CN117843798A - 抗chi3l1的纳米抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了抗CHI3Ll的纳米抗体及其制备方法与应用，本发明提供的纳米抗体包括纳米抗体CHI6、纳米抗体CHI13、纳米抗体CHI23以及纳米抗体CHI37，公开了纳米抗体的氨基酸序列以及编码基因序列；同时，本发明提供的制备方法具有普适性，且纳米抗体与抗原CHI3L1能够进行特异性结合，且亲和性与纳米抗体浓度呈依赖性；本发明提供的纳米抗体能够广泛应用于免疫学检测分析中。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及抗CHI3L1的纳米抗体及其应用。
背景技术
几丁质酶-3样蛋白-1(CHI3L1)是一种分泌型糖蛋白，相对分子量约为40kDa，具有由383个氨基酸组成的多肽链，肽链的三个N端氨基酸是酪氨酸(Y)、赖氨酸(K)和亮氨酸(L)，因此，CHI3L1也命名为YKL-40或RBP-39。美国芝加哥大学医学中心(University ofChicago Medical Center)的研究人员发现，CHI3L1基因的变异可能会影响人类软骨糖蛋白的分泌，对于早期判定病人是否有气喘病征有其指标意义。通过系统生物学方法，结合二代测序表达谱技术和蛋白质组学技术，发现CHI3L1可作为肝硬化的诊断、预后评估、治疗效果监测及病程监测的标记物。
肝硬化是各种慢性肝病的最终病理结果，而纤维化是肝硬化的前兆。肝纤维化是指肝脏内弥漫性细胞外基质过度沉积，它不是一个独立的疾病，是由病毒感染、毒素、液体等原因引起的损伤肝细胞的一个慢性修复过程。肝活检是检测和分期肝纤维化的重要标准。然而，这是一种侵入性手术，存在一定的局限性，因此，有必要用非侵入性的技术代替肝活检。研究表明，血清CHI3L1水平在酒精性肝硬化病人中升高，血液中的CHI3L1蛋白水平与丙肝病毒慢性感染和肝纤维化有关。
重链抗体(Heavy-chain antibody)是一种天然缺失轻链，仅由重链组成的抗体，存在于骆驼、羊驼、鲨鱼及软骨鱼类等动物中。单域重链抗体，即纳米抗体(Varia bledomain of heavy chain of heavy-chain antibody，VHH)是指仅由重链抗体可变区(Variable region)组成的基因工程抗体。与普通抗体相比，纳米抗体具有分子量小，水溶性好，稳定性高等优点，目前已广泛应用于食品科学研究，医学诊断，药物研发等领域。
由于CHI3L1分子量较小，常规抗体与之结合难以充分识别一些隐匿于裂隙或空腔里的抗原决定簇，如果抗体识别抗原决定簇过于单一或者位点过于接近或者重叠，都会导致特异性的抗原抗体结合反应受到影响，从而严重影响检测效率。
因此，需要开发一种新的方案改善以上问题。
发明内容
本发明旨在提供一种抗CHI3L1的纳米抗体及其应用以改善由于CHI3L1分子量小，常规抗体结合后难以识别裂隙与空腔中的抗原决定簇从而影响特异性结合反应，降低检测效率的问题。
一方面，本发明提供一种抗CHI3L1的纳米抗体，所述纳米抗体包括纳米抗体CHI6、纳米抗体CHI13，纳米抗体CHI23，纳米抗体CHI37；所述纳米抗体CHI6的氨基酸序列如SEQID NO.1所示；所述纳米抗体CHI13的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述纳米抗体CHI23的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述纳米抗体CHI37的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
第二方面，本发明提供编码所述纳米抗体基因的核苷酸序列，所述纳米抗体CHI6、CHI13、CHI23、CHI37如SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.8所示。
所述纳米抗体CHI6的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3分别选自SEQ ID NO.10，SEQ IDNO.12，SEQ ID NO.14；
所述纳米抗体CHI13的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3分别选自SEQ ID NO.17，SEQID NO.19，SEQ ID NO.21；
所述纳米抗体CHI23的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3分别选自SEQ ID NO.24，SEQID NO.26，SEQ ID NO.28；
所述纳米抗体CHI37的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3分别选自SEQ ID NO.31，SEQID NO.33，SEQ ID NO.35。
第三方面，本发明提供一种抗CHI3L1的纳米抗体的制备方法，包括噬菌体展示技术和基因工程重组技术。
可选地，所述噬菌体展示技术，包括以下步骤：所述噬菌体展示技术是将展示有该纳米抗体的噬菌体，通过生物扩增的方式，大量繁殖生产展示有该纳米抗体的噬菌体粒子。
可选地，所述基因工程重组技术，包括以下步骤：将编码所述纳米抗体的基因进行克隆，克隆完成后连接至表达载体，以蛋白表达的形式进行所述纳米抗体的大量制备。
第四方面，本发明提供一种蛋白质，所述蛋白质包括所述纳米抗体的互补决定区序列中的至少一条，且同源性不低于80％。
第五方面，本发明提供一种所述的纳米抗体在免疫学检测中的应用。
可选地，包括酶联免疫吸附检测、胶体金免疫层析。
可选地，所述纳米抗体应用时可以通过噬菌体扩增获得的展示有纳米抗体的噬菌体粒直接用于分析检测。
可选地，所述纳米抗体应用时可以经过原核生物或真核生物表达后以蛋白的形式进行免疫学检测分析。
可选地，所述纳米抗体均可单独应用于免疫学检测。
第六方面，本发明提供的纳米抗体的氨基酸序列可以作为前体，通过随机或定点突变技术进行改造，能够获得亲和力、特异性和稳定性更高的突变体。
本发明具备的有益效果包括：
(1)本发明提供的纳米抗体能够与抗原CHI3L1特异性结合，并且亲和性与纳米抗体浓度呈依赖性；且能够识别裂隙与空腔中的抗原决定簇，提高检测效率；
(2)本发明制备纳米抗体的方法具有普遍适用性，可用于其他小分子物质抗原替代物的筛选和制备，具有较高的应用价值；
(3)本发明提供的纳米抗体可以应用于免疫学检测，包括酶联免疫吸附检测、胶体金免疫层析。
附图说明
图1为实施例3中纳米抗体与CHI3L1的亲和性测试中建立的间接ELISA标准曲线；
图2为纳米抗体CHI6的氨基酸编号及结构域示意图；
图3为纳米抗体CHI13的氨基酸编号及结构域示意图；
图4为纳米抗体CHI23的氨基酸编号及结构域示意图；
图5为纳米抗体CHI37的氨基酸编号及结构域示意图。
具体实施方式
本发明将结合说明书附图，通过以下实施例作进一步说明。
一方面，本发明实施例提供一种抗CHI3L1的纳米抗体，所述纳米抗体包括纳米抗体CHI6、纳米抗体CHI13，纳米抗体CHI23，纳米抗体CHI37；所述纳米抗体CHI6的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述纳米抗体CHI13的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述纳米抗体CHI23的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述纳米抗体CHI37的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
第二方面，本发明实施例提供编码所述纳米抗体基因的核苷酸序列，所述纳米抗体CHI6、CHI13、CHI23、CHI37如SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.8所示。
所述纳米抗体CHI6的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3分别选自SEQ ID NO.10，SEQ IDNO.12，SEQ ID NO.14；
所述纳米抗体CHI13的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3分别选自SEQ ID NO.17，SEQID NO.19，SEQ ID NO.21；
所述纳米抗体CHI23的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3分别选自SEQ ID NO.24，SEQID NO.26，SEQ ID NO.28；
所述纳米抗体CHI37的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3分别选自SEQ ID NO.31，SEQID NO.33，SEQ ID NO.35。
第三方面，本发明实施例提供一种抗CHI3L1的纳米抗体的制备方法，包括噬菌体展示技术和基因工程重组技术。
一些实施例中，所述噬菌体展示技术，包括以下步骤：所述噬菌体展示技术是将展示有该纳米抗体的噬菌体，通过生物扩增的方式，大量繁殖生产展示有该纳米抗体的噬菌体粒子。
一些实施例中，所述基因工程重组技术，包括以下步骤：将编码所述纳米抗体的基因进行克隆，克隆完成后连接至表达载体，以蛋白表达的形式进行所述纳米抗体的大量制备。
第四方面，本发明实施例提供一种所述的纳米抗体在免疫学检测中的应用。
一些实施例中，包括酶联免疫吸附检测、胶体金免疫层析。
一些实施例中，所述纳米抗体应用时可以通过噬菌体扩增获得的展示有纳米抗体的噬菌体粒直接用于分析检测。
一些实施例中，所述纳米抗体应用时可以经过原核生物或真核生物表达后以蛋白的形式进行免疫学检测分析。
一些实施例中，所述纳米抗体CHI6、CHI13、CHI23、CHI37均能够单独应用于免疫学检测。
本发明所用试剂、培养基等均为市售。
实施例1
本发明实施例1提供了一种天然纳米文库的构建，包括以下步骤：
S1、驼源白细胞的分离：
将30mL驼源淋巴细胞分离液加入离心管中，并缓慢加入等体积血液样品，1000×g，离心50min；离心完成后，吸取中间层悬浮白细胞至新离心管中，加入PBS，体积比为2∶1，1000×g，离心15min；离心完成后，弃上清液，并用PBS洗涤，1000×g，离心10min；离心完成后，弃上清液，加入500μL PBS重悬白细胞，得到细胞悬浮液，通过细胞计数板计数；计数完成后，加入裂解液RNAiso保存于-80℃，得到细胞裂解液；裂解液与细胞悬浮液的体积比为15∶1；
S2、总RNA提取及cDNA的合成：
通过RNeasy Plus Mini Kit(50)说明书提取在S1步骤中得到的细胞裂解液中白细胞总RNA；通过PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit说明书对总RNA进行反转录，得到cDNA作为模板进行后续实验；
S3、抗体可变区基因扩增：
抗体可变区基因扩增需进行两轮PCR反应；
将步骤S2反转录得到的cDNA作为模板进行第一轮PCR反应；第一轮PCR反应条件为96℃1min；98℃6s，55℃20s，72℃65s，35cycles；75℃10min，第一轮PCR反应体系如表1所示：
表1第一轮PCR反应体系
采用DNA片段回收试剂盒回收第一轮PCR的扩增产物，稀释5-10倍作为第二轮PCR的模板；第二轮PCR的反应条件为：94℃5min；98℃8s，52℃15s，72℃50s，6cycles；98℃10s，68℃45s，30cycles；72℃7min；第二轮PCR反应体系如表2所示；
表2第二轮PCR反应体系
S4、文库的构建：
S41、VHH编码基因及载体的双酶切：分别采用Sfi I和Not I限制性内切酶对VHH编码基因和pHEN1载体进行双酶切；
S42、酶切后产物的连接：将酶切得到的载体pHEN1和酶切得到的VHH编码基因片段混匀(摩尔比为1∶7)，在16℃，连接8h，得到混合溶液一；
加入5μL浓度为3mol/L的pH＝5.2的CH3COONa(混合溶液一∶CH3COONa体积比为1∶10)，得到混合溶液二；
再加入125μL无水乙醇(乙醇∶混合溶液二体积比为2.5∶1)，得到混合溶液三；
将混合溶液三在-20℃静置2h，静置完成后，10000rpm/min，离心10min，得到沉淀；
用70％的冷乙醇清洗沉淀，室温25℃下进行干燥，干燥完成后，溶于10μL去离子水中，得到连接产物；
S5、电转化：
取5μL步骤S4中得到的连接产物加至80μL感受态细胞E.coli TG1中，充分混匀，于冰上放置1min，得到混合溶液四；
降温结束后，将混合溶液四转入0.1cm的电击杯中电击转化，电压为1.8kV，立即向电击杯中加入900μL LB培养基(10g蛋白胨，5g酵母抽提物，10g NaCl溶于800mL的去离子水中)；
滴加浓度为2mol/L的NaOH溶液调节pH至7.0后将混合溶液四定容至1L，121℃高温高压灭菌20min；
灭菌结束后，37℃160rpm培养1h，制得菌液；将菌液涂布于LB-AG平板，37℃倒置培养12h；
S6、文库的救援：
接种超过10倍库容量的细胞于100mL 2×YT/amp/2％葡萄糖，培养至OD600达0.5；加入辅助噬菌体(20∶1感染复数)，37℃，静置15min后，摇床220rpm培养45min；
4℃，1000×g，离心10min；弃上清，加入100mL新鲜的2×YT/amp/kan培养基重悬沉淀，30℃培养12h；
4℃，10000rpm/min，离心10min，取上清液；加入PEG-NaCl溶液，PEG-NaCl溶液与所取上清液的体积比为1∶5；
4℃，静置3-4h，静置完成后，4℃，10000rpm离心15min，弃上清液；
加入1mL PBS重悬沉淀；取10μL测定库容，其余加入终浓度为50％的甘油，于-80℃保存；构建得到驼源天然纳米抗体库。
实施例2
本发明实施例2提供一种纳米抗体的亲和筛选及其鉴定方法，包括以下步骤：
D1、纳米抗体的亲和筛选：
D11、第一轮筛选：
用pH＝7.4的PBS将抗原CHI3L1稀释至终浓度100μg/mL，于4℃进行包被，包被时间为12h；
包被完成后，用PBST溶液(10mmol/L PBS，0.1％Tween-20)洗涤5次后，加入3％BSA-PBS(或3％OVA-PBS)37℃封闭2h；
封闭完成后，使用PBST溶液洗涤6次，每孔加入100μL驼源天然纳米抗体库(滴度约2.0×1011cfu)，37℃孵育1.5h；
孵育完成，弃去未结合的噬菌体，使用PBST洗涤7次，再使用PBS洗涤7次，加入100μL的浓度为0.2mol/L，pH为2.2的Glycine-HCl洗脱8min后，立即用60μL浓度为1mol/L pH为8.0的Tris-HCl中和；制得洗脱噬菌体；
取10μL洗脱噬菌体测定滴度，其余的用于感染5mL生长至对数期的E.coli TG1菌株进行扩增；24h后用PEG/NaCl沉淀扩增后的噬菌体，并测定噬菌体的滴度；
D12、测定完成后，进行第二、三、四轮的筛选；与第一轮筛选的不同之处在于，包被的CHI3L1浓度分别为50μg/mL，25μg/mL和10μg/mL，PBST加入Tween-20的浓度分别为0.2％，0.3％和0.4％，加入噬菌体孵育后用PBST和PBS洗涤次数分别为8次，9次和10次，其余步骤、条件相同；
D2、阳性噬菌体克隆的鉴定：
从第二轮和第四轮筛选后测定噬菌体滴度的平板上随机各挑取48个克隆，进行噬菌体的扩增，采用间接酶联免疫吸附检测方法(Indirect Enzyme Linked immunoasorbentassay，I-ELISA)进行阳性噬菌体克隆的鉴定；
具体的，I-ELISA的步骤包括：
用pH＝7.4的PBS将CHI3Ll稀释至5μg/mL，于4℃包被12h；
包被完成后，使用PBST(10mmol/L PBS，0.01％Tween-20)洗涤3次后，加入300μL的5％脱脂奶粉，37℃封闭2h；
封闭完成后，弃封闭液，使用PBST洗涤6次后，加入100μL噬菌体扩增液(2.0×1011cfu)作为处理组，以原始噬菌体肽库作为阴性对照，于37℃孵育1h；
孵育完成后，加入1∶5000倍稀释的HRP标记抗M13噬菌体二抗100μL，37℃孵育1h；孵育完成后，加入100μLTMB底物溶液，避光进行10min的显色反应；
显色反应结束后，加入50μL终止液(2mol/LH2SO4)终止反应；用酶标仪(ThermoScientific Multiskan FC)测定450nm处的吸收值；选取OD450大于阴性对照2倍的噬菌体克隆为阳性克隆；
将所得阳性克隆进行DNA测序，通过测序结果得到的纳米抗体CHI6、CHI13、CHI23、CHI37的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.4所示；编码纳米抗体CHI6、CHI13、CHI23、CHI37的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.8所示。
实施例3
本发明实施例3提供一种纳米抗体的制备方法，包括以下步骤：
F1、纳米抗体重组质粒转化至大肠杆菌BL21：
将含有纳米抗体核酸的原始菌株TG1甘油菌于LB/Amp平板划线，37℃，培养12h；
培养完成后，挑取单菌落转接至5mL含有氨苄抗性的液体培养基，37℃，220rpm培养12h；培养完成后，使用Plasmidminikit试剂盒提取质粒，将编码纳米抗体序列无缝克隆到pET25b载体，经验证后，上述重组质粒1μL(20ng)转化于100μL感受态细胞中，轻轻混匀，在冰上静置30min；
静置完成后，42℃水浴加热90s后，冰浴冷却90s；
冷却完成后，加入900μL LB培养基，37℃振荡培养60min；
培养完成后，取上清100μL，用三角涂布器涂布在LB/Amp平板上，37℃倒置培养12h；
F2、纳米抗体的表达纯化：
将步骤F1中完成培养的平板上挑取重组单菌落转接至5mL含有氨苄抗性的液体培养基，37℃，220rpm培养12h；
培养完成后，按1％接种量转接至含有氨苄抗性的LB液体培养基，37℃培养至OD600值为0.6-0.8；加入最终浓度为0.1mmol/L的IPTG，25℃培养6h；
培养完成后，收集培养物于4℃，6500rpm/min离心20min，收集菌体沉淀，用1/10体积预冷的LE缓冲液重悬沉淀，于冰浴下超声破碎；超声波细胞破碎仪工作参数设置为：超声4s，休息6s，总工作时间8min，功率200W；
超声破碎后，于4℃，6500rpm/min离心20min，收集破碎上清，经镍柱离子亲和层析纯化即得表达的纳米抗体。
性能测试
1.本发明提供一种纳米抗体与抗原的亲和性测试，包括以下步骤：
取浓度为2μg/mL的CHI3L1抗原，100μL/孔加入酶标板，4℃包被12h；
包被完成后，用PBST(10mmol/L PBS，0.01％Tween-20)洗涤3次后，加入300μL/孔的5％脱脂奶粉，37℃封闭2h；
封闭完成后，弃封闭液，PBST洗涤6次后，酶标板中加入不同梯度稀释的纳米抗体CHI6；pET25b空载体表达出的蛋白作为阴性对照、PBS作为空白对照，37℃孵育1h；
孵育完成后，PBST洗板8次，加入按1∶5000比例稀释过的HRP/Anti-6×His二抗，100μL/孔，37℃孵育1h；
孵育完成后，PBST洗涤8次，加TMB显色液，37℃孵育10min，加入2mol/L H2SO4终止反应；读取OD450，比较不同纳米抗体浓度的吸光度值，得出纳米抗体与抗原的亲和活性；
纳米抗体CHI13、CHI23、CHI37和纳米抗体CHI6的测试步骤一致；4种纳米抗体的亲和性测试结果如图1所示。
2.本发明提供一种双抗夹心ELISA法检测CHI3L1抗原的方法，包括以下步骤：
以CHI3L1抗原特异性单克隆抗体包被酶标板作为捕获抗体，碱性磷酸酶(AP)标记的抗CHI3L1纳米抗体CHI6作为检测抗体进行双抗夹心ELISA试验；
检测血清中的CHI3L1抗原，包括以下步骤：
将CHI3L1抗原特异性单克隆抗体用磷酸缓冲液(PBS，10mmol/L，pH 7.4)稀释1000倍，以每孔100μL加入96孔酶标板中，4℃静置12h；
静置完成后，用PBST(10mmol/LPBS，0.01％Tween-20)洗涤3次后，加入300μL的5％脱脂奶粉，37℃封闭2h；
封闭完成后，加入待测血清样品于板孔中，正常血清或梯度稀释的CHI3L1标准品，每孔100μL，37℃静置1h；
静置完成后，加入碱性磷酸酶(AP)标记的纳米抗体(利用基因克隆技术，将本发明公开的纳米抗体与AP进行融合表达与纯化，融合蛋白用PBS稀释后终浓度为10μg/mL)，每孔100μL，37℃孵育1h；
孵育完成后，进行显色反应：将标记物的显色反应底物为化学发光碱性磷酸酶(CSPD)底物，每孔100μL加入96孔酶标板中，37℃静置5-10min；
静置完成后，每孔加50μL，2mol/L H2SO4终止反应，读取OD450值；
定性检测：当测试样品的OD450值＞正常血清对照组OD450值的2.1倍，则判为阳性结果；
定量检测：以标准品浓度为横坐标，OD450值为纵坐标绘制标准曲线；最低检测限为5ng/mL，线性范围为10-300ng/mL；
捕获抗体可以替换为多克隆抗体，定性检测和定量检测与单克隆抗体的方法一致；最低检测限为5ng/mL，线性范围为10-300ng/mL；其他三种纳米抗体的检测方法与此一致。
3.本发明提供纳米抗体氨基酸序列框架区与互补决定区示意图：
纳米抗体CHI6如图2所示；纳米抗体CHI13如图3所示；纳米抗体CHI23如图4所示；纳米抗体CHI37如图5所示；
纳米抗体包括四个框架区(Framework region，FR)和三个互补决定区(Complementarity determining region，CDR)框架区结构相对保守，主要起着维持蛋白质结构的作用；互补决定区结构相对多样化，主要负责抗体的识别；
纳米抗体CHI6框架区FR1、FR2、FR3、FR4序列分别选自SEQ ID NO.9，SEQ ID NO11，SEQ ID NO.13，SEQ ID NO.15，互补决定区CDR1、CDR2、CDR3分别选自SEQ ID NO.10，SEQ IDNO.12，SEQ ID NO.14；
纳米抗体CHI13框架区FR1、FR2、FR3、FR4序列分别选自SEQ ID NO.16，SEQ IDNO.18，SEQ ID NO.20，SEQ ID NO.22，互补决定区CDR1、CDR2、CDR3分别选自SEQ ID NO.17，SEQ ID NO.19，SEQ ID NO.21；
纳米抗体CHI23框架区FR1、FR2、FR3、FR4序列分别选自SEQ ID NO.23，SEQ IDNO.25，SEQ ID NO.27，SEQ ID NO.29，互补决定区CDR1、CDR2、CDR3分别选自SEQ ID NO.24，SEQ ID NO.26，SEQ ID NO.28；
纳米抗体CHI37框架区FR1、FR2、FR3、FR4序列分别选自SEQ ID NO.30，SEQ IDNO.32，SEQ ID NO.34，SEQ ID NO.36，互补决定区CDR1、CDR2、CDR3分别选自SEQ ID NO.31，SEQ ID NO.33，SEQ ID NO.35。
虽然在上文中详细说明了本发明的实施方式，但是对于本领域的技术人员来说显而易见的是，能够对这些实施方式进行各种修改和变化。但是，应理解，这种修改和变化都属于权利要求书中所述的本发明的范围和精神之内。而且，在此说明的本发明可有其它的实施方式，并且可通过多种方式实施或实现。
Claims (9)
1.抗CHI3L1的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体包括纳米抗体CHI6、纳米抗体CHI13，纳米抗体CHI23，纳米抗体CHI37；所述纳米抗体CHI6的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述纳米抗体CHI13的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述纳米抗体CHI23的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述纳米抗体CHI37的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.编码如权利要求1所述纳米抗体的基因，其特征在于，所述纳米抗体CHI6基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述纳米抗体CHI13基因的核苷酸序列如SE1 ID NO.6所示；所述纳米抗体CHI23基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述纳米抗体CHI37基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
3.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，
所述纳米抗体CHI6的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3分别选自SEQ ID NO.10，SEQ IDNO.12，SEQ ID NO.14；
所述纳米抗体CHI13的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3分别选自SEQ ID NO.17，SEQ IDNO.19，SEQ ID NO.21；
所述纳米抗体CHI23的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3分别选自SEQ ID NO.24，SEQ IDNO.26，SEQ ID NO.28；
所述纳米抗体CHI37的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3分别选自SEQ ID NO.31，SEQ IDNO.33，SEQ ID NO.35。
4.如权利要求1所述的纳米抗体的制备方法，其特征在于，包括噬菌体展示技术和基因工程重组技术。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述噬菌体展示技术，包括以下步骤：所述噬菌体展示技术是将展示有该纳米抗体的噬菌体，通过生物扩增的方式，大量繁殖生产展示有该纳米抗体的噬菌体粒子。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述基因工程重组技术，包括以下步骤：将编码所述纳米抗体的基因进行克隆，克隆完成后连接至表达载体，以蛋白表达的形式进行所述纳米抗体的大量制备。
7.一种蛋白质，其特征在于，所述蛋白质包括权利要求3中所述纳米抗体的互补决定区序列中的至少一条，且同源性不低于80％。
8.如权利要求1所述的纳米抗体的氨基酸序列在制备突变纳米抗体中的应用。
9.如权利要求1所述的纳米抗体在免疫学检测中的应用。
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