CN116479532A - 一种展示纳米抗体的酵母文库及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种展示纳米抗体的酵母文库及其构建方法和应用，属于纳米抗体技术领域。本发明针对酵母菌展示纳米抗体系统中亚型免疫球蛋白的重链和轻链可变结构的N端与负责识别抗原的CDRs相近，导致纳米抗体结合域的N端融合可能会干扰抗原结合，进而影响纳米抗体的筛选的问题，本发明优化酵母菌展示纳米抗体系统，每个纳米抗体的C‑末端与Aga2p的N‑末端融合，避免了结合域的N端融合可能会干扰抗原结合；此外纳米抗体在单个酵母细胞表面的显示水平可以通过一个共价标志物来监测，保证了试验的可重复性，同时有效的提高酵母菌展示纳米抗体的结果。

Description

一种展示纳米抗体的酵母文库及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于纳米抗体技术领域，具体涉及一种展示纳米抗体的酵母文库及其构建方法和应用。
背景技术
特异性亲和试剂在诊断、成像和蛋白质组学领域的需求一直在稳步增长。特征良好的亲和试剂也有助于研究目的蛋白的结构和功能。目前已有的几种体外展示方法，可以从大分子库中有效地选择亲和试剂。使用噬菌体展示与平移相结合，已经成功地从免疫或非免疫库中回收了纳米抗体。但是，通过噬菌体展示筛选更高亲和力的抗体时，通常会受到筛选处理过程的不利影响，不仅取决于亲和力，还取决于抗体表达水平。此外，噬菌体是原核系统，有些抗体对大肠杆菌有毒的克隆，其生长缓慢甚至不生长，导致文库的偏向与克隆的丢失。除了以上弊端，在用噬菌体展示也可能造成一定的生物危险。
目标特异性纳米抗体也通过酵母表面展示，然后进行细胞分选来选择。细胞表面展示的主要优点是这些方法与流式细胞仪提供的定量和多参数分析的兼容性，可以在缓冲液成分、pH值、温度和抗原浓度等可控条件下，实时对库中的每个细胞逐一调查克隆亲和试剂的显示水平及其抗原占用情况。因此，高通量的荧光激活细胞分选(FACS)可以选择和恢复独立的细胞群，显示具有不同预定特性的结合物。
酿酒酵母菌显示了多达十万份与Aga2p亚单位氮(N)端融合的独特亲和试剂，此方法已经被用来代替了噬菌体展示。但是，所有亚型免疫球蛋白的重链和轻链可变结构的N端与负责识别抗原的CDRs相近，这也导致这些结合域的N端融合可能会干扰抗原结合。另外，分析酵母细胞表面上克隆的免疫球蛋白显示水平的过程的复杂性也是该系统的一大难题。大多数载体使目的蛋白质显示为与肽标签的融合。然后，通过使用标签特异性的一抗来定量表面显示，再次通常与荧光基团结合的二抗一起孵育。然而，商业抗体可能的重复性问题和抗体/荧光基团标记比率的批次之间的差异，使得实验的可重复性不稳定。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种展示纳米抗体的酵母文库及其构建方法，每个纳米抗体在其C-末端与Aga2p的N-末端融合，避免了纳米抗体结合域的N端融合可能会干扰抗原结合，保证检测结果准确性。
本发明提供了一种展示纳米抗体的酵母文库，在酵母细胞表面展示表达纳米抗体-Aga2p-标签融合蛋白。
优选的，所述标签上共价连接荧光基团或生物素。
优选的，所述标签包括ACP和Myc标签。
优选的，所述酵母文库表达的纳米抗体包括抗非洲猪瘟P72蛋白的纳米抗体库。
优选的，所述纳米抗体-Aga2p-标签融合蛋白通过appS4前导序列分泌至胞外；
所述纳米抗体-Aga2p-标签融合蛋白在GAL1启动子的转录控制下表达。
本发明提供了一种所述酵母文库的构建方法，包括以下步骤：
构建含信号肽-纳米抗体-Aga2p-标签融合基因的重组载体；
将所述含信号肽-纳米抗体-Aga2p-标签融合基因的重组载体导入酵母细胞中，经过培养，得到展示纳米抗体的酵母文库。
优选的，所述培养后，将所述酵母细胞在Sfp合成酶的作用下与CoA衍生物进行正交染色；
所述CoA衍生物包括CoA-547荧光基团；
所述正交染色时，所述酵母细胞的反应缓冲液为pH 7.4的含10mM MgCl2的50mMHEPES水溶液。
优选的，所述含信号肽-纳米抗体-Aga2p-标签融合基因的重组载体的骨架载体包括pNACP载体。
优选的，所述构建含信号肽-纳米抗体-Aga2p-标签融合基因的重组载体时，所述纳米抗体的编码序列克隆值重组载体时扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的正向引物和SEQ ID NO：2所示的反向引物。
本发明提供了所述酵母文库或所述构建方法得到的酵母文库在筛选纳米抗体中的应用。
本发明提供了一种展示纳米抗体的酵母文库，在酵母细胞表面展示表达纳米抗体-Aga2p-标签融合蛋白。本发明针对现有技术中酵母菌展示纳米抗体的系统中所有亚型免疫球蛋白的重链和轻链可变结构的N端与负责识别抗原的CDRs相近，导致纳米抗体的结合域的N端融合可能会干扰抗原结合的问题，为了更好的优化酵母菌展示纳米抗体系统，本发明将每个纳米抗体的C-末端与Aga2p的N-末端融合，避免了结合域的N端融合可能会干扰抗原结合，从而保证了展示纳米抗体的酵母文库可准确有效评估纳米抗体的抗原抗体结合特性。
进一步的，本发明具体限定了融合蛋白中标签上共价结合荧光基团或生物素。由于现有技术中酵母细胞表面上克隆的免疫球蛋白显示水平的过程的复杂性通过使用标签特异性的一抗来定量表面显示，再次通常与荧光基团结合的二抗一起孵育，但商业抗体可能的重复性问题和抗体/荧光基团标记比率的批次之间的差异，使得实验的可重复性不稳定。针对该问题，本发明克隆的纳米抗体在单个酵母细胞表面的显示水平可以通过一个共价荧光基团或生物素来监测，该荧光基团或生物素在一个酶促步骤中连接到正交酰基载体蛋白(ACP)标签上进而显示，保证了试验的可重复性，同时也可以有效的提高酵母菌展示纳米抗体的结果。
附图说明
图1为融合蛋白胞外展示的新型载体示意图，其中所述融合蛋白由纳米抗体、Aga2p和ACP组成；
图2为Sfp合酶催化含有荧光基团或生物素的CoA衍生物共价连接到C-末端ACP标签的独特丝氨酸残基上示意图；
图3为纳米抗体文库在GAL1启动子的转录控制下表达融合蛋白示意图；注：利用appS4前导序列分泌融合蛋白，ACP可以被其他标签替代；
图4为酵母菌表面展示纳米抗体的正交标记结果；其中A：酵母细胞表面展示红色荧光信号；B：流式细胞仪分析表达融合的CoA-547标记细胞(pNACP_Nb，红色)与未显示Nb-Aga2p-ACP融合的标记酵母细胞(pNACP，灰色)的柱状图；
图5为通过流式细胞术(x轴)或BLI(y轴)测定的不同纳米抗体表观亲和力的相关性结果；
图6为P72纳米抗体氨基酸序列；
图7为P72与纳米体的缔合和解离等温线；
图8为BLI在Octetred96上测量生物素化纳米体-AgA2P-ACP融合蛋白的固定及其抗原与SA包被生物传感器的结合等温线。
具体实施方式
本发明提供了一种展示纳米抗体的酵母文库，在酵母细胞表面展示表达纳米抗体-Aga2p-标签融合蛋白。
在本发明中，所述融合蛋白通过Aga2p和酵母细胞表面的Aga1p蛋白之间形成的二硫键连接(见图1)。编码所述Aga2p的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
本发明对所述酵母文库中纳米抗体的种类没有特殊限制，采用本领域所树脂的纳米抗体库的种类即可。在本发明实施例中，所述酵母文库表达的纳米抗体优选为抗非洲猪瘟P72蛋白的纳米抗体库。
在本发明中，所述标签优选包括ACP和Myc标签。所述标签上优选共价连接荧光基团或生物素。本发明对所述荧光基团的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的荧光基团的种类即可。在本发明实施例中，所述荧光基团包括CoA-547荧光基团。本发明实施例中，所述标签为ACP-Myc标签。
在本发明中，所述纳米抗体-Aga2p-标签融合蛋白优选通过appS4前导序列分泌至胞外。所述appS4前导序列对应的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。所述纳米抗体-Aga2p-标签融合蛋白在GAL1启动子的转录控制下表达。
本发明提供了一种所述酵母文库的构建方法，包括以下步骤：
构建含信号肽-纳米抗体-Aga2p-标签融合基因的重组载体；
将所述含信号肽-纳米抗体-Aga2p-标签融合基因的重组载体导入酵母细胞中，经过培养，得到展示纳米抗体的酵母文库。
在本发明中，所述构建含信号肽-纳米抗体-Aga2p-标签融合基因的重组载体的方法，优选包括以下步骤：
将酵母展示载体中分别插入含不同的纳米抗体的融合基因，得到重组载体。
在本发明中，所述含信号肽-纳米抗体-Aga2p-标签融合基因的重组载体的骨架载体为酵母展示载体，优选包括pNACP载体。所述pNACP载体中的标签为CAP标签，在所述插入前，优选去除pCTCon2载体中Trp基因内HindIII限制性位点，合成了一个新的展示元件，编码appS4领导序列(LS)，然后是一个多克隆位点(MCS)，此为纳米抗体库插入位置，接着是Aga2p锚定蛋白和ACP以及Myc标签，所述新的展示元件的插入位点为EcoRI和BglII。本发明实施例中，改造后的pNACP载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:25，其中AmpR的核苷酸序列位于715-1575，GAL1启动子的核苷酸序列位于2940-3606；appS4引导肽的核苷酸序列位于3644-3910；多克隆位点的核苷酸序列位于3906-3943；自由连接肽的核苷酸序列位于3944-4045，Aga2p的核苷酸序列位于4046-4252；ACP的核苷酸序列位于4274-4507；Myc的核苷酸序列位于4511-4540；Trp1的核苷酸序列位于5613-6287。
在本发明中，所述插入的方法优选为采用带有内切酶识别位点的引物扩增纳米抗体库，得到的扩增产物与同样内切酶酶切后的线性载体连接。所述pNACP载体中插入的多克隆位点优选为BamHⅠ/HindⅢ。所述构建含信号肽-纳米抗体-Aga2p-标签融合基因的重组载体时，所述纳米抗体的编码基因的扩增引物优选包括核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的正向引物和SEQ ID NO：2所示的反向引物。
得到含信号肽-纳米抗体-Aga2p-标签融合基因的重组载体后，本发明将所述含信号肽-纳米抗体-Aga2p-标签融合基因的重组载体导入酵母细胞中，经过培养，得到展示纳米抗体的酵母文库。
本发明对所述导入酵母细胞的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的导入方法即可。所述酵母细胞优选为EBY100细胞。
在本发明中，所述培养用培养基优选为SDCAA培养基中，具体优选将20g葡萄糖，6.7g酵母氮基，5g酪蛋白氨基酸，5.4g Na2HPO4和8.56g NaH2PO4·H2O定容到1L水中，10mlGibcoTM青霉素-甾醇霉素1000U/mL。待培养至细胞的OD600为1时，收集酵母细胞至SGCAA培养基中过夜培养，以便正交染色。所述SGCAA培养基优选将20g半乳糖，6.7g酵母氮基，5g酪蛋白氨基酸，5.4g Na2HPO4和8.56g NaH2PO4·H2O定容到1L水中，10ml GibcoTM青霉素-甾醇霉素1000U/mL。
在本发明中，所述培养后，优选将所述酵母细胞在Sfp合成酶的作用下与CoA衍生物进行正交染色(见图2)。所述CoA衍生物优选包括CoA-547荧光基团。所述正交染色时，所述酵母细胞的反应缓冲液为pH 7.4的含10mM MgCl2的50mM HEPES水溶液。所述正交染色的条件为在40～60rpm条件下染色50～65min，之后用冰冷的PBS-BSA溶液洗涤细胞三次。Sfp合酶可用于将含有荧光团或生物素的CoA衍生物共价连接到C-末端ACP标签的独特丝氨酸残基上。在所述正交染色后，在激光扫描共聚焦显微镜下，显示酵母细胞表面显示荧光，说明成功构建了表面展示纳米抗体的酵母文库。
本发明提供了所述酵母文库或所述构建方法得到的酵母文库在筛选纳米抗体中的应用。
在本发明中，从构建的酵母文库中选择亲和力较强的纳米抗体，优选将酵母文库与荧光标记抗原反应，再利用流式细胞技术分选表观亲和力强的纳米抗体展示酵母细胞，再将筛选的表观亲和力强的纳米抗体在原核表达系统表达，验证纳米抗体的抗原结合特性。
在本发明中，筛选的非洲猪瘟P72纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO：5～SEQ IDNO：13，其中SEQ ID NO：12所示的纳米抗体中和活性最好。
下面结合实施例对本发明提供的一种展示纳米抗体的酵母文库、构建方法及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种展示纳米抗体的酵母文库的构建方法
1.重组蛋白表达与纯化
1.1非洲猪瘟P72的重组表达及纯化
非洲猪瘟的P72蛋白的编码基因根据GenBank中公布的我国ASFV流行毒株(登录号为MK128995.1)B646L基因序列，在引物(上游引物5′-CGCCATATGATGGATTTCCAAAATGACTTTTTA-3′，SEQ ID NO：77，限制性内切酶NdeⅠ；下游引物5′-CCCAAGCTTAAACTTATTTTTTACACTAATAAT-3′，SEQ ID NO：78，限制性内切酶HindⅢ的)作用下经PCR扩增(反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，共30个循环)得到。
用限制性内切酶NdeⅠ和HindⅢ分别酶切PCR产物和pET28a(+)表达载体，通过T4DNA连接酶于16℃连接12h；连接产物转化至E.coli Transetta(DE3)感受态细胞中，并涂布于LB固体培养基上，37℃倒置培养12h；用10μL枪头挑取单个菌落接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养12h；按照EasyPure Plasmid Miniprep Kit说明书提取表达载体，于室温条件下进行双酶切鉴定，酶切体系为：表达载体2μg，限制性内切酶NdeⅠ和HindⅢ各1μL，Cutsmart 2μL，ddH2O 15μL。对转化后的E.coli Transetta(DE3)感受态细胞进行扩大培养，待OD600值达到0.8时，加入0.1mmol/L IPTG诱导表达6h；收集菌体，用PBS重悬，破碎后纯化，得到的重组蛋白进行SDS-PAGE分析。
2.酵母展示载体的构建
用一对引物(引物1/引物2)通过点突变试剂盒(任意生物公司的点突变试剂盒)进行定点突变，去除pCTCon2载体中Trp基因内的HindIII限制性位点，合成了一个新的展示元件：编码appS4领导序列(LS)，然后是一个多克隆位点(MCS)，此为纳米抗体库插入位置，接着是Aga2p锚定蛋白和ACP以及Myc标签，将所述新的展示元件插入EcoRI和BglII多克隆位点处。pNACP可以通过BamHI和HindIII有效地线性化，引入单个纳米抗体基因或通过酵母中的体内同源重组构建完整的免疫库。
引物1：CCAGCTAACATAAAATGTAAACTTTCGGGGCTCTCTTGCC(SEQ ID NO：79)；
引物2：GGCAAGAGAGCCCCGAAAGTTTACATTTTATGTTAGCTGG(SEQ ID NO：80)。
3.纳米体展示库的构建
用上述步骤1中制备的纯化后重组蛋白作为抗原对骆驼进行免疫，免疫量是：840μg非洲猪瘟P72重组蛋白免疫次数为6次，具体方法为每840μg非洲猪瘟P72重组蛋白分别与弗氏完全佐剂(初免)和不完全佐剂(加强)等体积充分混匀乳化作为免疫原，分别对驼进行颈部皮下注射，每2周加强1次。免疫程序结束后，采集血液标本，分离外周血淋巴细胞(PBLs)并进行RT-PCR。编码来自体内成熟重链抗体库的纳米体集合的RNA片段被扩增如下：从PBLs中分离总RNA，经反转录制备cDNA，以cDNA为模板，用引物(5'-GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG-3'，SEQ ID NO：81和5'-GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3'，SEQ IDNO：82)进行PCR扩增出编码所有免疫球蛋白重链的开放阅读框。
随后，再用带BamHI/HindⅢ酶切位点的引物(5'-CAATTAGATAAAAGAGAGGCCGAAGCTCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGG-3'，SEQ ID NO：1和5'-CCCCTCCACCAGAGCCACCTCCGGATCCGCTGGAGACGGTGACCTGGGTCCC-3'，SEQ ID NO：2)进行巢式PCR扩增纳米体开放阅读框，生成能够同源重组到pNACP的侧链序列。PCR程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，共30个循环。
用EBY100菌落接种5ml的YPD培养基，在30℃下生长一夜。将50ml的培养液接种在YPD培养基中，600nm处的吸光度为0.1，并在30℃条件下培养细胞，600nm处的吸光度约为1.3～1.5(约6小时)。当细胞生长时，根据制造商的方案使用PelletPaint沉淀DNA进行转化。通常，将DNA放入四个电穿孔试管中，每个试管中含有上述PCR产物10μg与经过BamHI/HindⅢ线性化pNACP载体(10μg)混合，用于生成约4×107的文库。PCR产物/线性载体比率可以从5:1～1:1不等，每个反应杯至少有1mg线性载体。细胞在600nm处达到约1.3～1.5的吸光度，向培养物中加入500ml Tris-DTT缓冲液。在30℃的摇床中培养15分钟。在4℃下以2500g的颗粒细胞培养3分钟，并用25ml冰冷的E缓冲液(1.2gTris、92.4g蔗糖和0.2gMgCl2在1升的去离子H2O中，调节pH至7.5，过滤灭菌)洗涤(冲洗、排斥和吸取上清液)。再次用1ml冰冷的E缓冲液洗涤细胞。每个预冷电穿孔试管，等量50毫升再悬浮细胞-DNA混合物。保持电穿孔试管在冰上直到脉冲。将试管置于基因脉冲器中，在没有脉冲控制器的情况下以0.54kV和25mF电穿孔。立即向试管中加入1毫升温(30℃)的YPD培养基。电穿孔的典型时间常数在15～40ms之间，对转化效率影响不大。将细胞从脉冲试管转移到15ml Falcon试管中。用额外1ml的YPD培养基洗涤每个试管，以从试管中恢复剩余的细胞，在30℃下摇1小时。
4.酵母菌上纳米抗体库正交染色
将酵母菌纳米抗体展示系统的酵母细胞接种到SDCAA培养基中(20g葡萄糖，6.7g酵母氮基，5g酪蛋白氨基酸，5.4gNa2HPO4和8.56gNaH2PO4·H2O定容到1L水中，10ml GibcoTM青霉素-甾醇霉素1000U/mL)，生长到OD600为1。当显示文库时，接种物包含的细胞至少是文库大小的十倍。为了诱导，以4000g收获细胞，并将其重新悬浮在SGCAA培养基中(20g半乳糖，6.7g酵母氮基，5g酪蛋白氨基酸，5.4gNa2HPO4和8.56gNaH2PO4·H2O定容到1L水中，10mlGibcoTM青霉素-甾醇霉素1000U/mL)，并在30℃，120rpm生长过夜。对于正交染色，将总共4×107个诱导的酵母细胞在含有0.2％(w/v)BSA(牛血清白蛋白)(pH7.4)的冷PBS(磷酸盐缓冲液)(PBS–BSA)中洗涤两次，集4000g并储存在冰上。对于ACP的共价标记，细胞常规地重新悬浮在100μl反应缓冲液(50mM HEPES，pH 7.4，10mM MgCl2)中，该缓冲液补充有1μM的Sfp合成酶和1μM选择的CoA衍生物：CoA-547荧光团。在室温下以50rpm旋转染色60分钟后，用500μl冰冷的PBS–BSA洗涤标记的细胞三次。诱导显示，NB35的酵母细胞，用COA-547正交染色，在激光扫描共聚焦显微镜下，激发波长543nm，放大物镜100倍。
结果见图4。由结果可知，酵母细胞表面展示红色荧光信号，说明融合蛋白在细胞表面展示。同时流式细胞仪分析了表达融合蛋白的CoA-547标记细胞(pNACP_Nb，红色)与未显示Nb-Aga2p-ACP融合的标记酵母细胞(pNACP，灰色)相比，表达融合蛋白的CoA-547标记细胞占67％。
5.通过酵母展示和流式细胞仪选择纳米抗体以及亲和力测定
5.1通过酵母展示和流式细胞仪选择纳米抗体
酵母显示库Lib191(ASFV-P72)进行接种、诱导，并用CoA-547进行正交染色。在每一轮选择中，将4×107个CoA-547染色的酵母细胞在4℃下与抗DY-547P1荧光抗原在500μL冰冷的抗原特异性缓冲液中孵育60分钟。10mM HEPES pH 8.0，300mM NaCl，2.5mM CaCl2，0.2％BS A用于P72。酵母细胞与荧光抗原孵育后，用规定的流式细胞仪缓冲液洗涤三次，并在2mL的最终体积中重新悬浮，在流式细胞仪上进行分选。将筛选出的酵母细胞分选到SDCAA培养基中，进行培养和诱导，然后再次染色，进行连续几轮的筛选。将分选的酵母细胞等分体作为单个集落平铺在SDCAA琼脂平板上，挑取并在96孔平板中生长到500μL SDCAA培养基中进行进一步的表征。为了测序，将5×105个酵母细胞在10μL裂解缓冲液(10mM TrispH7.4，50mM KCl，1.5mM Mg Cl2，)加裂解酶(500U/mL)中于37℃温育60min，然后一次冻融循环，以2.5μL为模板，用引物5'-CGGAATTCGATGTGCAGCTGGTGGAGTCT-3'(SEQ ID NO：83)和5'-TGCTCGAGTGAGGAG AC AGTGACCTGGGTCC-3'(SEQ ID NO：84)进行PCR扩增纳米抗体的DNA片段。PCR程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，共30个循环。
5.2流式细胞术进行纳米体筛选和亲和力测定
筛选出来的酵母菌分别在96孔板中生长，并在500μL SGCAA培养基中诱导。展示与无关抗原结合的特征良好的酵母菌纳米抗体被作为阴性对照。为了对单个克隆进行流式细胞术分析，将106个细胞转移到新鲜的96孔板上，洗涤并用COA-547正交染色，最终体积为15μL。将105个染色细胞与100nm荧光抗原混合在50μL的流式细胞仪缓冲液中，在4℃和50rpm/min的振荡下孵育60分钟。为了去除未结合的荧光抗原，用FACS缓冲液洗涤细胞两次，并将其应用于流式细胞分析仪Fortessa。使用软件分析每孔10，000个酵母细胞，并与阴性对照进行比较。为了用流式细胞术测定单个纳米抗体在酵母上的表观亲和力，遵循了类似的程序，只是将同一克隆的等分分配到96孔板中，用连续稀释(μm-pm范围)的荧光抗原孵育60分钟。对于每个抗原浓度，计算10，000个酵母细胞的MFI并根据荧光抗原浓度绘制图，用软件对单位点特异结合模型计算了表观KD。
结果见图5。通过流式细胞术(x轴)或BLI(y轴)测定的不同纳米抗体表观亲和力，结果表明，预测结果与实际测定结果呈线性相关，且相关性较高。
6.纳米抗体在大肠杆菌中的表达
将筛选出来的纳米抗体酵母菌，用溶菌酶溶解。用引物对5'-CGGAATTCGATGTGCAGCTGGTG GAGTCT-3'(SEQ ID NO：85)和5'-TGCTCGAGTGAGGAGACAGTGACCTGGGTCC-3'(SEQ ID NO：86)进行PCR扩增纳米抗体的DNA片段。PCR程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，共30个循环。可以方便地通过PCR从Lyticase处理的酵母细胞中扩增通过酵母展示选择的纳米体的开放阅读框，并将其克隆为pMESy4的金门变体(GenBank KF415192)中的SapI消化片段。含有C末端His6标签和EPEA-tag7的纳米体在大肠杆菌菌株WK619的外周中常规表达并从中纯化。细胞在添加氨苄青霉素(100mg/ml)和葡萄糖(0.1％w/v)的极佳肉汤培养基中生长，转速为120转，37℃至OD600＝0.8，在28℃用1mM IPTG诱导过夜。第二天，通过离心(5000g，15min)收集细胞，并使用渗透休克提取周质部分(Pardon 2014)。将澄清后的上清液通过离心(5000g，30min)与原生质体分离后，装在Histrap FF 5ml预置柱上。用500mM咪唑从NINTA树脂中洗脱纳米抗体。
将洗脱的纳米抗体经过测序和比对，结果见图6。从比对结果可知，可确定纳米抗体的骨架区1、可变区1、骨架区2、可变区2、骨架区3、可变区3和骨架区4的氨基酸序列以及差异序列。
7.动力学分析
7.1纯化的纳米抗体-抗原结合动力学
对于纯化的纳米抗体，用OctetRED96测定了P72的结合动力学参数。纯化的His6和EPEA标记的纳米抗体在10mMHEPES pH 8.0，300mMNaCl，2.5mM CaCl2，0.5％BSA，0.04％Tween 20中稀释到2μg/ml，并直接固定在NiNTA生物传感器上，反应约1nm。在100秒的平衡步骤后，通过将不同的传感器同时暴露在不同浓度的P72中来监测结合等温线。抗原的结合被测量了300s，然后是900s的解离实验。所有的动力学实验都是在30℃下以1000rpm的恒定搅拌进行的。一个单独接触缓冲液的生物传感器被用来监测感觉图的背景。通过使用Octet数据分析软件中的1:1结合模型拟合感觉图来计算结合和解离率。
结果见图7。检测了Ni-NTA生物传感器对不同浓度的P72的结合特性。在降低抗原浓度的情况下，用荧光激活细胞分选快速筛选分离的酵母克隆是鉴定高亲和力结合物的有效方法。
7.2生物素化和纳米抗体降低的抗原结合动力学
用DTT从酵母细胞壁释放ACP的纳米体，并通过OctetRED96测量其结合动力学。展示的纳米抗体-Aga2p-ACP融合的酵母细胞在SGCAA培养基中生长并诱导。4×108诱导的细胞用PBS-BSA洗涤两次，并用1ml最终体积的CoA生物素正交染色，然后洗涤三次，并在室温下通过加入含有2mM DTT的PBS削减30min，以减少Aga1p和Aga2p之间的二硫键。离心(4000g，3min)后，回收上清液并用于以约1nm的响应将生物素化的纳米抗体-Aga2p-ACP融合物加载到链霉亲和素生物传感器上。在100s的平衡步骤后，通过将单独的传感器同时暴露于不同浓度的P72来监测结合等温线。在300s内测量抗原的结合，随后进行900s的解离实验。
结果见图8。由BLI在Octetred96上测量生物素化纳米抗体-AgA2P-ACP融合蛋白的固定及其抗原与SA包被生物传感器的结合等温线可知，融合蛋白可以正交地与生物素部分结合，并从酵母细胞壁中功能释放。由此证明，正交标记的纳米抗体可以从酵母细胞壁释放。
综上所述，开发了一个酵母菌展示纳米抗体的改进平台，通过实施表面暴露试剂的正交标记，该系统允许操作人员稳健地监测每个单独酵母克隆上的展示水平。正交标记还能够容易地进行结合物的初始生物物理或生物化学表征，而不需要从另一宿主亚克隆、表达或纯化它们。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种展示纳米抗体的酵母文库，其特征在于，在酵母细胞表面展示表达纳米抗体-Aga2p-标签融合蛋白。
2.根据权利要求1所述酵母文库，其特征在于，所述标签上共价连接荧光基团或生物素。
3.根据权利要求1所述酵母文库，其特征在于，所述标签包括ACP和Myc标签。
4.根据权利要求1所述酵母文库，其特征在于，所述酵母文库表达的纳米抗体包括抗非洲猪瘟P72蛋白的纳米抗体库。
5.根据权利要求1～4中任意一项所述酵母文库，其特征在于，所述纳米抗体-Aga2p-标签融合蛋白通过appS4前导序列分泌至胞外；
所述纳米抗体-Aga2p-标签融合蛋白在GAL1启动子的转录控制下表达。
6.一种权利要求1～5中任意一项所述酵母文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
构建含信号肽-纳米抗体-Aga2p-标签融合基因的重组载体；
将所述含信号肽-纳米抗体-Aga2p-标签融合基因的重组载体导入酵母细胞中，经过培养，得到展示纳米抗体的酵母文库。
7.根据权利要求6所述构建方法，其特征在于，所述培养后，将所述酵母细胞在Sfp合成酶的作用下与CoA衍生物进行正交染色；
所述CoA衍生物包括CoA-547荧光基团；
所述正交染色时，所述酵母细胞的反应缓冲液为pH 7.4的含10mM MgCl2的50mM HEPES水溶液。
8.根据权利要求6所述构建方法，其特征在于，所述含信号肽-纳米抗体-Aga2p-标签融合基因的重组载体的骨架载体包括pNACP载体。
9.根据权利要求6～8中任意一项所述构建方法，其特征在于，所述构建含信号肽-纳米抗体-Aga2p-标签融合基因的重组载体时，所述纳米抗体的编码基因的扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的正向引物和SEQ ID NO：2所示的反向引物。
10.权利要求1～5中任意一项所述酵母文库或权利要求6～9中任意一项所述构建方法得到的酵母文库在筛选纳米抗体中的应用。
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