CN112010969A - 一种高亲和力增强绿色荧光蛋白纳米抗体及其编码基因的筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程领域，具体为公开了高亲和力增强绿色荧光蛋白纳米抗体及其编码基因的筛选方法。所述抗体是含有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列，其核酸序列如SEQ ID NO.2所示。还公开了一种宿主细胞，可以表达抗EGFP纳米抗体，具有高水溶性、高耐性、高稳定性，高抗原结合性、低免疫原性以及高表达性。本发明提供的抗EGFP纳米抗体可特异性的结合绿色荧光蛋白，且其有较高亲和力，可应用与EGFP的基础研究中。

Description

一种高亲和力增强绿色荧光蛋白纳米抗体及其编码基因的筛 选方法

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种高亲和力增强绿色荧光蛋白纳米抗体及其编码基因的筛选方法。

背景技术

绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein GFP)是Shimomure等于1962年首次从维多利亚多管发光水母(Aequorea victoria)中分离出的蛋白，可自发产生荧光，发色基团位于β桶和α-螺旋形成的致密结构域中，其性质稳定，被广泛应用于抗体检测、细胞内定位、单分子荧光成像等。EGFP(enhanced green fluorescent protein),即增强绿色荧光蛋白,是经过改造后的定点突变体增强型GFP，其荧光强度更强，更易于检测，常作为在报告基因来研究基因表达调控，探索信号通路以及示踪成像等，EGFP作为生命科学研究中最常用的工具蛋白，具有很高的研究与应用价值。使得针对EGFP的高亲和力特异性抗体在基础生物研究十分重要。

纳米抗体是一种天然缺失轻链的功能性抗体(即重链抗体)，能与特异性的抗原结合。这种抗体的可变区域仅仅由一条链组成，因此又称为单域重链抗体，体积很小，分子大小仅为15kDa。具有免疫原性低、稳定性高、可溶性好；可以使用多种不同的表达系统如细菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞甚至植物宿主细胞等进行表达。这些优良的特性使得纳米抗体在基础研究领域具有极大的应用价值。

EGFP单克隆或多克隆抗体是通过免疫动物获得的，但其相对分子质量较大、生产成本高、稳定性差等问题，其应用受到限制。由于纳米抗体能在微生物中稳定高效表达，可以克服这些问题，因此开发高亲和力的抗EGFP纳米抗体及其原核表达载体和菌株，在对以EGFP为标签的蛋白研究中将有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供针对EGFP的高亲和力纳米抗体，以及该纳米抗体的原核表达载体和菌株。本发明表达纯化了该纳米抗体并证明了纳米抗体亲和力高且能够特异结合EGFP，可应用于EGFP基础研究。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

本发明提供了一种高亲和力增强绿色荧光蛋白纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的可变区具有3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，其中所述纳米抗体的可变区序列由SEQID NO.1所述氨基酸序列组成，其核酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种高亲和力增强绿色荧光蛋白纳米抗体的编码基因的筛选方法，包括以下步骤：

(1)用绿色荧光蛋白免疫羊驼，第4次免疫后抽取羊驼外周血，分离血细胞提取血细胞总RNA，反转录成cDNA后，通过PCR扩增得到VHH编码基因；

(2)将VHH编码基因克隆到噬菌体展示载体上，构建VHH噬菌体展示文库；

(3)将绿色荧光蛋白包被于酶标板中，通过噬菌体展示技术从文库中富集绿色荧光蛋白纳米抗体；

(4)通过ELISA方法筛选阳性单克隆；

(5)阳性单克隆菌落送测序，获得绿色荧光蛋白纳米抗体基因序列。

进一步地，所述载体为pComb3XSS。

本发明还提供一种宿主细胞，包括所述蛋白质或表达载体，细胞可选择大肠杆菌BL21(DE3)，易于培养，周期短，操作方便，且菌株能够稳定扩增。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明将EGFP蛋白免疫羊驼，随后利用该羊驼外周血淋巴细胞建立了针对于EGFP的纳米抗体基因库，实验中将EGFP蛋白偶联在酶标板上，利用噬菌体展示技术筛选免疫性的纳米抗体基因库(羊驼重链抗体噬菌体展示基因库)，从而获得了针对EGFP特异性的纳米抗体基因，将此基因转至大肠杆菌中，从而建立了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株，相比于传统的抗体，纳米抗体具有高亲和力、高特异性、高表达性等优点。本发明筛选得到的纳米抗体亲和力高，特异性强，具有广泛的商业用途。

附图说明

图1为巢式PCR结果；

图2为文库菌落PCR鉴定；

图3为纳米抗体原核表达SDS-PAGE结果；

图4为纳米抗体亲和力测定。

具体实施方式

本发明首先将EGFP蛋白作为抗原免疫羊驼，经过4次免疫之后提取该羊驼外周血淋巴细胞并构建了EGFP特异的单域重链抗体文库。将EGFP蛋白固定在酶标板上，利用噬菌体展示技术筛选EGFP免疫性的纳米抗体基因库，从而获得了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1

针对于EGFP的纳米抗体文库的构建：

EGFP蛋白用PBS稀释成1mg/ml，和等体积弗氏完全佐剂混合，置于混合器上剧烈振荡使抗原充分乳化，皮下多点免疫注射，两周后进行再次免疫；二免开始蛋白用PBS稀释成1mg/ml和等体积的弗氏不完全佐剂混合，乳化，皮下注射。第四次免疫后抽取羊驼外周血，分离淋巴细胞提取白细胞总RNA，按照按照Thermo公司的thermo Revert Aid First andCDNA syntheies kit操作说明将RNA反转录成cDNA后通过巢式PCR扩增得到VHH基因：

第一轮PCR：

上游引物：CTT GGT GGT CCT GGC TGC

下游引物：GGT ACG TGC TGT TGA ACT GTT CC

反应条件：94℃3min；98℃10s；50℃15s；72℃1min；30个循环，72℃10min。结果显示该片段的大小约为750bp，即纳米抗体基因电泳带约为750bp(图1a)，切胶回收。

第二轮PCR：

以第一轮PCR产物作模板，

上游引物：(VHH1)

CATGCCATGACTGTGGCCCAGGCGGCCCAGKTGCAGCTCGTGGAGTC

下游引物：

VHH2：CATGCCATGACTCGCGGCCGGCCTGGCCATGGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG

VHH3：CATGCCATGACTCGCGGCCGGCCTGGCCGTCTTGTGGTTTTGGTGTCTTGGG

反应条件：94℃3min；98℃10s；55℃15s；72℃30s；25个循环，72℃10min。结果显示该片段的大小约为500bp，即纳米抗体基因电泳带约为500bp(图1b)，切胶回收。

用限制性内切酶Sfil(购自TAKARA公司)分别酶切噬菌体展示载体Pcomb3xss和VHH片段，分别回收两个片段，并用T4DNA连接酶(购自NEB公司)连接两个片段，DNA纯化试剂盒(天根生化科技有限公司)纯化连接产物。将连接产物电转化至电转感受态细胞TG1中，构建EGFP的纳米抗体噬菌体展示文库并测定库容，库容的大小为1.8×10⁸。

随机挑取24个单克隆，通过对所建纳米抗体细菌文库中纳米抗体基因插入率进行检测，所用引物如下：

上游引物：AAGACAGCTATCGCGATTGCAG

下游引物：ATCACCGGAACCAGAGCCACCAC

结果如图2所示，从每个克隆中都能扩增出包含纳米抗体基因的约片段，表明纳米抗体细菌文库插入率达到100％，文库质量合格。

根据计算的库容量结果，接种10倍库容量的活细胞于100mL的含葡萄糖2YT培养基中，37℃，220r/min培养至OD₆₀₀达到0.5左右。按感染复数100:1加入辅助噬菌体，37℃先静置15min，220r/min培养45min，将培养物离心，收集菌体，用200mL含氨节青霉素和卡那霉素2YT培养基重悬沉淀，30℃250r过夜培养后离心取上清，加入1/5体积PEG/NaCI溶液，冰上放置2h或4℃过夜，8000r离心20min，重悬沉淀于含甘油的磷酸缓冲液，即得到抗EGFP单域重链抗体免疫文库，取10μL测定滴度，其余分装于-80℃保存备用。

实施例2

针对EGFP的纳米抗体筛选过程：

(1)将溶解在CBS中的100μg/mL的EGFP包被在酶标板上，4℃过夜，同时设立阴性对照。

(2)第二天两个孔中分别加入300μL 4％脱脂牛奶，室温封闭1小时。

(3)封闭后加入1×10¹²cfu噬菌体展示基因库，在室温下作用1小时。

(4)分别用PBST(PBS中含有0.05％吐温20)和PBS洗5遍以洗掉不结合的噬菌体。

(5)先用pH4.0的甘氨酸-盐酸洗脱掉亲和力较低的噬菌体，然后再采用pH2.2的甘氨酸-盐酸洗脱得到高亲和力的噬菌体。将洗脱产物感染处于对数期生长的大肠杆菌TG1，进行扩增纯化后的得到的文库用于下一轮的筛选。重复筛选4次，抗原包被浓度逐渐降低，洗涤次数逐倍增加。

结果表1显示：在不断地筛选的过程中，阳性的克隆将不断的被富集，从而达到从文库中富集EGFP纳米抗体的目的。

表1 EGFP纳米抗体的富集

实施例3

用酶联免疫方法(ELISA)筛选特异性单个阳性克隆：

(1)将溶解在CBS中的1μg/mL的EGFP包被在酶标板上，4℃过夜，同时设立阴性对照，第二天在孔中加入300μL 4％脱脂牛奶，室温封闭1小时；

(2)从3、4轮测洗脱量的平板上分别挑取45个克隆，接种于含有100μg/mL的氨苄青霉素的2YT培养基中，培养至对数期，按感染复数1:1的加入辅助噬菌体，过夜培养，次日离心取上清液；

(3)将上清液加入封闭后的酶标板中，37℃30min；

(4)用PBST洗去未结合的抗体，加入M13 Bacteriophage Antibody(HRP)(购自北京义翘神州科技有限公司)37℃30min；

(5)洗去抗体，加入TMB显色液，37℃显色5min，在酶标仪上测OD₄₅₀，读取吸收值，当样品孔OD值大于对照孔OD值2倍以上时，判为阳性克隆孔。

(6)将阳性克隆孔的菌提取质粒并进行测序。

根据序列比对软件Vector NTI分析各个克隆株的基因序列，把CDR1，CDR2，CDR3序列相同的株视为同一克隆株，而其序列不同的株视为不同克隆株，最终得到氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的纳米抗体。

纳米抗体的DNA序列如下：(SEQ ID NO.2)

CAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGAAGCCGCTTTAGTATCCATACCATGGGCTGGTACCGCCAGGCTCCTGGGAAGCAGCGCGAGTTGGTCGCAACTATTACTTGGGGTGGCAGACAAAACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCAACAGAGACAACGACAAGAATACGGTGGATCTACAAATGGACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGTCTATTACTGTAACGTCCGTCCGATATCGAACGGGCCCGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGAACCCAAGACACCAAAACCACAAGACGGCCAGGCCGGCCAG

编码具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSRFSIHTMGWYRQAPGKQRELVATITWGGRQNYADSVKGRFTINRDNDKNTVDLQMDSLKPEDTAVYYCNVRPISNGPDYWGQGTQVTVSSEPKTPKPQDGQAGQ

实施例4

阳性噬菌体效价测定

将EGFP蛋白以0.5μg/mL包被于酶标板中，4℃过夜；将上述阳性噬菌体克隆上清从1:10倍比稀释至1:1280，以ELISA方法进行测定OD₄₅₀，读取吸收值。结果编号4-28的吸收值最高，将其克隆进行表达并检测亲和力；计算得出亲和力为9.67×10-¹¹M。

实施例5

纳米抗体在宿主菌大肠杆菌中表达、纯化

(1)将前面测序分析所获得纳米抗体亚克隆至表达性的载体PET25b中，将重组质粒转化到表达型宿主菌Rosetta中，其涂布在含有100μg/mL氨苄青霉素的2YT固体培养基的板上，37℃过夜；

(2)挑选单个菌落接种在5mL含有氨苄青霉素的2YT培养液中，37℃摇床培养过夜；

(3)1％接种过夜菌种至300mL 2YT培养基中，37℃摇床培养，培养到OD值达到0.6-1时，加入0.1mM IPTG，30℃摇床培养6h离心收集菌体；

(4)将菌体破碎以获得抗体粗提液；

(5)经镍柱离子亲和层析纯化抗体蛋白，为获得高纯度的抗体，采用咪唑梯度洗脱，低浓度咪唑洗脱液(20mM)用于洗去杂带，高浓度咪唑洗脱液(100mM)洗脱得到目的蛋白。SDS-PAGE分析目的蛋白表达情况，结果如图3所示，通过用不同浓度的咪唑洗脱液洗脱，最终得到了分子量约20KD的纳米抗体蛋白。

实施例6

纳米抗体活性及亲和力鉴定

(1)将EGFP稀释至1μg/ml包被于酶标板中，4℃过夜；PBST洗板3次，加入4％脱脂乳，37℃封闭1h；PBST洗板3次，100μl/孔加入稀释至不同浓度纯化后的纳米抗体，37℃孵育30min；PBST洗板3次，加入二抗，37℃孵育30min；PBST洗板6次，加入TMB显色液，37℃孵育10min，最后加入终止液终止反应，测OD₄₅₀。

(2)利用纳米抗体上本身带有的NH2，选择已偶联羧基的传感探针AR2G，通过EDC法将纳米抗体偶联在探针上，然后通过结合和解离来测定他们之间的结合和解离常数(k_on、k_off)，据此再来计算他们之间的亲和力常数(kD)。

具体步骤如下：

首先将未使用过的AR2G探针在MES Buffer里面水化10min，然后将其套入光源，在棕色离心管中加入250μl MES Buffer进行最初的基线的运行，运行时间60s，然后分别在棕色离心管中加入125μl的碳化亚胺(0.4M EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(0.1M s-NHS)对探针进行震荡活化，活化时间为5min，再更换含有串联纳米抗体的稀释液250μl(纯化的纳米抗体不能有氨基)进行蛋白的结合，结合时间为10min，结合完毕后要把未结合的羧基给猝灭掉，照样加入250μl猝灭剂乙醇胺，猝灭10min，然后再运行基线180s，最后再结合和解离抗体，解离在PBS Buffer中进行。参数设定为基线时间180s，结合时间为300s，解离时间为120s。结果如图4所示，计算得出亲和力为9.67×10-¹¹M，亲和力较高。

序列表

<110> 南昌大学

<120> 一种高亲和力增强绿色荧光蛋白纳米抗体及其编码基因的筛选方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 131

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Arg Phe Ser Ile His

20 25 30

Thr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Thr Ile Thr Trp Gly Gly Arg Gln Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Asn Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Val Asp Leu

65 70 75 80

Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn

85 90 95

Val Arg Pro Ile Ser Asn Gly Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Asp Gly Gln

115 120 125

Ala Gly Gln

130

<210> 2

<211> 393

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caggtgcagc tcgtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggaag ccgctttagt atccatacca tgggctggta ccgccaggct 120

cctgggaagc agcgcgagtt ggtcgcaact attacttggg gtggcagaca aaactatgca 180

gactccgtga agggccgatt caccatcaac agagacaacg acaagaatac ggtggatcta 240

caaatggaca gcctgaaacc tgaggacacg gccgtctatt actgtaacgt ccgtccgata 300

tcgaacgggc ccgactactg gggccagggg acccaggtca ccgtctcctc agaacccaag 360

acaccaaaac cacaagacgg ccaggccggc cag 393

Claims (6)

1.一种高亲和力增强绿色荧光蛋白纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的可变区具有3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，其中所述纳米抗体的可变区序列由SEQ ID NO.1所述氨基酸序列组成，其核酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的一种高亲和力增强绿色荧光蛋白纳米抗体的编码基因的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)用绿色荧光蛋白免疫羊驼，第4次免疫后抽取羊驼外周血，分离血细胞提取血细胞总RNA，反转录成cDNA后，通过PCR扩增得到VHH编码基因；

(2)将VHH编码基因克隆到噬菌体展示载体上，构建VHH噬菌体展示文库；

(3)将绿色荧光蛋白包被于酶标板中，通过噬菌体展示技术从文库中富集绿色荧光蛋白纳米抗体；

(4)通过ELISA方法筛选阳性单克隆；

(5)阳性单克隆菌落送测序，获得绿色荧光蛋白纳米抗体基因序列。

3.根据权利要求2所述的一种高亲和力增强绿色荧光蛋白纳米抗体的编码基因的筛选方法，其特征在于，所述载体为pComb3XSS。

4.一种含有权利要求1所述的核酸序列的表达载体。

5.一种含有权利要求4所述表达载体的宿主细胞。

6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。

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