CN108795883A - 一种提高噬菌体侵染细菌效率的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种提高噬菌体侵染细菌效率的方法，属于分子生物学技术领域；本发明在噬菌体侵染宿主大肠杆菌的过程中，通过添加纳米材料，增加噬菌体与细菌的接触，从而有效提高噬菌体对大肠杆菌的侵染效率；本发明能够显著提升噬菌体的侵染效率，降低噬菌体的使用量，具有简易、高效、低成本的特点，在噬菌体表面展示、噬菌体扩增等方面具有潜在的实际应用价值。

Description

一种提高噬菌体侵染细菌效率的方法
技术领域
本发明涉及一种提高噬菌体侵染细菌效率的方法，主要涉及一种利用纳米TiO2材料提高噬菌体侵染细菌效率的方法；属于分子生物学技术领域。
背景技术
噬菌体是一类能够感染细菌、放线菌、螺旋体等微生物的病毒，具有严格的宿主特异性，对动植物没有危害性。噬菌体结构简单、基因数少，作为一种宝贵的生物资源已被广泛应用于科学研究中。噬菌体可作为分子生物学研究的试验工具，用于细菌的鉴定和分型、噬菌体展示技术、噬菌体抗体库，也可用于检测和控制致病菌，具有重要的理论研究意义和实际应用价值。
大肠杆菌M13单链丝状噬菌体是一类具有单链DNA的噬菌体，研究证实其能感染带有性菌毛的雄性大肠杆菌。当M13噬菌体感染大肠杆菌时，先通过其头部的pⅢ蛋白N端吸附于大肠杆菌F性菌毛的末端，脱去主要衣壳蛋白pⅧ，其感染性单链DNA则进入宿主细胞细菌，并在10～15min内，以此环状单链的DNA为正链，通过滚环复制拷贝出互补的负链DNA，形成环状双链DNA分子即复制型DNA(RF形式)。当宿主细胞内RFDNA积累到100～200个拷贝后，则开始转录和复制，并产生所有的病毒蛋白。子代噬菌体是以出芽的方式释放至胞外。M13噬菌体属于温和噬菌体，通常降低了细菌的生长和增殖速度，而不会引起宿主细菌的裂解与死亡。目前在M13噬菌体侵染过程中，通常使用高噬菌体/大肠杆菌的比率，以确保足够的侵染率，而这会显著增加实验操作的成本。因此，如何提高噬菌体对大肠杆菌的侵染率成为一个亟待解决的问题。
已有报道证明，离子性液体促进细菌菌毛蛋白的表达量，从而促进M13噬菌体的侵染效率。但离子性液体对细菌及真菌生长均有抑制作用，且随着烷基链的增长毒理学活性增加，其排放至环境中会通过吸附作用沉积，难以降解，对环境造成不良影响。纳米TiO2材料是一种高比表面积的廉价纳米材料。它性质稳定，不释放有毒金属离子，且在非光激发条件下对微生物无毒。纳米TiO2材料可以吸附噬菌体，并结合于宿主菌体表面，促进丝状噬菌体通过与细菌菌毛接触而侵染细菌，从而增加噬菌体对细菌的侵染效率。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中存在的缺陷，提出了一种利用纳米TiO2材料粘附作用增加噬菌体与细菌的接触，进而提高噬菌体侵染细菌效率的方法，是一种新型的提高噬菌体侵染效率的方法。本发明解决了目前噬菌体侵染效率不高的瓶颈，是一种简易操作、经济快捷的噬菌体侵染增效方法。
本发明的技术方案如下：
一种提高噬菌体侵染细菌效率的方法，包括如下步骤：
（1）细菌培养，离心收集菌体；
（2）配制纳米TiO2材料悬浮液作为母液，超声并稀释后待用；
所述纳米TiO2材料悬浮液的浓度为0.05-50 mmol/L，优选为0.01-1 mmol/L,更优选的为0.5mmol/L；
所述纳米TiO2材料粒径为5-100nm，优选为20-50nm。
所述母液超声条件为超声1 h，梯度稀释后再超声15 min。
（3）将步骤（1）中收集的菌体加入到PBS缓冲溶液中，并调节菌浓至初始浓度为2×108CFU/mL；
（4）将噬菌体用PBS缓冲溶液稀释，调节初始滴度为5×108 PFU/mL；
（5）在离心管中，每管加入步骤（3）中得到菌液、步骤（2）中得到的纳米TiO2材料悬浮液、步骤（4）中得到的噬菌体，样品混匀后静置孵育；
所述菌液、纳米TiO2材料悬浮液、噬菌体的体积比为6:1:3；所述孵育条件为静置于37℃孵育1 h。
（6）样品稀释后，涂布于含有氨苄青霉素和卡那霉素平板，培养后进行计数。
所述细菌为带有性菌毛的大肠杆菌宿主，优选为大肠杆菌TG1；所述噬菌体为丝状噬菌体，优选为M13噬菌体。
与现有技术相比较，本发明具有的技术优势如下：
针对目前丝状噬菌体侵染细菌的效率较低的瓶颈，本发明利用纳米TiO2材料的粘附作用，增加噬菌体与纳米材料的接触，进而促进噬菌体侵染细菌。纳米TiO2具有化学性质稳定、价格低廉等优势，已被当做研究纳米材料应用的典型代表物。这种方法便捷无害，既可以增加噬菌体侵染效率，也不会引发菌体的毒害胁迫而影响噬菌体的后续应用，因此对开展噬菌体的基础研究及拓展噬菌体的应用研究都具有重要价值。
附图说明
图1是不同浓度纳米TiO2材料对噬菌体转导的影响；
图2是不同粒径纳米TiO2材料对噬菌体转导的影响。
具体实施方式
本发明所使用的纳米材料为TiO2纳米颗粒；所用菌株为大肠杆菌TG1；所用噬菌体为M13，均为常规市售材料。
具体实施方式如下：
（1）将保存在甘油中的细菌划线于M9基本培养基葡萄糖平板（用800mL去离子水溶解15g琼脂，高压灭菌，冷却至50℃，加200mL 5×M9盐溶液、10mL 20%葡萄糖、1mL 1mol/LMgSO4、100μL 1mol/L CaCl2和1mL 1mg/mL VitB1。制备(5×)M9盐溶液：在1L去离子水中加入64g Na2HPO4、15g KH2PO4、5g NH4Cl和2.5g NaCl，高压灭菌，倒平板）上，37oC恒温培养箱中过夜培养；
（2）挑取待使用大肠杆菌TG1单克隆，接入50 mL酵母膏蛋白胨液体培养基（LB液体培养基，含酵母提取物5 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl l0 g/L），在好氧条件下于37oC恒温摇床中200 rpm振荡培养至对数后期；
（3）采用7000 rpm转速离心5 min收集菌体，然后用0.01 mol/L PBS溶液重悬并清洗三次，再次7000 rpm转速离心5 min收集菌体；
（4）大肠杆菌氨苄板划线，37℃过夜，挑单克隆加入含有4%葡萄糖和100 μg/mL氨苄青霉素的2×TY培养基。37℃、250 rpm生长条件下，培养至OD600=0.5。取培养液加入KM13辅助噬菌体，在37℃水浴中孵育30-60 min。用离心管分装，3200×g离心10min。弃上清，用500mL含有0.1%葡萄糖、100 μg/mL氨苄和50 μg/mL卡那的2×TY培养基重悬沉淀。25℃、250rpm条件下用培养16-20 h。分装，3200×g离心，弃沉淀；加入PEG使噬菌体沉淀，冰上孵育1h；离心管分装，4℃、3200×g离心30 min；弃上清，用PBS重悬沉淀，倒入离心管，加入PEG溶液，冰上孵育10 min，4℃、3200×g离心30 min，弃上清，用PBS重悬沉淀，4℃、3200×g离心5min；用0.45μm滤膜过滤上清。弃沉淀，通过测260nm处的吸光度来估计M13噬菌体滴度（用以下经验公式估算效价：噬菌体/mL=OD260×100×22.14×1010）噬菌体可以在4℃下长期保存；
（5）用灭菌的娃哈哈水配制500 mmol/L的纳米TiO2悬浮液，超声1 h，梯度稀释后再超声15 min待用；
（6）将步骤（3）中离心好的菌体加入到0.01 mol/L PBS(pH=7)中，并调节菌浓至初始浓度为2×108 CFU/mL；
（7）将步骤（4）中M13噬菌体用0.01 mol/L PBS(pH=7)稀释，调节初始滴度为5×108PFU/mL；
（8）2 mL离心管中，每管均加入600 μL步骤（6）中得到的菌液，300 μL步骤（7）中得到噬菌体，处理组加入100 μL步骤（5）中得到纳米TiO2悬浮液，空白对照组加100 μL PBS，样品混匀后静置于37oC孵育1 h；
（9）样品稀释后，取100 μL涂布于含有100μg/mL的氨苄青霉素和50μg/mL的卡那霉素平板，16 h后进行计数。
作为对照组，不加纳米TiO2材料，用PBS作为代替，填补体积且不造成其他干扰。
作为对比，本实施例考察纳米TiO2材料悬浮液浓度在0-50mmol/L范围内的效果；并且考察纳米TiO2材料粒径为5-100nm的效果。
实验数据证明：图1中外源添加TiO2纳米材料对噬菌体转导有显著促进作用。其中0.5mmol/L的促进效果最好，约为空白对照组的4.5倍。而当纳米浓度增加，对噬菌体的转导反而产生抑制。这一结果说明TiO2对噬菌体转导具有显著的促进效果，但用量要适宜。图2中相同浓度（0.5mmol/L）不同粒径的纳米TiO2对噬菌体转导促进效果不同，其中20 nm和50nm的TiO2促进效果较好。

Claims (10)

1.一种提高噬菌体侵染细菌效率的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）细菌培养，离心收集菌体；
（2）配制纳米TiO2材料悬浮液作为母液，超声并稀释后待用；
（3）将步骤（1）中收集的菌体加入到PBS缓冲溶液中，并调节菌浓至初始浓度为2×108CFU/mL；
（4）将噬菌体用PBS缓冲溶液稀释，调节初始滴度为5×108 PFU/mL；
（5）在离心管中，每管加入步骤（3）中得到菌液、步骤（2）中得到的纳米TiO2材料悬浮液、步骤（4）中得到的噬菌体，样品混匀后静置孵育。
2. 根据权利要求1中所述的一种提高噬菌体侵染细菌效率的方法，其特征在于，步骤（2）中所述纳米TiO2材料悬浮液的浓度为纳米TiO2材料悬浮液的浓度为0.05-50 mmol/L。
3. 根据权利要求2中所述的一种提高噬菌体侵染细菌效率的方法，其特征在于，步骤（2）中所述纳米TiO2材料悬浮液的浓度为0.01-1 mmol/L,更优选的为0.5 mmol/L。
4. 根据权利要求1中所述的一种提高噬菌体侵染细菌效率的方法，其特征在于，步骤（2）中所述纳米TiO2材料粒径为5-100 nm，优选为20-50 nm。
5. 根据权利要求1中所述的一种提高噬菌体侵染细菌效率的方法，其特征在于，步骤（2）中所述超声条件为超声1 h，梯度稀释后再超声15 min。
6. 根据权利要求1中所述的一种提高噬菌体侵染细菌效率的方法，其特征在于，所述PBS缓冲溶液浓度为0.01 mol/L，pH为7。
7.根据权利要求1中所述的一种提高噬菌体侵染细菌效率的方法，其特征在于，步骤（5）中所述菌液、纳米TiO2材料悬浮液、噬菌体的体积比为6:1:3。
8. 根据权利要求1中所述的一种提高噬菌体侵染细菌效率的方法，其特征在于，步骤（5）中所述孵育条件为静置于37oC孵育1 h。
9.根据权利要求1中所述的一种提高噬菌体侵染细菌效率的方法，其特征在于，所述细菌为带有性菌毛的宿主菌株；所述噬菌体为丝状噬菌体。
10.根据权利要求9所述的一种提高噬菌体侵染细菌效率的方法，其特征在于，所述细菌为带有性菌毛的大肠杆菌宿主菌株；所述噬菌体为M13噬菌体。
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