CN114716556A

CN114716556A - 毒鼠强纳米抗体及应用

Info

Publication number: CN114716556A
Application number: CN202011535063.9A
Authority: CN
Inventors: 王战辉; 温凯; 沈建忠; 于雪芝; 郭柳川; 杨慧娟; 张素霞
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2020-12-22
Filing date: 2020-12-22
Publication date: 2022-07-08
Anticipated expiration: 2040-12-22
Also published as: CN114716556B

Abstract

本发明提供一种毒鼠强纳米抗体及应用。利用毒鼠强人工抗原免疫动物分离外周血的B淋巴细胞，提取其RNA，构建纳米抗体文库，利用噬菌体展示技术，筛选得到毒鼠强纳米抗体。利用本发明提供的毒鼠强纳米抗体能够快速检测样品中的毒鼠强，在毒鼠强酶联免疫吸附法(Enzyme‑linked immunosorbent assay，ELISA)检测方法中，该抗体的IC₅₀值为1.04ng/mL，线性检测范围为0.057‑18.94ng/mL，本发明为实现毒鼠强的低成本、大批量现场检测提供有力工具。

Description

毒鼠强纳米抗体及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种毒鼠强纳米抗体及应用。

背景技术

毒鼠强(Tetramethylene，TET)，化学名为四亚甲基二飒四胺，为剧毒速效的灭鼠药，无色、无味，对所有温血动物都有剧毒，性质稳定，不易分解，且尚未有对应的解毒剂，在我国明令禁止生产和使用，但仍有人使用而造成中毒事件。仪器分析方法，如气质联用法等，需要繁琐复杂的前处理过程，且耗时长，面对公共卫生事件难以做到现场快速检测。因此，亟需建立一种简单快速的毒鼠强检测方法。免疫分析法具有简单快速，价格低廉等优势，可以实现大量样品的快速分析，在生物医药、食品健康与残留检测等领域有着广泛的应用。抗体作为免疫检测方法的核心试剂，影响着特异性、灵敏度等多个因素。

1993年，布鲁塞尔的Hamers课题组，首次报道了驼科动物血清中，天然存在缺少轻链的抗体，即重链抗体(Heavy chain antibody，HCAb)。这一发现被报道之后，围绕这种骆驼来源的重链抗体的一系列研究在全世界广泛开展。纳米抗体的抗原识别功能由可变区决定，即为重链抗体的可变区(Variable domain of the heavy chain of HCAbs，VHH)，克隆其可变区得到只由一个重链可变区组成的单域抗体(Single domain antibody，sdAb)，其晶体结构呈椭圆形，直径2.5nm，高度4nm，因分子量较小(约15KDa)，又被称作纳米抗体(Nanobody，Nb)。与传统抗体相比，纳米抗体具有很多优势，首先，纳米抗体保守的链内二硫键降低了CDR3区域的柔性，使得蛋白稳定性好；其次，有些纳米抗体的CDR3区域明显较长，使得与抗原有更大的接触面积；另外，纳米抗体中FR2区域疏水氨基酸残基被亲水氨基酸取代(Glu49、Arg50等)，因此亲水性比传统抗体高；除了以上几点外，纳米抗体对酸碱、有机溶剂等耐受性强、且其结构简单、易进化改造、成本低等特性弥补了传统抗体的不足。综上，纳米抗体的这些优势，对毒鼠强免疫学检测方法的建立具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型的毒鼠强纳米抗体及应用。

为了实现本发明目的，发明人先用毒鼠强人工抗原辅以免疫佐剂进行羊驼免疫，从外周血中分离淋巴细胞，提取RNA，通过PCR和电转化的方法，构建重组噬菌粒，建立纳米抗体的抗体库。利用噬菌体展示技术，筛选靶向特定抗原的纳米抗体，并从噬菌体库中筛选获得了一种体积小、稳定性强、易克隆、易表达、且可特异性结合毒鼠强的纳米抗体。

第一方面，本发明提供一种毒鼠强纳米抗体，所述抗体包含如下的氨基酸序列或由其组成：

i)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；或

ii)在i)的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列；或

iii)i)或ii)的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的抗体。

所述毒鼠强纳米抗体的结构分析如图3所示。毒鼠强纳米抗体的结构域包括四个框架区(Framework region，FR)和三个互补决定区(Complementarity-determiningregion，CDR)。

进一步地，可以将SEQ ID NO:1所示的毒鼠强纳米抗体作为前体，通过随机或定点突变技术进行改造得到突变体，这些突变体均属于本发明保护范围，以提升纳米抗体的水溶性、稳定性、亲和力以及特异性等。

第二方面，本发明提供编码所述毒鼠强纳米抗体的核酸分子。所述核酸分子的序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明提供的核酸分子或者至少部分序列可以通过合适的表达系统进行表达以得到相应的蛋白质或多肽。这些表达系统包括但不限于细菌，酵母菌，丝状真菌，动物细胞，昆虫细胞，植物细胞或无细胞表达系统。

第三方面，本发明提供含有上述核酸分子的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体(包括噬菌体载体)、工程菌或转基因细胞系。

进一步地，本发明提供一种载体，包含所述核酸分子。考虑到遗传密码子具有简并性，该核酸分子可以根据不同的应用目的而有所不同。

进一步地，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含所述蛋白质或表达载体。

第四方面，本发明提供一种毒鼠强检测试剂或试剂盒，有效成分为SEQ ID NO:1所示的毒鼠强纳米抗体。

第五方面，本发明提供一种毒鼠强ELISA检测试剂盒，所述试剂盒包括盒体、设在盒体内可拆卸的酶标板以及设在盒体内的试剂；所述酶标板的每个孔包被有毒鼠强人工抗原，所述试剂包括SEQ ID NO:1所示的抗体，以及毒鼠强标准溶液、酶标二抗、PBS缓冲液0.01M PBS(pH 7.4)、PBST洗涤液(含1％v/v Tween-20的PBS)、显色液和反应终止液等中的至少一种。

进一步地，所述毒鼠强人工抗原是由式I)所示的毒鼠强半抗原(TET-2j)与载体蛋白偶联后得到的；

所述载体蛋白可选自牛血清白蛋白(Albumin from bovine serum，BSA)、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白(Keyhole limpet hemocyanin，KLH)、甲状腺蛋白、人血清白蛋白中的至少一种，优选钥孔血蓝蛋白(KLH)。将TET-2j与KLH偶联后得到的毒鼠强人工抗原命名为TET-KLH。

第六方面，本发明提供所述毒鼠强纳米抗体的以下任一应用：

1)用于毒鼠强检测；

2)用于制备毒鼠强检测试剂或试剂盒；

3)用于毒鼠强的富集和纯化；

4)用于制备毒鼠强的富集和纯化试剂。

第七方面，本发明提供一种毒鼠强的检测方法，所述方法可选自ELISA，荧光偏振免疫分析(Fluorescence polarization immunoassay，FPIA)，化学发光免疫分析法(Chemiluminescence immunoassay，CLIA)，亲和层析法和免疫传感器等。上述检测方法使用的检测试剂中包含SEQ ID NO:1所示的毒鼠强纳米抗体。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

利用本发明提供的毒鼠强纳米抗体能够快速检测样品中的毒鼠强，在毒鼠强ELISA检测方法中，该抗体的IC₅₀值为1.04ng/mL，线性检测范围为0.057-18.94ng/mL，本发明为实现毒鼠强的低成本、大批量现场检测提供有力工具。

本发明提供的毒鼠强纳米抗体，可利用原核表达系统进行大规模高效制备(如在大肠杆菌内高效表达)，可应用于毒鼠强检测试剂及快速检测产品的开发。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中羊驼一免到六免的毒鼠强抗血清滴度。

图2为本发明较佳实施例中每轮筛选后多克隆phage-ELISA灵敏度变化。

图3为本发明较佳实施例中毒鼠强纳米抗体的结构分析情况。

图4为本发明较佳实施例中利用间接竞争ELISA法进行毒鼠强的检测所建标准曲线。

图5为本发明较佳实施例中抗体库插入率PCR验证。其中，Lane M0，DL2000 DNAMarker；Lane 1-23，随机挑选的23个克隆PCR产物(重组噬菌粒验证)。

图6为本发明较佳实施例中抗体在RV308菌株表达的SDS-PAGE分析。其中，LaneM1:Protein marker；Lane PC1:BSA(1μg)；Lane PC2:BSA(2μg)；Lane NC:未诱导的全细胞；Lane 1:16℃诱导16h的全细胞；Lane 2:37℃诱导4h的全细胞；Lane NC1:未诱导的细胞裂解上清；Lane 3:16℃诱导16h的细胞裂解上清；Lane 4:37℃诱导4h的细胞裂解上清；LaneNC2:未诱导的细胞裂解沉淀；Lane 5:16℃诱导16h的细胞裂解沉淀；Lane 6:37℃诱导4h的细胞裂解沉淀。目的蛋白大小为16.1KDa、表达水平为15mg/L，可溶比例15％。

图7为本发明较佳实施例中抗体在RV308菌株表达的Western blot分析。其中，Lane M2:Western blot Protein marker；Lane 3:16℃诱导16h的细胞裂解上清；Lane 4:37℃诱导4h的细胞裂解上清。Western blot的抗体为anti-His抗体(GenScript，Cat.No.A00186)。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，MolecularCloning:a Laboratory Manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1抗毒鼠强纳米抗体噬菌体抗体文库的构建

将式I)所示的毒鼠强半抗原通过NHS/DCC与Keyhole Limpet Hemocyanin(KLH)共价偶联，得到毒鼠强人工抗原TET-KLH，取500μg TET-KLH与弗氏佐剂按1:1比例混合乳化(第一次使用弗氏完全佐剂，此后的免疫使用弗氏不完全佐剂)，在羊驼(Alpaca)颈背部进行皮下多点免疫。免疫周期为间隔三周进行一次，免疫七天后静脉取血，采用间接竞争ELISA法测定毒鼠强特异性抗体滴度、特异性及灵敏度(图1)，取免疫后的外周血，采用密度梯度离心法分离淋巴细胞，用Trizol法提取RNA。以RNA为模板，使用反转录试剂盒(购自Invitrogen公司)合成cDNA。采用Taq酶，经PCR得到VHH编码基因，PCR反应条件为：95℃5min；95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min，30个循环；72℃ 10min。上游引物为F1(简并引物)：5′-CATGCCATGACTGTGGCCCAGGCGGCCCAGKTGCAGCTCGTGGAGTCNGGN GG-3′(K为G或T，N为A、T、C或G)，下游引物分别为R1：5′-CATGCCATGACTCGCGGCCGGCCTGGCCTCGTGGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG-3′和R2：5′-CATGCCATGACTCGCGGCCGGCCTGGCCTCGCCTTGTGGTTTTGGTGTCTTGG G-3′。产物经琼脂糖凝胶电泳切割400bp左右的条带，经DNA片段胶回收试剂盒回收及NanoDrop定量，-20℃保存备用。PCR扩增产物(VHH基因)和噬菌粒PAK100(由苏黎世大学Pluckthun教授惠赠)分别用限制性内切酶sfi I，50℃酶切3h，切胶回收，16℃过夜连接(VHH基因与PAK100的摩尔比1:3)，构建重组噬菌粒PAK100-TET。经电转化的方式，将PAK100-TET重组噬菌粒电转至大肠杆菌XL1-Blue电转感受态细胞，构建出抗体库，取10μL菌液倍比稀释，涂布2×YT氯霉素培养板，37℃培养过夜，通过菌落计数计算转化效率，转化平板上挑取单克隆进行菌液PCR，测定VHH插入率(图5)，通过Sanger测序分析抗体库多样性，计算库容。抗体库加入终浓度20％甘油，-20℃保存备用。按感染比例20:1加入辅助噬菌体M13KO7(辅助噬菌体M13KO7购自NEB公司)。用含有卡那霉素和氯霉素的双抗性2×YT培养基37℃培养过夜(250rpm振荡)。将过夜菌液以5000rpm离心10min沉淀菌体细胞，上清转移到另一无菌的50mL离心管中，加入PEG-NaCl(20％w/v PEG，2.5M NaCl)，冰浴30min，10000rpm离心20min，然后用1mLPBS重悬M13KO7沉淀，即为初级噬菌体抗体库，测定滴度，保存备用。

实施例2抗毒鼠强纳米抗体的筛选及鉴定

本发明采用固相亲和法淘选毒鼠强纳米抗体，从实施例1中制备的毒鼠强噬菌体文库淘选阳性克隆，鉴定单克隆。

小分子包被抗原的载体选择BSA，采用固相筛选的方式，通过物理吸附，将TET-BSA用包被缓冲液(0.05M，pH 9.6，碳酸盐缓冲液)稀释后固定在96孔酶标板，100μL/孔，37℃包被2h，四轮淘选的包被原浓度依次递减，分别为1000μg/mL、100μg/mL、10μg/mL、1μg/mL)；包被完成，使用PBST洗涤液300μL/孔洗涤，重复3次；封闭液采用3％脱脂奶粉，150μL/孔，37℃，封闭1.5h；弃孔中液体，PBST洗涤3次，保存备用；将构建好的毒鼠强噬菌体抗体文库在37℃，与TET-BSA孵育30min，100μL/孔，PBST洗涤(次数逐轮递增)，然后用PBS洗涤(次数逐轮增加)(表1)。利用酸洗脱方式(0.2M甘氨酸，pH 2.2)，洗脱结合在包被原上的噬菌体，然后用Tris-HCl(pH 8.0)中和洗脱物，侵染培养到对数期的大肠杆菌XL1-Blue，随后，加入M13KO7辅助噬菌体进行救援，加入氯霉素、卡那霉素的培养基，按实施例1的方法制备下一轮的噬菌体库。

第二轮、第三轮及第四轮淘选，采用标准品竞争洗脱的方式进行，分别用1000、100和10ng/mL的毒鼠强标准品竞争孔中的噬菌体，37℃，孵育1h，洗脱液侵染培养到对数期的大肠杆菌XL1-Blue，M13KO7辅助噬菌体救援，37℃，250rpm过夜培养，按照施例1的方法得到富集的噬菌体，进行多克隆phage-ELISA，监测噬菌体抗体的灵敏度变化，结果如图2所示，毒鼠强抗体灵敏度逐轮提升，表明展示特异性抗体的噬菌体得到了有效富集。

经四轮淘选，挑取单克隆并加入M13KO7噬菌体侵染大肠杆菌，得到展示出纳米抗体的单克隆，随后利用单克隆phage-ELISA的方法，挑选出展示了特异性抗体的阳性克隆，菌液PCR鉴定条带大小，最后将单克隆送去公司进行序列测定，得到插入片段的DNA序列(SEQ ID NO:2)，其编码如SEQ ID NO:1所示的纳米抗体的纳米抗体(图3)。

表1噬菌体抗体库富集程序

实施例3抗毒鼠强纳米抗体的表达及纯化

重组噬菌粒pAK100-TET及表达载体pJB33(载体pJB33由苏黎世大学Pluckthun教授惠赠)使用Sfi I限制性内切酶进行双酶切，酶切条件为50℃3h，随后采用琼脂糖凝胶电泳进行验证回收，用NanoDrop定量后，使用T4 DNA连接酶将VHH基因与载体pJB33按摩尔比3:1进行连接，16℃过夜连接，构建原核融合表达载体pJB33-TET。从超低温冰箱中取出100μL RV308感受态细胞，冰上融化，加入质粒pJB33-TET(100ng)，轻轻吹吸充分混匀，冰上放置30min，水浴锅42℃热激90s，然后冰上放置3min，最后，加入100μl 2×YT液体培养基，摇床37℃，200rpm培养1h，转化产物涂布含有氯霉素的2×YT固体培养基，平板倒置，37℃培养过夜。挑取单个菌落进行菌液PCR鉴定，并提取条带正确的单克隆菌株送测序，将测序正确的单克隆加入甘油-20℃保存。

取菌种接种到100mL含30μg/ml的氯霉素的2×TY液体培养基中，37℃在摇床200rpm培养，待OD₆₀₀达到0.6-0.8时，加入终浓度为0.25mM的IPTG，37℃诱导表达4h；然后菌液以5000rpm离心，弃上清，沉淀加入10mL PBS，重悬沉淀，5000rpm离心，弃上清；加入20ml裂解缓冲液(50mM Tris-Hcl，150mM NaCl，5％glycerol，pH8.0)，超声裂解20min，12000rpm离心20min，取上清用于后续纯化。先用平衡液对Ni柱进行平衡，随后对上清进行纯化，2ml洗脱液洗脱结合Ni柱上的抗体，将诱导前后的菌液裂解物、洗脱液等进行SDS-PAGE电泳和Westen blot检测。另外，优化诱导表达条件，如诱导时间、温度等(图6和图7)，可进一步提高目的蛋白表达量，为大量制备抗毒鼠强纳米抗体提供支持。分析纯化得到的纳米抗体大小为16.1KDa、表达水平为15mg/L，可溶比例15％。最后，用间接竞争ELISA初步测定其活性。

从图6可以看出，毒鼠强纳米抗体可以在RV308菌株中高效表达，目的蛋白大小为16.1KDa；通过比较诱导前后蛋白条带，可以发现，经过0.25mM的IPTG诱导后，蛋白表达量有了显著提高；比较细胞裂解沉淀和细胞裂解上清的蛋白量，可知蛋白的可溶比例相对较高；通过优化诱导条件，发现37℃诱导4h的诱导条件相较16℃诱导16h，具有更高的表达量。

从图7可以看出，目的蛋白大小为16.1KDa，从优化诱导表达条件可知，37℃诱导4h的细胞裂解上清的蛋白含量比16℃诱导16h的细胞裂解上清中的蛋白含量多；表达水平为15mg/L，可溶比例15％。

实施例4利用毒鼠强纳米抗体检测毒鼠强

本发明使用间接竞争ELISA建立了毒鼠强免疫分析方法。具体方法如下：

(1)包被：用CB缓冲液(0.05M的碳酸盐，pH 9.6)将合成的不同的毒鼠强人工抗原进行倍比稀释，加入96孔透明酶标板中(100μL/孔)，4℃过夜孵育10h，用PBST缓冲液洗板3次。

(2)封闭：加入封闭液(3％脱脂牛奶)150μL/孔，37℃温箱孵育1.5h，弃封闭液，PBST缓冲液洗涤3次，拍干。

(3)抗原抗体竞争反应：向孔中加入50μL PBS缓冲液或50μL 100ng/mL TET标准品，再加入50μL稀释不同梯度的纳米抗体，另外，设置空白对照孔(PBS)和背景对照孔(阴性抗体)，37℃温箱反应30min，PBST缓冲液洗涤3次，拍干。

(4)加酶标二抗：加入抗体稀释液稀释的辣根过氧化物酶(HorseradishPeroxidase，HRP)标记的抗His标签鼠源单克隆抗体(1:1000)，100μL/孔，37℃温箱反应30min，PBST缓冲液洗涤3次，拍干。

(5)显色：将显色液(购自北京维德维康生物技术有限公司)按1:1体积比混合，加入微孔板中(100μL/孔)，避光，37℃温箱避光显色15min。

(6)终止：加入50μL/孔终止液(2mol/L浓硫酸)。

(7)数据分析：M5酶标仪读450nm处光密度值(OD值)，以OD₄₅₀波长测定各孔OD值。选取OD值接近1.5且加入标准品数值差异较大的孔所对应的抗原抗体浓度为毒鼠强包被原和纳米抗体的最适工作浓度，挑取选出最优包被原。建立标准曲线：使用Origin 8.5软件，以不同稀释倍数的毒鼠强的对数值为横坐标，以其对应的OD₄₅₀为纵坐标(n＝3)，按照四参数方程进行拟合，获得IC₅₀值。结果如图4所示，IC₅₀值为1.04ng/mL，线性检测范围为0.057-18.94ng/mL。

实施例5纳米抗体的特异性考察

利用交叉反应率评价SEQ ID NO:1抗体对毒鼠强的特异性。用CB溶液将毒鼠强人工抗原TET-BSA稀释不同倍数，包被在96孔酶标板上，100μL/孔，温箱37℃孵育2h；PBST洗板3次，150μL/孔，拍干；加入封闭液，3％w/v脱脂牛奶，300μL/孔，37℃封闭1.5h。PBST洗板3次后，拍干；分别配制0ng/mL，0.8ng/mL，4ng/mL，20ng/mL，100ng/mL，500ng/mL，2500ng/mL的毒鼠强、溴敌隆、鼠得克、大隆、华法林、噻鼠灵、氯华法林、杀鼠醚、克灭鼠和氟鼠灵标准液，加入50μL稀释标准品，每个样品的浓度梯度分别做3个重复，同时加入50μL实施例2制备的抗毒鼠强纳米抗体，37℃温育30min；PBST洗板3次，拍干，加入HRP标记的抗His标签抗体，100μL/孔，37℃孵育30min。PBST洗板3次，拍干，加入100μL/孔显色液，37℃避光显色10min；加入50μL/孔终止液(2M浓硫酸)，读取450nm波长各孔OD值。建立标准曲线，利用四参数方程计算各标准物质与毒鼠强的交叉反应率，公式如下：

交叉反应率＝[IC₅₀(毒鼠强)/IC₅₀(其他标准物质)]×100％

计算与毒鼠强的交叉反应率。实验结果表明，SEQ ID NO:1所示抗体与毒鼠强结构类似物交叉反应率CR<0.5％，说明该抗体对毒鼠强具有良好的特异性。

本发明提供的毒鼠强纳米抗体，与现有的毒鼠强单克隆抗体相比，至少具有以下优势：1、本发明的毒鼠强纳米抗体检测灵敏度更高(1.04ng/mL)，且与其他的鼠药无交叉反应，特异性较；2、毒鼠强纳米抗体的体积为单克隆抗体的1/10，方便进行修饰和改造，如进行丙氨酸扫描和虚拟突变计算，建立突变文库，可进一步优化抗体性质。另外，更小的抗体体积在检测方法的开发中有着更明显的优势，如在荧光能量共振转移(FRET)中，体积较小的纳米抗体可以缩短能量传递距离，提高效率和检测灵敏度；3、本发明的纳米抗体有着较好的表达量，可以通过原核表达大量生产进行试剂盒等开发应用，相比毒鼠强单克隆抗体具有更低的生产成本。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 毒鼠强纳米抗体及应用

<130> KHP201119225.3

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ile Ser

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Ala Ile Thr Ser Gly Gly Ser Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Phe Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Arg Cys Ala

85 90 95

Ala Asp Ser Arg Ala Thr Gly Trp Gly Ile Asn Ser Trp Leu Ala Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 2

<211> 373

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggaag catcttcagt atcagtgcca tgggctggtt ccgccaggct 120

ccagggaagc agcgcgagtt ggtcgcggcg attactagtg gtggtagcac agtctatgca 180

gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaagaacac gttctatctg 240

caaatgaaca gcctggaacc tgaggacact gccatttatc gctgtgcagc agattcaagg 300

gcgacgggtt ggggtatcaa ctcgtggctc gccgactact ggggccaggg gacccaggtc 360

accgtctcct cag 373

Claims

1.毒鼠强纳米抗体，其特征在于，所述抗体包含如下的氨基酸序列或由其组成：

i)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；或

ii)在i)的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列；或

2.编码权利要求1所述抗体的核酸分子。

3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.含有权利要求2或3所述核酸分子的生物材料，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。

5.毒鼠强检测试剂或试剂盒，其特征在于，有效成分为权利要求1所述的抗体。

6.毒鼠强ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括盒体、设在盒体内可拆卸的酶标板以及设在盒体内的试剂；所述酶标板的各孔包被有毒鼠强人工抗原，所述试剂包括权利要求1所述的抗体，以及毒鼠强标准溶液、酶标二抗、PBS缓冲液、PBST洗涤液、显色液和反应终止液中的至少一种。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述毒鼠强人工抗原是由式I)所示的毒鼠强半抗原与载体蛋白偶联后得到的；

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白中的至少一种。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述载体蛋白为钥孔血蓝蛋白。

10.权利要求1所述抗体的以下任一应用：

1)用于毒鼠强检测；

2)用于制备毒鼠强检测试剂或试剂盒；

3)用于毒鼠强的富集和纯化；

4)用于制备毒鼠强的富集和纯化试剂。