CN110506209A - 尿中所测的半乳凝素3结合蛋白用于监测狼疮性肾炎严重性和进展的应用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的实施方式描述组合物和方法,其涉及诊断患有狼疮性肾炎(LN)的患者的尿中LGALS3BP的检测,以监测所述LN的严重性和进展。
Description
优先权声明
本申请要求2016年12月16日提交的美国临时申请序列号62/435,235的权益,其通过引用纳入本文。
本申请包含序列表,该序列表已经以ASCII格式电子提交,并且其全部内容通过引用并入本文。在2017年12月15日创建的所述ASCII拷贝被命名为P16-214WO_SL.txt,大小为433,834字节。
技术领域
本发明一般涉及用于检测和监测狼疮性肾炎(LN)进展的方法中检测尿中的LGALS3BP。
背景技术
系统性红斑狼疮(SLE)是自身免疫疾病,其特征是形成含自身抗体的免疫复合物(IC),该免疫复合物触发炎症、组织损伤和过早死亡(Tsokos GC,N Engl J Med(2011);365:2110-2121)。SLE IC通常含有被许多先天免疫受体识别的核酸,其可引发导致细胞因子生成的病理机制,并最终导致致使器官损伤的免疫应答。由于SLE具有巨大的临床多样性和特发性,对SLE的管控取决于其具体表现和严重性。因此,建议的SLE治疗药物不一定能有效治疗所有表现和并发症,如狼疮性肾炎(LN)。据信LN的发病机理来源于肾小球中免疫复合物的沉积,其引发致使肾损伤的炎性反应(Davidson A2016,Nature ReviewsRheumatology 12:143–153)。据估计,30-60%的SLE患者在其疾病过程中会发展出肾炎,需要对其进行医学评估和治疗。LN是一种进行性疾病,其经历临床恶化和缓解的过程。晚期LN的特征是肾脏中不可逆的瘢痕形成,其无法用目前的SLE药物治疗,需要肾移植(Lionaki S等,World Journal of Transplantation,2014,4(3):176-182)。
狼疮性肾炎的一般适应症是泡沫性或血性尿液,这归因于肾脏过滤功能受损所致的高尿蛋白浓度。通过肾部活检来诊断狼疮性肾炎(Schwartz N等,Curr OpinRheumatol.2014)。肾功能可以通过如下方式检测:血尿素氮(BUN)测试、血清肌酸酐评估、尿检(总蛋白、血红细胞和细胞管型)、肌酸酐和蛋白质浓度的现场尿检,或肌酸酐清除率和蛋白质分泌量的24小时尿检。目前无法对LN中的肾脏疾病进行适当的监测,因为活检是侵入性的,且通常仅用于初始诊断。虽然肾功能可使用当前的测试手段来估测,但它们都无法估计病因性炎症(causal inflamation)的水平(Zickert A等,狼疮Sci Med 2014,1:e000018;Alvarado等.狼疮2014,23:840)。如果没有评估肾脏炎性状态的能力,那么医生就无法准确评估其治疗效果,因为这些治疗方法均旨在消退正在发生的炎症。对于肾脏中病因性炎症的准确监测可以帮助医生采取积极的治疗决策和目标治疗(treat-to-target)方式,从而缓解疾病进展,改善患者的生活,并通过避免昂贵的肾移植来降低医疗保健成本。
SLE采用抗疟药、皮质类固醇、非甾体抗炎药(NSAID)、免疫抑制剂和生物制剂如贝利单抗(BAFF中和)和利妥昔单抗(B细胞耗竭)治疗。尽管许多患者对上述治疗药物标准没有反应或只有部分反应,但长期使用高剂量皮质类固醇和细胞毒性疗法可能会产生严重的副作用,如骨髓抑制、机会性生物感染增加、不可逆的卵巢功能衰竭、脱发和恶性肿瘤的风险增加。与活性SLE同时发生的感染性并发症及其免疫抑制药物治疗是SLE患者死亡的最常见原因。因此,需要替代性的诊断,其可以更好地提供对于SLE/LN的确定性诊断并监测疾病活动,以允许具有更少副作用的更有针对性的积极治疗。
半乳凝素-3结合蛋白[其它别名包括:LGALS3BP(以及所有相关的多态性形式)、uG3BP、G3BP、Mac2-BP、p90、凝集素半乳糖苷结合型可溶性3结合蛋白、BTBD17B、CyCAP、gp90、L3抗原、M2BP、Mac-2-结合蛋白、MAC-2-BP和TANGO10B]是普遍表达基因的基因产物,其属于清道夫受体家族(Koths,K.等1993J.Biol.Chem.268:14245)。这585个氨基酸(aa)的人蛋白包含18aa的信号序列和四个结构域(Hohenester,E.等1999Nat.Struct.Biol.6:228;Muller,S.A.等1999J.Mol.Biol.291:801;Hellstern,S.等2002J.Biol.Chem.277:15690)。结构域1是A组清道夫受体结构域,结构域2是强力介导二聚化的BTB/POZ结构域,而结构域3是IVR结构域,其也存在于果蝇Kelch蛋白中的POZ结构域之后。尽管对结构域4知之甚少,但重组结构域3和4再现了全长半乳糖凝素-3BP的固相粘附特征。位于7个N-连接位点的糖基化产生85-97kDa的分子大小(Ullrich,A.等(1994)J.Biol.Chem.269:18401)。半乳凝素-3BP二聚体形成线性和环状寡聚物,最常见的是十聚体和十二聚体。LGALS3BP是由某些类型的肿瘤细胞分泌的蛋白质,其中表达水平与肿瘤进展相关(Grassadonia,A.等.2004Glycoconj.J.19:551)。除了对肿瘤细胞增殖/存活的直接影响外,LGALS3BP还可上调血管内皮生长因子的表达并促进血管生成。其水平在HIV-1感染期间增高,并且认为其活性通过干扰包膜蛋白的成熟和掺入病毒体而降低HIV-1的感染性(Lodermeyer V等,Retrovirology.2013 24;10:111)。白塞病患者中LGALS3BP的血清水平增加并且与疾病活性相关(Lee YJ等Clin Exp Rheumatol.200725(4增刊45):S41-5)。在某些SLE患者群中也观察到血浆LGALS3BP水平增高(Nielsen CT等狼疮Sci Med.2014 19;1(1))。LGALS3BP在其启动子中具有IRF7调节元件(Heinig M等Nature.2010 23;467(7314):460-4),表明通过I型IFN的调节,并解释其与病毒感染和炎症的关联。
在临床医学和生物医学研究中对于改进的非侵入性工具有紧急但尚未满足的需求,以:i)鉴定SLE是否即将表现为LN,ii)评估已经诊断患有LN的对象中LN的肾病理生理学变化,和iii)评价已经诊断患有LN的对象的疾病进展/消退。
发明概述
本发明提供组合物和方法,其通过检测体液样品中半乳凝素-3结合蛋白(LGALS3BP)的量(例如,测定其水平)来评估患有或具有发展LN风险的哺乳动物对象中的当前和进行中的肾脏炎症状态。本发明还提供一种监测LN中肾病理生理学治疗有效性的方法,该方法通过如下方式进行:在设计用于治疗LN相关的突发(flare)的治疗之前,且尤其是之后,测定体液中的LGALS3BP水平。作为预测标志物,LGALS3BP的性质和特点允许其以这种方式用于LN中肾病理生理学或LN中LN状态的肾病理生理学变化的早期监测。
在一个实施方式中,本发明提供一种用于早期检测哺乳动物LN中肾病理生理学的方法,其包括如下步骤:i)获得或提供哺乳动物的体液样品,该哺乳动物没有发生LN中的急性肾病,所述体液选自下组:尿,血浆和血清;ii)检测(例如测定)所述样品中的LGALS3BP水平(例如,采用针对LGALS3BP的抗体);和iii)基于所述样品中的LGALS3BP水平,评价该对象中LN状态的肾病理生理学。对于LN状态下肾病理生理学的评价可用于确定LN中的肾病理生理学是否是亚临床、稳定或进展(即,进行性肾病)状态。所述方法还能仅以单次取样和测定,评价肾脏状态为LN中恶化的肾病理生理学或进行性状态。
在一个实施方式中,本发明提供一种检测哺乳动物的LN状态下任何肾病理生理学变化的方法,其包括如下步骤:i)获得显示至少一种SLE症状的哺乳动物体液的第一样品,所述体液选自下组:尿、血浆和血清(在一优选实施方式中所述体液是尿);ii)检测(例如测定)第一样品中的LGALS3BP水平(例如,采用针对LGALS3BP的抗体);iii)在获得第一样品之后的一段时间后,获得该哺乳动物体液的至少一个后续样品;iv)检测(例如测定)至少一个后续样品中的LGALS3BP水平(例如,采用针对LGALS3BP的抗体);和v)基于至少一个后续样品中LGALS3BP水平与第一样品中LGALS3BP水平之比较,评价该哺乳动物的LN状态下的肾病理生理学。通常,后续样品中较高水平的LGALS3BP指示对象中LN状态下肾病理生理学的恶化,表明存在SLE的至少一种症状,该症状指示SLE即将进展为LN,而后续样品中相似或降低的LGALS3BP水平则指示LN状态下肾病理生理学的改善,并且指示该对象的SLE不会进展为LN。
在一个实施方式中,本发明提供一种监测哺乳动物中针对LN中肾病理生理学的治疗的有效性的方法,其包括如下步骤:i)提供或获得具有至少一种LN症状的哺乳动物的体液的基线样品,所述体液选自下组:尿、血浆和血清(在一优选实施方式中所述体液是尿);ii)检测(例如测定)所述基线样品中的LGALS3BP水平(例如,采用针对LGALS3BP的抗体);iii)对该哺乳动物提供针对LN中肾病理生理学的至少一种治疗;iv)提供或获得所述哺乳动物的体液的至少一个处理后样品;v)检测(例如测定)该处理后样品中的LGALS3BP水平(例如,采用针对LGALS3BP的抗体);和vi)基于该处理后样品中LGALS3BP水平与该基线样品中LGALS3BP水平之比较,评价该治疗的有效性。
本发明的一个实施方式提供一种鉴定随时间推移的哺乳动物中LN中肾病理生理学程度的方法,其包括如下步骤:i)在第一时间,获得具有至少一种LN症状的哺乳动物的体液的至少一个第一样品,所述体液选自下组:尿、血浆和血清(在一优选实施方式中所述体液是尿);ii)检测(例如测定)第一样品中的LGALS3BP水平(例如,采用针对LGALS3BP的抗体);iii)在第一时间之后的某一时间,获得所述哺乳动物的体液的至少一个后续样品;iv)检测(例如测定)至少一个后续样品中的LGALS3BP水平(例如,采用针对LGALS3BP的抗体);和v)基于至少一个后续样品中LGALS3BP水平与第一样品中LGALS3BP水平之比较,确定随时间推移的该哺乳动物中LN中肾病理生理学的程度。
通常,哺乳动物是人。在采集多于一个后续样品的情况中,通常间歇地从对象获得它们,并且在预定时间,从一天或多天,到一周或数周,到一个月或多个月,到一年或多年。也可以采用其他采样方案。
在一个实施方式中,还评价哺乳动物对象以确定该对象是否具有可能贡献样品中LGALS3BP水平的另一病症,所述病症包括但不限于,急性细菌或病毒感染、急性炎症、对另一器官的急性或慢性损伤或癌症。所述另一病症可能不导致或造成对肾的损伤。然而,这种病症本身可贡献尿液中检测到的LGALS3BP的量,造成难以区分此类LGALS3BP与LN中肾病理生理学直接导致的LGALS3BP。一些其它病症类型可能会导致高水平的LGALS3BP,其可能会盖过由肾损伤引起的LGALS3BP浓度。
考虑多种蛋白质检测形式,包括但不限于,ELISA(酶联免疫吸附测定)、SMC免疫测定技术(单分子计数)和Western印迹。
在一些实施方式中,测定装置,尤其是ELISA装置,包含经被覆的微量滴定板。在一些实施方式中,在微量滴定板的孔中施加捕获试剂(即,LGALS3BP抗体)。在该测定中,将可能含有目标分析物(例如LGALS3BP)的测试样品(例如,血液或尿)置于含有被固定捕获试剂的微量滴定板的孔中。该分析物特异性结合被固定的抗体;然后,将未结合的物质洗去,主要留下与板结合的分析物-抗体复合物。该复合物可以多种不同方式检测,例如通过采用带标记的检测试剂,例如,带标记的LGALS3BP抗体。微量滴定板形式的一个优点是可以在同一块板的一个或多个不同孔中同时(与对照一起)测试多个样品;因此,允许对大量样品进行高通量分析。
在一些实施方式中,采用竞争性ELISA(参见例如,美国专利号5,958,715和5,484,707,其各自通过引用纳入本文)。竞争性ELISA可以是定量或非定量的。在竞争性ELISA中,微量滴定板的孔首先用含有LGALS3BP的全部或片段的融合蛋白被覆。将待测试的样品与对LGALS3BP具有特异性的抗体一起添加至板。样品中的LGALS3BP与固定的肽竞争和抗体结合。洗涤该板,然后使用任何合适的方法(例如,含标记物的二抗,或与酶检测系统反应的基团)检测与固定的LGALS3BP多肽结合的抗体。信号量与样品中存在的LGALS3BP的量成反比(例如,高信号表示样品中存在少量的LGALS3BP)。
在一些实施方式中,本发明的免疫测定装置允许进行相对便宜的一次性的膜式测定,用于目测鉴定液体样品中分析物的存在(或不存在)。这种装置的形式通常被设置为独立式试纸(例如,测试条)或具有某种外壳的装置。通常,本发明的免疫测定装置可与少至约200微升的液体样品一起使用,并且样品中分析物的检测可(但非必须)在2-5分钟内完成。在优选实施方式中,不需要辅助仪器来执行这样的测试,并且此类装置可以容易地用于诊所、实验室和现场位置(field location)。
在一些实施方式中,ELISA是免疫色谱"夹心"测定。通常,夹心免疫色谱法要求将可能含有待测定分析物(例如LGALS3BP)的样品与LGALS3BP特异性抗体混合。所述抗体,即,检测试剂,是可移动的,并且通常连接标记物或另一信号试剂(例如染色乳胶、胶体金属溶胶或放射性同位素)。然后将该混合物施加到含有识别LGALS3BP的被固定抗体(即捕获抗体或试剂)的条带或区域的色谱介质上。色谱介质通常呈条状,类似于量油尺。当LGALS3BP和检测试剂的复合物到达色谱介质上固定的捕获抗体的区域时,发生结合,从而检测试剂复合物定位在该区域。这表明存在待测定的分子。该技术可用于获得定量或半定量结果。在测试条上进行的夹心免疫测定的实例描述于美国专利号4,168,146和4,366,241中,其各自通过引用纳入本文。
在一些实施方式中,"Western印迹"形式用于检测目标蛋白质。Western印迹指对于固定至支持物(例如硝基纤维素或膜)的一种或多种蛋白质(或多肽)的分析。蛋白质在丙烯酰胺凝胶上跑动以分离这些蛋白质,然后将蛋白质从凝胶转移到固体支持物,例如硝酸纤维素或尼龙膜。然后将固定的蛋白质暴露于针对目标抗原具有反应性的抗体。可以通过各种方法检测抗体的结合,包括使用放射性标记的抗体。
在本发明另一实施方式中,提供了使用从哺乳动物对象获得的样品产生可用于诊断和非侵入性监测肾病理的结果的方法。所述方法包括:获得与所述样品相关的数据集,其中,所述数据集包含选自下组的标志物的蛋白质表达水平:尿肌酸酐和蛋白尿,其表示为尿蛋白:肌酸酐比率(uPCR);和,将该数据集输入分析过程中,该过程使用该数据来生成用于诊断和监测肾病理的结果。
在一些实施方式中,狼疮性肾炎的定义包括以下一种或多种:狼疮性肾炎、特发性免疫复合物肾小球肾炎、肾小球肾炎、肾小管-间质肾炎。
在一些实施方式中,本发明的诊断方面可更好地告知何时应考虑侵入性肾活检和/或治疗方案的变化。当狼疮患者出现新的肾脏炎症的临床证据(例如由本发明的诊断实施方式检测到增加的LGALS3BP水平)时,应当进行诊断性肾脏活检以指导治疗。
在一些实施方式中,狼疮性肾炎的肾分类包括以下一种或多种:
一类疾病(最小系膜肾小球肾炎),该类疾病的组织学在光学显微镜下具有正常外观,但在电子显微镜下可见肾小球膜沉积物。在这个阶段,尿液分析是正常的。
二类疾病(系膜增生性肾小球肾炎),该类疾病通过系膜细胞过多和基质扩张被注意到。可以看到有或没有蛋白尿的显微镜血尿。在此阶段,高血压、肾病综合征和急性肾功能不全非常罕见。
三类疾病(局灶性肾小球肾炎)由包括小于50%的肾小球的硬化病变指示,其可以是节段性或全局性的,并且是活性的或慢性的,具有毛细血管内或毛细血管外增生性病变。在电子显微镜下,注意到内皮下沉积物,并且可能存在一些系膜变化。免疫荧光显示IgG,IgA,IgM,C3和C1q阳性(指示免疫复合物沉积)。临床上,存在血尿和蛋白尿,有或没有肾病综合征、高血压和血清肌酸酐升高。弥漫增生性狼疮性肾炎,如病理标本中所见。
四类疾病(弥漫增生性肾炎)是最严重的,也是最常见的亚型。多于50%的肾小球涉及其中。病变可以是节段性或全局性的,活性或慢性,伴有毛细血管内或毛细血管外增生性病变。在电子显微镜下,注意到内皮下沉积物,并且可能存在一些系膜变化。临床上存在血尿和蛋白尿,常常伴有肾病综合征、高血压、低补体血症、抗dsDNA滴度升高和血清肌酸酐升高。
五类疾病(膜性肾小球肾炎)的特征在于肾小球毛细血管壁的扩散性增厚(节段性或全局性),弥漫性膜增厚,以及在电子显微镜下观察到的上皮下沉积物。临床上,第五阶段具有肾病综合征的迹象。还可出现显微镜下的血尿和高血压。第五阶段还可导致血栓性并发症,例如肾静脉血栓形成或肺栓塞。
五类,或晚期硬化性狼疮性肾炎。它的特征是涉及超过90%肾小球的全局性硬化,并代表先前炎性损伤的愈合。通常不存在活性肾小球肾炎。该阶段的特征在于缓慢进行性肾功能障碍,具有相对温和的尿沉积。对免疫疗法的反应通常很差。毛细血管内皮细胞内的管状网状包涵体也是狼疮性肾炎的特征,并且可以在所有阶段于电子显微镜下观察到。然而,它不是诊断性的,因为它存在于其他病症如HIV感染中。认为其归因于长期干扰素接触。
如按本申请提供的数据所报告的,除非另有说明,否则LGALS3BP以ng/ml计。LGALS3BP/肌酸酐比为每毫升尿液中每mg肌酸酐的ng LGALS3BP。
在一些实施方式中,狼疮性肾炎的LN中的肾病理生理学包括以下一种或多种:肾小球系膜免疫沉积物的存在、亚内皮免疫沉积物的存在、亚上皮免疫沉积物的存在、肾小管-间质性炎症、肾小管-间质纤维化、肾小管间质硬化、硬化、新月体性肾小球肾炎(存在新月体病变或毛细血管增生)、毛细血管外增生、毛细血管内增生、增生性肾小球肾炎、局灶性肾小球病(或局灶性肾小球肾炎)、局灶性节段性肾小球病(或局灶性节段性肾小球肾炎)、节段性肾小球病(或节段性肾小球肾炎)、膜性肾小球病、肾小球基底膜异常(如增厚)、肾小球硬化(或肾小球的硬化)、系膜细胞过多(或系膜增生)、系膜基质扩张、系膜纤维化。
在一些实施方式中,在一些实施方案中,分析过程是线性判别分析(LinearDiscriminant Analysis)模型。此外,在一些实施方式中,分析过程可包括使用预测模型。在一些实施方式中,分析过程包括将获得的数据集与参考数据集进行比较。
在一些实施方式中,参考数据集包含从一个或多个健康对照对象获得的蛋白质表达水平。在其它实施方式中,该方法还包括获得所得数据集与参考数据集的相似性的统计度量。
在一些实施方式中,该方法还包括使用该分类用于诊断、分型、预后、肾炎症水平、评估进展程度、监测治疗反应、预测肾间质炎症(INF)发作,或区分存在至少一种LN症状的对象中的肾间质炎症(INF)的稳定和不稳定表现。
附图说明
图1显示了从具有低或高IFN-α特征的HC和LN患者分离的PBMC中的LGALS3BP mRNA表达水平。
图2A提供显示LGALS3BP由炎性刺激物诱导的数据,所述炎性刺激物包括但不限于IFN-α,其中LGALS3BP表达通过QPCR采用从用指定刺激物活化6小时的体外分化的原代人巨噬细胞中提取的RNA进行。使用HPRT1作为管家基因对样品间的表达进行标准化。
图2B显示了另外的数据,显示LGALS3BP由炎性刺激物诱导,所述炎性刺激物包括但不限于IFN-α,其中LGALS3BP通过ELISA在用指定刺激物活化20小时的体外分化的原代人巨噬细胞的上清液中检测。
图3显示血清、尿液和血浆中的LGALS3BP蛋白质水平。通过ELISA检测健康对照供者、SLE和LN患者中的LGALS3BP血浆和尿液水平。在LN患者对比SLE患者或健康对照中,尿LGALS3BP蛋白水平显著更高(P<0.0001,带Tukey事后检验的单向方差分析)。在从相同对象获得的血清中未注意到该差异。血浆和尿液水平之间不存在线性相关性。
图4A显示来自HC和LN患者的肾组织切片的肾小球和肾小管间质中LGALS3BP的基因表达水平。来自欧洲肾脏cDNA库的总共46个样品(n=14HC和32LN)被处理并用于所述的微阵列分析(Berthier等,JI 2012)。将活检物切片手动微切割成肾小球和肾小管间质区室,并使用人类基因组U133A Affymetrix GeneChip阵列进行基因表达谱分析,其中,与HC相比,LGALS3BP的基因表达水平在肾小球(p=9.221e-12)和肾小管间质(p=1.511e-4)中显著更高。
图4B显示来自HC和LN患者的肾活检物的肾小球和肾小管间质中CCL2(MCP-1)的基因表达水平。来自欧洲肾脏cDNA库的总共46个样品(n=14HC和32LN)被处理并用于所述的微阵列分析(Berthier等,JI 2012)。将活检物切片手动微切割成肾小球和肾小管间质区室,并使用人类基因组U133A Affymetrix GeneChip阵列进行基因表达谱分析,其中,CCL2(MCP-1)的基因表达水平在肾小球和肾小管间质中于HC和LN样品之间不等同。图4C显示来自HC和LN患者的肾活检物的肾小球和肾小管间质中TNFSF12的基因表达水平。来自欧洲肾脏cDNA库的总共46个样品(n=14HC和32LN)被处理并用于所述的微阵列分析(Berthier等,JI 2012)。将活检物切片手动微切割成肾小球和肾小管间质区室,并使用人类基因组U133AAffymetrix GeneChip阵列进行基因表达谱分析,其中,LN肾小球中的TNFSF12基因表达水平显著更高(p=0.017),但在肾小管间质中显著较低(p=9.08e-5)。
图4D显示来自健康志愿者(HC)、患有和不患有肾小管间质性肾炎(TIN)、糖尿病(DM)和IgA肾病(IgAN)患者的LN患者的肾活检物中半乳凝素3结合蛋白的表达。半乳凝素3结合蛋白(亮区)用抗体染色并用荧光显微镜分析。
图5显示BXSB-Yaa LN小鼠模型中的LGALS3BP mRNA表达。患病小鼠于20周龄时实施安乐死,并通过NanoString分析肾LGALS3BP表达,对hprt1表达进行标准化。对照小鼠在发病前是年轻的(9周)BXSX-Yaa小鼠。通过组织学评估肾损伤。
图6A显示健康对照(HC)、狼疮性肾炎(LN)和系统性红斑狼疮(SLE)供者的尿中的总LGALS3BP对脲基酸酐进行标准化之比率。
图6B显示健康对照(HC)、狼疮性肾炎(LN)和系统性红斑狼疮(SLE)供者的尿液中总蛋白质与肌酸酐比率。
图6C显示健康对照(HC)、狼疮性肾炎(LN)和系统性红斑狼疮(SLE)供者的尿液中尿白蛋白与肌酸酐比率。
图7A显示尿液分析测量结果的相关性,其中白蛋白与肌酸酐比率和总蛋白质与肌酸酐比率彼此良好相关,相关系数为0.95。
图7B显示了尿液分析测量的相关性,其中,LGALS3BP与肌酸酐比率和总蛋白质与肌酸酐比率正相关(R=0.494)。
图7C显示了尿液分析测量的相关性,其中,LGALS3BP与肌酸酐比率和白蛋白与肌酸酐比率正相关(R=0.484)。
图8A显示多次就诊的患者尿蛋白测量值的变化。所有值均表示为肌酸酐水平标准化。每个点代表一个样品,每一行代表一个供者。线的颜色代表疾病组,其中LN样品为紫色,SLE样品为青色,HC样品为深灰色。
图8B显示多次就诊患者的白蛋白测量值的变化。所有值均表示为肌酸酐水平标准化。每个点代表一个样品,每一行代表一个供者。线的颜色代表疾病组,其中LN样品为紫色,SLE样品为青色,HC样品为深灰色。
图8C显示多次就诊患者的LGALS3BP测量值的变化。所有值均表示为肌酸酐水平标准化。每个点代表一个样品,每一行代表一个供者。线的颜色代表疾病组,其中LN样品为紫色,SLE样品为青色,HC样品为深灰色。
图9显示所选抗LGALS3BP单克隆抗体的结合曲线。使用被覆有全长重组人LGALS3BP的微量滴定板在ELISA中测试抗体噬菌体文库筛选中鉴定的单克隆抗体的连续稀释液的结合。用偶联于辣根过氧化物酶(HRP)的第二抗Ig抗体检测与结合于板的LGALS3BP结合的单克隆抗体。使用HRP底物显示结合,并在450nm下测量光密度。
图10A和图10B显示用于夹心ELISA的抗LGALS3BP单克隆抗体配对。将100ng/mL重组LGALS3BP(图10B)用作分析物,并与仅缓冲液对照进行比较(图10A)。将抗体与珠偶联并在多重Luminex测定中测试以确定最佳对。在不同的通道中检测各抗体,允许在相同环境中评估对。值以Luminex读板仪的任意单位计。列是捕获抗体,行是检测抗体。
图11A显示评估用于夹心ELISA以捕获和检测人尿液样品中LGALS3BP的单克隆抗体对。图来源于Luminex配对实验。显示的是'捕获mAb-检测mAb'(即mAb1-mAb9)。对于来自健康对照(健康)、狼疮性肾炎患者(LN)和肾外系统性红斑狼疮(SLE)患者的尿液样品,LGALS3BP浓度以ng/ml计。
图11B显示评估用于夹心ELISA以捕获和检测人尿液样品中LGALS3BP的单克隆抗体对。图来源于Luminex配对实验。显示的是'捕获mAb-检测mAb'(即mAb3-mAb11)。对于来自健康对照(健康)、狼疮性肾炎患者(LN)和肾外系统性红斑狼疮(SLE)患者的尿液样品,LGALS3BP浓度以ng/ml计。
图11C显示评估用于夹心ELISA以捕获和检测人尿液样品中LGALS3BP的单克隆抗体对。图来源于Luminex配对实验。显示的是'捕获mAb-检测mAb'(即mAb3-mAb22)。对于来自健康对照(健康)、狼疮性肾炎患者(LN)和肾外系统性红斑狼疮(SLE)患者的尿液样品,LGALS3BP浓度以ng/ml计。
图11D显示评估用于夹心ELISA以捕获和检测人尿液样品中LGALS3BP的单克隆抗体对。图来源于Luminex配对实验。显示的是'捕获mAb-检测mAb'(即mAb114-mAb116)。对于来自健康对照(健康)、狼疮性肾炎患者(LN)和肾外系统性红斑狼疮(SLE)患者的尿液样品,LGALS3BP浓度以ng/ml计。
图12A显示评估用于夹心ELISA以捕获和检测人尿液样品中LGALS3BP的单克隆抗体对。图来源于Luminex配对实验。显示的是'捕获mAb-检测mAb'(即mAb103-mAb116)。对于来自健康对照(健康)、狼疮性肾炎患者(LN)和肾外系统性红斑狼疮(SLE)患者的尿液样品,LGALS3BP浓度以ng/ml计。
图12B显示评估用于夹心ELISA以捕获和检测人尿液样品中LGALS3BP的单克隆抗体对。图来源于Luminex配对实验。显示的是'捕获mAb-检测mAb'(即mAb109-mAb116)。对于来自健康对照(健康)、狼疮性肾炎患者(LN)和肾外系统性红斑狼疮(SLE)患者的尿液样品,LGALS3BP浓度以ng/ml计。
图12C显示评估用于夹心ELISA以捕获和检测人尿液样品中LGALS3BP的单克隆抗体对。图来源于Luminex配对实验。显示的是'捕获mAb-检测mAb'(即mAb110-mAb116)。对于来自健康对照(健康)、狼疮性肾炎患者(LN)和肾外系统性红斑狼疮(SLE)患者的尿液样品,LGALS3BP浓度以ng/ml计。
图12D显示评估用于夹心ELISA以捕获和检测人尿液样品中LGALS3BP的单克隆抗体对。图来源于Luminex配对实验。显示的是'捕获mAb-检测mAb'(即mAb112-mAb116)。对于来自健康对照(健康)、狼疮性肾炎患者(LN)和肾外系统性红斑狼疮(SLE)患者的尿液样品,LGALS3BP浓度以ng/ml计。
图13A显示评估用于夹心ELISA以捕获和检测人尿液样品中LGALS3BP的单克隆抗体对。图来源于Luminex配对实验。显示的是'捕获mAb-检测mAb'(即mAb105-mAb116)。对于来自健康对照(健康)、狼疮性肾炎患者(LN)和肾外系统性红斑狼疮(SLE)患者的尿液样品,LGALS3BP浓度以ng/ml计。
图13B显示评估用于夹心ELISA以捕获和检测人尿液样品中LGALS3BP的单克隆抗体对。图来源于Luminex配对实验。显示的是'捕获mAb-检测mAb'(即mAb29-mAb116)。对于来自健康对照(健康)、狼疮性肾炎患者(LN)和肾外系统性红斑狼疮(SLE)患者的尿液样品,LGALS3BP浓度以ng/ml计。
图13C显示评估用于夹心ELISA以捕获和检测人尿液样品中LGALS3BP的单克隆抗体对。图来源于Luminex配对实验。显示的是'捕获mAb-检测mAb'(即mAb113-mAb116)。对于来自健康对照(健康)、狼疮性肾炎患者(LN)和肾外系统性红斑狼疮(SLE)患者的尿液样品,LGALS3BP浓度以ng/ml计。
图13D显示评估用于夹心ELISA以捕获和检测人尿液样品中LGALS3BP的单克隆抗体对。图来源于Luminex配对实验。显示的是'捕获mAb-检测mAb'(即mAb102-mAb103)。对于来自健康对照(健康)、狼疮性肾炎患者(LN)和肾外系统性红斑狼疮(SLE)患者的尿液样品,LGALS3BP浓度以ng/ml计。
图14A显示评估用于夹心ELISA以捕获和检测人尿液样品中LGALS3BP的单克隆抗体对。图来源于Luminex配对实验。显示的是'捕获mAb-检测mAb'(即mAb103-mAb103)。对于来自健康对照(健康)、狼疮性肾炎患者(LN)和肾外系统性红斑狼疮(SLE)患者的尿液样品,LGALS3BP浓度以ng/ml计。
图14B显示评估用于夹心ELISA以捕获和检测人尿液样品中LGALS3BP的单克隆抗体对。图来源于Luminex配对实验。显示的是'捕获mAb-检测mAb'(即mAb109-mAb103)。对于来自健康对照(健康)、狼疮性肾炎患者(LN)和肾外系统性红斑狼疮(SLE)患者的尿液样品,LGALS3BP浓度以ng/ml计。
图14C显示评估用于夹心ELISA以捕获和检测人尿液样品中LGALS3BP的单克隆抗体对。图来源于Luminex配对实验。显示的是'捕获mAb-检测mAb'(即mAb114-mAb103)。对于来自健康对照(健康)、狼疮性肾炎患者(LN)和肾外系统性红斑狼疮(SLE)患者的尿液样品,LGALS3BP浓度以ng/ml计。
图14D显示评估用于夹心ELISA以捕获和检测人尿液样品中LGALS3BP的单克隆抗体对。图来源于Luminex配对实验。显示的是'捕获mAb-检测mAb'(即mAb110-mAb103)。对于来自健康对照(健康)、狼疮性肾炎患者(LN)和肾外系统性红斑狼疮(SLE)患者的尿液样品,LGALS3BP浓度以ng/ml计。(SLE)患者。
图15A显示评估用于夹心ELISA以捕获和检测人尿液样品中LGALS3BP的单克隆抗体对。图来源于Luminex配对实验。显示的是'捕获mAb-检测mAb'(即mAb116-mAb103)。对于来自健康对照(健康)、狼疮性肾炎患者(LN)和肾外系统性红斑狼疮(SLE)患者的尿液样品,LGALS3BP浓度以ng/ml计。
图15B显示评估用于夹心ELISA以捕获和检测人尿液样品中LGALS3BP的单克隆抗体对。图来源于Luminex配对实验。显示的是'捕获mAb-检测mAb'(即mAb112-mAb103)。对于来自健康对照(健康)、狼疮性肾炎患者(LN)和肾外系统性红斑狼疮(SLE)患者的尿液样品,LGALS3BP浓度以ng/ml计。
图15C显示评估用于夹心ELISA以捕获和检测人尿液样品中LGALS3BP的单克隆抗体对。图来源于Luminex配对实验。显示的是'捕获mAb-检测mAb'(即mAb105-mAb103)。对于来自健康对照(健康)、狼疮性肾炎患者(LN)和肾外系统性红斑狼疮(SLE)患者的尿液样品,LGALS3BP浓度以ng/ml计。
图15D显示评估用于夹心ELISA以捕获和检测人尿液样品中LGALS3BP的单克隆抗体对。图来源于Luminex配对实验。显示的是'捕获mAb-检测mAb'(即mAb25-mAb103)。对于来自健康对照(健康)、狼疮性肾炎患者(LN)和肾外系统性红斑狼疮(SLE)患者的尿液样品,LGALS3BP浓度以ng/ml计。
图16A显示评估用于夹心ELISA以捕获和检测人尿液样品中LGALS3BP的单克隆抗体对。图来源于Luminex配对实验。显示的是'捕获mAb-检测mAb'(即mAb26-mAb103)。对于来自健康对照(健康)、狼疮性肾炎患者(LN)和肾外系统性红斑狼疮(SLE)患者的尿液样品,LGALS3BP浓度以ng/ml计。
图16B显示评估用于夹心ELISA以捕获和检测人尿液样品中LGALS3BP的单克隆抗体对。图来源于Luminex配对实验。显示的是'捕获mAb-检测mAb'(即mAb29-mAb103)。对于来自健康对照(健康)、狼疮性肾炎患者(LN)和肾外系统性红斑狼疮(SLE)患者的尿液样品,LGALS3BP浓度以ng/ml计。
图16C显示评估用于夹心ELISA以捕获和检测人尿液样品中LGALS3BP的单克隆抗体对。图来源于Luminex配对实验。显示的是'捕获mAb-检测mAb'(即mAb113-mAb103)。对于来自健康对照(健康)、狼疮性肾炎患者(LN)和肾外系统性红斑狼疮(SLE)患者的尿液样品,LGALS3BP浓度以ng/ml计。
图17显示了在各种储存条件下LGALS3BP在尿液中稳定的数据。将来自3个LN患者(储存在-80℃)的尿液样品解冻并在不同条件下储存:反复冻融,室温1小时或18小时,37℃或4℃或-20℃过夜。通过夹心ELISA检测尿样中的LGALS3BP水平。显示了来自3个LN患者的技术重复样的平均值±SEM。
图18显示来自不同患者群组的LN患者的尿液LGALS3BP浓度(ng/ml)显著升高。采用我们的原型试剂盒,检测来自指定对照和患者的尿液样品中的LGALS3BP。LN患者来自两个不同的群组,来自美国的两个不同地点。与所有其他组相比,两个LN组中的LGALS3BP水平均显著更高(P<0.0001,带Tukey多重比较检验的单向方差分析)。灰色区域描绘了健康对照样品的范围。
图19显示了来自HC、SLE、LN和IgAN的尿液样品中LGALS3BP与肌酸酐的比率。
图20显示了重调格式的图19的相同数据,使得尿蛋白与肌酸酐之比(UPCR)是在y轴上呈现的度量。
图21A LGALS3BP显示比CCL2(MCP-1)更好地区分LN患者与肾外SLE患者和健康对照。在来自指定组的样品中测量尿LGALS3BP并针对尿肌酸酐水平进行标准化。**P<0.01,****P<0.00001,带Tukey的多重比较检验的单向方差分析。
图21B LGALS3BP显示比CCL2(MCP-1)更好地分离LN患者与肾外SLE患者和健康对照。在来自指定组的样品中测量尿CCL2(MCP-1)并针对尿肌酸酐水平进行标准化。**P<0.01,****P<0.00001,带Tukey的多重比较检验的单向方差分析。
图22A和图22B描述的数据确认对于LN检测,检测尿液LGALS3BP比CCL2(MCP-1)灵敏度和特异度更高。用于区分LN与健康对照(HC)或肾外SLE(SLE)的尿LGALS3BP/肌酸酐(Cr)和CCL2(MCP-1)/肌酸酐比率的接受者操作特征(ROC)曲线。
图23A显示尿液分析测量的相关性,其中,白蛋白与肌酸酐比率和总蛋白质与肌酸酐比率彼此紧密相关,相关系数为0.965。
图23B显示了尿液分析测量的相关性(使用与本申请的实验部分中所述的诊断试剂盒相关的试剂),其中,LGALS3BP与肌酸酐比率和总蛋白质与肌酸酐比率呈弱正相关性(r=0.494)。
图24显示了尿液分析测量的相关性(使用与本申请的实验部分中所述的诊断试剂盒相关的试剂),其中,LGALS3BP与肌酸酐比率和白蛋白与肌酸酐比率呈弱正相关性(r=0.484)。
图25描述的数据显示不同肾病组中尿LGALS3BP/肌酸酐比率。该图显示当处于活性(复发)状态时,LN中的LGALS3BP水平优先增加。这显示了uG3BP表达中的疾病特异性模式以及在LN背景下由活性炎症驱动的趋势。
图26A显示了不同肾病组中尿LGALS3BP/肌酸酐比率的平均值。将尿LGALS3BP浓度(ng/ml)针对肌酸酐浓度(mg/ml)标准化,自然对数转换且排除异常值,用于数据分析。使用JMP pro v12,包括方差分析和Wilcoxon非参数多重比较。
图26B显示了对照组之间的显著p值。将尿LGALS3BP数据针对肌酸酐浓度进行标准化,自然对数转换且排除异常值,用于数据分析。使用JMP pro v12,包括方差分析和Wilcoxon非参数多重比较。
图27A、图27B和图27C显示,LN中,尿LGALS3BP/肌酸酐与尿蛋白/肌酸酐比率之间的弱正相关与疾病状态无关(全部、活性或缓解)。
图28A显示了按国际肾病学会(ISN)/肾病理学学会(RPS)的LN分类法,活性疾病对比缓解期患者中的尿蛋白与肌酸酐比率(UPCR)。UPCR与肾损伤有关,并且无论ISN/RPS类别如何,其在活性疾病中总是更高。
图28B显示了按国际肾病学会(ISN)/肾病理学学会(RPS)的LN分类法,活性疾病对比缓解期患者中的尿LGALS3BP/肌酸酐比率。与二至四(但不是五)类缓解相比,活性疾病中尿LGALS3BP/肌酸酐水平升高。二类至四类是LN的炎性形式,而五类炎性较少,进一步支持尿LGALS3BP是肾中活性炎症的读出。
图29显示LN患者中尿液LGALS3BP/肌酸酐水平随时间的波动。每月监测LN患者尿液。
图30显示LN特异性治疗的起始如何随时间降低尿LGALS3BP水平。具体而言,新诊断的LN患者接受Eurolupus治疗(特定)和随时间跟踪的尿LGALS3BP水平。
具体实施方式
通篇中,除非另有说明或上下文另有要求,应认为单个步骤、组合物、步骤的组或组合物的组包括一个和多个(即一个或多个)这些步骤、组合物、步骤组或组合物组。除非上下文另外清楚地说明,否则,本文所用的单数形式“一个”、“一种”以及“该/所述”包括复数指代。对于一实施方式,述及“一个”包括单个以及两个或更多个;述及“一种”包括单种以及两种或更多种;述及“该/所述”包括单个/种以及两个/种或更多个/种等等。
除非另有说明,可针对各个和每个其它实施方式对本公开的各实施方式做出细节上必要的修正。
本领域技术人员应理解,本公开易于进行除说明书中所述的那些以外的变化和修改。应理解本发明包含所有这些变化和修改。本发明还包括说明书中单独或共同提到或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物,以及所述步骤或特征中任意两种或更多种或任意和全部组合。
本发明的范围不限于本文所述的具体实施方式,实施方式仅用于示例目的。如本文所述,功能等同的产品、组合物和方法显然在本公开的范围内。
本公开的进行不采用不合适的实验方法,所述实验方法利用,除非另有说明,分子生物学、微生物学、病毒学的常规技术、重组DNA技术、溶液中肽合成、固相肽合成,和免疫学。对于实施方式,此类操作描述于,Sambrook,Fritsch和Maniatis,《分子克隆:实验室手册》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual),冷泉港实验室出版社(Cold SpringHarbor Laboratories),纽约,第二版(1989),第一、二和三卷全部内容;Benny K.C.Lo,《抗体工程:方法与方案》(Antibody Engineering:Methods and Protocols),(2004)胡马那出版社(Humana Press),第248卷;《DNA克隆:实践方法》(DNA Cloning:A PracticalApproach),第一和二卷(D.N.Glover编,1985),IRL出版社,牛津,全文;《寡核苷酸合成:实用方法》(Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach)(M.J.Gait编,1984)IRL出版社,牛津,全文,特别是其中Gait的论文,第1-22页;Atkinson等,第35-81页;Sproat等,第83-115页;和Wu等,第135-151页;《核酸杂交:实用方法》(Nucleic Acid Hybridization:APractical Approach)(B.D.Hames和S.J.Higgins编,1985)IRL出版社,牛津,全文;《固定化细胞和酶:实用方法》(Immobilized Cells and Enzymes:A Practical Approach)(1986)IRL出版社,牛津,全文;Perbal,B.,《分子克隆实践指南》(A Practical Guide toMolecular Cloning)(1984);《酶学方法》(Methods In Enzymology)(S.Colowick和N.Kaplan编,学术出版公司(Academic Press,Inc.)),全系列;J.F.Ramalho Ortigao,“肽合成化学(The Chemistry of Peptide Synthesis)”刊于:访问虚拟实验室网站的知识库(Knowledge database of Access to Virtual Laboratory website)(Interactiva公司,德国);Sakakibara Biochem.Biophys.Res.Commun 73:336-342,1976;MerrifieldJ.Am.Chem.Soc.85:2149-2154,1963;Barany和Merrifield(1979)刊于《肽》(ThePeptides)(Gross,E.和Meienhofer,J.编),第2卷,第1-284页,学术出版公司,纽约.12.Wunsch,E.编.(1974)《Houben-Weyl肽的有机化学合成》(Synthese von Peptiden inHouben-Weyls Metoden der Organischen Chemie)(Müller,E.编),第15卷,第4版,第1和2部分,蒂姆,斯图加特;Bodanszky,M.(1984)《肽合成原理》(Principles of PeptideSynthesis),施普林格出版社(Springer-Verlag),海德堡;Bodanszky,M.和Bodanszky,A.(1984)《肽合成实践》(The Practice of Peptide Synthesis),施普林格出版社,海德堡;Bodanszky Int.J.Peptide Protein Res.25:449-474,1985;《实验免疫学手册》(Handbookof Experimental Immunology),第一至四卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell编,1986,布莱克威尔科学出版社(Blackwell Scientific Publications);和《动物细胞培养:实践方法》(Animal Cell Culture:Practical Approach),第3版(John R.W.Masters编,2000),ISBN0199637970,全文。
整篇说明书中,词语“包括”或其变化形式,如“包含”或“含有”应理解为意味着包括所指的元素、整数或步骤,或成组的元素、整数或步骤,但不排除任何其它元素、整数或步骤,或成组的元素、整数或步骤。
本发明的优选实施方式基于LGALS3BP作为预测标志物在定量LN中肾脏炎症水平中的作用。
示例性的全长人LGALS3BP多肽序列(SEQ ID NO:1)如下:
MTPPRLFWVWLLVAGTQGVNDGDMRLADGGATNQGRVEIFYRGQWGTVCDNLWDLTDASVVCRALGFENATQALGRAAFGQGSGPIMLDEVQCTGTEASLADCKSLGWLKSNCRHERDAGVVCTNETRSTHTLDLSRELSEALGQIFDSQRGCDLSISVNVQGEDALGFCGHTVILTANLEAQALWKEPGSNVTMSVDAECVPMVRDLLRYFYSRRIDITLSSVKCFHKLASAYGARQLQGYCASLFAILLPQDPSFQMPLDLYAYAVATGDALLEKLCLQFLAWNFEALTQAEAWPSVPTDLLQLLLPRSDLAVPSELALLKAVDTWSWGERASHEEVEGLVEKIRFPMMLPEELFELQFNLSLYWSHEALFQKKTLQALEFHTVPFQLLARYKGLNLTEDTYKPRIYTSPTWSAFVTDSSWSARKSQLVYQSRRGPLVKYSSDYFQAPSDYRYYPYQSFQTPQHPSFLFQDKRVSWSLVYLPTIQSCWNYGFSCSSDELPVLGLTKSGGSDRTIAYENKALMLCEGLFVADVTDFEGWKAAIPSALDTNSSKSTSSFPCPAGHFNGFRTVIRPFYLTNSSGVD
定义
“炎症”在本文中表示该词的一般医学意义,并且可以是急性的或慢性的;简单或化脓性的;局部或传播性的;由任何数量的化学、物理或生物物质或物质组合引发或维持的细胞和组织反应。
“炎性状态”用于指示由炎症引起的对象的相对生物学状况,或表征炎症程度。
术语“患者”和“对象”在本公开中用于指待治疗或需要治疗诸如LN的病症的哺乳动物。这些术语包括人类患者和志愿者,非人类哺乳动物,例如非人类灵长类动物、大型动物模型和啮齿动物。
来自对象的“样品”可包括单个细胞或多个细胞或细胞碎片或采自对象的等分试样,其通过包括静脉穿刺、排泄、射精、按摩、活检、针吸出法、灌洗样品、刮擦、手术切口或介入或本领域已知的其他手段采集。样品是血液、尿液、脊髓液、淋巴液、粘膜分泌物、前列腺液、精液、血淋巴或本领域已知的任何其他体液。样品也是组织样品。
“治疗”包括所有干预措施,无论是生物学、化学、物理学还是前述的组合,旨在维持或改变对象的监测生物学状况。
术语“分离的蛋白质”意指蛋白质或多肽,从本义或派生含义上说,其与天然状态下与其相伴的天然相关组分无关;基本上不含来自相同来源的其他蛋白质。使用本领域已知的蛋白质纯化技术,还可通过分离使蛋白基本不含天然相关的组分或成为基本纯化的。“基本纯化的”指该蛋白质基本不含污染物,例如,至少约70%或75%或80%或85%或90%或95%或96%或97%或98%或99%不含污染物。
术语“重组”应理解为指人工遗传重组的产物。因此,对于包含抗原结合结构域的重组蛋白,该术语不包括作为B细胞成熟期间发生的天然重组的产物的在对象体内天然产生的抗体。然而,如果这种抗体被分离,则认为它是包含抗原结合结构域的分离蛋白。类似地,如果编码蛋白质的核酸被分离并使用重组方法表达,所得蛋白质是包含抗原结合结构域的重组蛋白。重组蛋白还包括当其处于细胞、组织或对象(例如其中表达该蛋白质的细胞、组织或对象)内时通过人工重组方式表达的蛋白质。
术语“特异性结合LGALS3BP的Ig融合蛋白”应包括能够以本文描述和/或要求保护的方式结合LGALS3BP的Ig融合蛋白(包括但不限于抗LGALS3BP抗体)。
术语“多肽”或“多肽链”应理解为意指通过肽键连接的一系列连续氨基酸。
本文所用术语“抗原结合结构域”应理解为表示能够特异性结合抗原的抗体区域,即,VH或VL或包含VH和VL的Fv。抗原结合结构域不需要在整个抗体的情形下,例如,它可以是分离的(例如结构域抗体)或另一种形式(例如scFv)。
出于本公开的目的,术语“抗体”包括能够通过Fv中包含的抗原结合结构域特异性结合一种或几种密切相关的抗原(例如,LGALS3BP)的蛋白质。该术语包括四链抗体(如两条轻(L)链和两条重(H)链)、重组或修饰的抗体(如嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、CDR移植抗体、灵长类动物化抗体、去免疫化抗体、同人源化抗体(synhumanized antibody)、半抗体、双特异性抗体)。抗体通常包含恒定区,其可被排列为恒定区或恒定片段或可结晶片段(Fc)。抗体的示例性形式包括四链结构作为其基本单元。全长抗体包含共价连接的两条重链(每条约50至70kDa)和两条轻链(每条约23kDa)。轻链通常包含可变区(如果存在)和恒定结构域,并且在哺乳动物中是κ轻链或λ轻链。重链通常包含可变区和一个或两个恒定结构域,其通过铰链区与其他恒定结构域相连。哺乳动物的重链具有以下类型之一:α、δ、ε、γ或μ。每条轻链也与重链之一共价连接。例如,两条重链以及重链与轻链通过链间二硫键并通过非共价相互作用固定在一起。链间二硫键的数量可以在不同类型的抗体之间变化。各链具有N末端可变区(VH或VL,其各自的长度都是约110个氨基酸)以及一个或多个C末端处的恒定结构域。轻链的恒定结构域(CL,其长度为约110个氨基酸)与重链的第一恒定结构域(CH1,其长度为330-440个氨基酸)对齐并通过二硫键连接。轻链可变区与重链的可变区对齐。抗体重链可包含2个或多个其他CH结构域(如CH2、CH3等)并可包含CH1和CH2恒定结构域之间的铰链区。抗体可以是任何类型(如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类(如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。
如本文所用,“可变区”指本文所定义抗体的轻链和/或重链能够特异性结合抗原并包含互补决定区(CDR)(即CDR1、CDR2和CDR3)和框架区(FR)的氨基酸序列的部分。例如,可变区包含三个或四个FR(如FR1、FR2、FR3和任选的FR4)以及三个CDR。VH指重链的可变区。VL指轻链的可变区。
本文所用术语“互补决定区”(同义词CDR;即CDR1、CDR2和CDR3)指抗体可变区的氨基酸残基,其存在是特异性抗原结合的主要原因。各可变区结构域(VH或VL)通常具有三个CDR区,其被鉴定为CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方式中,分配给CDR和FR的氨基酸位置是根据Kabat等,《免疫学感兴趣的蛋白质序列》(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest),国立卫生研究院(National Institutes of Health),马里兰州贝塞斯达,1987和1991(本文中也称作“Kabat编码系统”)来定义的。在另一个实施方式中,分配给CDR和FR的氨基酸位置是根据加强版Chothia编码方案来定义的。根据Kabat的编码系统,VH FR和CDR的位置如下:残基1至30(FR1)、31至35(CDR1)、36至49(FR2)、50至65(CDR2)、66至94(FR3)、95至102(CDR3)和103至113(FR4)。根据Kabat的编码系统,VL FR和CDR的位置如下:残基1至23(FR1)、24至34(CDR1)、35至49(FR2)、50至56(CDR2)、57至88(FR3)、89至97(CDR3)和98至107(FR4)。本发明不限于Kabat编码系统所定义的FR和CDR,而是包括所有编码系统,包括规范编码系统或Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196:901-917,1987;Chothia等,Nature342:877-883,1989;和/或Al-Lazikani等,J.Mol.Biol.273:927-948,1997的编码系统;Honnegher和Plükthun J.Mol.Biol.309:657-670,2001的编码系统;或者Giudicelli等,Nucleic Acids Res.25:206-211 1997所讨论的编码系统。在一个实施方式中,这些CDR是根据Kabat编码系统定义的。
本文所用术语“Fv”应理解为指任何蛋白质,无论其由多个多肽或单个多肽组成,其中VL和VH连接并形成具有抗原结合结构域(即能够特异性结合抗原)的复合物。形成抗原结合结构域的VH和VL可以在单条多肽链中或不同多肽链中。此外,本发明的Fv(以及本发明的任何蛋白质)可具有多个抗原结合结构域,其可结合或不结合相同的抗原。该术语应理解为包括直接来源于抗体的片段以及采用重组方式生产的对应于这类片段的蛋白质。在一些实施方式中,VH不与重链恒定结构域(CH)1相连和/或VL不与轻链恒定结构域(CL)相连。示例性的含Fv多肽或蛋白质包括Fab片段、Fab’片段、F(ab’)片段、scFv、双抗体、三抗体、四抗体或更高级的复合物,或者与恒定区或其结构域(如CH2或CH3结构域)相连的任意前述物质,如微小抗体。
“Fab片段”由免疫球蛋白的单价抗原结合片段组成且可通过使用木瓜蛋白酶消化全抗体以生成由完整轻链和一部分重链组成的片段来生产或者可使用重组方法来生产。
通过使用胃蛋白酶处理全抗体随后还原以生成由完整轻链和一部分重链(包含VH和单个恒定结构域)组成的分子,由此可获得抗体的“Fab'片段”。通过该方式处理,每个抗体可获得两个Fab'片段。还可通过重组方式生产Fab'片段。
“单链Fv”或“scFV”是含有抗体的可变区片段(Fv)的重组分子,其中轻链的可变区和重链的可变区通过合适的柔性多肽接头共价连接。
对于特异性结合LGALS3BP的Ig融合蛋白或其抗原结合结构域与抗原的相互作用,本文所用术语“结合”指该相互作用取决于抗原上所存在的特定结构(如抗原决定簇或表位)。例如,抗体识别并结合特定蛋白质结构而非广泛结合蛋白质。如果抗体结合表位“A”,则在含有标记的“A”和该抗体的反应中存在含有表位“A”(或游离、未结合的“A”)的分子会降低与该抗体结合的标记的“A”的量。
本文所用术语“特异性结合”应理解为表示:与同其他抗原或细胞的反应或连接相比,本公开的蛋白质(例如,抗LGALS3BP抗体)更频繁、更快速、更持久和/或亲和力更高地与特定抗原或表达该特定抗原的细胞反应或缔合。例如,特异性结合抗原的蛋白质以比其与其他抗原结合更大的亲和性、亲和力、更容易和/或更长的持续时间结合该抗原。例如,蛋白质与LGALS3BP结合的物质亲和性大于其与其它免疫球蛋白超家族配体或通常被多反应性天然抗体识别的抗原(即,通过天然存在的结合天然存在于人体中的多种抗原的抗体)。通过阅读该定义还可以理解,例如,特异性结合第一抗原的蛋白质可以或可以不特异性结合第二抗原。因此,“特异性结合”不一定需要另一种抗原的专有结合或不可检测的结合,这由术语“选择性结合”表示。
如本文所用,术语“表位”(同义词“抗原决定簇”)应理解为表示LGALS3BP由包含抗体的抗原结合结构域的蛋白质结合的区域。该术语不必限于与该蛋白质接触的特定残基或结构。对于实施方式而言,该术语包括跨越蛋白质接触的氨基酸的区域和/或该区域外至少5至10或2至5或1至3个氨基酸。在一些实施方式中,所述表位是线性系列氨基酸。表位还可以包含一系列不连续的氨基酸,当LGALS3BP折叠时,它们的定位彼此靠近,即“构象表位”。本领域技术人员还将意识到,术语“表位”不限于肽或多肽。对于实施方式而言,术语“表位”包括分子的化学活性表面基团,例如糖侧链,磷酰基侧链或磺酰基侧链,并且在某些实施方式中,可具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。可以将表位或包含该表位的肽或多肽施用于动物以产生针对表位的抗体。
如本文所用,术语“诊断”及其变化形式,例如但不限于“诊断的”、“被诊断”或“诊断中”包括临床状态的任何初步诊断或复发性疾病的诊断。
方法
采用以下方法来获得和制备本专利申请的以下实验实施例部分中使用的材料(包括但不限于人和非人组织、细胞和蛋白质)。
人巨噬细胞的体外刺激。
根据制造商的说明,使用Ficoll Paque Plus(GE Health Sciences)从健康供者(纽约血液中心)的血沉棕黄层制剂中分离人PBMC。单核细胞通过在塑料上贴附90分钟来纯化,随后通过用含有Pen/Strep和10%热灭活的胎牛血清(Corning)的RPMI 1640(Gibco)中的100ng/ml GM-CSF(沙格司亭,Sanofi)培养来分化成巨噬细胞。第7天加入炎性刺激物(重组IFNα,对于TLR9是CpG,对于TLR4是LPS,TLR7/8和IFNα的小分子激动剂),6小时后通过qCPR测定LGALS3BP mRNA,20小时后通过ELISA测定LGALS3BP蛋白。用Taqman技术(AppliedBiosystems)测量mRNA,用HPRT1作为管家基因进行标准化。样品在Applied BiosystemsQuantStudio仪器上运行。用市售的ELISA试剂盒(Abnova)检测LGALS3BP蛋白质。
血液的LGALS3BP表达。
收集患者全血并通过Ficoll密度离心分离PBMC。将PBMC在含有10%DMSO的90%胎牛血清中于-80℃冷冻。当准备好进一步分析时,将细胞快速解冻,用含有1%β-巯基乙醇的缓冲液RLT(Qiagen)裂解,并使用RNeasy微型试剂盒(Qiagen)提取RNA。然后进行DNA酶1处理,并使用SPRI珠(Life Technologies)进行进一步净化。随后使用Smartseq2方案进行RNA-seq。数据表示为FPKM值。
LN患者和健康对照的肾中LGALS3BP表达
在获得知情同意后收集人肾活检物,处理并用于微阵列分析。详细的方法信息可以在原始参考文献中找到(Berthier CC等,JI 2012)。该数据是从GSE32591下的GEO数据库访问的。显示了线性表达数据。
BXSB-Yaa模型中的LGALS3BP表达。
所有使用动物的程序均按照所有关于动物护理的地方和国家法律和法规进行。雄性BXSB-Yaa小鼠购自Jackson。在20周龄时,通过CO2窒息使小鼠安乐死,并通过腔静脉收集血液。在研究结束时,收集肾脏,在福尔马林中固定并运送到HistoTox实验室,在那里对它们进行苏木精和伊红染色处理,并由训练有素的病理学家对损伤的组织学证据进行评分。使用的评分系统是从先前公布的系统修改而来(Chan,O.,Madaio,M.P.和Shlomchik,M.J.1997.B细胞在MRL/lpr鼠狼疮中的作用(The roles of B cells in MRL/lpr murinelupus).Ann N Y Acad Sci 815:75-87),并且基于肾小球新月体、蛋白质管型(proteincast)、间质性炎症和血管炎评价肾切片,并基于这些参数的综合评分获得总体组织学评分。
血浆和尿液收集
全血和新鲜尿液获自健康患者或SLE和LN患者。将全血收集在肝素管中并在环境温度下运输。通过将全血以720×g旋转10分钟来收集血浆。收集血浆并再次以2000×g离心15分钟以除去血小板。所有样品均储存在-80C。
基于抗体/文库的方法
本公开还包括筛选抗体或蛋白质文库,所述文库包含所述抗体或蛋白质的抗原结合结构域(例如,包含其可变区),以鉴定特异性结合本公开的LGALS3BP的Ig融合蛋白。对于实施方式,可以筛选包含本公开的VH和多个VL区的文库以鉴定特异性结合本公开的LGALS3BP的Ig融合蛋白。
本公开内容考虑的文库的实施方式包括原初文库(来自未受攻击的对象)、免疫文库(来自用抗原免疫的对象)或合成文库。通过常规技术(例如,如Sambrook和Russell编,《分子克隆:实验室手册》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual),第三版第1-3卷,冷泉港实验室出版社,2001中所述)克隆编码抗体或其区域的核酸,并将其用于以本领域已知的方法编码和展示蛋白质。对于实施方式,用于产生蛋白质文库的其他技术描述于以下文件中:美国专利号6,300,064(例如,Morphosys AG的HuCAL文库)、美国专利号5,885,793、美国专利号6,204,023、美国专利号6,291,158,或美国专利号6,248,516。
根据本发明特异性结合LGALS3BP的Ig融合蛋白可以是可溶性分泌蛋白,或者可以作为融合蛋白存在于细胞或颗粒(例如噬菌体或其他病毒、核糖体或孢子)的表面上。各种展示文库形式在本领域中是已知的。对于实施方式,文库是体外展示文库(例如,核糖体展示文库、共价展示文库或mRNA展示文库,例如,如美国专利号7,270,969中所述)。而在另一实施方式中,展示文库是噬菌体展示文库,其中包含抗体的抗原结合结构域的蛋白质在噬菌体上表达,对于实施方式,如美国专利号6,300,064、美国专利号5,885,793、美国专利号6,204,023、美国专利号6,291,158,或美国专利号6,248,516所述。其它噬菌体展示方法是本领域已知的,并且为本公开所涵盖。类似地,本公开设想了细胞展示方法,对于实施方式,细菌展示文库,对于实施方式,如美国专利号5,516,637所述;酵母展示文库,对于实施方式,如美国专利号6,423,538所述;或哺乳动物展示文库。
筛选展示文库的方法是本领域已知的。在一个实施方式中,对于实施方式,使用亲和纯化筛选本公开的展示文库,如Scopes所述(刊于《蛋白质纯化:原理与实践》(Proteinpurification:principles and practice),第三版,施普林格出版社,1994)。亲和纯化方法通常包括使包含文库展示的抗原结合结构域的蛋白质与靶抗原(例如LGALS3BP)接触,并且在洗涤后洗脱那些仍然结合抗原的结构域。
必要时,经筛选鉴定的任何可变区或scFv均易被修改为完整的抗体。将可变区或scFv修改或重排成完整抗体的示例性方法描述于,例如,Jones等,J.Immunol.Methods354:85-90,2010;或Jostock等,J.Immunol.Methods,289:65-80,2004。或者或另外,采用标准克隆方法,例如,如Ausubel等(刊于:《新编分子生物学方法》(Current Protocols inMolecular Biology),韦利科学出版社;ISBN 047 150338,1987)和/或Sambrook等(刊于:《分子克隆:实验室手册》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual),冷泉港实验室出版社,纽约,第三版2001)中所述。
在一个实施方式中,本公开提供一种通过筛选展示文库(例如,噬菌体展示文库)来产生或分离Ig融合蛋白的方法,所述Ig融合蛋白特异性结合本公开的LGALS3BP,例如,如美国专利号6,300,064和/或美国专利号5,885,793所述。作为一实施方式,本发明人通过针对全长重组人LGALS3BP的多轮选择对人scFv免疫球蛋白基因文库进行生物淘选来分离scFv。一旦分离,可以克隆并表达特异性结合本发明LGALS3BP的Ig融合蛋白,并且任选地重新调整(例如,使用本领域已知的方法)为IgG1抗体。
在一个实施方式中,本公开提供一种产生特异性结合LGALS3BP的Ig融合蛋白的方法,该方法包括:
·(i)筛选特异性结合LGALS3BP制剂或文库的Ig融合蛋白,目标是结合LGALS3BP的胞外结构域(例如,重组人LGALS3BP的胞外结构域)的结合蛋白;和
·(ii)分离特异性结合LGALS3BP的Ig融合蛋白,其对LGALS3BP的胞外结构域具有所需的结合亲和性。
在一个实施方式中,筛选特异性结合LGALS3BP制剂的Ig融合蛋白。例如,LGALS3BP制剂可通过如下方式制备:用LGALS3BP抗原免疫动物以产生与LGALS3BP的胞外结构域反应的抗体。
在另一实施方式中,筛选特异性结合LGALS3BP文库的Ig融合蛋白。文库可以是噬菌体文库,例如,scFv噬菌体文库或Fab噬菌体文库。
在一个实施方式中,该方法包括产生一群噬菌体颗粒,在其表面展示一组结合分子,其具有靶LGALS3BP表位或抗原的一定结合特异性。此类噬菌体颗粒包含噬菌粒基因组,其包含编码结合蛋白的核酸。可以在重组系统中分离、克隆和表达该核酸,以产生特异性结合本发明LGALS3BP的Ig融合蛋白。
用于表达特异性结合本公开LGALS3BP的Ig融合蛋白的示例性细胞是CHO细胞、骨髓瘤细胞或HEK细胞。细胞可进一步包含促进修饰抗体表达的一个或多个基因突变和/或缺失。一非限制性实施方式是使编码表达的免疫球蛋白或抗体的岩藻糖基化所需的酶的基因缺失。
蛋白质纯化
在生成/表达后,使用本领域已知的方法纯化特异性结合本公开的LGALS3BP的Ig融合蛋白。这种纯化提供了基本上不含非特异性蛋白质、酸、脂质、碳水化合物等的本公开的蛋白质。在一个实施方式中,蛋白质的制剂中超过约90%(例如,95%、98%或99%)的蛋白质是Ig融合蛋白,其特异性结合本公开的LGALS3BP。
使用肽纯化的标准方法来获得本公开的分离的特异性结合LGALS3BP的Ig融合蛋白,包括但不限于各种高压(或高效)液相色谱(HPLC)和非HPLC多肽分离方案,例如尺寸排阻色谱法、离子交换色谱法、疏水相互作用色谱法、混合模式色谱法、相分离方法、电泳分离、沉淀方法、盐溶/盐析方法、免疫色谱法和/或其他方法。
特异性结合LGALS3BP的Ig融合蛋白/抗LGALS3BP抗体
本发明的选定实施方式基于发明人生产的特异性结合LGALS3BP的人抗体。这些人抗LGALS3BP抗体来源于人scFv序列的噬菌体展示文库;将获得的scFv噬菌体克隆重新调整为IgG1mAb。
本公开广泛涉及Ig融合蛋白,其特异性结合LGALS3BP,其包含特异性结合LGALS3BP的抗原结合结构域。Qqq
在一个实施方式中,本发明公开了一种LGALS3BP Ig融合蛋白,其特异性结合LGALS3BP,其中,该Ig融合蛋白包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),所述重链可变区包含三个互补决定区(CDR),其中,VH CDR1包含SEQ ID NO:32所示氨基酸序列,VH CDR2包含SEQ ID NO:33所示氨基酸序列,且VH CDR3包含SEQ ID NO:34的氨基酸所示氨基酸序列,所述轻链可变区包含三个互补决定区(CDR),其中,VL CDR1包含SEQ ID NO:35所示氨基酸序列,VL CDR2包含SEQ ID NO:36所示氨基酸序列,且VL CDR3包含SEQ ID NO:37所示氨基酸序列。前述段落中所述的LGALS3BP Ig融合蛋白的三个VH CDR和三个VL CDR的缩合示于SEQ IDNO:2的氨基酸中。
在一个实施方式中,本发明公开了一种LGALS3BP Ig融合蛋白,其特异性结合LGALS3BP,其中,该Ig融合蛋白包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),所述重链可变区包含三个互补决定区(CDR),其中,VH CDR1包含SEQ ID NO:38所示氨基酸序列,VH CDR2包含SEQ ID NO:39所示氨基酸序列,且VH CDR3包含SEQ ID NO:40的氨基酸所示氨基酸序列,所述轻链可变区包含三个互补决定区(CDR),其中,VL CDR1包含SEQ ID NO:41所示氨基酸序列,VL CDR2包含SEQ ID NO:42所示氨基酸序列,且VL CDR3包含SEQ ID NO:43所示氨基酸序列。前述段落中所述的LGALS3BP Ig融合蛋白的三个VH CDR和三个VL CDR的缩合示于SEQ IDNO:3的氨基酸中。
在一个实施方式中,本发明公开了一种LGALS3BP Ig融合蛋白,其特异性结合LGALS3BP,其中,该Ig融合蛋白包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),所述重链可变区包含三个互补决定区(CDR),其中,VH CDR1包含SEQ ID NO:44所示氨基酸序列,VH CDR2包含SEQ ID NO:45所示氨基酸序列,且VH CDR3包含SEQ ID NO:46的氨基酸所示氨基酸序列,所述轻链可变区包含三个互补决定区(CDR),其中,VL CDR1包含SEQ ID NO:47所示氨基酸序列,VL CDR2包含SEQ ID NO:48所示氨基酸序列,且VL CDR3包含SEQ ID NO:49所示氨基酸序列。前述段落中所述的LGALS3BP Ig融合蛋白的三个VH CDR和三个VL CDR的缩合示于SEQ IDNO:4的氨基酸中。
在一个实施方式中,本发明公开了一种LGALS3BP Ig融合蛋白,其特异性结合LGALS3BP,其中,该Ig融合蛋白包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),所述重链可变区包含三个互补决定区(CDR),其中,VH CDR1包含SEQ ID NO:50所示氨基酸序列,VH CDR2包含SEQ ID NO:51所示氨基酸序列,且VH CDR3包含SEQ ID NO:52的氨基酸所示氨基酸序列,所述轻链可变区包含三个互补决定区(CDR),其中,VL CDR1包含SEQ ID NO:53所示氨基酸序列,VL CDR2包含SEQ ID NO:54所示氨基酸序列,且VL CDR3包含SEQ ID NO:55所示氨基酸序列。前述段落中所述的LGALS3BP Ig融合蛋白的三个VH CDR和三个VL CDR的缩合示于SEQ IDNO:5的氨基酸中。
在一个实施方式中,本发明公开了一种LGALS3BP Ig融合蛋白,其特异性结合LGALS3BP,其中,该Ig融合蛋白包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),所述重链可变区包含三个互补决定区(CDR),其中,VH CDR1包含SEQ ID NO:56所示氨基酸序列,VH CDR2包含SEQ ID NO:57所示氨基酸序列,且VH CDR3包含SEQ ID NO:58的氨基酸所示氨基酸序列,所述轻链可变区包含三个互补决定区(CDR),其中,VL CDR1包含SEQ ID NO:59所示氨基酸序列,VL CDR2包含SEQ ID NO:60所示氨基酸序列,且VL CDR3包含SEQ ID NO:61所示氨基酸序列。前述段落中所述的LGALS3BP Ig融合蛋白的三个VH CDR和三个VL CDR的缩合示于SEQ IDNO:6的氨基酸中。
在一个实施方式中,本发明公开了一种LGALS3BP Ig融合蛋白,其特异性结合LGALS3BP,其中,该Ig融合蛋白包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),所述重链可变区包含三个互补决定区(CDR),其中,VH CDR1包含SEQ ID NO:62所示氨基酸序列,VH CDR2包含SEQ ID NO:63所示氨基酸序列,且VH CDR3包含SEQ ID NO:64的氨基酸所示氨基酸序列,所述轻链可变区包含三个互补决定区(CDR),其中,VL CDR1包含SEQ ID NO:65所示氨基酸序列,VL CDR2包含SEQ ID NO:66所示氨基酸序列,且VL CDR3包含SEQ ID NO:67所示氨基酸序列。前述段落中所述的LGALS3BP Ig融合蛋白的三个VH CDR和三个VL CDR的缩合示于SEQ IDNO:7的氨基酸中。
在一个实施方式中,本发明公开了一种LGALS3BP Ig融合蛋白,其特异性结合LGALS3BP,其中,该Ig融合蛋白包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),所述重链可变区包含三个互补决定区(CDR),其中,VH CDR1包含SEQ ID NO:68所示氨基酸序列,VH CDR2包含SEQ ID NO:69所示氨基酸序列,且VH CDR3包含SEQ ID NO:70的氨基酸所示氨基酸序列,所述轻链可变区包含三个互补决定区(CDR),其中,VL CDR1包含SEQ ID NO:71所示氨基酸序列,VL CDR2包含SEQ ID NO:72所示氨基酸序列,且VL CDR3包含SEQ ID NO:73所示氨基酸序列。前述段落中所述的LGALS3BP Ig融合蛋白的三个VH CDR和三个VL CDR的缩合示于SEQ IDNO:8的氨基酸中。
在一个实施方式中,本发明公开了一种LGALS3BP Ig融合蛋白,其特异性结合LGALS3BP,其中,该Ig融合蛋白包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),所述重链可变区包含三个互补决定区(CDR),其中,VH CDR1包含SEQ ID NO:74所示氨基酸序列,VH CDR2包含SEQ ID NO:75所示氨基酸序列,且VH CDR3包含SEQ ID NO:76的氨基酸所示氨基酸序列,所述轻链可变区包含三个互补决定区(CDR),其中,VL CDR1包含SEQ ID NO:77所示氨基酸序列,VL CDR2包含SEQ ID NO:78所示氨基酸序列,且VL CDR3包含SEQ ID NO:79所示氨基酸序列。前述段落中所述的LGALS3BP Ig融合蛋白的三个VH CDR和三个VL CDR的缩合示于SEQ IDNO:9的氨基酸中。
在一个实施方式中,本发明公开了一种LGALS3BP Ig融合蛋白,其特异性结合LGALS3BP,其中,该Ig融合蛋白包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),所述重链可变区包含三个互补决定区(CDR),其中,VH CDR1包含SEQ ID NO:80所示氨基酸序列,VH CDR2包含SEQ ID NO:81所示氨基酸序列,且VH CDR3包含SEQ ID NO:82的氨基酸所示氨基酸序列,所述轻链可变区包含三个互补决定区(CDR),其中,VL CDR1包含SEQ ID NO:83所示氨基酸序列,VL CDR2包含SEQ ID NO:84所示氨基酸序列,且VL CDR3包含SEQ ID NO:85所示氨基酸序列。前述段落中所述的LGALS3BP Ig融合蛋白的三个VH CDR和三个VL CDR的缩合示于SEQ IDNO:10的氨基酸中。
在一个实施方式中,本发明公开了一种LGALS3BP Ig融合蛋白,其特异性结合LGALS3BP,其中,该Ig融合蛋白包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),所述重链可变区包含三个互补决定区(CDR),其中,VH CDR1包含SEQ ID NO:86所示氨基酸序列,VH CDR2包含SEQ ID NO:87所示氨基酸序列,且VH CDR3包含SEQ ID NO:88的氨基酸所示氨基酸序列,所述轻链可变区包含三个互补决定区(CDR),其中,VL CDR1包含SEQ ID NO:89所示氨基酸序列,VL CDR2包含SEQ ID NO:90所示氨基酸序列,且VL CDR3包含SEQ ID NO:91所示氨基酸序列。前述段落中所述的LGALS3BP Ig融合蛋白的三个VH CDR和三个VL CDR的缩合示于SEQ IDNO:11的氨基酸中。
在一个实施方式中,本发明公开了一种LGALS3BP Ig融合蛋白,其特异性结合LGALS3BP,其中,该Ig融合蛋白包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),所述重链可变区包含三个互补决定区(CDR),其中,VH CDR1包含SEQ ID NO:92所示氨基酸序列,VH CDR2包含SEQ ID NO:93所示氨基酸序列,且VH CDR3包含SEQ ID NO:94的氨基酸所示氨基酸序列,所述轻链可变区包含三个互补决定区(CDR),其中,VL CDR1包含SEQ ID NO:95所示氨基酸序列,VL CDR2包含SEQ ID NO:96所示氨基酸序列,且VL CDR3包含SEQ ID NO:97所示氨基酸序列。前述段落中所述的LGALS3BP Ig融合蛋白的三个VH CDR和三个VL CDR的缩合示于SEQ IDNO:12的氨基酸中。
在一个实施方式中,本发明公开了一种LGALS3BP Ig融合蛋白,其特异性结合LGALS3BP,其中,该Ig融合蛋白包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),所述重链可变区包含三个互补决定区(CDR),其中,VH CDR1包含SEQ ID NO:98所示氨基酸序列,VH CDR2包含SEQ ID NO:99所示氨基酸序列,且VH CDR3包含SEQ ID NO:100的氨基酸所示氨基酸序列,所述轻链可变区包含三个互补决定区(CDR),其中,VL CDR1包含SEQ ID NO:101所示氨基酸序列,VL CDR2包含SEQ ID NO:102所示氨基酸序列,且VL CDR3包含SEQ ID NO:103所示氨基酸序列。前述段落中所述的LGALS3BP Ig融合蛋白的三个VH CDR和三个VL CDR的缩合示于SEQ ID NO:13的氨基酸中。
在一个实施方式中,本发明公开了一种LGALS3BP Ig融合蛋白,其特异性结合LGALS3BP,其中,该Ig融合蛋白包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),所述重链可变区包含三个互补决定区(CDR),其中,VH CDR1包含SEQ ID NO:104所示氨基酸序列,VH CDR2包含SEQ ID NO:105所示氨基酸序列,且VH CDR3包含SEQ ID NO:106的氨基酸所示氨基酸序列,所述轻链可变区包含三个互补决定区(CDR),其中,VL CDR1包含SEQ ID NO:107所示氨基酸序列,VL CDR2包含SEQ ID NO:108所示氨基酸序列,且VL CDR3包含SEQ ID NO:109所示氨基酸序列。前述段落中所述的LGALS3BP Ig融合蛋白的三个VH CDR和三个VL CDR的缩合示于SEQ ID NO:14的氨基酸中。
在一个实施方式中,本发明公开了一种LGALS3BP Ig融合蛋白,其特异性结合LGALS3BP,其中,该Ig融合蛋白包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),所述重链可变区包含三个互补决定区(CDR),其中,VH CDR1包含SEQ ID NO:110所示氨基酸序列,VH CDR2包含SEQ ID NO:111所示氨基酸序列,且VH CDR3包含SEQ ID NO:112的氨基酸所示氨基酸序列,所述轻链可变区包含三个互补决定区(CDR),其中,VL CDR1包含SEQ ID NO:113所示氨基酸序列,VL CDR2包含SEQ ID NO:114所示氨基酸序列,且VL CDR3包含SEQ ID NO:115所示氨基酸序列。前述段落中所述的LGALS3BP Ig融合蛋白的三个VH CDR和三个VL CDR的缩合示于SEQ ID NO:15的氨基酸中。
在一个实施方式中,本发明公开了一种LGALS3BP Ig融合蛋白,其特异性结合LGALS3BP,其中,该Ig融合蛋白包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),所述重链可变区包含三个互补决定区(CDR),其中,VH CDR1包含SEQ ID NO:116所示氨基酸序列,VH CDR2包含SEQ ID NO:117所示氨基酸序列,且VH CDR3包含SEQ ID NO:118的氨基酸所示氨基酸序列,所述轻链可变区包含三个互补决定区(CDR),其中,VL CDR1包含SEQ ID NO:119所示氨基酸序列,VL CDR2包含SEQ ID NO:120所示氨基酸序列,且VL CDR3包含SEQ ID NO:121所示氨基酸序列。前述段落中所述的LGALS3BP Ig融合蛋白的三个VH CDR和三个VL CDR的缩合示于SEQ ID NO:16的氨基酸中。
在一个实施方式中,本发明公开了一种LGALS3BP Ig融合蛋白,其特异性结合LGALS3BP,其中,该Ig融合蛋白包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),所述重链可变区包含三个互补决定区(CDR),其中,VH CDR1包含SEQ ID NO:122所示氨基酸序列,VH CDR2包含SEQ ID NO:123所示氨基酸序列,且VH CDR3包含SEQ ID NO:124的氨基酸所示氨基酸序列,所述轻链可变区包含三个互补决定区(CDR),其中,VL CDR1包含SEQ ID NO:125所示氨基酸序列,VL CDR2包含SEQ ID NO:126所示氨基酸序列,且VL CDR3包含SEQ ID NO:127所示氨基酸序列。前述段落中所述的LGALS3BP Ig融合蛋白的三个VH CDR和三个VL CDR的缩合示于SEQ ID NO:17的氨基酸中。
在一个实施方式中,本发明公开了一种LGALS3BP Ig融合蛋白,其特异性结合LGALS3BP,其中,该Ig融合蛋白包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),所述重链可变区包含三个互补决定区(CDR),其中,VH CDR1包含SEQ ID NO:128所示氨基酸序列,VH CDR2包含SEQ ID NO:129所示氨基酸序列,且VH CDR3包含SEQ ID NO:130的氨基酸所示氨基酸序列,所述轻链可变区包含三个互补决定区(CDR),其中,VL CDR1包含SEQ ID NO:131所示氨基酸序列,VL CDR2包含SEQ ID NO:132所示氨基酸序列,且VL CDR3包含SEQ ID NO:133所示氨基酸序列。前述段落中所述的LGALS3BP Ig融合蛋白的三个VH CDR和三个VL CDR的缩合示于SEQ ID NO:18的氨基酸中。
在一个实施方式中,本发明公开了一种LGALS3BP Ig融合蛋白,其特异性结合LGALS3BP,其中,该Ig融合蛋白包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),所述重链可变区包含三个互补决定区(CDR),其中,VH CDR1包含SEQ ID NO:134所示氨基酸序列,VH CDR2包含SEQ ID NO:135所示氨基酸序列,且VH CDR3包含SEQ ID NO:136的氨基酸所示氨基酸序列,所述轻链可变区包含三个互补决定区(CDR),其中,VL CDR1包含SEQ ID NO:137所示氨基酸序列,VL CDR2包含SEQ ID NO:138所示氨基酸序列,且VL CDR3包含SEQ ID NO:139所示氨基酸序列。前述段落中所述的LGALS3BP Ig融合蛋白的三个VH CDR和三个VL CDR的缩合示于SEQ ID NO:19的氨基酸中。
在一个实施方式中,本发明公开了一种LGALS3BP Ig融合蛋白,其特异性结合LGALS3BP,其中,该Ig融合蛋白包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),所述重链可变区包含三个互补决定区(CDR),其中,VH CDR1包含SEQ ID NO:140所示氨基酸序列,VH CDR2包含SEQ ID NO:141所示氨基酸序列,且VH CDR3包含SEQ ID NO:142的氨基酸所示氨基酸序列,所述轻链可变区包含三个互补决定区(CDR),其中,VL CDR1包含SEQ ID NO:143所示氨基酸序列,VL CDR2包含SEQ ID NO:144所示氨基酸序列,且VL CDR3包含SEQ ID NO:145所示氨基酸序列。前述段落中所述的LGALS3BP Ig融合蛋白的三个VH CDR和三个VL CDR的缩合示于SEQ ID NO:20的氨基酸中。
在一个实施方式中,本发明公开了一种LGALS3BP Ig融合蛋白,其特异性结合LGALS3BP,其中,该Ig融合蛋白包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),所述重链可变区包含三个互补决定区(CDR),其中,VH CDR1包含SEQ ID NO:146所示氨基酸序列,VH CDR2包含SEQ ID NO:147所示氨基酸序列,且VH CDR3包含SEQ ID NO:148的氨基酸所示氨基酸序列,所述轻链可变区包含三个互补决定区(CDR),其中,VL CDR1包含SEQ ID NO:149所示氨基酸序列,VL CDR2包含SEQ ID NO:150所示氨基酸序列,且VL CDR3包含SEQ ID NO:151所示氨基酸序列。前述段落中所述的LGALS3BP Ig融合蛋白的三个VH CDR和三个VL CDR的缩合示于SEQ ID NO:21的氨基酸中。
在一个实施方式中,本发明公开了一种LGALS3BP Ig融合蛋白,其特异性结合LGALS3BP,其中,该Ig融合蛋白包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),所述重链可变区包含三个互补决定区(CDR),其中,VH CDR1包含SEQ ID NO:152所示氨基酸序列,VH CDR2包含SEQ ID NO:153所示氨基酸序列,且VH CDR3包含SEQ ID NO:154的氨基酸所示氨基酸序列,所述轻链可变区包含三个互补决定区(CDR),其中,VL CDR1包含SEQ ID NO:155所示氨基酸序列,VL CDR2包含SEQ ID NO:156所示氨基酸序列,且VL CDR3包含SEQ ID NO:157所示氨基酸序列。前述段落中所述的LGALS3BP Ig融合蛋白的三个VH CDR和三个VL CDR的缩合示于SEQ ID NO:22的氨基酸中。
在一个实施方式中,本发明公开了一种LGALS3BP Ig融合蛋白,其特异性结合LGALS3BP,其中,该Ig融合蛋白包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),所述重链可变区包含三个互补决定区(CDR),其中,VH CDR1包含SEQ ID NO:158所示氨基酸序列,VH CDR2包含SEQ ID NO:159所示氨基酸序列,且VH CDR3包含SEQ ID NO:160的氨基酸所示氨基酸序列,所述轻链可变区包含三个互补决定区(CDR),其中,VL CDR1包含SEQ ID NO:161所示氨基酸序列,VL CDR2包含SEQ ID NO:162所示氨基酸序列,且VL CDR3包含SEQ ID NO:163所示氨基酸序列。前述段落中所述的LGALS3BP Ig融合蛋白的三个VH CDR和三个VL CDR的缩合示于SEQ ID NO:23的氨基酸中。
在一个实施方式中,本发明公开了一种LGALS3BP Ig融合蛋白,其特异性结合LGALS3BP,其中,该Ig融合蛋白包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),所述重链可变区包含三个互补决定区(CDR),其中,VH CDR1包含SEQ ID NO:164所示氨基酸序列,VH CDR2包含SEQ ID NO:165所示氨基酸序列,且VH CDR3包含SEQ ID NO:166的氨基酸所示氨基酸序列,所述轻链可变区包含三个互补决定区(CDR),其中,VL CDR1包含SEQ ID NO:167所示氨基酸序列,VL CDR2包含SEQ ID NO:168所示氨基酸序列,且VL CDR3包含SEQ ID NO:169所示氨基酸序列。前述段落中所述的LGALS3BP Ig融合蛋白的三个VH CDR和三个VL CDR的缩合示于SEQ ID NO:24的氨基酸中。
在一个实施方式中,本发明公开了一种LGALS3BP Ig融合蛋白,其特异性结合LGALS3BP,其中,该Ig融合蛋白包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),所述重链可变区包含三个互补决定区(CDR),其中,VH CDR1包含SEQ ID NO:170所示氨基酸序列,VH CDR2包含SEQ ID NO:171所示氨基酸序列,且VH CDR3包含SEQ ID NO:172的氨基酸所示氨基酸序列,所述轻链可变区包含三个互补决定区(CDR),其中,VL CDR1包含SEQ ID NO:173所示氨基酸序列,VL CDR2包含SEQ ID NO:174所示氨基酸序列,且VL CDR3包含SEQ ID NO:175所示氨基酸序列。前述段落中所述的LGALS3BP Ig融合蛋白的三个VH CDR和三个VL CDR的缩合示于SEQ ID NO:25的氨基酸中。
在一个实施方式中,本发明公开了一种LGALS3BP Ig融合蛋白,其特异性结合LGALS3BP,其中,该Ig融合蛋白包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),所述重链可变区包含三个互补决定区(CDR),其中,VH CDR1包含SEQ ID NO:176所示氨基酸序列,VH CDR2包含SEQ ID NO:177所示氨基酸序列,且VH CDR3包含SEQ ID NO:178的氨基酸所示氨基酸序列,所述轻链可变区包含三个互补决定区(CDR),其中,VL CDR1包含SEQ ID NO:179所示氨基酸序列,VL CDR2包含SEQ ID NO:180所示氨基酸序列,且VL CDR3包含SEQ ID NO:181所示氨基酸序列。前述段落中所述的LGALS3BP Ig融合蛋白的三个VH CDR和三个VL CDR的缩合示于SEQ ID NO:26的氨基酸中。
在一个实施方式中,本发明公开了一种LGALS3BP Ig融合蛋白,其特异性结合LGALS3BP,其中,该Ig融合蛋白包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),所述重链可变区包含三个互补决定区(CDR),其中,VH CDR1包含SEQ ID NO:182所示氨基酸序列,VH CDR2包含SEQ ID NO:183所示氨基酸序列,且VH CDR3包含SEQ ID NO:184的氨基酸所示氨基酸序列,所述轻链可变区包含三个互补决定区(CDR),其中,VL CDR1包含SEQ ID NO:185所示氨基酸序列,VL CDR2包含SEQ ID NO:186所示氨基酸序列,且VL CDR3包含SEQ ID NO:187所示氨基酸序列。前述段落中所述的LGALS3BP Ig融合蛋白的三个VH CDR和三个VL CDR的缩合示于SEQ ID NO:27的氨基酸中。
在一个实施方式中,本发明公开了一种LGALS3BP Ig融合蛋白,其特异性结合LGALS3BP,其中,该Ig融合蛋白包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),所述重链可变区包含三个互补决定区(CDR),其中,VH CDR1包含SEQ ID NO:188所示氨基酸序列,VH CDR2包含SEQ ID NO:189所示氨基酸序列,且VH CDR3包含SEQ ID NO:190的氨基酸所示氨基酸序列,所述轻链可变区包含三个互补决定区(CDR),其中,VL CDR1包含SEQ ID NO:191所示氨基酸序列,VL CDR2包含SEQ ID NO:192所示氨基酸序列,且VL CDR3包含SEQ ID NO:193所示氨基酸序列。前述段落中所述的LGALS3BP Ig融合蛋白的三个VH CDR和三个VL CDR的缩合示于SEQ ID NO:28的氨基酸中。
在一个实施方式中,本发明公开了一种LGALS3BP Ig融合蛋白,其特异性结合LGALS3BP,其中,该Ig融合蛋白包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),所述重链可变区包含三个互补决定区(CDR),其中,VH CDR1包含SEQ ID NO:194所示氨基酸序列,VH CDR2包含SEQ ID NO:195所示氨基酸序列,且VH CDR3包含SEQ ID NO:196的氨基酸所示氨基酸序列,所述轻链可变区包含三个互补决定区(CDR),其中,VL CDR1包含SEQ ID NO:197所示氨基酸序列,VL CDR2包含SEQ ID NO:198所示氨基酸序列,且VL CDR3包含SEQ ID NO:199所示氨基酸序列。前述段落中所述的LGALS3BP Ig融合蛋白的三个VH CDR和三个VL CDR的缩合示于SEQ ID NO:29的氨基酸中。
在一个实施方式中,本发明公开了一种LGALS3BP Ig融合蛋白,其特异性结合LGALS3BP,其中,该Ig融合蛋白包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),所述重链可变区包含三个互补决定区(CDR),其中,VH CDR1包含SEQ ID NO:200所示氨基酸序列,VH CDR2包含SEQ ID NO:201所示氨基酸序列,且VH CDR3包含SEQ ID NO:202的氨基酸所示氨基酸序列,所述轻链可变区包含三个互补决定区(CDR),其中,VL CDR1包含SEQ ID NO:203所示氨基酸序列,VL CDR2包含SEQ ID NO:204所示氨基酸序列,且VL CDR3包含SEQ ID NO:205所示氨基酸序列。前述段落中所述的LGALS3BP Ig融合蛋白的三个VH CDR和三个VL CDR的缩合示于SEQ ID NO:30的氨基酸中。
在一个实施方式中,本发明公开了一种LGALS3BP Ig融合蛋白,其特异性结合LGALS3BP,其中,该Ig融合蛋白包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),所述重链可变区包含三个互补决定区(CDR),其中,VH CDR1包含SEQ ID NO:206所示氨基酸序列,VH CDR2包含SEQ ID NO:207所示氨基酸序列,且VH CDR3包含SEQ ID NO:208的氨基酸所示氨基酸序列,所述轻链可变区包含三个互补决定区(CDR),其中,VL CDR1包含SEQ ID NO:209所示氨基酸序列,VL CDR2包含SEQ ID NO:210所示氨基酸序列,且VL CDR3包含SEQ ID NO:211所示氨基酸序列。前述段落中所述的LGALS3BP Ig融合蛋白的三个VH CDR和三个VL CDR的缩合示于SEQ ID NO:31的氨基酸中。
在一个实施方式中,所述VH和VL是在单个多肽链中。对于实施方式,特异性结合LGALS3BP的Ig融合蛋白是:
■(i)单链Fv片段(scFv);或
■(ii)二聚scFv(二-scFv);或
■(iii)与Fc或重链恒定结构域(CH)2和/或CH3相连的(i)或(ii);或
■(iv)与结合免疫效应细胞的蛋白质相连的(i)或(ii)。
在本发明的选定实施方式中,设想VL和VH在分开的多肽链中。例如,特异性结合LGALS3BP的Ig融合蛋白是:
■(i)双抗体;或
■(ii)三抗体;或
■(iii)四抗体;或
■(iv)Fab;或
■(v)F(ab′)2;或
■(vi)Fv;或
■(vii)与Fc或CH2和/或CH3相连的(i)-(vi)之一
在本发明的优选实施方式中,本发明的特异性结合LGALS3BP的Ig融合蛋白是全长抗体。
表1–7呈现了说明本发明各实施方式中所述的特异性结合LGALS3BP的Ig融合蛋白的不同氨基酸序列。
表1–VH和VL CDR序列(合并)
表2–VH和VL ELISA反应性
表3–VH和VL序列的分列CDR5
表4–LH序列的分列CDR5
0
表5–VL CDR序列(合并)
表6–VL序列的分列CDR5
表7–VH CDR序列(合并)
LGALS3BP检测测定与试剂盒
在本发明的一个实施方式中是试剂盒。该人uG3BP ELISA试剂盒用于对尿样中的人G3BP(半乳凝素-3-结合蛋白、LGALS3BP、凝集素半乳糖苷结合可溶性3结合蛋白、M2BP;Mac-2BP;90K/Mac-2-结合蛋白)进行非放射性定量。一个试剂盒足以重复检测38份未知样品。
测定原理
该测定是基于如下顺序的夹心ELISA:1)将样品中的人G3BP分子捕获至被覆有抗人G3BP单克隆抗体的微量滴定板的孔,2)从样品洗涤未结合的材料,3)第二生物素化抗人G3BP单克隆抗体与捕获的分子结合,4)从样品洗涤未结合的物质,5)链霉亲和素-辣根过氧化物酶(HRP)偶联物与固定的生物素化抗体结合,6)洗涤过量的游离酶偶联物,和7)通过在底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)存在下监测辣根过氧化物酶活性来定量固定的抗体-酶偶联物。通过分光光度法,通过在形成的产物酸化后在450nm-590nm处增加的吸光度来测量酶活性。由于吸光度的增加与未知样品中捕获的人G3BP的量成正比,后者可以通过从在相同测定中使用已知浓度的人G3BP的参考标准品产生的参考曲线插值得到。本领域技术人员可以理解,SEQ ID No:2-31描述的抗人G3BP单克隆抗体可纳入本测定中。
提供的试剂
每个试剂盒足以用于一块96孔板并含有以下试剂:
(所有试剂均存放于2-8℃)。
存储和稳定性
所有组分均在2-8℃下运输和储存。可以冷冻重构的标准品和对照品以备将来使用,但应避免重复的冷冻/解冻循环。使用前请参阅所有试剂的失效日期。除非它们具有相同的批号,否则不要混合来自不同试剂盒的试剂。
需要但未提供的材料
1.多通道移液器和移液器吸头:5-50μL和50-300μL
2.移液器和移液器吸头:10μL-20μL或20μL-100μL
3.试剂容器
4.聚丙烯微细管
5.涡旋混合器
6.去离子水
7.微量滴定板读板仪,能够读取450nm和590nm的吸光度
8.轨道微量滴定板振动器
9.吸水纸或布
10.
样品收集和储存
尿样的制备:
·在4℃下离心样品以去除碎片并立即进行分析或等分并将样品储存在-20℃。
·避免反复冻/融循环。
·在测定之前,尿样可能需要用测定缓冲液稀释1:10。
注意:
·每孔最多可使用100μL稀释或纯尿样。
·所有样品必须存放在聚丙烯管中。不要在玻璃中存放样品。
试剂准备
人G3BP标准品制备
1.使用移液器,用500μL蒸馏水或去离子水重建人G3BP标准品。轻轻颠倒混合,静置5分钟,然后混合均匀。
2.将7个聚丙烯微量离心管标记为1、2、3、4、5、6和7。将200μL测定缓冲液加入试管1、2、3、4、5和6。通过将500μL重构标准品加入管7来制备连续稀释物,充分混合并将100μL管7转移至管6,充分混合并将100μL管6转移至管5,充分混合并将100μL管5转移至管4,充分混合并将100μL管4转移至管3,充分混合并将100μL管3转移至管2,充分混合并将100μL管2转移至管1,充分混合。0ng/mL标准品(背景)为测定缓冲液。
注意:每次稀释更换移液头。在分配前用标准品湿润移液头。重构标准品的未使用部分应以小等分试样储存在≤-20℃。避免多次冻融循环。
试剂准备(续)
B.人G3BP质量对照1和2制备
用500μL蒸馏水或去离子水重构每个人G3BP质量对照1和质量对照2并轻轻倒置以确保完全水合(轻轻混合,静置5分钟然后充分混合)。未重复使用的重构质量对照部分应在≤20℃以小等分试样储存。避免进一步冻融循环。
C.洗涤缓冲液的制备
将10X洗涤缓冲液置于室温并混合,将所有盐加入溶液中。用450mL去离子水稀释50mL 10X洗涤缓冲液。将未使用的部分在2~8℃下保存至多一个月。
人uG3BP ELISA测定程序
在设置测定之前将所有试剂加热至室温。
1.从微滴定测定板(Microtiter Assay Plate)上移出所需数量的条带。未使用的条带应在铝箔袋中重新密封,并在2~8℃下储存。将条带组装在空的板架中。向板的每个孔中加入300μL稀释的洗涤缓冲液。倾析洗涤缓冲液,通过翻转平板并将其巧妙地轻拍在吸水毛巾上几次来除去残留的体积。再重复两次洗涤程序。在进行下一步之前,不要让孔干燥。如果使用自动化机器进行测定,请按照制造商的说明进行本方案中描述的所有洗涤步骤。
2.向所有孔中加入50uL测定缓冲液。
3.向每个空白孔中加入50μL分析缓冲液。
4.将50μL标准品和质量对照添加到适当的孔中(对于建议的样品次序放置,请参阅“微量滴定板排布(Microtiter Plate Arrangement)”部分)。
5.将50μL稀释的尿液样品加入适当的孔中。
6.用板封盖住平板,在室温下在轨道微量滴定板振荡器上孵育2小时,该振荡器设定为以中等速度旋转,约400至500rpm。
7.从板上移出板封并倾析试剂。像以前一样轻拍以清除孔中的剩余体积。用稀释的洗涤缓冲液洗涤孔3次,每次洗涤300μL/孔。每次洗涤后倾析并轻拍以除去残留的缓冲液。(如果使用自动洗板机,建议在每次洗涤之间添加搅动/浸泡步骤。)
8.每孔加入100μL检测抗体。用板封再次盖住板并在轨道微量滴定板振荡器上在室温下孵育1小时,该振荡器以中等速度旋转,大约400-500rpm。
9.从板上移出板封并倾析试剂。像以前一样轻拍以清除孔中的剩余体积。用稀释的洗涤缓冲液洗涤孔3次,每次洗涤300μL/孔。每次洗涤后倾析并轻拍以除去残留的缓冲液。
10.每孔加入100μL酶溶液。用板封盖住板并在微量滴定板振荡器上在室温下适度摇动孵育30分钟。
11.移去板封,从板轻轻倒出试剂并轻拍板以移除残余体积。用稀释的洗涤缓冲液洗涤孔4次,每次洗涤300μL/孔。每次洗涤后倾析并轻拍以除去残留的缓冲液。
12.向每个孔中加入100μL底物溶液,用板封盖住板并在平板振荡器上摇动约5-20分钟。人G3BP标准品的孔中应形成蓝色,其强度与人G3BP浓度的增高成比例。
注意:根据区域室温,显色可能比建议的孵育时间更快或更慢。请视觉监控显色,以优化孵育时间。
13.取下板封,加入100μL终止溶液,用手轻轻摇动,确保所有孔中的溶液完全混合。酸化后蓝色应变为黄色。在读板仪上读数之前,擦拭微量滴定板的底部以去除任何残留物。在5分钟内在读板仪中读取450nm(信号)和590nm(背景)的吸光度,并确保任何孔中没有气泡。记录吸光度单位的差异。最高人G3BP标准品的吸光度应约为2.5-3.5,或不超过所用读板仪的能力。
注意:如果尿液样品以1:10稀释,最终结果,样品中的G3BP ng/mL浓度应乘以稀释倍数10。
表8:人uG3BP ELISA试剂盒的测定程序
表9微量滴定板排布(人uG3BP ELISA)
典型参考曲线的表9图表
测定特点
A.灵敏度
人G3BP的最小可检测浓度(MinDC)为0.08ng/mL。采用分析器5.1计算。如果在相同条件下为测定运行无限数量的标准浓度,则其通过数学确定什么是经验MinDC,来测量测定的真实检测限。该报告值是多次测定的MinDC的平均值加2个标准偏差(n=8)。
B.特异度
该测定中所用的抗体对对于人G3BP具有特异性。
C.精度
测定内变异
平均水平(ng/mL) | 测定内%CV | |
1 | 219 | 5.9 |
2 | 636 | 5.6 |
测定间变异
平均水平(ng/mL) | 测定间%CV | |
1 | 380 | 8.3 |
2 | 607 | 8.1 |
在uG3BP标准曲线上的两个水平的尿液样品上研究了该uG3BP ELISA试剂盒的测定变异。从所示样品的八次测定的结果计算平均测定内变异。每个样品的平均测定间变异由8个单独测定的结果计算,每个测定中具有重复样品。(在测定之前,用测定缓冲液稀释尿液样品。)
D.在测定样品中加标回收G3BP
8个尿样中人G3BP的平均回收率为103%。将三种浓度的人G3BP加入到个体尿液样品中(n=8),并通过人uG3BP ELISA测定每种样品的所得G3BP含量。回收率=[(观察到的G3BP/(加标的G3BP浓度+基础G3BP)]×100%。(测定前,尿液样品用测定缓冲液稀释。)
E.样品稀释的线性
8个尿样中预期线性的平均%为96%。对于测定所得的稀释因子1、2、4和8分别加入所需量的测定缓冲液。%预期=(观察值/预期值)x 100%。(测定前,尿液样品用测定缓冲液稀释。)
实验实施例
以下实施例仅用于说明,不应解释为限制要求保护的发明的范围。
实施例1:来自LN患者的PBMC中LGALS3BP表达增加并且与其干扰素状态相关
为了找到LN患者中疾病活动的预测标志物,评估从LN患者分离的PBMC的mRNA谱,并将这些谱与健康对照(HC)的谱图进行比较。通过Ficoll梯度从HC(n=4)和LN供者(n=9)的全血分离PBMC。通过RNA-seq进行基因表达谱分析。显示FPKM值。根据四种IFN诱导型基因IFI44L、RSAD2、MX1和OAS2(Hagberg N和L,Scand J Immunol.2015年9月;82(3):199-20)的中位数平均z分数,将LN患者分为低干扰素(IFN)或高IFN组。相对于LN(低IFN)组(p=0.044)和HC组(p=0.028),LN(高IFN)组的LGALS3BP mRNA水平显著升高。从上述概况中发现,LGALS3BP mRNA表达是最好的基因之一,其水平可用于区分LN和HC PBMC(图1)。还观察到LN患者中LGALS3BP水平存在显著差异。LN患者通常根据其干扰素诱导型基因水平测量的I型干扰素水平进行分组(Scand J Immunol.2015年9月;82(3):199-20)。随后的评估确定LN样品之间的干扰素水平是否可以解释观察到的LGALS3BP大变异性。在狼疮性肾炎患者中,发现I型干扰素诱导型基因中的双峰分布表明一些患者具有高干扰素特征,而其他患者具有低干扰素特征。为了进一步将狼疮性肾炎患者分为两组,通过在所有样本中取四个基因的平均z分数,组合四种已知干扰素诱导型基因IFI44L、RSAD2、OAS2和MX1的表达水平。将干扰素特征分数等于或低于中值水平的样品分配至低干扰素组。干扰素评分高于中位数的那些样品被分配到高干扰素组。在将供者分入这两组后,发现与健康对照相比,低干扰素组LGALS3BP水平高5倍,高健康对照组高30倍(p=0.028;图1)。并且,与低干扰素组相比,高干扰素组中LGALS3BP水平高6倍(p=0.044)。这些数据表明LG患者中LGALS3BP表达增加,并且LGALS3BP表达可能受I型干扰素调节。
实施例2:可通过IFNα和其他炎性刺激物诱导LGALS3BP表达
LGALS3BP具有与I型干扰素调节一致的IRF7结合位点。为了发现哪个途径可诱导LGALS3BP表达,令原代人单核细胞在体外分化为巨噬细胞,随后用IFNα、IFNγ、TLR4激动剂(LPS)、TLR7/8激动剂(瑞喹莫德)和TLR9激动剂(CpG)刺激。IFNα、IFNγ和LPS诱导LGALS3BPmRNA表达(图2a)和蛋白质分泌增加(图2b)。所有刺激均诱导IL-6分泌。这些数据表明,不仅I型干扰素可以驱动LGALS3BP表达,IFNγ和其他先天性触发因子也可以。
基于组蛋白乙酰化位点的位置,LGALS3BP表达可能受结合LGALS3BP基因中四个不同区域的因子调节:在启动子起始位点处,上游增强子(上游5K区域)中,内含子位点中或3'UTR中。通过三种不同方法的基序扫描鉴定了免疫相关的转录调节因子。在LGALS3BP基因座中及其周围发现了IRF、AP-1和STAT以及其他重要因子如NF-κB。转录因子结合的预测表明LGALS3BP表达通过干扰素调节因子(IRF)受到干扰素的调节,并受到激活STAT、NF-κB和AP-1的其他免疫刺激物的调节。
实施例3:LGALS3BP蛋白在LN患者尿液中增加而在血浆中没有增加
为了确定PBMC中增加的mRNA水平是否导致患者血液中LGALS3BP蛋白水平增加,通过ELISA测量来自LN患者、SLE患者和健康对照(HC)供者的血浆中的LGALS3BP。尽管PBMC中的mRNA上调,但在这三组之间未发现血浆LGALS3BP水平的显著差异(图3)。已经证明PBMC仅贡献少量的总血浆LGALS3BP。尽管如此,与SLE患者和健康对照相比,LN患者尿液中的LGALS3BP水平显著升高。
实施例4:LN患者肾脏中LGALS3BP表达升高
LN的特征在于肾脏炎症。目前用于监测疾病活动的测试测量血液和尿液中的肾功能,但不测量病因性炎症。LGALS3BP由炎性刺激物诱导,其在尿液中的升高可以反映肾脏炎症。为了确定增加的尿LGALS3BP是否与尿蛋白测量值相关以监测狼疮性肾炎中的炎症,检查肾活检物中的LGALS3BP的mRNA表达谱。使用包含从欧洲肾脏cDNA库收集的总共46个肾活检样品(n=14HC和32LN)的GEO数据集(GSE32592)。通过显微切割分离肾小球和肾小管间质,并使用Affymetrix GeneChip阵列进行表达谱分析。在最初的质量对照评估和标准化后,发现LN患者与健康对照组相比,LGALS3BP的表达水平在肾小球(1.5倍,p=9.2e-12)和肾小管间质(2.2倍,p=1.5e-4)中均显著升高(图4a)。然后评价已被提出作为潜在的尿生物标志物的两种其他基因CCL2(MCP-1)和TNFSF12(TWEAK)的表达谱(Schwartz等,Ann N YAcad Sci.2007年8月;1109:265-74)。在该数据集中,发现CCL2(MCP-1)(图4b)表达水平在LN和HC样本之间在肾小球(1.3倍,p=0.392)和肾小管间质(0.7倍,p=0.33)中是相等的。TNFSF12的表达水平(图4C)在LN样品的肾小球中显著更高(1.2倍,p=9.1e-5),但在LN样品的肾小管间质中显著更低(0.85倍,p=0.017)。这些数据表明LGALS3BP可能是比CCL2(MCP-1)和TNFSF12更合适的尿预测标志物,以区分HC和LN样品。
还评估了全局差异表达以阐明在LN患者中显著调节的所有基因。使用R limma包,构建模型以执行差异表达计算,同时控制组织差异。这允许将来自肾小球和肾小管间质的数据一起使用。在分析中包括的12030个总基因中,只有166个基因具有小于0.01的p值和至少2的倍数变化。在LN中显著上调的基因编号为137,而在LN中29个基因被下调。在该分析中,LGALS3BP的p值为2.11e-8,并且在具有最低p值的基因的前3%中。这些数据证实LGALS3BP是在LN肾活检物的肾小球和肾小管间质中显著上调的少数基因之一,因此是良好的预测标志物。
用抗LGALS3BP抗体对LN肾活检物的染色显示,某些区域的水平和点状图案增加,特别是在患有或不患有肾小管间质性肾炎的患者的小管周围(图4d)。健康对照样品中的LGALS3BP信号强度较低,更为扩散,主要归因于二抗(FITC抗兔)的背景染色。来自糖尿病(DM)和IgA肾病(IgAN)患者的样品显示出一些但弱于LN的LGALS3BP染色。
实施例5:LGALS3BP表达仅于检测到肾损伤的情况下在LN的小鼠模型中增加
为了进一步研究增加的LGALS3BP肾表达是否由局部炎症诱导,测量其在BXSB-Yaa狼疮小鼠中的表达。这些小鼠自发地发展出SLE和LN样炎症的全身症状以及肾脏的损伤。该模型基于Yaa基因座的重复,其包含TLR7基因并导致TLR7表达增加和I型干扰素炎症。只有在通过组织学评价肾小球新月体、蛋白质管型、间质性炎症和血管炎检测到肾脏损伤和炎症时,才发现小鼠LGALS3BP的鼠类同源物水平升高(图5)。这些结果进一步表明LGALS3BP在肾脏的炎症进程中局部表达。
实施例6:LG患者尿中LGALS3BP蛋白升高
设计以下实验以确定患者肾脏中LGALS3BP表达的增加是否转化为尿蛋白水平的可测量差异,这可以区分LN患者、SLE患者和健康对照供者。通过ELISA在来自LN患者,SLE患者和健康对照的尿液中测量LGALS3BP蛋白。在将数据针对尿肌酸酐水平进行标准化后,发现LN患者中的LNALS3BP(图3A)显著高于SLE(6.8倍,p<0.001)和HC供者(17.7倍,p<0.001)。在SLE患者和HC供者中也存在更高水平的LGALS3BP的趋势,但是这种趋势没有统计学意义(2.6倍,p=0.59)。
接下来考虑如何将LGALS3BP的尿蛋白水平与其他常见的尿液分析读数(例如总蛋白水平或白蛋白水平)进行比较。在将所有值标准化为尿肌酸酐水平后,发现总蛋白水平或白蛋白水平也能够区分LN患者与SLE和HC供者。LN患者的总蛋白水平(图6B)和白蛋白(图6C)水平均显著高于SLE或HC供者(两者p<0.001)。
为了将这些数据应用于诊断测试的构建,需要定义与肾脏炎症相关的值。为了得到这些值,将健康对照样品的最大值设定为截止值,意味着任何具有高于最大健康对照样品的样品可能具有肾脏炎症。其基本原理是基于健康对照供者不应该有任何炎症的假设,因此,健康对照中发现的值应该代表正常范围。对于LGALS3BP/肌酸酐比率、蛋白质/肌酸酐比率和白蛋白/肌酸酐比率,截止值分别为3.133、0.166和0.457。使用这些值,发现对于LGALS3BP,50个LN和12个SLE样品高于截止值(图6A)。对于总蛋白,53个LN和18个SLE样品高于截止值(图6B)。对于白蛋白,56个LN和9个SLE样品高于截止值(图6C)。这些数据表明LGALS3BP在鉴定可能具有肾脏中炎症的样品方面更为保守。对于LGALS3BP水平高于截止值的SLE样本,这些可能是患有狼疮性肾炎风险最高的患者或未确诊LN的SLE患者。
实施例7:LGALS3BP尿液水平不是肾功能和过滤能力的反映
为了验证LGALS3BP作为LN的预测标志物,我们进一步就总蛋白质或白蛋白水平考察了测得LGALS3BP。为了确定这一点,在对尿肌酸酐水平进行标准化后,评估皮尔森相关系数,将这三个测量值相互比较。通过该经验研究,发现总蛋白和白蛋白水平之间有非常强的相关性(R=0.95;图7A)。我们还发现LGALS3BP与总蛋白(R=0.513;图7B)和LGALS3BP与白蛋白水平(R=0.507;图7C)之间存在正相关。基于这些相关系数,这些数据表明,与测量的总蛋白质或白蛋白相比,测量的LGALS3BP提供差异读出。更具体地,在具有高水平LGALS3BP和低水平总蛋白的患者样品中,该表达谱与肾脏中具有高水平炎症但肾脏损伤水平相对较低的患者一致;与早期LN的LN病理生理学一致。在呈现低水平LGALS3BP和高总蛋白水平的患者样品中,表达谱与肾脏炎症水平低但肾脏损伤程度高的患者一致;与具有肾衰竭风险的五类晚期肾病的LN病理生理学一致。这些数据表明,与测量尿液中的总蛋白或白蛋白水平相比,测量尿液LGALS3BP提供了关于LN的严重性和进展的不同且更细致的诊断信息。
实施例8:尿液LGALS3BP水平随时间波动
与SLE和HC供者相比,LN患者具有更高水平的总蛋白、白蛋白和LGALS3BP。在大多数样品供者中,这些值随着时间的推移保持得相当稳定,特别是在HC和SLE组中。然而,在一些LN患者中,在总蛋白(图5A)和白蛋白(图5B)和LGALS3BP(图5C)中观察到尖峰。这些指标不仅用于其自身中(即,监测LN患者的肾脏炎症),而且还可用于评估LN患者中某些免疫抑制治疗的有效性。
出于所有目的,在美利坚合众国,本文引用的每个出版物和专利文献出于所有目的通过引用并入,如同每个这样的出版物或文献被具体和单独地指出通过引用并入本文。
虽然已经参考具体实施例描述了本发明,但是可以进行改变并且可以替换等同形式以适应特定的上下文或预期用途,从而在不脱离所附权利要求的范围的情况下实现本发明的益处。
实施例9:不同肾病组中的尿LGALS3BP/肌酸酐比率
如图25所示,当活性(复发)时,尿中LGALS3BP的水平优先在LN中增加。这显示了尿液LGALS3BP表达中的疾病特异性模式,并且这一趋势主要由LN背景下的活性炎症驱动。糖尿病肾病(DM)、IgAN和ANCA显示低尿LGALS3BP水平。考虑到ANCA、DM的特征是慢性低度炎症,数据显示尿LGALS3BP水平是疾病特异性的并且不由非LN特异性肾炎症状态增加。
活性LN与缓解型LN显示出显著差异。鉴于本申请中描述的尿液LGALS3BP测定法的优点,这是显著的:以区分活性疾病与慢性疾病。如图26A和26B所示,将尿LGALS3BP数据对肌酸酐浓度进行标准化,自然对数转换且排除异常值,用于数据分析。此外,使用JMP prov12,包括方差分析和Wilcoxon非参数多重比较,显示平均LGALS3BP/肌酸酐比率和标准误差平均值。虚线表示健康对照的平均值+2个标准差(132.95)。
实施例10:尿LGALS3BP/肌酸酐和尿蛋白/肌酸酐比率在LN中不相关
图27A、27B和27C所示,比较患者尿液样品的LGALS3BP/肌酸酐和尿总蛋白/肌酸酐(UPCR)水平。这些数据表明LGALS3BP/肌酸酐报告活性LN肾病中的其它情况(即炎症)而非UPCR(即损伤)。LN中LGALS3BP/Cr升高而UPCR不高的事实表明该指标报告了活性炎症。对于缓解中具有升高的UPCR但LGALS3BP/Cr低的更多样品,情况也是如此,表明炎症已经消退,但肾脏损害仍然存在。尽管如此,缓解状态但仍然存在LGALS3BP/Cr升高但UPCR低的患者存在LN突发的风险。在上述图中,R2是皮尔森相关系数。
实施例11:LN患者中尿LGAL3BP/肌酸酐水平的波动
如图29所示,LN患者中尿LGALS3BP/肌酸酐水平随时间波动。更具体地,每月监测LN患者尿液。这些数据表明,尿液LGALS3BP水平随时间变化与炎症的早期指标相关。
应理解,根据本发明的教导,本领域普通技术人员可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下对其进行某些改变和修改。
Claims (8)
1.一种利用获自哺乳动物对象的样品产生在诊断和非侵入性监测肾病理中起决定作用的数据的方法,包括:
(i)获得与所述样品相关的数据集,其中该数据集包含选自下组的至少两种标志物的蛋白质表达水平:尿LGALS3BP、尿肌酸酐和蛋白尿,其表示为尿蛋白:肌酸比率(uPCR);和
(ii)将该数据集输入分析过程中,该过程使用该数据来生成用于诊断和监测肾病理的结果。
2.如权利要求2所述的方法,其中,所述肾病理包含以下一种或多种:肾小球疾病;系统性红斑狼疮(SLE)疾病;狼疮性肾炎(LN)中的间质性炎症;狼疮性肾炎(LN)中的间质纤维化;肾间质炎症(INF);新月体性肾小球肾炎;膜性肾小球病和肾小球基底膜异常。
3.一种用于预测和/或诊断对象中狼疮性肾炎的体外方法,所述对象受系统性红斑狼疮影响或潜在地受系统性红斑狼疮影响,所述方法包括如下步骤:a)提供来自所述对象的尿样;b)检测所述尿中LGALS3BP、肌酸酐和总蛋白的水平;c)将步骤b)中测得的LGALS3BP和肌酸酐(c)的所测水平表示为比率LGALS3BP/c;和d)将所述LGALS3BP/c之比之相对于所述总蛋白与对照值做比较,其中,LGALS3BP/c比之总蛋白相对于所述对照值的增加指示狼疮性肾炎的发展。
4.如权利要求3所述的方法,其中,所述LGALS3BP和肌酸酐水平的检测通过ELISA或Western印迹进行。
5.一种用于监测患者中狼疮性肾炎进展的体外方法,所述患者受系统性红斑狼疮影响,所述方法包括如下步骤:a)提供来自所述对象的尿样;b)检测所述尿中半乳凝素3结合蛋白、肌酸酐和总蛋白的水平;c)将步骤b)中测得的LGALS3BP和肌酸酐(c)所测水平表示为如下比率:所述对象的至少第一和至少第二尿样中的LGALS3BP/c之相对于所述总蛋白,其中,所述至少第一和第二尿样在不同时间获得;和d)比较所述第一和第二尿样中所得的测得LGALS3BP/c之比之相对于所述总蛋白浓度。
6.如权利要求5所述的方法,其中,所述至少第一和第二样品分别在开始治疗之前以及所述治疗过程中和/或所述治疗之后获得。
7.如权利要求6所述的方法,其中,所述治疗包括采用类固醇药物、免疫抑制剂、利妥昔单抗,或血管紧张素转化酶抑制剂的治疗。
8.一种用于诊断对象中系统性红斑狼疮和狼疮性肾炎并将它们与其它风湿性疾病和原发性肾小球肾炎区分开的体外方法,所述方法包括:a)提供来自所述对象的尿样;b)检测所述尿中的LGALS3BP、肌酸酐和总蛋白水平;c)将步骤b)中测得的LGALS3BP和肌酸酐(c)所测水平表示为LGALS3BP/c之比,和d)将所述LGALS3BP/c之比之相对于所述总蛋白与所述对照值做比较,其中,LGALS3BP/c比之总蛋白相对于所述对照值的增加指示狼疮性肾炎的发展。
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