900 μl混合菌液，使最终纳米二氧化钛浓度为0.05 mM，充分涡旋；另外将100 μl无菌超纯水加入900 μl混合菌作为对照组；
（3）将各处理组和对照组放进30 oC细菌培养箱静置培养；
（4）12 h后，将各实验组和对照组取出，并分别取100 μl涂布于含15 μg/ml Gm的LB平板上，每组三个重复。放置于30 oC细菌培养箱倒置过夜培养。
（5）16~18 h后，待平板上长出直径约为1mm的单菌落后，进行单菌落计数（CFU）。
实验数据证明，在加入终浓度为0.05 mM纳米二氧化钛作用于两菌混合液后，在含Gm的LB平板上的单菌落数明显增加（同等稀释度）。与对照未加入纳米二氧化钛的转化体系相比，每ml混合细菌悬浮液获得具有Gm抗性的S. oneidensis MR-1单菌落个数增加了12.6倍（如图1），显示添加纳米二氧化钛能够显著增强S. oneidensis MR-1的接合转化效率。
Claims (3)
1.一种提高改良的Shewanella oneidensis MR-1遗传转化的方法，其特征在于按照下述步骤进行：
一、供体菌体菌的制备：
（1） 配置添加了庆大霉素和二氨基庚二酸盐的固体平板酵母膏蛋白胨培养基，对携带抗Gm表达质粒pBBR1MCS-5的E. coli WM3064进行37 oC下过夜培养活化；
（2）挑取（1）中活化菌体所形成的单克隆菌落，接种于添加了庆大霉素和二氨基庚二酸盐的LB液体培养基中，37 oC、200 rpm过夜培养到对数期；取对数期菌液，7000 rpm离心10 min，取沉淀，加pH=7.0的0.01 M PBS将细菌重悬液调成l×109 CFU/ml的密度；
二、受体菌S. oneidensis MR-1的制备：
（1）配置固体平板LB培养基，对S. oneidensis MR-1进行30 oC下过夜培养；
（2）将活化的菌体接种于 LB液体培养基中，30 oC、200 rpm过夜培养到对数期，取对数期菌液，7000 rpm离心10 min，取沉淀，加0.01 M PBS（pH=7.0）重悬细胞，并将细菌重悬浮液调成l×109 CFU/ml；
三、纳米二氧化钛悬浮液的制备：
（1）称取5 nm粒径的纳米二氧化钛，利用无菌超纯水将其制备成0. 5 M悬浮液，并充分涡旋混合；
（2）将一定体积的悬浮液放入无菌密封试管中，然后置于超声波仪中超声15 min备用；
四、纳二米氧化钛作用于细菌接合转化体系：
（1）将供体菌悬浮液和受体菌悬浮液以1:1比例混合，并充分涡旋；
（2）按照体积比为1：9分别取纳米二氧化钛悬浮液，加入混合菌液，使最终纳米二氧化钛浓度为0.05 mM，充分涡旋。
2.根据权利要求1所述的一种提高改良的Shewanella oneidensis MR-1遗传转化的方法，其特征在于其中步骤一（1）中所述的配置添加了庆大霉素和二氨基庚二酸盐的固体平板酵母膏蛋白胨培养基中含有酵母提取物5 g/l、蛋白胨10 g/l、NaCl 10 g/l， 15 μg/ml的庆大霉素，终浓度为100 μg/ml的二氨基庚二酸盐。
3.根据权利要求1所述的一种提高改良的Shewanella oneidensis MR-1遗传转化的方法，其特征在于其中步骤一（2）中所述的添加了庆大霉素和二氨基庚二酸盐的LB液体培养基中其中含有酵母提取物5 g/l、蛋白胨10 g/l、NaCl 10 g/l， 15 μg/ml的庆大霉素，100 μg/ml的二氨基庚二酸盐，其余为水。
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