CN104560860A

CN104560860A - 一种枯草芽孢杆菌gc5表面展示gcrv vp7蛋白的重组芽孢及制备方法

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Publication number: CN104560860A
Application number: CN201510041532.4A
Authority: CN
Inventors: 张永安; 陈丹丹; 郭霞
Original assignee: Institute of Hydrobiology of CAS
Current assignee: Institute of Hydrobiology of CAS
Priority date: 2015-01-27
Filing date: 2015-01-27
Publication date: 2015-04-29
Anticipated expiration: 2035-01-27
Also published as: CN104560860B

Abstract

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌GC5表面展示GCRV VP7蛋白的重组芽孢及制备方法，步骤：（1）获得目前流行株Ⅱ型GCRV VP7核酸序列。（2）从草鱼体内分离野生型芽孢杆菌，确定其为枯草芽孢杆菌，命名为Bacillus subtilis GC5，CCTCC NO:M2014654。（3）融合表达的重组整合型载体构建。重组质粒中vp7序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。（4）重组枯草芽孢杆菌的制备及鉴定。CCTCC NO:M2014655。（5）表面展示VP7重组芽孢的诱导及其鉴定。芽孢的产生率高达100%，生产简便成低，可作为饲料添加剂；具有肠道定制能力，有助于调节动物肠道菌落平衡、提高动物机体的免疫能力、增强动物营养代谢功能。芽孢具有抗逆性强、易于大规模生产，解决了GCRV VP7蛋白作为免疫抗原在极端环境中不稳定的问题。

Description

一种枯草芽孢杆菌 GC5 表面展示 GCRV VP7 蛋白的重组芽孢及制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体涉及一种枯草芽孢杆菌GC5表面展示GCRV VP7蛋白的重组芽孢，同时还涉及一种枯草芽孢杆菌GC5表面展示GCRV VP7蛋白的重组芽孢的制备方法。

背景技术

草鱼（Ctenopharynodon idellus）作为我国四大家鱼之一，是我国广泛饲养的一种经济鱼类，具有重要的经济价值。草鱼呼肠孤病毒（grass carp reovirus，GCRV）是引起草鱼出血病的主要病原之一，严重影响草鱼养殖业的健康发展。由于不同地区病毒株间基因节段重配和抗原漂移，可将现已分离的GCRV毒株分为3型（I、Ⅱ、III型），其中Ⅱ型为目前主要流行株（曾伟伟等. 草鱼呼肠孤病毒三重PCR检测方法的建立及其应用[J].中国水产科学，2013，20 (2)：419-426）。GCRV是无囊膜的双链RNA病毒，VP7为该病毒的外衣壳蛋白，其功能主要与病毒侵染和进入细胞有关（Nibert M L, Schiff L A. Reoviruses and their replication. In: Knipe D M,Howley P M,eds. Fields Virology. Philadelphia: Lippincott Williams and Wilkins, 2001. 1679-1728）。近年来，大量研究表明了利用VP7蛋白进行抗草鱼出血病育种及疫苗研制的可行性，原核表达VP7蛋白具有良好的抗原性，能够诱导产生中和抗体（Shao L, Sun X, Fang Q. Antibodies against outer-capsid proteins of grass carp reovirus expressed in E.coli are capable of neutralizing viral infectivity [J]. Virol . 2011. j8:347）；VP7蛋白双基因及团头鲂β-肌动蛋白启动子的重组载体pFastBac-p-VP71-VP72构成的核酸疫苗，对草鱼出血病具有较好的免疫效果（徐诗英，刘林，李蜻慧等. 草鱼呼肠孤病毒VP7基因核酸疫苗的构建及免疫效果 [J]. 水产学报. 2011, 35 (11): 1694-1700)。然而，重组蛋白质亚单位疫苗的稳定性及耐受性差，容易被草鱼消化道内的蛋白酶降解，而核酸疫苗的免疫方式及免疫剂量又严重限制了其免疫效果。因此，寻求一种新的方法来制备GCRV疫苗十分必要。

枯草芽孢杆菌是一种非致病性革兰氏阳性菌，常被用于食品或饲料添加剂。在营养缺乏或其它胁迫（极端温度、湿度等）条件下，能形成具有抗逆性的休眠体（芽孢）。芽孢由芽孢髓质、皮层、芽孢衣壳和芽孢外壁构成，芽孢衣壳主要由多种衣壳蛋白构成，如cotB、cotC、cotF、cotG 和cotX等，这些芽孢衣壳蛋白基因能够与外源蛋白基因融合，同源重组转化芽孢杆菌，在芽孢衣壳蛋白基因启动子及调控基因的精密调控下，正确地将外源蛋白表达于芽孢表面（参考文献3篇），且其芽孢能够抵御胃肠道酸性消化液的破坏，最终能够将抗原有效传递给后肠免疫细胞从而产生保护性抗体（Wang X Y, Chen W J, Tian Y L. Surface display of Clonorchis sinensis enolase on Bacillus subtilis spores potentializes an oral vaccine candidate [J]. Vaccine. 2014. 1338-1345），因此，芽孢成为极端环境中运载外源抗原蛋白等生物大分子的潜在有效载体。

本发明所用的枯草芽孢杆菌GC5分离自草鱼肠道，避免了其它来源的细菌所造成的免疫原性及安全性问题。利用草鱼来源的野生型枯草芽孢杆菌表面展示Ⅱ型GCRV的外衣壳蛋白VP7，不仅突破了野生菌株难以转化及转化率低的瓶颈，而且为针对目前流行的草鱼出血病口服疫苗提供了一种有效的制备方法。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种枯草芽孢杆菌GC5表面展示GCRV VP7蛋白的重组芽孢。该芽孢耐酸（pH=1的条件下处理2h，芽孢萌发率不会发生变化）、耐胆盐（胆汁酸盐浓度达到10%，芽孢萌发率无明显变化），因此该芽孢能够抵御动物体类极端的胃肠道环境，使得芽孢在经过整个动物消化道的过程中，可以耐受胃酸，从而顺利到达肠道，在消化液稀释作用的帮助下，最终在肠道得以顺利萌发；另外，该芽孢能够耐高温（100℃，5min）且芽孢的产生率高达100%（DSM培养基），生产简便成本低，可作为饲料添加剂；此外，该芽孢能够粘附肠道上皮细胞，即具有肠道定制能力，有助于调节动物肠道菌落平衡、提高动物机体的免疫能力、增强动物营养代谢功能（GC5菌体具有较高的产纤维素酶能力）等。

本发明的另一个目的是在于提供了一种枯草芽孢杆菌GC5表面展示GCRV VP7蛋白的重组芽孢的制备方法，该方法以野生型枯草芽孢杆菌芽孢为载体，通过芽孢表面展示技术将草鱼呼肠孤病毒抗原蛋白VP7展示于枯草芽孢杆菌芽孢表面。由于芽孢具有抗逆性强、易储存、制备简便、易于大规模生产和在水体环境中稳定性好等特点，解决了GCRV VP7蛋白作为免疫抗原在极端环境中不稳定的问题。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

本发明的技术方案为：以野生型枯草芽孢杆菌GC5芽孢衣蛋白基因cotC为分子载体，与草鱼呼肠孤病毒蛋白基因vp7重组，构建出融合表达草鱼呼肠孤病毒蛋白VP7的整合型重组质粒。转化枯草芽孢杆菌GC5，利用同源重组获得枯草芽孢杆菌重组菌株，通过诱导表达该重组菌株得到表面展示有草鱼呼肠孤病毒蛋白VP7的芽孢。

一种枯草芽孢杆菌GC5表面展示GCRV VP7蛋白的重组芽孢的制备方法，其步骤是：

（1）获得目前流行株Ⅱ型GCRV VP7核酸序列（Genebank序列号：HQ231206）。从患病草鱼体内提取GCRV病毒，利用TRizol法提取病毒总RNA，用反转录PCR获得GCRV VP7核酸序列，并将其连接到克隆载体上测序，并与GeneBank上登录的其它流行株的VP7序列进行比对。将VP7序列克隆到表达载体pET-23b(+)(Novagen)中，获得质粒pET-23b(+)-VP7，转化大肠杆菌BL21(DE3) （TransGen Biotech ），经IPTG诱导表达，Ni柱纯化，透析，冷冻干燥浓缩，纯化的VP7蛋白加免疫佐剂免疫新西兰大白兔（中国科学院武汉病毒研究所）获得多克隆抗体，抗体经Protein A、特异性VP7蛋白亲和纯化备用，说明VP7蛋白具有较好的免疫原性。

（2）从草鱼体内分离野生型芽孢杆菌，并通过一系列序列分析（gyrB, rpoB, phoR 测序、进化树分析）及生化实验（革兰氏染色、过氧化氢酶、需氧性、明胶液化、淀粉水解、甲基红、枸橼酸盐利用实验）鉴定，确定其为枯草芽孢杆菌，命名为枯草芽孢杆菌GC5 Bacillus subtilis GC5。该菌株于2014年12月19日送交武汉大学内的中国典型培养物保藏中心（英文简称CCTCC）保藏，其保藏编号为：CCTCC NO:M2014654。

（3）融合表达的重组整合型载体构建。融合表达的整合型重组质粒是将枯草芽孢杆菌GC5的芽孢衣蛋白基因cotC（扩增于GC5染色体）与草鱼呼肠孤病毒蛋白衣壳蛋白基因vp7重组构建的质粒，这些重组质粒中含有整合基因amyE、适用于大肠杆菌的抗性选择标记基因Amp ^r（扩增于pMD-18T载体,购自宝生物工程（大连）有限公司）、适用于枯草芽孢杆菌的抗性选择标记基因Cm ^r（扩增于pHT43载体，武汉大学生命科学学院陈向东教授馈赠，MoBiTec:http://www.mobitec.com/cms/index.html ）、芽孢衣蛋白基因启动子和不加终止密码子的芽孢衣蛋白编码序列、柔性链接link (GGGGS)₃、草鱼呼肠孤病毒蛋白衣壳蛋白基因vp7及芽孢衣蛋白基因转录终止子序列以及原核复制子片段oriC。将重组载体命名为pMD-MACCVC，重组质粒中vp7序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

（4）重组枯草芽孢杆菌的制备及鉴定。为了解决野生型枯草芽孢杆菌转化效率低而且不稳定的问题，在制备枯草芽孢杆菌感受态细胞时，需要在过夜培养的培养基中加入终浓度为5%的吐温80。按照经典Spizizen方法（BGSC，http://www.bgsc.org/），将线性化的重组整合型载体通过同源重组整合进Bacillus subtilis GC5染色体中，经过抗生素筛选后，重组菌株通过淀粉酶活性实验及PCR方法进行鉴定。将重组菌株命名为枯草芽孢杆菌GC5/ pMD-MACCVC Bacillus subtilis GC5/ pMD-MACCVC。该菌株于2014年12月19日送交武汉大学内的中国典型培养物保藏中心（英文简称CCTCC）保藏，其保藏编号为：CCTCC NO:M2014655。所述的重组枯草芽孢杆菌GC5/ pMD-MACCVC中含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

该菌株有以下特征：最适生长温度为37℃，菌落表面粗糙不透明，边缘不整齐，呈齿状，微黄色（如附图2所示），培养基：LB 培养基配方：1L 溶液中，10g Tryptone( 胰蛋白胨 )，5g Yeast Extract( 酵母提取物 )，10g NaCl（氯化钠）, 再加入 16g Agar( 琼脂 )pH7.2，氯霉素抗性；

进一步的纤维素降解实验、生物膜形成实验、上皮细胞粘附实验、平板抑菌实验验证该菌株能够产纤维素酶、形成生物膜、粘附肠道上皮细胞、具有抑菌活性（抑制嗜水气单胞菌、肠型点状气单胞菌、鲶爱德华氏菌、河弧菌、无乳链球菌、大肠杆菌）。

（5）表面展示VP7重组芽孢的诱导及其鉴定。利用DSM培养基观察Bacillus subtilis GC5/ pMD-MACCVC的产孢时间及产孢效率。通过免疫荧光实验检测芽孢表面展示GCRV VP7蛋白，所述的重组枯草芽孢杆菌GC5/ pMD-MACCVC中含有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

该芽孢有以下特征：在营养缺乏的培养基中，枯草芽孢杆菌能够形成芽孢，产芽孢培养基：DSM培养基的配制：0.8％肉汤营养液（Difco），0.1％ KCl，0.025％ MgSO₄·7H₂O，1.0 mM Ca(NO₃)₂，10 μM MnCl₂，1.0 μM FeSO₄，最佳产孢条件为37℃。

进一步芽孢耐高温、耐酸、耐胆盐、上皮细胞粘附实验表明该芽孢能够耐高温（90℃，10min）, 该芽孢耐酸（pH=1的条件下处理2h，芽孢萌发率不会发生变化）、耐胆盐（胆汁酸盐浓度达到10%，芽孢萌发率无明显变化）,同样能够粘附肠上皮细胞。（重组菌株的功能与特点）。

本发明涉及GCRV vp7片段扩增的引物序列为：

vp7-F：5’-CGCGGATCCATGGCGGGTGTGTCTCTCAAC-3’

vp7-R：5’-CCGCTCGAGCTACAGCATCTGCGCGAATATCCGTCTT-3’

本发明涉及枯草芽孢杆菌淀粉酶基因amyE片段扩增的引物序列为：

amyE-NheI：5’-TCACTAGCTAGCTCATTGCTCGGGCTGTATGACTG-3’

amyE –SmaI：5’- CTGACCCGGGAATCTCACACCATTTCCGCCTCC-3’

amyE- HindIII：5’- ATTCAAGCTTGAAAAGCCAAATAGGCGATCGCGGGAG-3’

amyE- ScaI：5’- GGTACCAGTACTGTTACACCATCACTGTTCGTTCC-3’

本发明涉及氯霉素抗性基因Cm^r片段扩增的引物序列为：

Cm^R-F：5’-ATCCCGGGAGCACGCCATAGTGACTGGC-3’

Cm^R-R：5’-CGGGGTACCTTAAGTTATTGGTATGACTGGTTTTAAG-3’

本发明涉及cotC启动子、不含终止密码子的编码序列及柔性link (GGGGS)₃片段扩增的引物序列为：

CotC-1s：5’-CTAGTCTAGATGTAGGATAAATCGTTTGGGC-3’

CotC-1a：5’-ACCGCCACCTCCGTAGTGTTTTTTATGCTTTTTATACTC-3’

CotC-2a：5’-CTACCGCCACCTCCACTACCGCCACCTCCGTAGTG-3’

CotC-3a：5’-ACCGCCACCTCCACTACCGCCACCTCCACTAC-3’

CotC-4a：5’-CGGGATCCACTACCGCCACCTCCACTACCG-3’

本发明涉及cotC启动子转录终止子片段扩增的引物序列为：

Cot-ter-1s：5’-GCTCGAGACGCCATTAACATCTCCTCG-3’

Cot-ter-1a：5’-AAGAATGCGGCCGCAGTAAAATGAGATAAAATACGATG-3’。

将重组菌株命名为Bacillus subtilis GC5/ pMD-MACCVC，枯草芽孢杆菌GC5，分离自草鱼肠道，该菌株于2014年12月19日送交武汉大学内的中国典型培养物保藏中心（英文简称CCTCC保藏，其保藏编号为：CCTCC NO:M2014654。

将重组载体命名为pMD-MACCVC。重组枯草芽孢杆菌GC5/ pMD-MACCVC，该菌株于2014年12月19日送交武汉大学内的中国典型培养物保藏中心（英文简称CCTCC保藏，其保藏编号为：CCTCC NO:M2014655。

所述的重组枯草芽孢杆菌GC5/ pMD-MACCVC中含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

所述的重组枯草芽孢杆菌GC5/ pMD-MACCVC中含有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

本发明所采用的野生型枯草芽孢杆菌GC5来自草鱼肠道，避免了其它来源的菌体的免疫原性及安全性问题，无毒副作用，不会造成环境污染，符合绿色渔药标准；本发明所用的转化方法适用于野生型枯草芽孢杆菌，提高了野生型枯草芽孢杆菌的转化率；本发明将草鱼呼肠孤病毒蛋白VP7与芽孢衣蛋白cotC融合表达，通过在两蛋白质之间加入柔性link序列，可以使两蛋白互不干扰形成各自的空间构象，从而更好地保证VP7蛋白的免疫原性；本发明将VP7蛋白（实验证明重组VP7蛋白免疫草鱼后，能够在血清里检测到针对VP7蛋白的特异性抗体，该抗体做体外细胞病毒中和实验能够阻止GCRV感染，因此VP7蛋白可以作为制备针对GCRV疫苗的免疫原）展示于枯草芽孢杆菌GC5芽孢表面，由于芽孢能够耐酸、耐高胆汁盐，使得重组芽孢能够抵御动物体类极端的胃肠道环境，即通过草鱼消化道屏障达到免疫提呈细胞进入免疫系统，因此展示于芽孢表面的VP7蛋白可直接用作草鱼呼肠孤病毒的口服疫苗，相比其他容易被消化道降解的重组疫苗（蛋白质亚单位疫苗、DNA疫苗），具有明显的优越性，另一方面，重组芽孢在肠道萌发后形成的菌体，在肠道内具有很好的定植及生物膜的能力，同时还具有很强的抑菌能力（尤其是对水产病原微生物），因此，重组枯草芽孢杆菌芽孢萌发形成的菌体能够通过大量分泌抑菌物质或者通过形成生物膜占据病原体的侵染位点从而提高动物体抵御病原微生物的能力，即使用枯草芽孢杆菌GC5表面展示草鱼呼肠孤病毒蛋白VP7的重组芽孢具有预防GCRV和提高机体免疫力的双重功效；本发明所产生的芽孢能耐高温，因此在饲料制备的过程中添加作为饲料添加剂，草鱼可以直接摄食，可解决鱼类群体免疫接种难题，并且制备方便，易于储存。

附图说明

图1为一种融合表达 cotC-VP7整合性重组质粒pMD-MACCVC结构示意图。

amyE 5’-end 和amyE 3’-end 分别表示淀粉酶基因编码序列的5’端和3’端DNA片断，通过双交换整合在Bacillus subtilis GC5 染色体的淀粉酶基因中；Amp^r和Cm^r分别表示青霉素抗性基因和氯霉素抗性基因，用于大肠杆菌或Bacillus subtilis GC5中筛选重组菌株或转化子；cotC-VP7为在Bacillus subtilis GC5芽孢中融合表达cotC-VP7重组蛋白的基因片段，该片段含cotC启动子序列、不含终止密码子的cotC编码序列、柔性link (GGGGS)₃、vp7的全编码序列以及cotC终止子序列。oriC为大肠杆菌复制子片段。

图2为一种重组菌株Bacillus subtilis GC5/ pMD-MACCVC的淀粉酶活性分析示意图。

1：在淀粉平板上培养野生型菌株Bacillus subtilis GC5和重组菌株Bacillus subtilis GC5/ pMD-MACCVC；2：在淀粉平板上被碘液染色后的野生型菌株Bacillus subtilis GC5和重组菌株Bacillus subtilis GC5/ pMD-MACCVC。

图3为一种PCR检测重组菌株中的Cm^r-cotC-VP7片段示意图。

分别以重组菌株Bacillus subtilis GC5/ pMD-MACCVC及野生菌株Bacillus subtilis GC5的染色体为模板，用amyE-F/amyE-R引物，进行PCR鉴定重组基因。Marker：DNA marker III；1-8：重组菌株Bacillus subtilis GC5/ pMD-MACCVC阳性转化子；9：pMD-MACCVC质粒；10：野生菌株Bacillus subtilis GC5。

图4为一种菌株Bacillus subtilis GC5/ pMD-MACCVC芽孢表面展示VP7蛋白的重组芽孢的免疫荧光鉴定示意图。

A：可见光下观察菌株Bacillus subtilis GC5芽孢（10×100油镜）；B：紫外光下观察菌株Bacillus subtilis GC5芽孢。C：可见光下观察菌株Bacillus subtilis GC5/ pMD-MACCVC重组芽孢（10×100油镜），D：紫外光下观察菌株Bacillus subtilis GC5/ pMD-MACCVC重组芽孢。E、F：分别为C和D的放大。兔抗-VP7多克隆抗体与菌株Bacillus subtilis GC5/ pMD-MACCVC重组芽孢结合后，与以FITC荧光素标记羊抗兔IgG抗体免疫反应，荧光显微镜（10×100油镜）观察并拍照（附图4中D、F中绿色荧光改为黑色）。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

所有质粒的构建采用Sambrook等人 (《分子克隆：试验手册》第二版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1989) 所述的标准分子生物学技术进行，用于本发明的所有回收DNA片段均采用凝胶回收试剂盒分离纯化（TIANGEN天根生化科技（北京）有限公司）。所有PCR产物克隆片段均经武汉擎科技术服务公司测序。

实施例1：

GCRV VP7基因的克隆、测序及鉴定。

（1）因感染GCRV病毒死亡的草鱼样品采自安徽省合肥市，取病鱼头肾、肠道，剪成小块，用PBS在匀浆器中研磨，然后-80℃/28℃反复冻融3次，用擦镜纸过滤，1500 rpm离心10 min，取上清病毒液，8000 rpm离心30 min。上清经0.22 μm滤膜过滤除菌，获得病毒粗提取液。利用TRizol（Invitrogen）法提取总RNA，用反转录试剂盒（Promega）获得cDNA。

（2））根据目前流行株Ⅱ型GCRV VP7核酸序列（Genebank序列号：HQ231206），设计并合成以下序列：

vp7-F：5’-CGCGGATCCATGGCGGGTGTGTCTCTCAAC-3’

vp7-R：5’-CCGCTCGAGCTACAGCATCTGCGCGAATATCCGTCTT-3’

PCR反应体系按照TaKaRa PrimeSTAR GXL DNA Polymerase使用说明书进行。PCR扩增条件为：94℃，5 min；94℃，30 sec；55℃，30 sec；72℃，30 sec，30个循环；72℃延伸5 min。取扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，PCR纯化试剂盒纯化。

（3）GCRV VP7基因片段的测序与鉴定。

PCR产物大小为1056 bp，包括GCRV VP7基因的1038 bp的编码序列。扩增片段克隆于pMD-18T载体中（TAKARA)，克隆重组质粒命名为 pMD18-VP7，克隆片断测序，重组质粒中VP7基因序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

测序结果在NCBI（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中通过BLAST软件搜索比对。本发明中GCRV（合肥株）VP7序列与NCBI中序列号分别为KC238685、GU350747、KC201175、KC201186等的5个VP基因的同源性均为100％。

（3）将VP7序列克隆到表达载体pET-23b(+)(Novagen)中，获得质粒pET-23b(+)-VP7，转化大肠杆菌BL21(DE3) （TransGen Biotech ），经IPTG诱导表达，Ni柱纯化，透析，冷冻干燥浓缩，纯化的VP7蛋白加免疫佐剂免疫新西兰大白兔（中国科学院武汉病毒研究所）获得多克隆抗体，抗体经Protein A、特异性VP7蛋白亲和纯化备用，说明VP7蛋白具有较好的免疫原性。

实施例2：

野生型枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis GC5的分离与鉴定。

（1）从集市上购买数条鲜活草鱼；取出肠道纵向剪开，用PBS涮洗两次，无菌水涮洗一次，刮取肠道黏膜壁并将刮取物置于新的PBS中，适当稀释，80℃处理20 min，涂布TSA平板，37℃培养过夜。挑取平板上与芽孢杆菌相似的菌落于TSB中培养，之后用革兰氏阳性菌的16S RNA通用引物扩增并测序，测序结果在NCBI中用 BLAST比对，分析比对结果，多次划线，纯化菌株。

（2）通过gyrB、rpoB、phoR基因序列比对及一系列的生理生化(革兰氏染色、过氧化氢酶、需氧性、明胶液化、淀粉水解、甲基红、枸橼酸盐利用实验）实验鉴定确定从草鱼肠道分离到的细菌为枯草芽孢杆菌，将其命名为Bacillus subtilis GC5。在此基础上，进一步实验验证Bacillus subtilis GC5有很好抑菌活性、产纤维素酶活性、生物膜产生能力、对上皮细胞的粘附能力，并且能够芽孢耐高温、耐酸、耐胆汁盐。严格按照细菌基因组提取试剂盒（康为世纪生物技术有限公司）说明书提取枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis GC5的染色体。

实施例3：

融合表达的重组整合型载体构建：

（2）重组质粒是以pMD-M质粒（为本实验室构建，以pMD-19T simple(TAKARA)为母体，含有酶切位点依次为NheI、SmaI、KpnI、NotI、XhoI、BamHI、XbaI、HindIII、ScaI）为平台构建的。pMD-M质粒构建过程：根据pTurboGFP质粒上的GFP片段(GenBank: LC008492.1)设计引物，同时在上游引物加入NheI、SmaI、KpnI、NotI、XhoI酶切位点，在下游引物加入BamHI、XbaI、HindIII、ScaI酶切位点，引物序列如下：

GFP-F:GCTAGCCCCGGGGGTACCGCGGCCGCCTCGAGATGGTGAGCAAGGGCG

GFP-R:AGTACTAAGCTTTCTAGAGGATCCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG

以GFP-F和GFP-R为引物，pTurboGFP质粒为模板，扩增GFP基因片段，PCR反应程序为：94℃变性 5 min ；94℃ 30 sec，55℃ 30 sec，72℃ 1 min，30 个循环；72℃延伸5 min。扩增产物大小约为780 bp，回收扩增片段克隆到pMD-19T simple，得到pMD-M质粒。

（3）根据Bacillus subtilis 168染色体上的淀粉酶基因amyE（GenBanK序列号：NP_388186）序列，加入酶切位点，设计并合成引物：

amyE-NheI：5’-TCACTAGCTAGCTCATTGCTCGGGCTGTATGACTG-3’

amyE –SmaI：5’- CTGACCCGGGAATCTCACACCATTTCCGCCTCC-3’

amyE- HindIII：5’- ATTCAAGCTTGAAAAGCCAAATAGGCGATCGCGGGAG-3’

amyE- ScaI：5’- GGTACCAGTACTGTTACACCATCACTGTTCGTTCC-3’

以amyE-NheI和amyE-SmaI，amyE-HindIII和amyE-ScaI分别为引物，GC5染色体为模板。PCR扩增条件为：94℃，5 min；94℃，30 sec；55℃，30 sec；72℃，30 sec，30个循环；72℃延伸5 min，扩增得到amyEF和amyER2个片段，大小约为550 bp。分别用NheI和SmaI，HindIII和ScaI酶切，依次与用同样酶切的pMD-M质粒连接，产物传化E.coli DH5α，鉴定后的重组质粒为pMD-MA。

(4) 根据质粒pHT43上的氯霉素抗性基因Cm ^r的序列设计（GenBank: KC779546.1）并合成以下引物：

Cm^R -F：5’-ATCCCGGGAGCACGCCATAGTGACTGGC-3’

Cm^R-R：5’-CGGGGTACCTTAAGTTATTGGTATGACTGGTTTTAAG-3’

以Cm^R-F和Cm^R-R为引物，质粒pHT43为模板，扩增氯霉素抗性基因Cm ^r片段，

PCR反应程序为：94℃变性 5 min ；94℃ 30 sec，57℃ 30 sec，72℃ 1 min，30 个循环；72℃延伸5 min。扩增产物大小约为1100 bp，回收扩增片段克隆到pMD-MA，得到pMD-MAC质粒。

（5）根据Bacillus subtilis 168染色体上的cotC（GenBanK：NP 389653）序列，同时为了保证VP7蛋白与cotC蛋白融合表达时不影响蛋白构象，在两段序列之间设计一段柔性link (GGGGS)₃，通过重叠延伸PCR方法连接到cotC序列上，设计并合成以下引物（含有cotC启动子）：

CotC-1s：5’-CTAGTCTAGATGTAGGATAAATCGTTTGGGC-3’

CotC-1a：5’-ACCGCCACCTCCGTAGTGTTTTTTATGCTTTTTATACTC-3’

CotC-2a：5’-CTACCGCCACCTCCACTACCGCCACCTCCGTAGTG-3’

CotC-3a：5’-ACCGCCACCTCCACTACCGCCACCTCCACTAC-3’

CotC-4a：5’-CGGGATCCACTACCGCCACCTCCACTACCG-3’

以CotC-1s和CotC-1a为引物，GC5染色体为模板，PCR扩增条件为：94℃，5 min；94℃，30 sec；56℃，30 sec；72℃，30 sec，30个循环；72℃延伸5 min，扩增得到cotC1片段。依次用CotC-1s和CotC-2a、CotC-3a、CotC-4a为引物，用上一轮PCR产物作为模板，经过3轮PCR得到cotC4片段，用BamI和XbaI酶切，与用同样酶切的pMD-MAC质粒连接，产物传化E.coli DH5α（TAKARA），鉴定后的重组质粒为pMD-MACC。

(6) 用BamI和XhoI酶切pMD18-VP7质粒，获得VP7片段，与用同样酶切的pMD-MACC质粒连接，产物传化E.coli DH5α，鉴定后的重组质粒为pMD-MACCV。

（7）转录终止子促进蛋白表达，因此根据Bacillus subtilis 168染色体上的cotC基因转录终止序列（GenBanK：NP 389653），加入酶切位点，设计并合成引物：

Cot-ter-1s：5’-GCTCGAGACGCCATTAACATCTCCTCG-3’

Cot-ter-1a：5’-AAGAATGCGGCCGCAGTAAAATGAGATAAAATACGATG-3’

以Cot-ter-1s和Cot-ter-1a为引物, GC5染色体为模板，PCR扩增条件为：94℃，5 min；94℃，30 sec；56℃，30 sec；72℃，20 sec，30个循环；72℃延伸5 min，扩增得到cotC基因终止子片段。用NotI和XhoI酶切，与用同样酶切的pMD-MACCV质粒连接，产物传化 E.coli DH5α，将重组载体命名为pMD-MACCVC。该质粒的图谱见本发明附图1。

实施例4：

以CotC为载体蛋白表面展示VP7的重组枯草芽孢杆菌的制备及鉴定。

（1）按照经典Spizizen方法制备枯草芽孢杆菌感受态细胞，在细节上略有改进，为了提高野生型菌株的细胞膜通透性，在用于过夜培养的SPI培养基中加入终浓度为5%的吐温80。

（2）将整合型质粒pMD-MACCVC用NheI和ScaI酶切线性化，转化枯草芽孢杆菌GC5，先以含5 μg/mL氯霉素的LB平板筛选转化子，再从平板上挑单菌落接种到含高浓度（20 μg/mL）氯霉素的LB平板上进一步筛选。

（3）淀粉平板碘液染色法鉴定。0.5％淀粉平板的制备：固体LB培养基中加可溶性淀粉至终浓度为0.5％，高压灭菌后制备平板；碘液的配制：先将2 g碘化钾溶于少量蒸馏水中，待全溶解后再加1 g碘，振荡溶解后稀释至300 mL，保存于棕色玻璃瓶内，使用时稀释5倍。取1μL上述重组枯草芽孢杆菌滴于淀粉平板上，野生型Bacillus subtilis GC5作为对照，37℃培养16 h，取适量碘液滴于平板上，菌落周围颜色变蓝表明重组基因成功插入到了Bacillus subtilis GC5染色体上的淀粉酶基因amyE中，导致淀粉水解酶失去活性，从而无法水解淀粉，因此淀粉遇碘变蓝；菌落周围产生透明水解圈表明水解酶基因amyE没有被破坏。见图2。

（4）特异性引物PCR鉴定。用细菌基因组提取试剂盒提取重组Bacillus subtilis GC5的染色体。以引物amyE-NheI/ amyE-ScaI进行PCR扩增。PCR反应条件根据各个引物对的特征分别设置。在重组菌株中分别检测到大小约为3800 bp的扩增片段，而野生型菌株中只检测到约1100 bp的淀粉酶基因，见图3。这表明Cm^R-cotC-VP7重组片段成功插入到淀粉水解酶基因amyE中。将鉴定后的重组菌株命名为Bacillus subtilis GC5/ pMD-MACCVC，该菌株于2014年12月19日送交武汉大学内的中国典型培养物保藏中心（英文简称CCTCC保藏，其保藏编号为：CCTCC NO:M2014655。所述的重组枯草芽孢杆菌GC5/ pMD-MACCVC中含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述的重组枯草芽孢杆菌GC5/ pMD-MACCVC中含有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

进一步的平板抑菌实验、纤维素降解实验、生物膜形成实验、上皮细胞粘附实验验证Bacillus subtilis GC5/ pMD-MACCVC有很好抑菌活性(抑制嗜水气单胞菌、肠型点状气单胞菌、鲶爱德华氏菌、河弧菌、无乳链球菌、大肠杆菌)、产纤维素酶活性、生物膜产生能力、对上皮细胞的粘附能力。

实施例5：

表面展示VP7重组芽孢的诱导及其鉴定。

以DSM培养基诱导重组菌株Bacillus subtilis GC5/ pMD-MACCVC形成芽孢，高温、低pH、高胆盐处理实验表明芽孢能够耐高温、耐酸、耐胆汁盐（分别经100℃处理5min；pH=1处理2h； 10%胆汁酸盐，处理2h，芽孢萌发率均没有显著变化）。DSM培养基的配制：0.8％肉汤营养液（Difco），0.1％ KCl，0.025％ MgSO₄·7H₂O，1.0 mM Ca(NO₃)₂，10 μM MnCl₂，1.0 μM FeSO₄。挑取重组菌株Bacillus subtilis GC5/ pMD-MACCVC单菌落接种于15 mL DSM培养基中，37℃震荡培养45 h，5000 rpm离心5 min收集芽孢，重悬于5 mL无菌水中。取芽孢用含有5% BSA的PBS重悬于EP管中，加入一定量兔抗-VP7多克隆抗体（实施例1中步骤3制备），4℃孵育过夜；离心后，用PBS孵育5 min、离心洗涤，反复5次；加稀释后的FITC荧光素标记羊抗兔IgG抗体（北京中杉金桥），37℃作用30 min；PBS漂洗（操作同上）后，用蒸馏水重悬，取10 μL滴于载玻片上（避光），干燥后，加抗猝灭剂封片后盖上盖玻片，置于荧光显微镜下观察结果（见本发明附图说明及附图4），野生型Bacillus subtilis GC5同样操作作为对照。产生绿色荧光的芽孢表明表面展示VP7蛋白，该芽孢即为表面展示VP7蛋白的重组芽孢。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院水生生物研究所

<120> 一种枯草芽孢杆菌GC5表面展示GCRV VP7蛋白的重组芽孢及制备方法

<130> 一种枯草芽孢杆菌GC5表面展示GCRV VP7蛋白的重组芽孢及制备方法

<160> 2

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 1038

<212> DNA

<213> 草鱼呼肠孤病毒

<400> 1

atggcgggtg tgtctctcaa catcaatcgc aacatctcaa actcggcatc aacgatcttt 60

ctcgaagata ttccattact gtcatgttca gtgcggtgtg aacccggtaa aggacgcgaa 120

ttaccaaaat ttaacatgag ctgccctgct attaacgcga tgggtcgatg tcttaatcca 180

atgaagttca ttgctgagca ctgggtcccc aacagtccaa gtcgtaaacc atccagacag 240

cattggcgta atgttttgaa tggactggaa ttcagtaatg gtcgtggatt cgatgtgctg 300

agtttctcac cagcgggcat ggctgttctt cgtgacatcc tgacagaaga tagcgtgaaa 360

tattgctttg acgagagtaa cacttgcagt ttgttcacct tgctgtacac tctgtgttgc 420

gatgccgcag gcgtagaacc gatggacttg gattcacgtc agacggacgc cagtgcccgg 480

atggtgagct accaagatcg cgctatcgtg ctgacctcta atgaggcagg agacagaatt 540

gagccgtgga atgttgagct cgacaaggag tttggaaatc cagatctgct cagccgtctg 600

aacatctcat atggcgtgca acgatatggc gactccaaag ccagcacaga cactctgacc 660

ttggctgatg ccccagagag gtccaagcct gctctgatta ctgtgcaacc cttattggtg 720

gctatgtgca tcaaacagtc tttggatggc ttgctggctt tatctgattt gcgcctgaga 780

ttcgatcagt atcctggata cgcaaatgct ctcatgaatg ctatggccat gtacgcttgc 840

ctagatcgtg acttgatgcg ttttctgctc cgcttagaaa tgactcacgc gagcacggtg 900

tctgaagtgg ctgagtgctg gaggaactct cgcaactctc gcgatgcaac aggttgtcat 960

attgtcccac gtcaaggttt gctcatcatc gtttccggag atgtcgaggt aagacggata 1020

ttcgcgcaga tgctgtag 1038

<210> 2

<211> 345

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌

<400> 2

Met Ala Gly Val Ser Leu Asn Ile Asn Arg Asn Ile Ser Asn Ser Ala

1 5 10 15

Ser Thr Ile Phe Leu Glu Asp Ile Pro Leu Leu Ser Cys Ser Val Arg

20 25 30

Cys Glu Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Pro Lys Phe Asn Met Ser Cys

35 40 45

Pro Ala Ile Asn Ala Met Gly Arg Cys Leu Asn Pro Met Lys Phe Ile

50 55 60

Ala Glu His Trp Val Pro Asn Ser Pro Ser Arg Lys Pro Ser Arg Gln

65 70 75 80

His Trp Arg Asn Val Leu Asn Gly Leu Glu Phe Ser Asn Gly Arg Gly

85 90 95

Phe Asp Val Leu Ser Phe Ser Pro Ala Gly Met Ala Val Leu Arg Asp

100 105 110

Ile Leu Thr Glu Asp Ser Val Lys Tyr Cys Phe Asp Glu Ser Asn Thr

115 120 125

Cys Ser Leu Phe Thr Leu Leu Tyr Thr Leu Cys Cys Asp Ala Ala Gly

130 135 140

Val Glu Pro Met Asp Leu Asp Ser Arg Gln Thr Asp Ala Ser Ala Arg

145 150 155 160

Met Val Ser Tyr Gln Asp Arg Ala Ile Val Leu Thr Ser Asn Glu Ala

165 170 175

Gly Asp Arg Ile Glu Pro Trp Asn Val Glu Leu Asp Lys Glu Phe Gly

180 185 190

Asn Pro Asp Leu Leu Ser Arg Leu Asn Ile Ser Tyr Gly Val Gln Arg

195 200 205

Tyr Gly Asp Ser Lys Ala Ser Thr Asp Thr Leu Thr Leu Ala Asp Ala

210 215 220

Pro Glu Arg Ser Lys Pro Ala Leu Ile Thr Val Gln Pro Leu Leu Val

225 230 235 240

Ala Met Cys Ile Lys Gln Ser Leu Asp Gly Leu Leu Ala Leu Ser Asp

245 250 255

Leu Arg Leu Arg Phe Asp Gln Tyr Pro Gly Tyr Ala Asn Ala Leu Met

260 265 270

Asn Ala Met Ala Met Tyr Ala Cys Leu Asp Arg Asp Leu Met Arg Phe

275 280 285

Leu Leu Arg Leu Glu Met Thr His Ala Ser Thr Val Ser Glu Val Ala

290 295 300

Glu Cys Trp Arg Asn Ser Arg Asn Ser Arg Asp Ala Thr Gly Cys His

305 310 315 320

Ile Val Pro Arg Gln Gly Leu Leu Ile Ile Val Ser Gly Asp Val Glu

325 330 335

Val Arg Arg Ile Phe Ala Gln Met Leu

340 345

Claims

1.一种枯草芽孢杆菌GC5表面展示GCRV VP7蛋白的重组芽孢，其特征在于：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis GC5，CCTCC NO:M2014654。

2.一种枯草芽孢杆菌GC5表面展示GCRV VP7蛋白的重组芽孢，其特征在于：重组枯草芽孢杆菌GC5/ pMD-MACCVC，CCTCC NO:M2014655。

3.一种枯草芽孢杆菌GC5表面展示GCRV VP7蛋白的重组芽孢，其特征在于：融合表达的整合型重组质粒pMD-MACCVC是将枯草芽孢杆菌GC5的芽孢衣蛋白基因cotC与草鱼呼肠孤病毒蛋白衣壳蛋白基因vp7重组构建的质粒，重组质粒中含有整合基因amyE、大肠杆菌的抗性选择标记基因Amp ^r、枯草芽孢杆菌的抗性选择标记基因Cm ^r、芽孢衣蛋白基因启动子和不加终止密码子的芽孢衣蛋白编码序列、柔性链接link (GGGGS)₃、草鱼呼肠孤病毒蛋白衣壳蛋白基因vp7及芽孢衣蛋白基因转录终止子序列。

4.权利要求2所述的一种枯草芽孢杆菌GC5表面展示GCRV VP7蛋白的重组芽孢，其特征在于：所述的重组枯草芽孢杆菌GC5/ pMD-MACCVC中含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

5.权利要求2所述的一种枯草芽孢杆菌GC5表面展示GCRV VP7蛋白的重组芽孢，其特征在于：所述的重组芽孢是枯草芽孢杆菌重组菌株诱导形成的枯草芽孢杆菌的芽孢，芽孢表面展示草鱼呼肠孤病毒蛋白VP7，所述的重组枯草芽孢杆菌GC5/ pMD-MACCVC中含有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。