CN113151346B - 一种CRISPR/Cas9系统介导的小麦多基因敲除编辑体系 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种CRISPR/Cas9系统介导的小麦多基因敲除编辑体系，所述体系包括一种重组载体，所述重组载体含有骨架结构，所述骨架结构由Ubi启动子、核定位序列、Cas9基因、核定位序列、E9终止子、Actin启动子、tRNA编码基因、n个DNA片段1、PolyA序列与Nos终止子连接得到，n为2‑5间的自然数，所述DNA片段1由gRNA编码基因与tRNA编码基因连接得到。本专利利用CRISPR/Cas9基因编辑技术和tRNA自剪切同时释放多个sgRNAs策略，在小麦中实现了同时靶向2个、3个、4个和多达15个基因组的5个基因的敲除编辑，仅在一代中就实现了多个优异等位基因的聚合。

Description

一种CRISPR/Cas9系统介导的小麦多基因敲除编辑体系

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的说，涉及一种CRISPR/Cas9系统介导的小麦多基因敲除编辑体系。

背景技术

第三代基因编辑器CRISPR/Cas9系统，因具有操作简单、效率高等优点，已成为一种有效的农作物遗传改良和育种研究的分子工具。该系统通过Cas9蛋白和导向RNA 在目标生物基因组范围内定位切割靶标位点，随后Cas9蛋白切割引起基因组DNA双链断裂，然后通过主要的非同源末端连接修复或低效率的同源重组修复方式引入突变。在进行非同源末端连接修复时，通常会引起小片段核苷酸的缺失或插入，使靶标基因表达产物发生改变，功能丧失，最终引起目标生物相应性状的变化，目前，利用该修复途径获得优良性状新种质已经在水稻、玉米等二倍体农作物中的得到了广泛的应用，但对于异源六倍体的普通小麦，应用的相对较少。

小麦是世界上重要的粮食作物之一，我国作为小麦总产量最高、消费量最大的国家，小麦的生产对我国的粮食安全和农业的可持续发展尤为重要。尽管在过去的几十年里，随着绿色革命和分子标记辅助育种，使小麦的产量增加了10倍，但在全球气候变化、世界人口增长、干旱和半干旱地区缺水以及环境和生态恶化的背景下，它仍然面临着前所未有的挑战。同时，由于小麦的基因功能冗余和多倍体特性，利用正向遗传学方法选择所需表型和破译由多个基因赋予的复杂性状，是非常耗时的，并且在某些情况下由于基因连锁等特性，在商品化品种中聚合几个重要的农艺性状，是很难实现的。但利用CRISPR/Cas9技术可以同时靶向小麦的ABD三个亚基因组，定向改良小麦农艺性状，避免杂交和回交过程中基因累赘现象，目前利用CRISPR/Cas9技术在小麦中已实现单个目的基因的敲除，从而改良农艺性状，获得性状优良的小麦新种质。 Wang等利用CRISPR/Cas9系统实现了对TaMLO-A等位基因的定向敲除，为获得抗白粉病小麦材料奠定了基础(Wang et al.,2014)。Zhang等利用CRISPR/Cas9系统，获得了同时敲掉TaEDR1-1A、TaEDR1-1B和TaEDR1-1D基因的突变体，该突变株系表现为对白粉病具有一定的抗性，最终获得了抗白粉病小麦种质(zhang et al.,2017)。 Zhang等利用CRISPR/Cas9瞬时表达系统对影响小麦籽粒形状和分蘖的基因TaGASR7 和TaDEP1进行编辑，结果在T₀代即获得小麦纯合敲除突变体，且突变体的千粒重和分蘖数明显增加，获得了小麦高产新种质(zhang et al.,2016)。Wang等利用 CRISPR/Cas9系统敲除了一个决定粒重的关键基因TaGW2，最终获得了高产小麦新种质(wang etal.,2018)。Sánchez-León等通过对家族基因a-gliadin的定向敲除，获得了低含量a-醇溶蛋白的优质小麦种质(Sánchez-León et al.,2018)。Abe等利用CRISPR/Cas9系统敲除了由隐性遗传系统控制的TaQsd1基因，使种子形成较长的休眠期，抑制穗发芽，获得了优质小麦新种质(Abe et al.,2019)。CRISPR/Cas9系统作为一种定向的、可多位点编辑的有效基因编辑工具，已经证明可以改善水稻的综合农艺性状，同时获得多优良性状的水稻新种质。Zeng等利用CRISPR/Cas9系统，同时靶向了穗长基因OsPIN5b、粒长基因OsGS3和耐寒基因OsMYB30，最终获得了三重突变体的高产和耐寒性优异的水稻新种质(Zeng et al.,2020)。对于异源六倍体的普通小麦来说，利用CRISPR/Cas9系统同时靶向多个目的基因，同时改良多个农艺性状的体系和方法还有待研究、拓展及应用。研究表明，在水稻或小麦中,获得以下基因突变体，可以在产量、品质或资源高效利用方面获得优质新种质。OsARE1基因编码一种叶绿体蛋白，ARE1功能缺失型突变体在氮素有限条件下能增强氮素利用效率，提高产量(Wang et al.,2018)。OsSPDT基因编码磷分布转运蛋白，控制磷在谷物中的分配，敲除该基因能降低籽粒中的有机磷含量，增加叶片中的有机磷含量，减少环境污染(Yamaji et al.,2017)。失去功能或下调表达NPT1基因，可以增强分生组织的活性，导致水稻分蘖数减少、粒数增加、粒重增加，从而提高产量(Wang et al.,2017)。 TaSBEIIa基因编码淀粉分支酶，SBEIIa敲除突变体将减少支链淀粉含量，提高抗性淀粉含量，可获得高抗性淀粉小麦新种质(Li et al.,2020a)。OsIPA1基因是一个半显性数量性状位点，在调节水稻植株结构和提高产量方面发挥重要作用(Jiao et al.,2010)。因此，将在ZM7698中克隆ARE1、SPDT、NPT1、SBEIIa、Qsd1和IPA1六个同源基因，作为本实验的靶标基因。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于：如何同时对小麦中的多个目的基因进行敲除编辑。

本发明提供一种重组载体，所述重组载体含有骨架结构，所述骨架结构由Ubi启动子、核定位序列、Cas9基因、核定位序列、E9终止子、Actin启动子、tRNA编码基因、n个DNA片段1、PolyA序列与Nos终止子连接得到，n为2-5间的自然数，所述DNA片段1由gRNA编码基因与tRNA编码基因连接得到。

所述gRNA编码基因由目的基因的靶片段与gRNA骨架基因连接得到。所述 gRNA骨架基因为CRISPR/Cas9系统中gRNA编码基因的非靶序列部分。

其中，所述骨架结构还含有限制性内切酶识别序列。

所述限制性内切酶可用于将待敲除基因的靶序列插入至所述骨架结构中或对所述骨架结构进行编辑(如酶切和/或连接)。所述限制性内切酶可为HindⅢ，AvrⅡ， KpnⅠ。

所述重组载体，其特征在于：

所述Ubi启动子的序列为序列1的第2582-4573位；

和/或，所述核定位序列为序列1的第4664-4684位或者第8810-8857位；

和/或，所述Cas9基因的序列为序列1的第4709-8809位；

和/或，所述E9终止子的序列为序列1的第8865-9499位；

和/或，所述Actin启动子的序列为序列1的第269-1669位；

和/或，所述tRNA编码基因的序列为序列1的第1670-1746位；

和/或，所述PolyA的序列为序列1的第2098-2312位；

和/或，所述Nos终止子的序列为序列1的第2318-2570位；

和/或，所述gRNA骨架基因的序列为序列1的第1767-1842位。

其中，n为2-5间的自然数。n为2或3或4或5。

其中，所述重组载体的序列为如下A1)-A4)中的任一种：

A1)序列1；

A2)将序列1中第1670--2092位替换为序列2得到的序列；

A3)将序列1中第1670--2092位替换为序列3得到的序列；

A4)将序列1中第1670--2092位替换为序列4得到的序列。

上述重组载体能用于同时敲除m个基因，m为小于等于n的自然数。

序列1-4中，NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN为用于敲除靶基因的靶序列。所述靶序列的长度为20bp。

上述的重组载体在进行至少两个基因的敲除中的应用也应在本发明的保护范围之内。

本发明还提供一种植物多基因敲除方法，包括将所述重组载体中NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN分别替换为待敲除的不同目的基因的靶片段后转化到受体植物中，实现所述受体植物的多基因敲除。

所述受体植物为单子叶植物；

进一步，所述受体植物为禾本科植物；

更进一步，所述受体植物为小麦。

所述目的基因可为TaQsd1、TaNPT1、TaARE1、TaSPDT、TaIPA1和/或TaSBEⅡa。

在本发明的一个实施例中，制备将序列1中的第1670--2092位替换为序列5的重组载体，将所得重组载体转化小麦，实现小麦TaQsd1与TaNPT1的敲除。

在本发明的一个实施例中，制备将序列1中的第1670--2092位替换为序列6的重组载体，将所得重组载体转化小麦，实现小麦TaARE1与TaSPDT的敲除。

在本发明的一个实施例中，制备将序列1中的第1670--2092位替换为序列7的重组载体，将所得重组载体转化小麦，实现小麦TaQsd1、TaARE1与TaNPT1的敲除。

在本发明的一个实施例中，制备将序列1中的第1670--2092位替换为序列8的重组载体，将所得重组载体转化小麦，实现小麦TaQsd1、TaARE1与TaSPDT的敲除。

在本发明的一个实施例中，制备将序列1中的第1670--2092位替换为序列9的重组载体，将所得重组载体转化小麦，实现小麦TaQsd1、TaARE1、TaNPT1与TaIPA1 的敲除。

在本发明的一个实施例中，制备将序列1中的第1670--2092位替换为序列10的重组载体，将所得重组载体转化小麦，实现小麦TaQsd1、TaARE1、TaNPT1、TaSBEⅡa 与TaSPDT的敲除。

所述的重组载体或所述的方法在以下P1)或P2)中的应用也应在本发明的保护范围之内：

P1)植物育种；

P2)植物基因编辑。

本发明的有益效果在于：本研究以郑麦7698(Li et al.,2020a)为受体材料，对候选小麦同源基因ARE1、SPDT、NPT1、SBEIIa、Qsd1、IPA1进行了两个、三个、四个或五个目的基因的组合，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术和tRNA自剪切同时释放多个sgRNAs策略(Xie etal.,2015)，同时进行小麦多基因敲除编辑，根据实验结果，在优质小麦品种中，仅用一年的时间实现了多个有利等位基因的聚合，并且通过后代的分离，在T₁代已获得无转基因并且同时具有多优良性状的小麦种质。有效通用的小麦多基因编辑体系的建立，将极大地促进基础生物学的研究，例如破译由多基因赋予的复杂性状和加快多倍体农作物的育种进程，以促进农业的可持续发展和保障粮食安全。

附图说明

图1为靶标基因结构及靶点选择示意图；

图2为构建的多基因编辑载体结构示意图；其中a为 pBUE411-Ubi-NLS-Cas9-NLS-E9为本实验的基础载体框架图。b为 pBUE411-Ubi-NLS-Cas9-NLS-E9-Actin-tRNA-gRNA1-tRNA-gRNA2-tRNA-PolyA-Nos 为双基因组合敲除载体框架图。c为pBUE411-Ubi-NLS-Cas9-NLS-E9-Actin- tRNA-gRNA1-tRNA-gRNA2-tRNA-gRNA3-tRNA-PolyA-Nos为三基因组合敲除载体框架图。d为pBUE411-Ubi-NLS-Cas9-NLS-E9-Actin-tRNA-gRNA1-tRNA-gRNA2-tRNA-gRNA3-tRNA-gRNA4-tRNA-PolyA-Nos为四基因组合敲除载体框架图、e为 pBUE411-Ubi-NLS-as9-NLS-E9-Actin-tRNA-gRNA1-tRNA-gRNA2-tRNA-gRNA3-tRN A-gRNA4-tRNA-gRNA5-tRNA-PolyA-Nos为五基因组合敲除载体框架图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实验材料

用于小麦转化的小麦材料为郑麦7698(Li,J.,Jiao,G.,Sun,Y.,Chen,J.,Zhong,Y.,Yan, L.,Jiang,D.,Ma,Y.,and Xia,L.(2020a).Modification of starchcomposition,structure and properties through editing of TaSBEIIa in bothwinter and spring wheat varieties by CRISPR/Cas9. Plant BiotechnologyJournal.doi:10.1111/pbi.13519)，公众可以由中国农业科学院作物科学研究所获取。

基因枪转化表达载体pBUE411-Ubi-NLS-Cas9-NLS-E9基础载体(Xing,H.,Dong,L.,et al.(2014).A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing inplants.BMC Plant Biology,14)由中国农业大学陈其军老师和倪中福老师提供。

实验中所用内切酶、试剂盒、PCR酶均购自试剂公司。引物，DNA合成及测序均在华大和天一辉远公司完成。

本发明中，利用EnsemblPlants(http://plants.ensembl.org/Triticum_aestivum/ Info/Index)数据库调出小麦同源基因ARE1、SPDT、NPT1、SBEIIa、Qsd1、IPA1的核苷酸序列，并在受体材料郑麦7698中克隆以上候选基因(图1)。分别设计ABD三个基因组的同时敲除靶点，具体的靶点序列见表1，利用tRNA处理系统高效、精确地释放gRNAs的特点，分别间隔两个、三个、四个或五个gRNAs，并选择组成型启动子Actin启动表达，稳定转录本的polyA序列和Nos终止子终止表达，最终构建 TaQsd1+TaNPT1、TaARE1+TaSPDT双基因组合敲除载体 pBUE411-Ubi-NLS-Cas9-NLS-E9-Actin-tRNA-gRNA1-tRNA-gRNA2-tRNA-PolyA-Nos， TaQsd1+TaARE1+TaNPT1、TaQsd1+TaARE1+TaSPDT三个基因组合敲除载体pBUE411-Ubi-NLS-Cas9-NLS-E9-Actin-tRNA-gRNA1-tRNA-gRNA2-tRNA-gRNA3- tRNA-PolyA-Nos，TaQsd1+TaARE1+TaNPT1+TaIPA1四个基因组合敲除载体 pBUE411-Ubi-NLS-Cas9-NLS-E9-Actin-tRNA-gRNA1-tRNA-gRNA2-tRNA-gRNA3- tRNA-gRNA4-tRNA-PolyA-Nos，TaQsd1+TaARE1+TaNPT1+TaSBEⅡa+TaSPDT五个基因组合敲除载体pBUE411-Ubi-NLS-Cas9-NLS-E9-Actin-tRNA-gRNA1-tRNA-gRNA2-tRNA-gRNA3-tRNA-gRNA4-tRNA-g RNA5-tRNA-PolyA-Nos(图2)，该敲除载体的Cas9蛋白为密码优化后的Cas9蛋白，并且在两端各有一个核定位信号，有利于促进Cas9蛋白进入细胞核及提高工作效率，构建完成的载体采用基因枪法转化小麦幼胚，经小麦植物组织培养获得的再生植株，利用Hi-Tom试剂盒(Liu,Q.,Wang,C.,Jiao,X.,Zhang,H.,Song,L.,Li,Y.,Gao,C.,and Wang,K.(2019).Hi-TOM:aplatform for high-throughput tracking of mutations induced by CRISPR/Cassystems.Science China Life Sciences,62:1-7.)和基因组特异性引物扩增PCR产物测序方法进行基因型鉴定。

实施例1双基因组合载体构建

1.1TaQsd1+TaNPT1双基因组合敲除载体的构建

首先在pBUE411-Ubi-NLS-Cas9-NLS-E9基础载体上构建pBUE411-Ubi-NLS- Cas9-NLS-E9-Actin-PolyA-Nos载体。在第一轮PCR中，同时进行两个PCR体系的扩增，分别使用引物对414-M13-Actin-F/Nos-Hind-Act-R(表2)和Act-Hind-Nos-F/414 -Ubi-Nos-R(表2)，以Actin序列和Nos序列为模板进行扩增，第二轮PCR利用引物对414-M13-F/414-Ubi-R(表2)，以第一轮PCR获得的两种PCR产物为模板获得 Actin-Nos表达盒，并且将该表达盒与HindⅢ(NEB，北京，中国)酶切后的 pBUE411-Ubi-NLS-Cas9-NLS-E9基础载体，利用同源重组酶(全式金，北京，中国) 进行连接获得重组载体pBUE411-Ubi-NLS-Cas9-NLS-E9-Actin-Nos。PolyA片段使用引物Act-Hind-PolyA-F/Nos-PolyA-R(表2)对进行扩增，最终利用同源重组酶(全式金，北京，中国)将该片段克隆到HindⅢ(NEB，北京，中国)酶切后的 pBUE411-Ubi-NLS-Cas9-NLS-E9-Actin-Nos基础载体，获得重组载体 pBUE411-Ubi-NLS-Cas9-NLS-E9-Actin-PolyA-Nos。

利用重叠PCR方法获得tRNA和TracrRNA-tRNA基础片段。第一轮PCR，利用引物tRNA-F1、tRNA-F2、tRNA-R(表2)，获得tRNA基础片段，以tracrRNA为模板，利用引物TraRNA-F/tRNA-TracrRNA-MT-R2(表2)进行扩增，获得带tRNA接头的tracrRNA片段。第二轮PCR，以第一轮的PCR产物tRNA片段为模板，利用引物TracrRNA-MT-tRNA-F3/tRNA-w-R(表2)进行扩增，获得带tracrRNA接头的tRNA 片段，第三轮PCR以第一轮PCR产物tracrRNA片段和第二轮的tRNA片段按照摩尔比1:1进行混合后作为模板，利用引物TraRNA-F/tRNA-w-R进行扩增，获得 TracrRNA-tRNA基础片段。

利用重叠PCR方法获得tRNA-gRNA1(TaQsd1)-tRNA-gRNA2(TaNPT1)-tRNA 片段。第一轮PCR以tRNA片段为模板，利用引物9-Actin-tRNA-F/9-TaQsd1-tRNA-R (表2)进行扩增，获得带TaQsd1基因靶点序列的tRNA片段，以TracrRNA+tRNA 片段为模板，分别利用引物9-TaQsd1-TrRNA-F/9-TaNPT-tRNA-R和 9-TaNPT-TrRNA-F/PolyA-Hind-tRNA-R(表2)进行扩增，分别获得带接头的gRNA1 (TaQsd1)-tRNA和gRNA2(TaNPT1)-tRNA片段。第二轮PCR以第一轮PCR产物带TaQsd1基因靶点序列的tRNA片段、gRNA1(TaQsd1)-tRNA和gRNA2(TaNPT1) -tRNA片段按照摩尔比1:1:1进行混合后作为模板，利用引物Actin-w-F0/Poly-t-R0(表 2)进行扩增，获得tRNA-gRNA1(TaQsd1)-tRNA-gRNA2(TaNPT1)-tRNA片段。将该片段与HindⅢ(NEB，北京，中国)酶切后的载体pBUE411-Ubi-NLS- Cas9-NLS-E9-Actin-PolyA-Nos利用同源重组酶(全式金，北京，中国)进行连接获得 TaQsd1+TaNPT1双基因组合敲除载体pBUE411-Ubi-NLS- Cas9-NLS-E9-Actin-tRNA-gRNA1(TaQsd1)-tRNA-gRNA2(TaNPT1) -tRNA-PolyA-Nos。其序列为将序列1的第1670-2092位替换为序列5的序列并保持其他序列不变。

1.2TaARE1+TaSPDT双基因组合敲除载体的构建

利用重叠PCR方法获得tRNA-gRNA1(TaARE1)-tRNA-gRNA2(TaSPDT)-tRNA 片段。第一轮PCR以tRNA为模板，利用引物9-Actin-tRNA-F/9-TaARE-tRNA-R进行扩增，获得PCR产物为带TaARE1基因靶点序列的tRNA片段，以TracrRNA-tRNA基础片段为模板，分别利用引物9-TaARE1-TrRNA-F/9-TaSPDT-tRNA-R和 9-TaSPDT-TrRNA-F/PolyA-Hind-tRNA-R(表2)进行扩增，分别获得带接头的gRNA1 (TaARE1)-tRNA和gRNA2(TaSPDT)-tRNA片段。第二轮PCR以第一轮PCR产物带TaARE1基因靶点序列的tRNA片段和带接头的gRNA1(TaARE1)-tRNA、gRNA2(TaSPDT)-tRNA片段按照摩尔比1:1:1进行混合后作为模板，利用引物 Actin-w-F0/Poly-t-R0(表2)进行扩增，最终获得tRNA-gRNA1(TaARE1)-tRNA-gRNA2 (TaSPDT)-tRNA片段。最后将该片段与HindⅢ(NEB，北京，中国)酶切后的载体pBUE411-Ubi-Cas9-E9-Actin-PolyA-Nos

利用同源重组酶(全式金，北京，中国)进行连接获得TaARE1+TaSPDT双基因组合敲除载体pBUE411-Ubi-NLS-Cas9-NLS-E9-Actin-tRNA-gRNA1(TaARE1)- tRNA-gRNA2(TaSPDT)-tRNA-PolyA-Nos。所述TaARE1+TaSPDT双基因组合敲除载体的序列为将序列1的第1670-2092位之间的序列替换为序列6所示的序列并保持其他序列不变。

实施例2三基因组合载体构建

2.1TaQsd1+TaARE1+TaNPT1三基因组合敲除载体构建

pBUE411-Ubi-NLS-Cas9-NLS-E9-Actin-tRNA-gRNA1(TaQsd1)-tRNA-gRNA2(TaARE1)-tRNA-gRNA3(TaNPT1)-tRNA-PolyA-Nos三基因组合敲除载体的构建。第一轮PCR以tRNA为模板，利用引物对9-Actin-tRNA-F/9-TaQsd1-tRNA-R进行扩增，第二轮PCR使用tracrRNA-tRNA片段为模板，分别利用引物对9-TaQsd1-TrRNA-F/9-TaAER1-tRNA-R和9-TaARE1-TrRNA-F/PolyA-Hind-tRNA-R 进行扩增，在第三轮PCR中，利用引物对Actin-w-F0/Poly-t-R0，以第一轮和第二轮的三种PCR产物为模板进行扩增，获得tRNA-gRNA1(TaQsd1)-tRNA-gRNA2 (TaARE1)-tRNA片段，之后该片段利用同源重组酶(全式金，北京，中国)被克隆到HindⅢ(NEB，北京，中国)酶切的pBUE411-Ubi-Cas9-E9-Actin-PolyA-Nos载体中，获得pBUE411-Ubi-NLS-Cas9-NLS-E9-Actin-tRNA-gRNA1(TaQsd1) -tRNA-gRNA2(TaARE1)-tRNA-PolyA-Nos载体，然后使用上述 9-TaNPT-TrRNA-F/PolyA-Hind-tRNA-R引物对扩增产物为模板，利用引物对 tRNA-TaNPT-F/PolyA-Hind-tRNA-R进行扩增获得gRNA3(TaNPT1)-tRNA片段，最后将该片段利用同源重组酶(全式金，北京，中国) 克隆到HindⅢ(NEB，北京，中国)酶切的线性化 pBUE411-Ubi-NLS-Cas9-NLS-E9-Actin-tRNA-gRNA1(TaQsd1)-tRNA-gRNA2 (TaARE1)-tRNA-PolyA-Nos载体中，获得TaQsd1+TaARE1+TaNPT1三基因组合敲除载体pBUE411-Ubi-NLS-Cas9-NLS-E9-Actin-tRNA-gRNA1(TaQsd1)-tRNA-gRNA2 (TaARE1)-tRNA-gRNA3(TaNPT1)-tRNA-PolyA-Nos。所述TaQsd1+TaARE1+TaNPT1 三基因组合敲除载体的序列为将序列1的第1670-2092位之间的序列替换为序列7所示的序列并保持其他序列不变。

2.2TaQsd1+TaARE1+TaSPDT三基因组合敲除载体构建

pBUE411-Ubi-NLS-Cas9-NLS-E9-Actin-tRNA-gRNA1(TaQsd1)-tRNA-gRNA2(TaARE1)-tRNA-gRNA3(TaSPDT)-tRNA-PolyA-Nos三基因组合敲除载体的构建。以前面9-TaSPDT-TrRNA-F/PolyA-Hind-tRNA-R引物扩增PCR产物为模板，利用引物对tRNA-TaSPDT-F/PolyA-Hind-tRNA-R进行扩增，获得带接头的gRNA3(TaSPDT) -tRNA片段，将该片段与HindⅢ(NEB，北京，中国)酶切后的 pBUE411-Ubi-NLS-Cas9-NLS-E9-Actin-tRNA-gRNA1(TaQsd1)-tRNA-gRNA2 (TaARE1)-tRNA-PolyA-Nos利用同源重组酶(全式金，北京，中国)进行连接获得 TaQsd1+TaARE1+TaSPDT三基因组合敲除载体 pBUE411-Ubi-NLS-Cas9-NLS-E9-Actin-tRNA-gRNA1(TaQsd1)-tRNA-gRNA2 (TaARE1)-tRNA-gRNA3(TaSPDT)-tRNA-PolyA-Nos。所述TaQsd1+TaARE1+TaSPDT 三基因组合敲除载体的序列为将序列1的第1670-2092位之间的序列替换为序列8所示的序列并保持其他序列不变。

实施例3四基因组合载体构建

3.1TaQsd1+TaARE1+TaNPT1+TaIPA1四基因组合敲除载体构建

第一轮PCR以tracrRNA-tRNA片段作为模板，利用引物对 tRNA-TaIPA-F0/PolyA-Hind-tRNA-R进行扩增，第二轮PCR以第一轮PCR产物为模板，利用引物tRNA-TaIPA-F/PolyA-Hind-tRNA-R进行扩增，获得gRNA4(TaIPA1) -tRNA片段，将该片段与HindⅢ(NEB，北京，中国)酶切后的 pBUE411-Ubi-NLS-Cas9-NLS-E9-Actin-tRNA-gRNA1(TaQsd1)- tRNA-gRNA2(TaARE1)-tRNA-gRNA3(TaNPT1)-tRNA-PolyA-Nos载体，利用同源重组酶(全式金，北京，中国)进行连接获得TaQsd1+TaARE1+TaNPT1+TaIPA1 四基因组合敲除载体pBUE411-Ubi-NLS-Cas9-NLS-E9-Actin-tRNA-gRNA1(TaQsd1) -tRNA-gRNA2(TaARE1)-tRNA-gRNA3(TaNPT1)-tRNA-gRNA4(TaIPA1) -tRNA-PolyA-Nos。所述TaQsd1+TaARE1+TaNPT1+TaIPA1四基因组合敲除载体的序列为将序列1的第1670-2092位之间的序列替换为序列9所示的序列并保持其他序列不变。

实施例4五基因组合载体构建

4.1TaQsd1+TaARE1+TaNPT1+TaSBEⅡa+TaSPDT五基因组合敲除载体构建。

pBUE411-Ubi-NLS-Cas9-NLS-E9-Actin-tRNA-gRNA1(TaQsd1)-tRNA-gRNA2(TaARE1)-tRNA-gRNA3(TaNPT1)-tRNA-gRNA4(TaSBEⅡa)-tRNA-gRNA5(TaSPD T)-tRNA-PolyA-Nos五基因组合敲除载体的构建。第一轮PCR以TracrRNA-tRNA片段为模板，利用9-TaSBE2A-TrRNA-F/9-TaSPDT-tRNA-R引物进行扩增，获得gRNA4 (TaSBEⅡa)-tRNA片段，第二轮PCR以第一轮PCR产物为模板，利用引物 tRNA-TaSBE2A-F/9-TaSPDT-tRNA-R进行扩增，获得带接头的gRNA4(TaSBEⅡa) -tRNA片段，利用引物tRNA-TaSBE2A-F/PolyA-t-R0，以第二轮PCR产物和前面 9-TaSPDT-TrRNA-F/PolyA-Hind-tRNA-R引物对扩增产物按照摩尔比1:1进行混合后作为模板，获得带接头的gRNA4(TaSBEⅡa)-tRNA-gRNA5(TaSPDT)-tRNA片段，将该片段与HindⅢ(NEB，北京，中国)酶切后的TaQsd1+TaARE1+TaNPT1三基因组合的敲除载体pBUE411-Ubi-NLS-Cas9-NLS-E9-Actin-tRNA-gRNA1(TaQsd1) -tRNA-gRNA2(TaARE1)-tRNA-gRNA3(TaNPT1)-PolyA-Nos利用同源重组酶(全式金，北京，中国)进行连接获得TaQsd1+TaARE1+TaNPT1+TaSBEⅡa+TaSPDT五基因组合敲除载体pBUE411-Ubi-NLS-Cas9-NLS-E9-Actin-tRNA-gRNA1(TaQsd1) -tRNA-gRNA2(TaARE1)-tRNA-gRNA3(TaNPT1)-tRNA-gRNA4(TaSBEⅡa) -tRNA-gRNA5(TaSPDT)-tRNA-PolyA-Nos。所述TaQsd1+TaARE1+TaNPT1+TaSBEⅡa+TaSPDT五基因组合敲除载体的序列为将序列1的第1670-2092位之间的序列替换为序列10所示的序列并保持其他序列不变。

表1：小麦多基因编辑靶标基因及靶点序列

表2：本发明所用引物列表

实施例5转基因小麦的获得

选取开花后12-14天的小麦幼胚(郑麦7698)，剥出未成熟的种子，放到无菌的培养瓶中，先用70％的乙醇消毒5min，然后用10％的次氯酸钠溶液消毒15min，期间注意不停摇晃，最后用无菌水清洗3次，在无菌超净台中使用解刨镜剥离幼胚并切去胚芽，盾片组织朝上放置于MS高渗培养基(Altpeter,F.,Vasil,V.,Srivastava,V.,

E., and Vasil,I.(1996).Accelerated production of transgenic wheat(Triticum aestivum L.)plants. Plant Cell Reports，16:12-17)上，每个培养皿中接种30-40个纵轴直径为1.0-1.5mm的幼胚，放置于24℃的暗室中过夜培养，第二天进行基因枪轰击，轰击后放入28℃的暗室中培养4小时后转到24℃的暗室中过夜培养，第三天转移到Resting培养基(Ishida etal.,2015)上，在24℃的暗室中培养5天后转到一筛培养基(Ishida et al.,2015)上 (15毫克/升的潮霉素)，24℃的暗室中培养10天，一筛结束后，将幼胚转移到二筛培养基(Ishidaet al.,2015)上(30毫克/升的潮霉素)，24℃的暗室中培养10天后移至再生培养基(Ishidaet al.,2015)上(15毫克/升的潮霉素)，在24℃的光照条件下培养冒出幼芽后移至生根培养基(Ishida et al.,2015)中，24℃的光照培养5-6周之后即可利用Hi-Tom试剂盒(Liu,Q.,Wang,C.,Jiao,X.,Zhang,H.,Song,L.,Li,Y.,Gao,C., and Wang,K.(2019).Hi-TOM:aplatform for high-throughput tracking of mutations induced by CRISPR/Cassystems.Science China Life Sciences，62:1-7.)及基因组特异性扩增测序鉴定再生植株的编辑情况，并将编辑植株移入土中置于4℃的冷室中进行春化30天，完成春化后移至25℃的可控温室中进行培养繁种。

实施例6对T₀代再生植株的基因型鉴定

通过基因枪法分别转化上述实施例1-4中的六个载体(TaQsd1+TaNPT1双基因组合组合敲除载体、TaARE1+TaSPDT双基因组合组合敲除载体、TaQsd1+TaNPT1+ TaARE1三基因组合组合敲除载体、TaQsd1+TaARE1+TaSPDT三基因组合组合敲除载体、TaQsd1+TaNPT1+TaARE1+TaIPA1四基因组合组合敲除载体、TaQsd1+ TaNPT1+TaARE1+TaSPDT+TaSBEⅡa五基因组合组合敲除载体)，经上述植物组织培养分别获得11、14、4、12、4、6簇再生植株。首先成簇剪取T₀代小麦叶片，利用DNA提取试剂盒(天根，北京，中国)提取DNA作为模板，使用Pfu高保真酶(全式金，北京，中国)进行扩增，利用Hi-Tom试剂盒(Liu,Q.,Wang,C.,Jiao,X.,Zhang, H.,Song,L.,Li,Y.,Gao,C.,and Wang,K.(2019).Hi-TOM:a platform for high-throughput tracking of mutations induced by CRISPR/Cas systems.Science ChinaLife Sciences，62:1-7.)确定编辑植株，根据Hi-Tom测序结果，将确定编辑的成簇小麦分单株剪取叶片，利用 DNA提取试剂盒(天根，北京，中国)提取DNA作为模板，分别设计TaQsd1、TaARE1、 TaNPT1、TaSBEⅡa、TaSPDT、TaIPA1六个基因的ABD三个亚基因组特异性扩增引物 (表2)，将获得的特异性引物扩增的PCR产物进行测序，测序结果通过 http://dsdecode.scgene.com/网站分析基因型(Liu,W.,Xie,X.,Ma,X.,Li,J.,Chen,J.,and Liu,Y.G.(2015).DSDecode:A web-based tool for decoding of sequencing chromatogramsfor genotyping of targeted mutations.Molecular Plant，8:1431-1433.)，部分测序结果不能通过该网站分析出基因型的PCR产物，连接pEasy载体(全式金，北京，中国)，挑取单克隆测序确定编辑类型。具体的编辑类型及转化情况见表3和表4。

对于TaQsd1和TaNPT1双基因敲除载体来说，共转化的184个幼胚中，共获得 11簇再生苗，分别命名为QN1至QN11,其中通过Hi-Tom测序显示共有2簇再生苗进行了敲除编辑(QN3和QN9)，第一簇共有6株，分别命名为QN3-1至QN3-6，通过单株测序显示共有2株进行了敲除编辑(QN3-3和QN3-4)，并且编辑类型一致，均为双基因ABD三个基因组同时敲除编辑类型，第二簇共有12株，分别命名为QN9-1 至QN9-12，通过单株测序显示共有1株进行了TaQsd1基因ABD三个基因组和TaNPT1 基因AD两个基因组同时敲除编辑类型(QN9-6)，具体的编辑类型见表3。对于TaARE1 和TaSPDT双基因敲除载体来说，共转了342个小麦幼胚，经植物组织培养共获得14 簇再生植株,分别命名为AS1至AS12、AS14-1和AS14-2，经Hi-Tom高通量测序显示，其中有4簇再生苗进行了敲除编辑(AS1、AS6、AS14-1和AS14-2)，第一簇共有1株，命名为AS1-1，并且进行了敲除编辑(AS1-1)，敲除类型为双基因的ABD 基因组同时敲除编辑，第二簇共有8株，分别命名为AS6-1至AS6-8，单株测序显示共有1株进行了TaARE1基因的BD基因组和TaSPDT基因的B基因组敲除编辑 (AS6-4)，第三簇共有3棵单株，分别命名为AS14-1-1至AS14-1-3，单株测序显示共有1株进行了敲除编辑(AS14-1-1)，但仅对TaARE1基因的ABD三个基因组进行了编辑，第四簇共有4棵单株，分别命名为AS14-2-1至AS14-2-4，单株测序显示共有1株进行了敲除编辑(AS14-2-1)，并且同时对TaARE1和TaSPDT基因的ABD三个基因组进行了敲除编辑，具体的编辑类型见表3，将每个转化的小麦幼胚当成一个独立事件，分别统计了编辑事件的发生概率及靶标基因多基因组同时发生概率，见表 4。

对于TaQsd1+TaARE1+TaNPT1三基因组合敲除载体来说，共转化152个小麦幼胚，共获得4簇小麦再生植株，分别命名为QAN1至QAN4，经Hi-Tom测序显示3簇再生植株有敲除编辑(QAN1、QAN2和QAN3)，第一簇共有5株，分别命名为QAN1-1 至QAN1-5，都为编辑植株(QAN1-1、QAN1-2、QAN1-3、QAN1-4、QAN1-5)，并且编辑类型一致，为三个基因的三个基因组同时敲除编辑类型。第二簇共有1株，命名为QAN2-1，为编辑植株(QAN2-1)，该株系的TaQsd1基因的三个基因组、TaARE1 基因的AD基因组，TaNPT1基因的AD基因组进行了同时敲除编辑，第三簇共有1 株，命名为QAN3-1，为三个基因ABD基因组同时编辑植株(QAN3-1)，具体的编辑类型见表3。对于TaQsd1+TaARE1+TaSPDT三基因组合敲除载体来说，共转化264 个小麦幼胚，经植物组织培养，共获得12簇再生植株，分别命名为QAS1至QAS12，经Hi-Tom测序显示共有4簇进行了敲除编辑(QAS2、QAS3、QAS7、QAS8)，第一簇QAS2共有2株，分别命名为QAS2-1和QAS2-2，其中一株为编辑植株(QAS2-1)，为TaQsd1和TaARE1基因的ABD三个基因组同时编辑，但TaSPDT基因仅D基因组进行了编辑，第二簇共有1株，命名为QAS3-1，并且为编辑植株(QAS3-1)，仅TaQsd1 基因的A基因组和TaSPDT基因的B基因组发生了编辑，第三簇共有3棵单株，分别命名为QAS7-1至QAS7-3，其中1株为编辑植株(QAS7-1)，为TaQsd1基因、TaARE1三个基因组和TaSPDT基因的AB基因组同时编辑植株，第四簇共有4株，分别命名为QAS8-1至QAS8-4，都为编辑植株，并且编辑类型一样(QAS8-1、QAS8-2、QAS8-3、 QAS8-4)，均为三个基因三个基因组同时敲除的编辑类型，具体的编辑类型见表3。将每个转化的小麦幼胚当成一个独立事件，分别统计了编辑事件的发生概率及靶标基因多基因组同时发生概率，见表4。

对于TaQsd1+TaARE1+TaNPT1+TaIPA1四个基因组合敲除载体来说，共转化228 个小麦幼胚，共获得4簇再生植株，分别命名为QANI1至QANI4，利用Hi-Tom测序显示共有2簇再生苗进行了敲除编辑(QANI1和QANI3)，第一簇苗共有两株，分别命名为(QANI1-1和QANI1-2)，都为TaQsd1、TaARE1、TaNPT1和TaIPA1四个基因所有基因组同时编辑植株(QANI1-1和QANI1-2)，并且编辑类型一致，第二簇共有1株，命名为QANI3-1，为TaQsd1、TaARE1、TaNPT1三个基因的三个基因组和 TaIPA1基因的A基因组同时编辑植株(QANI3-1)，具体的编辑类型见表3。将每个转化的小麦幼胚当成一个独立事件，分别统计了编辑事件的发生概率及靶标基因多基因组同时发生概率，见表4。

对于TaQsd1+TaARE1+TaNPT1+TaSBEⅡa+TaSPDT五基因组合敲除载体来说，共转化小麦幼胚284个，共获得再生植株6簇，分别命名为QANSS1至QANSS6，利用 Hi-Tom测序显示共有4簇再生苗进行了敲除编辑(QANSS1、QANSS2、QANSS4、 QANSS5)，第一簇共有1株，命名为QANSS1-1，并且进行了五个基因ABD三个基因组同时敲除编辑(QANSS1-1)，第二簇共有4株，分别命名为QANSS2-1至QANSS2-4，都为编辑植株，并且编辑类型一致(QANSS2-1、QANSS2-2、QANSS2-3、 QANSS2-4)，均为TaQsd1基因ABD三个基因组和TaNPT1基因的B基因组同时编辑类型，第三簇共有1株，命名为QANSS4-1，为五个基因的ABD三个基因组同时敲除编辑植株(QANSS4-1)，第四簇共有2棵单株，分别命名为QANSS5-1和QANSS5-2，都为编辑植株，并且编辑类型一致(QANSS5-1、QANSS5-2)，为TaQsd1基因、TaNPT1 基因的ABD三个基因组和TaARE1基因、TaSBEⅡa基因的AB基因组和TaSPDT基因的D基因组同时编辑类型，具体的编辑类型见表3。将每个转化的小麦幼胚当成一个独立事件，分别统计了编辑事件的发生概率及靶标基因多基因组同时发生概率，见表 4。

表3：T₀代多重基因编辑植株的基因分型情况

注：大写字母A、B、D和小写字母a、b、d分别代表A、B和D亚基因组中特定靶基因的野生型等位基因和突变型等位基因。斜线表示敲除和插入发生在同一个等位基因上，分号后是另一个等位基因的基因型。“i”表示插入指定数量的核苷酸，“d”表示删除指定数量的核苷酸。wt表示野生型。

表4：T₀代多重基因编辑植株的转化情况及编辑效率统计表

实施例6T₀代编辑植株的脱靶分析

本实验进一步对靶标基因的靶向序列进行了脱靶分析，根据WheatCrispr网站预测(https://crispr.bioinfo.nrc.ca/WheatCrispr/)结果，每个靶点选择两个潜在的脱靶位点，设计特异性引物(见表2)扩增测序，根据测序结果显示，分别在TaSPDT基因和TaIPA1基因预测脱靶位点1中有脱靶情况，其他基因的预测脱靶位点均无脱靶情况出现。具体检测情况见表5。

表5：T₀代编辑植株的脱靶分析统计表

注：PAM序列(NGG)为下划线显示；错配的碱基为斜体加粗字体显示。

实施例7T₁代植株的获取及基因分型鉴定

将T₀代结的种子分组合单株收获，播种温室或大田，进行繁育，剪取叶片，利用DNA提取试剂盒(天根，北京，中国)提取DNA作为模板，利用靶标基因特异性引物使用Pfu高保证酶(全式金，北京，中国)进行扩增测，测序结果通过 http://dsdecode.scgene.com/网站分析基因型(Liu,W.,Xie,X.,Ma,X.,Li,J.,Chen,J.,and Liu,Y.G.(2015).DSDecode:Aweb-based tool for decoding of sequencing chromatograms for genotyping oftargeted mutations.Molecular Plant，8:1431-1433.)，部分测序结果不能通过该网站分析出基因型的PCR产物，连接pEasy载体(全式金，北京，中国)，挑取单克隆测序确定编辑类型。具体T₁代分型编辑情况如表6所示，其中在收获T₀代株系AS6-4 和AS14-1-1种子中，鉴定到了新的编辑类型，具体编辑情况见表6，已用红色字体标出，经分析大部分株系都符合孟德尔分离比。设计转化载体检测特异性引物对 Cas9-F/Cas9-R、hpt-F/hpt-R、Actin-S-F/TaARE1-S-R或Actin-S-F/TaQsd1-S-R分别对 Cas9、hptⅡ和gRNA进行扩增，检测T₁代转基因情况，如表6。

表6：T₁代多重基因编辑植株的基因分型及转基因情况统计表

注：大写字母A、B、D和小写字母a、b、d分别代表A、B和D亚基因组中特定靶基因的野生型等位基因和突变型等位基因。斜线表示敲除和插入发生在同一个等位基因上，分号后为另一个等位基因的基因型。“i”表示插入指定数量的核苷酸，“d”表示删除指定数量的核苷酸。红色字体为T₁代出现的新突变类型。wt表示野生型。χ2值表明，所观察到的频率与预期频率是否有显著差异。对于转基因分析，“+”表示检测到Cas9/gRNA/hptII，“-”表示未检测到Cas9/gRNA/hptII。**P>0.5，与孟德尔分离比1:2:1非常符合。*0.1<P<0.5，符合孟德尔分离比1:2:1。

本专利利用CRISPR/Cas9基因编辑技术和tRNA自剪切同时释放多个sgRNAs策略，在小麦中实现了同时靶向2个、3个、4个和多达15个基因组的5个基因的敲除编辑，仅在一代中就实现了多个优异等位基因的聚合，并且通过后代分离，成功获得了无转基因聚合多优良农艺性状的小麦新种质，该策略拓展了多倍体作物聚合多优良性状的育种途径，扩展了CRISPR/Cas9基因编辑系统在小麦基因组编辑中的应用范围，对于推进此系统在植物基因组编辑中的应用具有重要意义。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 一种CRISPR/Cas9系统介导的小麦多基因敲除编辑体系

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18123

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

taaacgctct tttctcttag gtttacccgc caatatatcc tgtcaaacac tgatagttta 60

aactgaaggc gggaaacgac aatctgatcc aagctcaagc tgctctagca ttcgccattc 120

aggctgcgca actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg 180

gcgaaagggg gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca 240

cgacgttgta aaacgacggc cagtgccatc gaggtcattc atatgcttga gaagagagtc 300

gggatagtcc aaaataaaac aaaggtaaga ttacctggtc aaaagtgaaa acatcagtta 360

aaaggtggta taaagtaaaa tatcggtaat aaaaggtggc ccaaagtgaa atttactctt 420

ttctactatt ataaaaattg aggatgtttt tgtcggtact ttgatacgtc atttttgtat 480

gaattggttt ttaagtttat tcgcttttgg aaatgcatat ctgtatttga gtcgggtttt 540

aagttcgttt gcttttgtaa atacagaggg atttgtataa gaaatatctt taaaaaaacc 600

catatgctaa tttgacataa tttttgagaa aaatatatat tcaggcgaat tctcacaatg 660

aacaataata agattaaaat agctttcccc cgttgcagcg catgggtatt ttttctagta 720

aaaataaaag ataaacttag actcaaaaca tttacaaaaa caacccctaa agttcctaaa 780

gcccaaagtg ctatccacga tccatagcaa gcccagccca acccaaccca acccaaccca 840

ccccagtcca gccaactgga caatagtctc cacacccccc cactatcacc gtgagttgtc 900

cgcacgcacc gcacgtctcg cagccaaaaa aaaaaaaaga aagaaaaaaa agaaaaagaa 960

aaaacagcag gtgggtccgg gtcgtggggg ccggaaacgc gaggaggatc gcgagccagc 1020

gacgaggccg gccctccctc cgcttccaaa gaaacgcccc ccatcgccac tatatacata 1080

cccccccctc tcctcccatc cccccaaccc taccaccacc accaccacca cctccacctc 1140

ctcccccctc gctgccggac gacgagctcc tcccccctcc ccctccgccg ccgccgcgcc 1200

ggtaaccacc ccgcccctct cctctttctt tctccgtttt ttttttccgt ctcggtctcg 1260

atctttggcc ttggtagttt gggtgggcga gaggcggctt cgtgcgcgcc cagatcggtg 1320

cgcgggaggg gcgggatctc gcggctgggg ctctcgccgg cgtggatccg gcccggatct 1380

cgcggggaat ggggctctcg gatgtagatc tgcgatccgc cgttgttggg ggagatgatg 1440

gggggtttaa aatttccgcc atgctaaaca agatcaggaa gaggggaaaa gggcactatg 1500

gtttatattt ttatatattt ctgctgcttc gtcaggctta gatgtgctag atctttcttt 1560

cttctttttg tgggtagaat ttgaatccct cagcattgtt catcggtagt ttttcttttc 1620

atgatttgtg acaaatgcag cctcgtgcgg agcttttttg taggtagaca acaaagcacc 1680

agtggtctag tggtagaata gtaccctgcc acggtacaga cccgggttcg attcccggct 1740

ggtgcannnn nnnnnnnnnn nnnnnngttt tagagctaga aatagcaagt taaaataagg 1800

ctagtccgtt atcaacttga aaaagtggca ccgagtcggt gcaacaaagc accagtggtc 1860

tagtggtaga atagtaccct gccacggtac agacccgggt tcgattcccg gctggtgcan 1920

nnnnnnnnnn nnnnnnnnng ttttagagct agaaatagca agttaaaata aggctagtcc 1980

gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgcaacaa agcaccagtg gtctagtggt 2040

agaatagtac cctgccacgg tacagacccg ggttcgattc ccggctggtg caagcttgtc 2100

gaggctgagt aaggttaact ttgagtatta tggcattgga aaagccattg ttctgcttgt 2160

aatttactgt gttctttcag ttttgttttc ggacatcaag ttaacaaaaa aaaaaaaaaa 2220

aaaaaaaaaa tttaacaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa tttaacaaaa aaaaaaaaaa 2280

aaaaaaaaaa tttaaagagc tcgaatttcc ccagcttgat cgttcaaaca tttggcaata 2340

aagtttctta agattgaatc ctgttgccgg tcttgcgatg attatcatat aatttctgtt 2400

gaattacgtt aagcatgtaa taattaacat gtaatgcatg acgttattta tgagatgggt 2460

ttttatgatt agagtcccgc aattatacat ttaatacgcg atagaaaaca aaatatagcg 2520

cgcaaactag gataaattat cgcgcgcggt gtcatctatg ttactagatc agcttgcatg 2580

cctgcagtgc agcgtgaccc ggtcgtgccc ctctctagag ataatgagca ttgcatgtct 2640

aagttataaa aaattaccac atattttttt tgtcacactt gtttgaagtg cagtttatct 2700

atctttatac atatatttaa actttactct acgaataata taatctatag tactacaata 2760

atatcagtgt tttagagaat catataaatg aacagttaga catggtctaa aggacaattg 2820

agtattttga caacaggact ctacagtttt atctttttag tgtgcatgtg ttctcctttt 2880

tttttgcaaa tagcttcacc tatataatac ttcatccatt ttattagtac atccatttag 2940

ggtttagggt taatggtttt tatagactaa tttttttagt acatctattt tattctattt 3000

tagcctctaa attaagaaaa ctaaaactct attttagttt ttttatttaa taatttagat 3060

ataaaataga ataaaataaa gtgactaaaa attaaacaaa taccctttaa gaaattaaaa 3120

aaactaagga aacatttttc ttgtttcgag tagataatgc cagcctgtta aacgccgtcg 3180

acgagtctaa cggacaccaa ccagcgaacc agcagcgtcg cgtcgggcca agcgaagcag 3240

acggcacggc atctctgtcg ctgcctctgg acccctctcg agagttccgc tccaccgttg 3300

gacttgctcc gctgtcggca tccagaaatt gcgtggcgga gcggcagacg tgagccggca 3360

cggcaggcgg cctcctcctc ctctcacggc acggcagcta cgggggattc ctttcccacc 3420

gctccttcgc tttcccttcc tcgcccgccg taataaatag acaccccctc cacaccctct 3480

ttccccaacc tcgtgttgtt cggagcgcac acacacacaa ccagatctcc cccaaatcca 3540

cccgtcggca cctccgcttc aaggtacgcc gctcgtcctc cccccccccc cctctctacc 3600

ttctctagat cggcgttccg gtccatggtt agggcccggt agttctactt ctgttcatgt 3660

ttgtgttaga tccgtgtttg tgttagatcc gtgctgctag cgttcgtaca cggatgcgac 3720

ctgtacgtca gacacgttct gattgctaac ttgccagtgt ttctctttgg ggaatcctgg 3780

gatggctcta gccgttccgc agacgggatc gatttcatga ttttttttgt ttcgttgcat 3840

agggtttggt ttgccctttt cctttatttc aatatatgcc gtgcacttgt ttgtcgggtc 3900

atcttttcat gctttttttt gtcttggttg tgatgatgtg gtctggttgg gcggtcgttc 3960

tagatcggag tagaattctg tttcaaacta cctggtggat ttattaattt tggatctgta 4020

tgtgtgtgcc atacatattc atagttacga attgaagatg atggatggaa atatcgatct 4080

aggataggta tacatgttga tgcgggtttt actgatgcat atacagagat gctttttgtt 4140

cgcttggttg tgatgatgtg gtgtggttgg gcggtcgttc attcgttcta gatcggagta 4200

gaatactgtt tcaaactacc tggtgtattt attaattttg gaactgtatg tgtgtgtcat 4260

acatcttcat agttacgagt ttaagatgga tggaaatatc gatctaggat aggtatacat 4320

gttgatgtgg gttttactga tgcatataca tgatggcata tgcagcatct attcatatgc 4380

tctaaccttg agtacctatc tattataata aacaagtatg ttttataatt attttgatct 4440

tgatatactt ggatgatggc atatgcagca gctatatgtg gattttttta gccctgcctt 4500

catacgctat ttatttgctt ggtactgttt cttttgtcga tgctcaccct gttgtttggt 4560

gttacttctg cagccctagg cctactagat ggattacaag gaccacgacg gggattacaa 4620

ggaccacgac attgattaca aggatgatga tgacaagatg gctccgaaga agaagaggaa 4680

ggttggcatc cacggggtgc cagctgctga caagaagtac tcgatcggcc tcgatattgg 4740

gactaactct gttggctggg ccgtgatcac cgacgagtac aaggtgccct caaagaagtt 4800

caaggtcctg ggcaacaccg atcggcattc catcaagaag aatctcattg gcgctctcct 4860

gttcgacagc ggcgagacgg ctgaggctac gcggctcaag cgcaccgccc gcaggcggta 4920

cacgcgcagg aagaatcgca tctgctacct gcaggagatt ttctccaacg agatggcgaa 4980

ggttgacgat tctttcttcc acaggctgga ggagtcattc ctcgtggagg aggataagaa 5040

gcacgagcgg catccaatct tcggcaacat tgtcgacgag gttgcctacc acgagaagta 5100

ccctacgatc taccatctgc ggaagaagct cgtggactcc acagataagg cggacctccg 5160

cctgatctac ctcgctctgg cccacatgat taagttcagg ggccatttcc tgatcgaggg 5220

ggatctcaac ccggacaata gcgatgttga caagctgttc atccagctcg tgcagacgta 5280

caaccagctc ttcgaggaga accccattaa tgcgtcaggc gtcgacgcga aggctatcct 5340

gtccgctagg ctctcgaagt ctcggcgcct cgagaacctg atcgcccagc tgccgggcga 5400

gaagaagaac ggcctgttcg ggaatctcat tgcgctcagc ctggggctca cgcccaactt 5460

caagtcgaat ttcgatctcg ctgaggacgc caagctgcag ctctccaagg acacatacga 5520

cgatgacctg gataacctcc tggcccagat cggcgatcag tacgcggacc tgttcctcgc 5580

tgccaagaat ctgtcggacg ccatcctcct gtctgatatt ctcagggtga acaccgagat 5640

tacgaaggct ccgctctcag cctccatgat caagcgctac gacgagcacc atcaggatct 5700

gaccctcctg aaggcgctgg tcaggcagca gctccccgag aagtacaagg agatcttctt 5760

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ctacaagttc atcaagccga ttctggagaa gatggacggc acggaggagc tgctggtgaa 5880

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ccagattcat ctcggggagc tgcacgctat cctgaggagg caggaggact tctacccttt 6000

cctcaaggat aaccgcgaga agatcgagaa gattctgact ttcaggatcc cgtactacgt 6060

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gacctaccac gatctcctga agatcattaa ggataaggac ttcctggaca acgaggagaa 6540

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cggtcctgcc cgtcaccgag atttgactcg agtttctcca taataatgtg tgagtagttc 11640

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ccttagtatg tatttgtatt tgtaaaatac ttctatcaat aaaatttcta attcctaaaa 11760

ccaaaatcca gtactaaaat ccagatcccc cgaattaatt cggcgttaat tcagtacatt 11820

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<210> 4

<211> 942

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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<210> 5

<211> 423

<212> DNA

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Claims (7)

1.一种小麦多基因敲除编辑重组载体，其特征在于，所述重组载体含有骨架结构，所述骨架结构由Ubi启动子、核定位序列、Cas9基因、核定位序列、E9终止子、Actin启动子、tRNA编码基因、n个DNA片段1、PolyA序列与Nos终止子顺序连接得到，n为2-5间的自然数，所述DNA片段1由gRNA编码基因与tRNA编码基因顺序连接得到；

所述gRNA编码基因由目的基因的靶片段与gRNA骨架基因连接得到，所述gRNA骨架基因为CRISPR/Cas9 系统中gRNA编码基因的非靶序列部分；

所述Ubi启动子的序列为序列1的第2582-4573位；

所述Cas9基因上游的核定位序列为序列1的第4664-4684位；

所述Cas9基因的序列为序列1的第4709-8809位；

所述Cas9基因下游的核定位序列为序列1的第8810-8857位；

所述E9终止子的序列为序列1的第8865-9499位；

所述Actin启动子的序列为序列1的第269-1669位；

所述tRNA编码基因的序列为序列1的第1670-1746位；

所述PolyA的序列为序列1的第2098-2312位；

所述Nos终止子的序列为序列1的第2318-2570位；

所述gRNA骨架基因的序列为序列1的第1767-1842位；

n为2-5间的自然数。

2.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于：所述骨架结构还含有限制性内切酶识别序列。

3.根据权利要求1或2所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体的序列为如下A1）-A4）中的任一种：

A1）序列1；

A2）将序列1中第1670--2092位替换为序列2得到的序列；

A3）将序列1中第1670--2092位替换为序列3得到的序列；

A4）将序列1中第1670--2092位替换为序列4得到的序列。

4.根据权利要求1或2所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体能用于同时敲除m个基因，m为小于等于n的自然数。

5.权利要求1-4中任一所述的重组载体在对小麦进行至少两个基因敲除中的应用。

6.一种植物多基因敲除方法，其特征在于，包括将权利要求1-4任一所述重组载体中NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN分别替换为待敲除的不同目的基因的靶片段后转化到受体植物中，实现所述受体植物的多基因敲除；所述植物为小麦。

7.权利要求1-4中任一所述的重组载体或权利要求6所述的方法在以下P1）或P2）中的应用：

P1）小麦育种；

P2）小麦基因编辑。

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