CN101930005A - 一种对虾白斑综合征病毒快速检测试纸条及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种对虾白斑综合征病毒快速检测试纸条及其制备方法，它是在硝酸纤维膜上包被抗重组病毒囊膜蛋白VP28抗体和抗鼠IgG，结合胶体金标记的抗重组病毒囊膜蛋白VP28单克隆抗体，应用膜层析双抗体夹心法，检测标本中对虾白斑综合征病毒抗原。应用本发明试纸条检测，方便、快速、简捷，不需特殊仪器设备，不需专业培训，结果清晰易辨，操作简单，易于推广，适合基层，适合于突发事件的大批量现场检测，适合流行病学调查，对对虾白斑综合征病毒的感染诊断起到辅助作用。

Description

一种对虾白斑综合征病毒快速检测试纸条及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种对虾白斑综合征病毒快速检测试纸条及其制作方法。

背景技术

对虾白斑综合症(White spot syndrome，WSS)是当前全球对虾养殖业所面临的危害性最大、影响范围最广的病害之一，已成为目前制约对虾养殖业发展的主要瓶颈。WSS为烈性的暴发性传染病，病程短，感染发病后3～10d内可达100％的死亡率，因此，虾塘一旦发病，几乎全军覆没、颗粒无收。该病病原为对虾白斑综合症病毒(White spot syndrome virus，WSSV)，是呈杆状具囊膜的DNA病毒。大量研究表明囊膜蛋白的有无是其感染与否的关键，而且中和试验表明囊膜蛋白VP28可能与病毒的系统感染有关。WSSV具有相当广泛的宿主，甲壳类(蟹虾类和桡足类)、昆虫类中均有其中间宿主和生物媒介，这对海洋生态环境造成了一定的威胁，也大大增加了该病的防治难度。

虽然此病引起了世界各国的广泛关注，对WSSV的研究也日趋深入，但目前仍然没有很好的措施来控制WSS的发生，其危害依然存在。由于目前没有特效的治疗药物，早期预防就显得尤其重要，而快速有效地检测方法将为该病的预防研究提供有力的技术支撑。通过对不同生活阶段的对虾以及对虾生活环境中的有关生物进行病毒检测，对了解病毒的感染与传播，进而控制该病毒的继续蔓延意义重大。同时，准确、快速地检测WSSV在优质虾苗培育、流行病学调查、WSS的早期诊断和预防、养殖环境的监测及防治效果的评估、养殖场WSS病情调查与控制等方面具有广泛的应用价值和重要的社会经济意义。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种对虾白斑综合征病毒快速检测试纸条及其制作方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种对虾白斑综合征病毒快速检测试纸条，它包括基板、样品垫、硝酸纤维素膜、检测线、质控线、吸水垫、结合垫。其中，所述样品垫、结合垫、检测线、质控线、硝酸纤维素膜和吸水垫依次固定在基板上。所述结合垫是玻璃纤维素膜结合垫，其中含标记有免疫胶体金颗粒的抗VP28蛋白的鼠源性单克隆抗体，可与样品中的病毒VP28蛋白发生抗原-抗体特异性结合。所述VP28蛋白具有Seq id NO.1所示的氨基酸序列。

一种上述试纸条的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)WSSV病毒的分离纯化。

(2)用纯化WSSV直接免疫新西兰兔子制备多克隆抗体。

(3)以WSSV病毒基因组为模板，克隆其囊膜蛋白VP28基因，在大肠杆菌中进行融合表达并用Ni柱进行蛋白纯化；VP28基因核苷酸序列如Seq id NO.2所示，重组VP28蛋白氨基酸序列如Seq id NO.3所示

(5)纯化的重组VP28蛋白免疫Balb/c小鼠制备单克隆抗体；

(5)用单克隆抗体制备检测试纸条。

本发明的有益效果是，本发明利用基因工程技术，克隆对虾白斑综合征病毒的囊膜蛋白结构基因，并在大肠杆菌内表达，以方便地获得大量廉价的重组抗原，纯化后即可用于免疫学诊断。由此方法得到的重组抗原及快速检测试纸条可以快速、简便地检测WSSV，且耗时短、准确率高、特异性强，无需特殊仪器，无需训练有素的专业人员，可在对虾养殖场大规模推广应用。

附图说明

图1为WSSV快速检测试纸条结构示意图。

具体实施方式

如图1所示，本发明对虾白斑综合征病毒快速检测试纸条包括基板1、样品垫2、硝酸纤维素膜3、检测线4，质控线5、吸水垫6、结合垫7。样品垫2、结合垫7、检测线4，质控线5、硝酸纤维素膜3、吸水垫6依次固定在基板1上。

基板1为塑胶支撑板。

样品垫2是试纸条检测时直接与样品溶液互相接触的部分，起到了过滤样品溶液中的非可溶性杂质成分的作用。

硝酸纤维素膜3又称NC膜。

检测线4含有与病毒WSSV发生抗原-抗体特异性反应的兔源性多克隆抗体。

质控线5含有与过量的金标抗体发生抗原-抗体特异性反应的羊抗鼠多克隆抗体抗体。

吸水垫6为纯白滤纸，100％的植物长纤维，具极强的吸水能力。

结合垫7是玻璃纤维素膜结合垫中含标记有免疫胶体金颗粒的抗VP28蛋白的鼠源性单克隆抗体，可与样品中的病毒VP28蛋白发生抗原-抗体特异性结合。

VP28蛋白氨基酸序列如Seq id NO.1所示。

本发明对虾白斑综合征病毒快速检测试纸条的制作方法，包括以下步骤：

1、WSSV病毒的分离纯化；

1)取10g左右感染WSSV的克氏原螯虾腮和肌肉组织，剪碎后按1∶10比例加入TNE缓冲液(含1％PMSF)，用玻璃匀浆冰浴匀浆，直到组织被完全磨碎为止；

2)4℃，6000g离心20min，收集上清；

3)沉淀重新冰浴匀浆，4℃，6000g离心20min，收集上清；

4)合并所有上清，4℃，6000g离心30min，收集上清；

5)上清液用0.45μm滤膜过滤除菌；

6)4℃，30000g离心60min，去上清；

7)沉淀用150μl蒸馏水充分悬浮，以备电镜观察。

2、用纯化WSSV直接免疫新西兰兔子制备多克隆抗体。

免疫程序按常规方法进行。

3、以WSSV病毒基因组为模板，克隆其囊膜蛋白VP28基因，在大肠杆菌中进行融合表达并用Ni柱进行蛋白纯化；

1)WSSV基因组提取：

按动物组织基因组DNA小量制备试剂盒(AXY gene公司)操作说明书进行。

2)克隆VP28基因：

(1)根据GenBank上登录的WSSV囊膜蛋白基因VP28核苷酸序列，进行同源分析，根据保守序列设计克隆引物，由上海生物工程公司合成，引物为：

VP28pET  Sense      5’CAGGATCCATGGATCTTTCTTTCACTC3’(BamHI)

VP28pET  Antisense  5’GCAAGCTTTTACTCGGTCTCAGTGC 3’(HindIII)

PCR反应及琼脂糖凝胶电泳按常规进行，退火温度为50℃，凝胶浓度为1％。

(2)目的片段进行割胶回收(按上海生工的试剂盒进行)，DNA片段与pUCm-T载体(购自上海生物工程公司)连接，连接产物转化至自备的感受态细胞E.coli TOP10F’，提取重组质粒进行了测序鉴定(将重组菌交由上海博亚生物技术有限公司测定。)得VP28基因核苷酸序列如Seq id NO.2所示。

3)在大肠杆菌中融合表达VP28蛋白：

(1)将重组质粒与表达载体pET-30a(+)分别用BamHI和HindIII进行酶切，用以上所述方法割胶回收目的片段和载体片段，并进行连接。连接产物转化表达宿主菌BL21(DE3)感受态细胞。阳性表达子的经筛选后进行诱导表达。重组VP28蛋白氨基酸序列如Seq id NO.3所示。

(2)表达产物分别进行SDS-PAGE和Western blot检测。Western blot中一抗为鼠抗His₆单克隆抗体(购于Roche公司)，二抗为AP偶联羊抗鼠IgG(购自Promega公司)。

4)表达产物的纯化：

通过金属离子(Ni-NTA Agarose)亲和层析柱纯化。采用QIAGEN公司的His纯化试剂盒，操作参照The QIA expressionist(Fifth Edition)中的Purification protocol。

4、纯化的重组VP28蛋白免疫Balb/c小鼠制备单克隆抗体；

1)小鼠免疫：

选择与所用骨髓瘤细胞同源的Balb/c健康雌性小鼠3只，鼠龄在8周。免疫程序按常规方法进行。

2)饲养细胞的制备：

将Balb/c小鼠拉颈脱臼处死，浸泡于75％酒精后用剪刀向上下两侧做钝性分离，充分暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器吸取5mlRPMI-1640基础培养液，注入小鼠腹腔，反复抽吸几次。用原注射器抽回腹腔内液体，注入离心管。如此反复操作3次。1000rpm离心10min，弃上清。用20ml完全培养液、重悬细胞，100μl/孔滴加到培养板，置培养箱备用。观察饲养细胞的生长状态，一般生长良好的饲养细胞和巨嗜细胞呈梭形或多角形、细胞透亮、折光性强。

3)细胞融合：

(1)脾细胞制备：取加强免疫小鼠一只，眼眶采血后脱臼处死，在75％酒精中消毒后取脾脏，去除结缔组织，制备脾细胞悬液，转移到50ml离心管中，加RPMI-1640至30ml，1500～2000rpm离心5分钟，弃上清，加RPMI-1640至30ml，白细胞稀释液稀释20倍，计数，取1×10⁸个细胞待用。

(2)骨髓瘤细胞制备：取3瓶生长状态良好的(活细胞数＞95％)骨髓瘤细胞，将之完全吹下，转移到50ml离心管中，加RPMI-1640至30ml，1500rpm离心5min，弃上清，加RPMI-1640至30ml，RPMI-1640稀释10倍，计数，取2×10⁷个细胞待用。

(3)细胞混合：脾细胞∶骨髓瘤＝5∶1，混合，1500rpm离心5min。

(4)细胞融合：将离心上清倒干，把沉淀细胞弹成糊状，置37℃水浴，在1min内加入1ml融合剂并搅拌细胞，37℃水浴45秒，在1分钟内加入1ml RPMI-1640并搅拌细胞，终止反应(500rpm离心7分钟，弃上清)。

(5)：细胞培养：轻轻将细胞弹匀，缓缓加入HAT培养液至所需体积，将细胞重悬，轻轻地将之混匀，加到预先准备好的饲养细胞板中。滴加80μl，37℃，CO₂培养箱培养、观察。

(6)：细胞培养、换液：细胞融合后第一天开始，对细胞进行仔细观察，记录好细胞的生长状态、每孔杂交细胞瘤个数、块数、培养液有无污染、饲养细胞的状况。培养3天HAT培养液换液一次，10天换HT培养液培养至20天，换1640完全培养液。

4)筛选分泌抗体的杂交瘤细胞：

融合后当杂交细胞集落生长到一定大小，培养液开始变黄，便可开始筛选抗体活性。用ELISA法进行筛选。

5)杂交瘤细胞的克隆化培养：

用有限稀释法对杂交瘤细胞的克隆化培养。

6)杂交瘤细胞的冻存与复苏

7)单克隆抗体的大量制备(腹水制备)

(1)老鼠致敏：液体石蜡致敏Balb/c小鼠，6周，注射体积500ul/只。

10d后可制备腹水。

(2)注射细胞：收集杂交瘤细胞并用1640洗细胞两遍，取100到150万细胞注射于老鼠腹腔，一周后可见老鼠状态不活跃并且老鼠的腹腔肿大。

(3)腹水采集：注射细胞一周后用无菌注射器于老鼠腹腔采集腹水，每隔2d采集一次，这样多次反复采集直到老鼠自然死亡。采集到的腹水分装归类最后于-80℃冰箱保存。

8)单克隆抗体特异性的检测：

用Western blot和Dot-blotting对抗体的特异性进行检测。

5、用单克隆抗体制备检测试纸条。

1)胶体金的制备：

(1)取用新制超纯水稀释成0.01％氯金酸100ml置于锥形瓶内在微波炉内加热，直至煮沸(约3min)；

(2)准确吸取1.0ml，1.5ml，2.0ml，2.5ml，3ml，4ml的1％柠檬酸三钠，迅速加入锥形瓶中，摇晃均匀后，立即放入微波炉中继续煮沸，直至金黄色的氯金酸变成红色后，取出；

(3)冷却至室温后用超纯水恢复至原体积，加入0.02％的Na2N3，经一次性灭菌滤器过滤，装入洁净玻璃瓶中4℃冰箱保存备用，用电镜观察胶体金的直径大小，选择合适直径的胶体金颗粒。

2)免疫胶体金的制备：

(1)待标记抗原经除盐后，逐级稀释法确定胶体金与抗原的比例及标记最适pH；

(2)调整胶体金溶液的pH值到稍高于最适PI的0.2～0.5pH；

(3)在电磁搅拌下，将抗原溶液加入胶体金溶液中，加入抗原时应逐滴加入，1mg的蛋白质人约5min加完；

(4)在磁力搅拌器下，加入终浓度为1％的牛血清白蛋白(BSA)；

(5)在最低稳定量的基础再加10％～20％即为待标记抗原的实际用量。

(6)采用低温超速离心法纯化以除去其中未标记的病毒和未充分标记的胶体金，以及在标记过程中可能形成的各种聚合物。

3)胶体金试纸条的制备：

(1)硝酸纤维素膜(NC)的选择：应用已经选择好的胶体金，用不同流速的NC膜，喷上标准阳性抗体做流速试验，选择流速在5～10min的NC膜。

(2)封闭液的选择：分别选用0.1％BSA、0.2％BSA、5％犊牛血清、0.05％聚乙二醇3000(PEG-3000)、0.1％PEG-3000作为封闭液。用标准阳性和标准阴性血清做试验，选最优结果。

(3)玻璃纤维素膜的选择及处理：剪取玻璃纤维素膜，分别于0.5％、1％、1.5％、2％、3％的BSA中分别浸泡1、2、3、4、5min，取一定量金标喷涂于玻璃纤维上，室温干燥，选择最佳处理方法。

(4)玻璃纤维素膜的滴加：将金标抗原做一定的稀释，稀释液为加入终浓度为1％BSA的Tween-20，按照每条试纸条约5～10μl量来滴加，选择最合适的滴加量，然后可将大批量滴加，在室温下干燥备用。

(5)NC膜的喷洒：检测线喷洒纯化的WSSV抗原，质控线喷洒兔抗小鼠抗体，量的选择采取矩阵法。

4)试纸条的组装：

将NC膜、结合垫、吸收垫和样品垫依次粘在单面PVC板上，其中金标结合垫、吸收垫均层叠在NC膜上，分别与NC膜重叠约2mm，样品垫层叠于金标结合垫上，二者重叠约2mm。用切割机将粘贴好的试纸板切成宽为0.4cm试纸条，将做好的试纸条与干燥剂一起装入铝箔袋内

密封保存。

直接将待测样品滴入样品垫后，5分钟后就可明显读出结果。如只出现质控线，说明样品呈阴性；如同时出现检测线和质控线，说明样品呈阳性；如没有出现任何线，说明此试纸条失效。

Claims (3)

1.一种对虾白斑综合征病毒快速检测试纸条，其特征在于，它包括基板、样品垫、硝酸纤维素膜、检测线、质控线、吸水垫、结合垫。其中，所述样品垫、结合垫、检测线、质控线、硝酸纤维素膜和吸水垫依次固定在基板上。所述结合垫是玻璃纤维素膜结合垫，其中含标记有免疫胶体金颗粒的抗VP28蛋白的鼠源性单克隆抗体，可与样品中的病毒VP28蛋白发生抗原-抗体特异性结合。所述VP28蛋白具有Seq id NO.1所示的氨基酸序列。

2.一种权利要求1所述试纸条的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)WSSV病毒的分离纯化。

(2)用纯化WSSV直接免疫新西兰兔子制备多克隆抗体。

(3)以WSSV病毒基因组为模板，克隆其囊膜蛋白VP28基因，在大肠杆菌中进行融合表达并用Ni柱进行蛋白纯化；VP28基因核苷酸序列如Seq id NO.2所示，重组VP28蛋白氨基酸序列如Seq id NO.3所示

(4)纯化的重组VP28蛋白免疫Balb/c小鼠制备单克隆抗体；

(5)用单克隆抗体制备检测试纸条。

3.根据权利要求2所述试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)具体为：

(a)WSSV基因组提取。

(b)克隆VP28基因：得VP28基因核苷酸序列如Seq id NO.2所示。

(c)在大肠杆菌中融合表达VP28蛋白，重组VP28蛋白氨基酸序列如Seq idNO.3所示。

(d)表达产物的纯化。

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