CN103221823A - 高度灵敏的单克隆抗体残留物检测测定法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于在监测产物遗留时检测生物技术产物残留物和/或用于在生物技术产物的制造中清洁验证的组合物和高度灵敏的方法。具体而言，本发明涉及免疫测定法，其中一种或多种捕获抗体或其抗原结合片段用于检测与生物技术产物生产相关的残留物。

Description

高度灵敏的单克隆抗体残留物检测测定法
交叉引用相关优先权
本申请要求2010年9月13日提交的美国临时申请系列号61/382,413的优先权利益，其在此处完整地通过引用并入本文。
1. 介绍
本发明涉及用于在监测产物遗留时检测生物技术产物残留物和/或用于在生物技术产物的生产中清洁验证的组合物和高度灵敏的方法。具体而言，本发明涉及免疫测定法，其中一种或多种捕获抗体或其抗原结合片段用于检测与生物技术产物生产相关的残留物。
2. 发明背景
工艺设备清洁验证对于良好制造程序(Good Manufacturing Procedure , “GMP”)合规性是需要的，并且这样的合规性意在确保治疗性产物符合它们意在具有或代表具有的质量和纯度特征。作为GMP合规性的部分，总有机碳(“TOC”)测定已经常规地用于验证清洁程序对于去除生物技术产物残留物的效率。在个别生产运行之间以及当不同产物之间切换生产场所时可以采用TOC测定。然而，TOC测定的重要限制在于，检测限值< 0.1 ppm对于非常低剂量产物如某些抗体治疗剂(其最大允许的遗留限值低于TOC检测限值)监测产物遗留和/或清洁验证可能是不适合的。
除关于符合非常低剂量产物的问题以外，美国食品和药物管理局在2001年采用的关于人用药品注册的技术要求的协调的国际会议(International Conference On Harmonization Of Technical Requirements For Registration Of Pharmaceuticals For Human Use, “ICH”)文件ICH Q7A以及加拿大卫生部指南-0028，都推荐开发用于监测产物遗留和/或清洁验证的活性药物成分(“API”)特异性测定。因为TOC测定不是API特异性的，而是无论来源地测量总有机碳，所以它不符合这些推荐。
鉴于对于TOC测定的固有限制，更灵敏且API特异性的测定作为当监测产物遗留和/或用于清洁验证时检测生物技术产物残留物的可替代或补充的方法将是期望的。本发明通过引入用于检测痕量的核酸或蛋白残留物包括单克隆抗体残留物的一般分析测定(其可以用于监测产物遗留和/或用于清洁验证)来满足该需要。
3. 发明概述
在某些实施方案中，本发明涉及用于检测生物技术产物残留物的方法，其中将测试样品与包含捕获抗体或其抗原结合片段的基质接触，并且抗体 - 抗原复合物的检测指示存在生物技术产物残留物。
在某些实施方案中，本发明涉及用于检测生物技术产物残留物的方法，其中将测试样品与包含捕获抗体或其抗原结合片段的基质接触，并且抗体 - 抗原复合物的检测指示存在生物技术产物残留物，其中通过监测能够结合抗体 - 抗原复合物的标记的检测抗体的结合来实​​现抗体 - 抗原复合物的检测。
在某些实施方案中，本发明涉及用于检测生物技术产物残留物的方法，其中将测试样品与包含捕获抗体或其抗原结合片段的基质接触，并且抗体 - 抗原复合物的检测指示存在生物技术产物残留物，其中生物技术产物残留物的存在指示产物遗留。
在某些实施方案中，本发明涉及用于检测生物技术产物残留物的方法，其中将测试样品与包含捕获抗体或其抗原结合片段的基质接触，并且抗体 - 抗原复合物的检测指示存在生物技术产物残留物，其中生物技术产物残留物的存在指示清洁过程不足。
在某些实施方案中，本发明涉及用于检测生物技术产物残留物的方法，其中将测试样品与包含捕获抗体或其抗原结合片段的基质接触，并且抗体 - 抗原复合物的检测指示存在生物技术产物残留物，其中所述抗原源自核酸产物。
在某些实施方案中，本发明涉及用于检测生物技术产物残留物的方法，其中将测试样品与包含捕获抗体或其抗原结合片段的基质接触，并且抗体 - 抗原复合物的检测指示存在生物技术产物残留物，其中所述抗原源自酶；肽激素；多克隆抗体；人单克隆抗体；人源化单克隆抗体；嵌合单克隆抗体；单链抗体；Fab抗体片段；F(ab')2抗体片段；Fd抗体片段；Fv抗体片段；分离的CDR；双抗体；和免疫粘附分子。
在某些实施方案中，本发明涉及用于检测生物技术产物残留物的方法，其中将测试样品与包含捕获抗体或其抗原结合片段的基质接触，并且抗体 - 抗原复合物的检测指示存在生物技术产物残留物，其中所述抗原源自抗体产物。
在某些实施方案中，本发明涉及用于检测生物技术产物残留物的方法，其中将测试样品与包含捕获抗体或其抗原结合片段的基质接触，并且抗体 - 抗原复合物的检测指示存在生物技术产物残留物，其中所述捕获抗体或其抗原结合片段选自：抗人IgG(H + L)、抗人IgG F(ab')2、抗人IgG κ、抗人IgGλ、抗小鼠IgG(H + L)抗体及其组合。
在某些实施方案中，本发明涉及用于检测生物残留物的方法，其中将测试样品与包含两种或更多种具有不同结合特异性的捕获抗体或其抗原结合片段的基质接触，并且其中抗体 - 抗原复合物的检测指示存在所述基质包含的生物技术产物残留物。在某些实施方案中，具有不同特异性的捕获抗体将以特定比例存在于基质上。
4. 附图简述
图1描述实验结果，在该实验中，使用SDS-PAGE和Western印迹测试选择的检测抗体(HRP缀合物)对于两种产物的识别：Ab #1，本研究中的主要目标，和Ab #2，作为暴露于清洁剂后测试识别的模型。将Ab #1和Ab #2与CIP-100 (2.5%)和CIP-200 (2.5%)在75°C孵育30分钟以模拟严谨的设施清洁条件。孵育后，中和测试样品。将完整分子和中和的处理样品上样至SDS-PAGE上，并且针对抗人IgG (H+L)进行印迹。该图特别描述了完整的(*)、CIP-100处理的(1)或CIP-200处理的(2) Ab #2和Ab #1的抗人IgG (H+L)的SDS-PAGE和Western印迹。
图2描述了下列的SDS-PAGE分离：SeeBlue Plus2 STD (第1道)；Ab #1 (第3道)；Ab #2 (第4道)；Ab #11 (第5道)；Ab #3 (第6道)；Ab #13 (第7道)；Ab #9 (第8道)；和SeeBlue Plus2 STD (第10道)。第3和9道是空白。
图3描述了使用抗人IgG (H+L)抗体如图2中所概述进行的SDS-PAGE分离的Western印迹分析。
图4描述了使用抗人IgG F(ab')2抗体如图2中所概述进行的SDS-PAGE分离的Western印迹分析。
图5描述了使用抗人IgG λ抗体如图2中所概述进行的SDS-PAGE分离的Western印迹分析。
图6描述了使用抗人IgG κ抗体如图2中所概述进行的SDS-PAGE分离的Western印迹分析。
图7描述了使用抗小鼠IgG (H+L)抗体如图2中所概述进行的SDS-PAGE分离的Western印迹分析。
图8描述了基于Ab #1、Ab #2和Ab #1用于检测的灵敏度和适用性的组合，基于组合的Ab(如下文表5中所概述的)参考标准曲线。所有曲线用二次拟合具有0.9999的相关系数，并且每种曲线范围为0.25至8 ng/mL。
图9描述了涉及建立本文所用的分析方法的线性的实验。分析方法的“线性”是其引发或直接或通过良好定义的数学转换与目的分析物的浓度成比例的测试结果的能力。从Ab #1药物物质制备0.25至8 ng/mL范围的标准品。将标准品和缓冲液空白上样至板上并且测试。图显示于图9中：Ab #1标准曲线(板1，顶部；板#2，中部，和板#3，底部)。二次拟合的相关系数大于0.999。结果表明，标准品的吸光度响应与通过二次拟合的蛋白浓度成比例。
图10描述了涉及建立本文所用的分析方法的范围的实验。分析方法的“范围”是分析物上部和下部水平之间的间隔，其可以用所述方法以合适的精度、准确度和线性水平来确定。基于线性、准确度、精度和定量限值，该测定的范围被确定为0.25至8 ng/mL。二次拟合的相关系数值大于0.999。这表明，在0.25至8 ng/mL的范围内，吸光度响应与通过二次拟合的蛋白浓度成比例。在两种不同的进程中样品中以1.0、2.0和4.0 ng/mL水平的标准品进行掺料回收研究。回收率为100 ± 7.9%。这表明，在估计的范围内，该方法是精确和准确的。结果总结于表17中，并且来自第一和第二批次的参考标准曲线显示于图10中：使用第一(顶部)和第二(底部)批次Ab的Ab #1标准曲线。
5. 发明详述
本发明涉及用于在监测产物遗留时检测生物技术产物残留物和/或用于在这样的生物技术产物的生产中清洁验证的组合物和高度灵敏的方法。具体而言，本发明涉及免疫测定法，其中一种或多种捕获抗体或其抗原结合片段用于检测与生物技术产物生产相关的残留物。
5.1 遗留监测和清洁验证
通过本发明的组合物和方法的遗留监测和清洁验证可以针对其中材料的污染或遗留对API质量构成最大风险的状况和工艺步骤。然而，本发明的组合物和方法同样适用于对API质量构成最小或没有直接风险、但其中另外需要使用本发明的组合物和方法的状况和工艺步骤。影响这样的实施的需要性的因素包括但不限于：雇员健康和安全、工艺设备维护、对于有效工艺开发优化的需要，以及关于在生产生物技术产物中采用的设施和/或工艺设备的环境条件。
在某些实施方案中，使用本发明的组合物和方法监测遗留和/或验证清洁程序被设计为反映实际设备使用模式。例如，但不是通过限制的方式，在其中使用相同设备生产多于一种API并且通过相同工艺清洁设备的情况下，可以选择代表性API用于通过本发明的组合物和方法来验证。在可替代的实施方案中，可以选择使用相同设备制造的API中的一种或多种的组合，或所有，用于通过本发明的组合物和方法来验证。在某些实施方案中，选择API或API的组合基于各种因素，如但不限于，API的溶解度和清洁难度。此外，在某些实施方案中，残留物限值的计算将基于各种因素，如但不限于，API的效价、毒性和稳定性。
在某些实施方案中，本发明的方法涉及在特定工艺步骤取样以监测遗留或验证清洁程序。在某些实施方案中，取样包括但不限于，擦拭、冲洗和本领域技术人员已知的获得测试材料的任何可替代方法(例如，直接提取)。在某些实施方案中，进行取样以检测不溶性残留物。在可替代的实施方案中，进行取样以检测可溶性残留物。在某些实施方案中，进行取样以检测不溶性和可溶性残留物。
在某些实施方案中，在初始验证后的特定间隔监测清洁程序以确保该程序在常规生产期间使用时仍然有效。在某些实施方案中，间隔将是在每次生产运行之后。然而，可替代的间隔是本领域已知的，例如，但不限于，特定次生产运行之后，替换特定工艺设备如过滤器或通风孔之后，或引入特定生产组分如培养基之后。
5.2 生物技术产物残留物检测测定
本发明涉及生物技术产物残留物检测测定，其包含一种或多种能够结合一种或多种目的产物残留物的捕获抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，在免疫测定的情况下采用捕获抗体或其抗原结合片段。这样的免疫测定包括但不限于，夹心ELISA、抑制ELISA、放射免疫测定、荧光免疫测定和化学发光免疫测定。在本发明的特定实施方案中，使用夹心ELISA。
在本发明的某些实施方案中，采用夹心ELISA以测定样品的一种或多种生物技术产物残留物。一般来说，在夹心ELISA中，首先制备表面，使得可以结合一定量的捕获抗体。然后封闭制备的表面上的任何非特异性结合位点。可以通过本领域一般已知的方法完成这样的封闭，包括但不限于，将表面暴露于封闭蛋白，如但不限于牛血清白蛋白。封闭非特异性结合位点后，将表面与测试样品接触。将表面与测试样品孵育以允许产物残留物和捕获抗体之间的结合，如果存在任何产物残留物。一旦完成孵育期，洗涤该表面以除去未结合的分子。在某些实施方案中，然后加入能够结合产物残留物的第二种未标记抗体。在这样的实施方案中，加入对第二种抗体的恒定区特异性的第三种酶联的或以其他方式标记的抗体。然后洗涤表面，使得未结合的抗体-标记缀合物被洗掉。然后加入化学剂以从标记引发可以测量的信号，例如，颜色或电化学信号。测量该信号作为目标片段的存在和量的指示。在可替代的实施方案中，第二种抗体本身是标记的或连接至酶，从而忽略对第三种抗体的需要。
在某些实施方案中，用作进行免疫测定的表面的固相可以是任何基本上水不溶性的惰性支持物或载体，包括表面、颗粒、多孔基质等形式的支持物/载体。示例性支持物/载体包括由聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯等制造的小薄片、SephadexTM、聚氯乙烯、塑料珠粒和测定板或测试管，包括96-孔微量滴定板，以及颗粒材料如滤纸、琼脂糖、交联葡聚糖和其他多糖。可替代地，反应性水不溶性基质如溴化氰活化的碳水化合物和反应性基质可以适当地用于捕获试剂固定化。
在特定实施方案中，将固定的捕获抗体包被在微量滴定板上。例如，不是通过限制的方式，固相可以是多孔微量滴定板，其可用于一次分析多份样品。微量滴定板的实例包括96孔Elisa板，如MaxisorbTM或ImmulonTM (Nunc, Roskilde, Denmark)。此外，多重ELISA技术，如LuminexTM技术可用于同时运行几百个ELISA(Millipore)。这样的多重ELISA测定技术是本领域众所周知的，除了LuminexTM技术外，包括多种涉及使用多种捕获和/或检测抗体用于同时询问多种分析物的技术。这样的多重测定中的各种检测抗体间的区别涉及使用多种不同的标记。可替代的多重测定技术包括LiquiChipTM系统(Qiagen)和BDTM Cytometric Bead Array (BD Bioscience)。
本发明包括所有表现出本文描述的所需特征的捕获抗体。例如，但不是通过限制的方式，具有本文例举的反应性模式的抗体在本发明的范围内，无论它们属于的免疫球蛋白种类或亚类。在特定的实施方案中，合适的单克隆抗体可以是IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3种类或IgM、IgA种类，或任何其他已知的Ig种类或亚类。
通过本领域技术人员可获得的任何方法将本发明的选择的捕获抗体或其抗原结合片段固定在合适的基质上。在某些实施方案中，将抗体或抗原结合片段直接连接至基质上选择的官能团。可替代地，通过接头或间隔子将抗体或抗原结合片段间接连接至基质。在某些非限制性实施方案中，可以通过将捕获抗体或其抗原结合片段共价连接至链霉亲和素(或生物素)，然后通过共价连接至基质的生物素(或链霉亲和素)间接进行与基质的连接。可替代地，硫醇-末端硅烷可用于包被基质表面且异双功能交联剂，例如，N-γ-马来酰亚胺丁酰基氧基琥珀酰亚胺酯(GMBS)可用于抗体或抗原结合片段结合。参见美国专利号5,077,210。使用该方法，可以以高密度(例如2 ng/mm2)固定抗体或其抗原结合片段。
另一种类型的表面固定技术使用聚合物水凝胶基质。这些材料通常含有大量的水，是软的，并且是生物惰性的。实例包括聚(乙烯醇)的交联聚合物膜和羧甲基葡聚糖的膜。参见Kobayashi, J.和Y. Ikada, “Covalent Immobilization of Proteins Onto the Surface of Poly(vinyl alcohol) Hydrogel,” Biomaterials, 12, (1991), 第747-751页; Johnsson, B.等人, “Immobilization of Proteins to a Carboxymethyldextran-Modified Gold Surface for Biospecific Interaction Analysis in Surface Plasmon Resonance Sensors,” Anal. Biochem., 196, (1991), 268-277; Lofas, S.和B. Johnsson, “A Novel Hydrogel Matrix on Gold Surfaces in Surface Plasmon Resonance Sensors for Fast and Efficient Covalent Immobilization of Ligands,” J. Chem. Soc. Commun., (1990), 第1526-1528页)。
本发明的捕获抗体包括但不限于下列：α Hu IgG (H+L); α Hu IgG F(ab')2; α Hu IgG λ; α Hu IgG κ;和α Ms IgG (H+L)。
此外，可以使用传统单克隆抗体的替代物实现捕获抗体或其抗原结合片段提供的功能，例如，特定生物技术产物残留物与基质表面的结合。传统单克隆抗体的替代物包括抗体模拟物，如但不限于，亲和抗体(affibodies)、结构域抗体、纳米抗体和单抗体。
在某些实施方案中，多个具有不同结合特异性的捕获抗体或其抗原结合片段结合至基质表面。包括多种捕获抗体或其抗原结合片段允许同时检测多种生物技术产物残留物。这样的生物技术产物残留物可以源自相同或不同的产物。例如，但不是通过限制的方式，单一单克隆抗体产物的生产可以导致各种产物残留物，包括但不限于，重链残留物、轻链残留物、可变区残留物和恒定区残留物。在某些实施方案中，各种捕获抗体或其抗原结合片段将以特定比例存在。这样的捕获抗体的混合物的一个非限制性实例概述在下面表5中，其中下述抗体：α Hu IgG (H+L); α Hu IgG F(ab')2; α Hu IgG λ; α Hu κ;和α Ms IgG (H+L)以下述比例存在：1:2:16:8:8。
将选择的捕获抗体或其抗原结合片段固定化至合适的基质上并将该捕获抗体或其抗原结合片段暴露于样品用于监测遗留和/或用于清洁验证之后，有必要将生物技术产物残留物的结合可视化。通常通过加入特异性结合生物技术产物残留物上的表位的检测抗体完成这样的可视化。
可以直接通过一些部分如荧光染料、化学发光和放射性标记，或间接通过一些必须被反应或衍生化的部分如酶来检测检测抗体。可以被直接检测的部分的实例包括放射性同位素、荧光团如稀土螯合物或荧光素及其衍生物；若丹明及其衍生物。必须被反应或衍生化的部分的实例包括但不限于丹酰；伞形酮；荧光素酶；荧光素；2,3 –二氢酞嗪二酮；辣根过氧化物酶；碱性磷酸酶；β-半乳糖苷酶；葡糖淀粉酶；溶菌酶；糖类氧化酶；杂环氧化酶；生物素/亲和素；生物素/链霉亲和素；生物素/链霉亲和素-HRP；自旋标记；噬菌体标记；稳定自由基等。常规方法可用于将这些可检测部分与检测抗体共价结合。例如，可以使用偶联剂如二醛、碳化二亚胺、二马来酰亚胺、双-亚氨酸酯(imidates)、双-重氮化联苯胺(bis-diazotized benxidine)等为具有上述标记的抗体加标签。
因为夹心测定中的两种抗体当它们每个结合目标抗原但不彼此相互作用或结合时工作最有效，所以测定固定的捕获抗体或其抗原结合片段与检测抗体的反应性，或在三抗体系统的情况下与第二种和检测抗体的反应性。捕获抗体或其抗原结合片段和检测抗体之间优选低反应性，同时保持对于目标抗原的高亲和力。此外，当抗体对各自在不同位置结合目标生物技术产物残留物时，它们将工作最有效。因此，应当评价抗体以避免配对具有重叠结合特异性的抗体。
使用针对生物技术产物残留物的捕获抗体或其抗原结合片段对于监测遗留和/或验证清洁是有利的方法。由于单克隆抗体的高特异性和灵敏度，本发明的组合物和方法能够检测到远低于TOC测定的目前限值的非常低剂量生物技术产物残留物。此外，这样的抗体检测方法能够特异性鉴定一种或多种目的API的存在，因此落在ICH Q7A和加拿大卫生部指南-0028的推荐方案中。
5.3 抗体生产的遗留监测和清洁验证
在某些实施方案中，本发明涉及在生产其中API是抗体的药物的情况下用于监测产物遗留和/或用于清洁验证的组合物和方法。在某些实施方案中，抗体可用于药物作为裸抗体、作为与伴侣分子(如但不限于毒素或标记)缀合的抗体的情况下，或可以以其他方式修饰(如但不限于，通过包括修饰的氨基酸，或通过碳水化合物侧链的添加、缺失或修饰)。在某些实施方案中，这样的产物遗留监测和/或清洁验证将在生产多克隆抗体的情况下。在某些实施方案中，这样的产物遗留监测和/或清洁验证将在生产单克隆抗体的情况下。在某些实施方案中，这样的产物遗留监测和/或清洁验证将在生产用于研究或诊断用途的抗体的情况下。在某些实施方案中，这样的产物遗留监测和/或清洁验证将在生产用于治疗用途的抗体的情况下。
在某些实施方案中，产物遗留监测和/或清洁验证将在生产用于治疗用途的单克隆抗体的情况下。目前在商业化生产中有三大类治疗性单克隆抗体分子：完全人抗体、人源化抗体和嵌合抗体。完全人抗体分子是源自人细胞或源自表达人免疫球蛋白基因的非人细胞的抗体。相比而言，人源化抗体是在非人动物如小鼠中产生、但已经随后被修饰以反映人抗体序列的抗体。发生这种修饰主要为了使对抗体施用的免疫应答最小化。然而，在某些实施方案中，人源化抗体将保留一种或多种初始非人序列。通常进行非人序列的这种保留以保持抗体的治疗有效活性。最后，嵌合抗体分子由人源化恒定区的和非人可变区组成。通常使用重组DNA技术生产嵌合抗体以将非人动物中生产的抗体的可变(抗原结合)区可操作地连接至人抗体的恒定(免疫系统效应物)区。
在某些实施方案中，本发明涉及在完全人抗体生产的情况下用于监测产物遗留和/或用于清洁验证的组合物和方法。在可替代的实施方案中，本发明涉及在人源化抗体生产的情况下用于监测产物遗留和/或用于清洁验证的组合物和方法。在可替代的实施方案中，本发明涉及在嵌合抗体生产的情况下用于监测产物遗留和/或用于清洁验证的组合物和方法。在某些实施方案中，特别是其中正在用相同设施和/或工艺设备生产多种抗体的实施方案中，本发明涉及在完全人和人源化；完全人和嵌合；人源化和嵌合；或完全人、人源化和嵌合抗体生产的情况下用于监测产物遗留和/或用于清洁验证的组合物和方法。
抗体包括但不限于治疗性抗体中的额外多样性发生在与特定重链和轻链(包含特定抗体)的连接中。免疫球蛋白分子由二硫键互连的4条多肽链 - 2条重(H)链和2条轻(L)链组成。每条重链由重链可变区(本文缩写为HCVR或VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域—CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域—CL组成。VH和VL区可以进一步分成称为互补性决定区(CDR)的高变区，由称为构架区(FR)的更保守区域点缀。每个VH和VL由3个CDR和4个FR组成，从氨基末端到羧基末端以下述顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。例如，基于其重链的氨基酸序列，人抗体可以分成以下特定同种型：IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和IgM。此外，根据其轻链的序列是否是kappa (κ)或lambda (λ)轻链序列，抗体可以分成两组。
在某些实施方案中，本发明涉及在IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和IgM抗体生产的情况下用于监测产物遗留和/或用于清洁验证的组合物和方法。在可替代的实施方案中，本发明涉及在κ或λ抗体生产的情况下用于监测产物遗留和/或用于清洁验证的组合物和方法。在某些实施方案中，特别是其中正在用相同设施和/或工艺设备生产多种抗体的实施方案中，本发明涉及在生产具有抗体同种型和轻链使用的任何组合的情况下用于监测产物遗留和/或用于清洁验证的组合物和方法。
除了全长抗体外，特异性抗体片段通常用于研究、开发中，和作为治疗剂。例如，但不是通过限制的方式，这样的抗体片段可以包含全长抗体的整个抗原结合部分或其部分。在术语抗体的“抗原结合部分”内包含的结合片段实例包括(i)Fab片段，包含VL、VH、CL和CH1结构域的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包含在铰链区通过二硫键连接的2个Fab片段的二价片段；(iii)包含VH和CH1结构域的Fd片段；(iv)包含抗体单臂的VL和VH结构域的Fv片段，(v)包含VH结构域的dAb片段(Ward等人,(1989)Nature 341:544-546，其完整教导通过引用并入本文)；和(vi)分离的互补性决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的2个结构域VL和VH由分开的基因编码，但是它们可以使用重组方法通过合成接头进行连接，所述合成接头使它们能够制备为单条蛋白链，其中VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如，Bird等人(1988)Science 242:423-426；和Huston等人(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883，其完整教导通过引用并入本文)。这样的单链抗体也意欲包含在术语抗体的“抗原结合部分”内。还包含其他形式的单链抗体，如双抗体。双体是二价、双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单一多肽链上表达，但使用太短而不允许相同链上的2个结构域之间配对的接头，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对，并且产生2个抗原结合位点(参见例如，Holliger，P.，等人(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448；Poljak，R. J.，等人(1994)Structure 2:1121-1123，其完整教导通过引用并入本文)。仍进一步地，抗体或其抗原结合部分可以是通过抗体或抗体部分与一种或多种其他蛋白或肽的共价或非共价结合形成的更大免疫粘附分子的部分。这样的免疫粘附分子的实例包括使用链霉亲和素核心区，以制备四聚scFv分子(Kipriyanov，S. M.，等人(1995)Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101)，以及使用半胱氨酸残基、标记肽和C末端多组氨酸标签，以制备二价和生物素化的scFv分子(Kipriyanov，S. M.，等人(1994)Mol. Immunol. 31:1047-1058)。可以使用常规技术如完整抗体的分别地木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化从完整抗体制备抗体部分如Fab和F(ab')2片段。此外，可以使用标准重组DNA技术获得抗体、抗体部分和免疫粘附分子。在一个方面，抗原结合部分是完整结构域或完整结构域对。
在某些实施方案中，本发明包括用于检测抗体片段和含有抗体片段的分子中的一个或多个或任何组合的组合物和方法，所述抗体片段和含有抗体片段非限制性地选自：Fab；F(ab')2；Fd；Fv；scFv；一种或多种分离的CDR；双抗体；和免疫粘附分子。
5.4 捕获和检测抗体的生产
如本节中使用的，术语“捕获抗体”和“检测抗体”是指完整抗体或其抗原结合片段。可以通过多种技术生成本发明的捕获和检测抗体，包括用目的抗原免疫动物和随后的常规单克隆抗体方法，例如Kohler和Milstein(1975)Nature 256：495的标准体细胞杂交技术。尽管体细胞杂交程序是优选的，但是原则上可以采用用于生产单克隆抗体的其他技术，例如B淋巴细胞的病毒或致癌性转化。
用于制备杂交瘤的一种优选的动物系统是鼠系统。杂交瘤生产是非常良好确立的程序。用于分离免疫的脾细胞用于融合的免疫方案和技术是本领域已知的。融合伴侣(例如，鼠骨髓瘤细胞)和融合方案也是已知的。
抗体优选可以是人、嵌合或人源化抗体。可以基于如上所述制备的非人单克隆抗体序列制备本发明的嵌合或人源化抗体。编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA可以得自目的非人杂交瘤，并且使用标准分子生物学技术工程改造为含有非鼠(例如，人)免疫球蛋白序列。例如，为了产生嵌合抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠可变区与人恒定区连接(参见例如Cabilly等人的美国专利号4,816,567)。为了产生人源化抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠CDR区插入人构架内(参见例如Winter的美国专利号5,225,539，和Queen等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
在某些实施方案中，本发明涉及评价一组捕获和/或检测抗体或其抗原结合片段以鉴定对于正在生产的特定生物技术产物适当的捕获和/或检测抗体或其抗原结合片段。示例性但非限制性的组包括：抗人IgG (H+L)、抗人IgG F(ab')2、抗人IgG κ、抗人IgG λ和抗小鼠IgG (H+L)抗体。使用抗人IgG (H+L)捕获和/或检测整个(完全人/人源化抗体)产物分子；抗人IgG F(ab’)2、抗人IgG κ和抗人IgG λ将捕获和/或检测产物结合位点，如果这样的结合位点是人或人源化的；并且抗小鼠IgG (H+L)将提供对于嵌合产物的特异性。在某些实施方案中，特别是在设备清洁后发生的那些实施方案中，当残留物产物可能被片段化、降解或以其他方式变性时，各种捕获和/或检测抗体的组合将确保检测尽可能多的产物残留物。
6. 实施例
6.1. ELISA检测测定
在某些实施方案中，本发明涉及免疫测定法，其中一种或多种捕获抗体或其结合片段用于检测与生物技术产物生产相关的残留物。如表1中所示，评价与初始测定开发相关的5种商业上获得的捕获抗体。在该研究中还评价这些相同的五种与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗体(“Ab”)作为检测抗体。
表1. 捕获抗体
Figure 201180054320X100002DEST_PATH_IMAGE001
使用Western印迹测试选择的检测抗体(HRP缀合物)对两种产物的识别：Ab #1，在本研究的主要目标，和Ab #2，作为测试暴露于清洁剂后的识别的模型。Ab #1和Ab #2在75°C与CIP-100 (2.5%)和CIP-200 (2.5%)孵育30分钟以模拟严谨的设施清洁条件。孵育后，中和测试样品。将完整分子和中和处理的样品上样至SDS-PAGE上并针对抗人IgG (H+L)进行印迹。
如图1中所示，通过抗人IgG (H+L)检测Ab #1和Ab #2残留物。CIP-100处理的样品降解最严重。未检测到降解产物，但是仍然检测到残留产物。CIP-200处理的样品生成一些聚集体和显著量的Ab残留物。通过抗人IgG (H+L)检测聚集体和残留产物。抗人IgG (H+L)适合于检测单克隆抗体产物。掺入清洁溶液中的抗体浓度预计比来自生产转换的实际清洁样品高约1000倍。需要更高的蛋白浓度需要来选择用于测定开发的ELISA检测试剂。
为了进一步研究检测Ab，针对表1中的五种商购检测Ab测试一般mAb分子、完全人、人源化、嵌合、κ和λ轻链单克隆抗体的识别。结果显示在图2至图7中。
所有五种检测Ab识别预期产物(表2)。抗人IgG (H+L)和抗人IgG F(ab')2识别所有产物(图3和图4)。抗人IgG λ仅识别具有λ轻链的AB＃1和AB＃3(图5)。抗人IgG κ强烈识别具有κ轻链的Ab #2、Ab #11、Ab #13和Ab #9，但与其他分子也有轻微交叉反应性(图6)。抗小鼠IgG (H+L)强烈识别Ab #11(小鼠和人嵌合产物)，但也轻微检测到其他人产物(图7)。在Western印迹中这种轻微交叉反应性现象是剂量依赖的，因为这种方法不是定量的并且没有进行任何上样量研究。区分测试分子间的交叉反应性的进一步研究描述如下。
表2. 在ABC产生的mAb产物
Figure 684597DEST_PATH_IMAGE002
通过单独ELISA单独地评价每种单一捕获和检测Ab用于初步评价。用10 µg/mL捕获Ab包被板并用2和5 µg/mL检测Ab检测。基于这些筛选结果，通过进行实验进一步研究每种单一抗体量，其中在针对相关产物的3种捕获和6种检测条件下测试每种Ab。将抗人IgG (H+L)和IgG F(ab')2应用于Ab #1，因为Ab #1是该项目中的主要目标。条件和实验结果显示在表3中。
表3 单一Ab DOE和结果
Figure 201180054320X100002DEST_PATH_IMAGE003
*异常值，板孔被污染并且该值没有用于评价。
单一Ab检测的目的是发现对于每种Ab实现最佳灵敏度的最佳组合。表3中的粗体显示的条件表明，在0.25至8 ng/mL的动态范围内，最低信号超过0.1，这是超过背景的可靠读数，并且最高信号达到酶标仪的最大值。在那些条件下，测定达到了所需的Ab #1的超过10倍的灵敏度。表4列出了Ab #1允许的遗留限值。
表 4. Ab #1要求的灵敏度
a ELISA定量限值为0.25 ng/mL。
b在ELISA中没有观察到在western印迹筛选过程中观察到的剂量依赖的交叉反应性，可能是由于测试样品的浓度更低(数据显示)。
如表5中所示，根据上述实验结果组合五种单一Ab。
表5. Ab组合
Figure DEST_PATH_IMAGE005
重新验证组合的Ab对于Ab #1、Ab #2和Ab #11检测的灵敏度和适用性。图8显示了对那些产物的标准曲线。所有曲线用二次拟合具有0.9999的相关系数，并且每个曲线范围为0.25至8 ng/mL。
用于制备包被和检测Ab合并物的目标是足以用于1000块板。基于组合比例，根据表6和表7制备大的捕获和检测Ab合并物。使用Ab合并物用于评价测定质量。
表6. 捕获Ab合并物
Figure 194524DEST_PATH_IMAGE006
表7. 检测Ab合并物
Figure DEST_PATH_IMAGE007
为了验证测定的可靠性，采用来自Ab #1放大运行的SP洗脱物和最终超滤/渗滤(“UF/DF”)用于评价测定质量。报告这些样品为约5 mg/mL，并且相应地稀释用于本研究。
在正常条件下，在测试之前，药物物质样品储存于-80℃。挑战在环境温度持续4小时、2o-8oC持续48小时和3个冷冻/解冻循环的储存条件以覆盖可能的实验室环境。结果总结于表8中。蛋白结果没有受到不同储存条件的显著影响(<10％)。
表8. 样品储存的影响
Figure 963635DEST_PATH_IMAGE008
ELISA底物颜色显现时间设定为14分钟。为了评价时间变化，测试14 ± 1分钟。结果在1分钟窗口期间没有受到影响(表9)。
表9. 底物显色时间
Figure DEST_PATH_IMAGE009
测试板在添加停止反应的2 M磷酸后立即读数，并且然后放在环境温度30分钟后再次读数。没有观察到显著性差异(<10％)(参见表10)。
表10. 板孵育时间
Figure 715690DEST_PATH_IMAGE010
分析方法的“精度”是当方法反复应用于均匀样品的多次采样时在个别测试结果之间的一致性程度。
“测定重复性”测量当在统一分析条件下多次进行分析程序时该分析程序的精度。在一块板中测试SP洗脱物和最终UF/DF的六份等分试样。在每个等分试样中计算蛋白浓度。使用所有六次测量计算浓度值的百分比相对标准偏差。结果总结于表11中。蛋白测量的相对标准偏差为<7％。
表11. 测定重复性
Figure DEST_PATH_IMAGE011
“中间精度”是在不同天或通过不同的分析者进行分析程序时在实验室内产生的测试结果的分散的测量值。
测试SP洗脱物和最终UF/DF的各自三份等分试样。在不同天通过不同的分析者额外两次重复该实验。使用来自研究的测定重复性部分的前三次结果用于本研究的第1天。结果显示于表12中。对于蛋白测量的百分比相对标准偏差为< 5%，在20%的预期精度范围内。
表12. 中间精度
Figure 475836DEST_PATH_IMAGE012
为了估计定量限值，标准曲线的最低点，8 ng/mL Ab #1标准品的2倍系列稀释物制备六次并且上样至6块不同的板。结果如表13中所示。根据ICH指南，测定的定量限值是信噪比高于10:1并且相对标准偏差小于20%的最小浓度。空白测量的噪音为0.004 AU。0.25 ng/mL标准品的平均信号为0.122 AU。尽管0.125 ng/mL满足该标准，但是选择0.25作为LOQ以确保测定稳健性。定量限值设定为0.25 ng/mL，信噪比为30.5:1，并且相对标准偏差为14％。
表13. 定量限值研究
Figure DEST_PATH_IMAGE013
分析方法的“线性”是其引发或直接或通过良好定义的数学转换与目的分析物的浓度成比例的测试结果的能力。
从Ab #1药物物质制备0.25至8 ng/mL范围的标准品。将标准品和缓冲液空白上样至板上并且测试。图显示于图9中。二次拟合的相关系数大于0.999。结果表明，标准品的吸光度响应与通过二次拟合的蛋白浓度成比例。
使用掺料和回收方法研究测定的准确度。在1.0、2.0和4.0 ng/mL的最终标准品水平掺料SP洗脱液和最终UF/DF。将测定计算为回收的蛋白浓度除以掺料的实验浓度的比例，并且表示为百分比。本研究的结果显示于表14中。对于所有掺料水平，掺料的回收率在100 ± 7.9%范围内。
表14. 掺料和回收率
Figure 179087DEST_PATH_IMAGE014
SP洗脱物和最终UF/DF样品在参考标准曲线校准范围中进行两倍系列稀释以评价样品稀释线性。如表15中所示，样品稀释度没有影响结果。变量小于10％。对于未知样品测试验证样品稀释度只需要三个稀释点。
表15. 样品稀释线性
分析方法的“范围”是分析物上部和下部水平之间的间隔，其可以用所述方法以合适的精度、准确度和线性水平来确定。基于线性、准确度、精度和定量限值，该测定的范围被确定为0.25至8 ng/mL。二次拟合的相关系数值大于0.999。这表明，在0.25至8 ng/mL的范围内，吸光度响应与通过二次拟合的蛋白浓度成比例。在两种不同的进程中样品中以1.0、2.0和4.0 ng/mL水平的标准品进行掺料回收研究。回收率为100 ± 7.9%。这表明，在估计的范围内，该方法是精确和准确的。
为了覆盖未来商业供应的需要，评价每种抗体的第二批次。表16表明用于大合并物的第一批次和用于比较的第二批次。
表16. 用于结果比较的Ab批次
Figure 518933DEST_PATH_IMAGE016
结果总结于表17中，并且来自第一和第二批次的参考标准曲线显示于图10中。第二批次没有影响结果。
表17. 第二批次Ab比较
Figure DEST_PATH_IMAGE017
为了评价该测定对于检测设备冲洗物中残留产物蛋白水平的适用性，研究蛋白从设备表面的回收。生产设备由不锈钢、哈氏合金或玻璃制成。用稀释至2和3 ppm的40 mL Ab #1药物物质点每种材料的代表性形式(coupon)(即，代表性样品，如擦拭物、冲洗物或其他样品形式)。允许表面空气干燥3-4小时，然后用40 mL MilliQ水冲洗。收集冲洗物。将从表面的蛋白回收率计算为冲洗物中的蛋白浓度除以掺料浓度的比例，并且表示为百分比。
如表18中所示，对于玻璃表面，平均回收率为76％，对于不锈钢为87％，并且对于哈氏合金为76％。结果符合通过标准(50 - 150％)，并且表明，该测定适合用于生产设备冲洗样品测试。
表18 . 表面冲洗回收
Figure 922232DEST_PATH_IMAGE018
Ab #1工艺验证包括在产物工艺运行后的空白运行以评价遗留。空白运行包括蛋白A、SP琼脂糖和Q琼脂糖层析和UF/DF操作。使用Bradford测定法评价产物A至A遗留，但是，对于产物A至B的残留物遗留限值(RCL)为4 ng/mL (VR-2249、VR-2250和VR-2251)，其低于Bradford测定LOQ (1.25 ug/mL)。评价mAb测定支持Ab #1 A至B遗留研究的适用性。通过进行缓冲液掺料和回收实验评价工艺缓冲液对测定的干扰。在1.0、2.0和4.0 ng/mL的最终标准品水平掺料未稀释和五倍稀释度(用充足稀释缓冲液)每一种工艺缓冲液。
如表19中所示，对于Q琼脂糖洗脱缓冲液SR-488和SP琼脂糖洗脱缓冲液SR-610的回收率为约70％，其在通过标准(50％至150％)之内，但是蛋白A洗脱缓冲液S​​R-493仅回收1.1％，这是因为酸性条件干扰抗原和抗体结合。
表19. 对于未稀释的Ab #1工艺缓冲液的掺料和回收率
稀释缓冲液的掺料和回收率结果总结于表20中。蛋白回收率当稀释5倍时从110.3至121.9％是可以接受的。测定定量限值为具有5倍稀释的1.25 ng/mL。因此，对于强大的测定操作，对于所有三种工艺缓冲液推荐5倍稀释。具有1.25 ng/mL的LOQ的这种测定形式适于评价产物A至B遗留。
表20. 对于五倍稀释的Ab #1过程缓冲液的掺料和回收率
已经开发新的测定形式和条件来检测一般残留mAb相关产物。上述结果表明测定的再现性。新的测定能够定量痕量水平的mAb蛋白，对于Ab #1的定量限值为0.25 ng/mL。因此，新开发的mAb ELISA提供了用于定量残留mAb相关分子的有价值的工具，用于设施转换和清洁验证。
该测定对于过程中样品Ab #1产物定量的表现是合格的。研究该测定的稳健性、精度、定量限值、线性、准确度、样品稀释线性、范围、第二批次商业试剂。所有上述结果在ELISA的预期准确度和精度之内。测定条件总结于表21中。此外，回收研究证明该测定适用于冲洗物研究和Ab #1过程遗留研究。然而，对于空白运行，需要5倍稀释来消除缓冲液干扰。
表21. 测定条件
Figure DEST_PATH_IMAGE021
上述测定用来测试来自在GMP-1后含有抗体#1工艺中间体的生物反应器、收获和下游处理罐、柔性软管和滤器外壳上进行的清洁循环的最终冲洗物。最终冲洗物均低于LOQ。此外，对于生物反应器Z-3200和罐TK-2830，对中间冲洗物进行采样。如表23中所示，只有来自Z-3200和TK-2830的第一USP水冲洗物检测到非常低水平的蛋白残留物。结果进一步证明了上述测定的灵敏度和特异性。
表23 GMP-1的设备冲洗物的清洁结果*
Figure 981510DEST_PATH_IMAGE022
*: LOQ = 0.25 ng/mL。
通过上述测定测试来自与工艺验证运行相关的设备的最终产生样品。所有测试的样品均低于LOQ。来自工艺验证运行1(“PV-1”)的结果列在表24中。清洁后，报告的抗体#1水平(0.25 ng/ml)比最大允许的遗留限值(4 - 13 ng/mL)低至少16倍。
表24 PV-1的设备冲洗物的清洁结果
描述 ELISA结果
Chrom Skid Z-2340 <LOQ
生物反应器Z-3200 <LOQ
Z-3200收获转移管路 <LOQ
滤器基座F-8190-4, F-8190-1,F-7665, F-7666 <LOQ
F-7665圆顶 <LOQ
F-7666圆顶 <LOQ
F-8190-1圆顶(或F-8190-4) <LOQ
收获罐TK-3210 <LOQ
TK-3210产物转移管路 <LOQ
1100L缓冲罐TK-2060 <LOQ
200L处理罐TK-4170 <LOQ
1.5英寸软管 <LOQ
700L Capture Chrom洗脱物合并的罐TK-2665 <LOQ
1100L SP Seph装载罐TK-2830 <LOQ
200L SP Seph洗脱物罐TK-2138 <LOQ
Chrom Skid Z-2330 <LOQ
200L Q Seph装载罐TK-3224 <LOQ
UF Skid Z-2815 <LOQ
200L Q Seph FTW罐TK-3226 <LOQ
900L病毒滤液罐TK-2845 <LOQ
流量计FI-7565 <LOQ
3/4英寸软管 <LOQ
阀11/2英寸 <LOQ
阀3/4英寸 <LOQ
阀1英寸 <LOQ
有孔阀11/2 x 1英寸 <LOQ
具有阀的T形11/2 x 1/2英寸 <LOQ
T形11/2 x 3/4英寸 <LOQ
T形11/2 x 11/2英寸 <LOQ
T形3/4 x 3/4英寸 <LOQ
T形1 x 1英寸 <LOQ
T形11/2 x 1英寸 <LOQ
弯管1/1/2英寸 <LOQ
减径管2 x 11/2英寸 <LOQ
减径管1 x 3/4英寸 <LOQ
观察孔1/1/2英寸 <LOQ
垫圈2英寸 <LOQ
夹钳2英寸 <LOQ
顶板12英寸外壳 <LOQ
底板12英寸外壳 <LOQ
随动管12英寸外壳 <LOQ
密封螺母12英寸外壳 <LOQ
压缩弹簧12英寸外壳 <LOQ
中心柱12英寸外壳 <LOQ
O形圈11/2英寸12 <LOQ
O形圈3/4英寸 <LOQ
顶板18英寸外壳 <LOQ
底板18英寸外壳 <LOQ
随动管18英寸外壳 <LOQ
密封螺母18英寸外壳 <LOQ
压缩弹簧18英寸外壳 <LOQ
中心柱18英寸外壳 <LOQ
大容器 <LOQ
大容器盖 <LOQ
小容器 <LOQ
小容器盖 <LOQ
交叉管1英寸 <LOQ
减径管11/2 x 1英寸 <LOQ
排气套管1英寸x 5.2英寸 <LOQ
排气套管1英寸x 17.4英寸 <LOQ
阀1 x 1/2英寸 <LOQ
F-7282圆顶 <LOQ
F-7282基底 <LOQ
DT-2060中的导管- 11/2 <LOQ
导管 - 3/4英寸DT-9238 <LOQ
导管 - 1英寸DT-3224 <LOQ
1x1x11/2英寸仪器T形 <LOQ
1英寸弯管 <LOQ
1英寸观察孔 <LOQ
由于测定灵敏度高，通常在实验室中处理的mAb产物可能导致在该测定中的污染。因此，推荐采取预防措施，以确保在样品检测过程中使用的设备和环境尽可能干净。
各种出版物在本文中引用，其内容在此完整地并入。

Claims (9)

1.用于检测生物技术产物残留物的方法，其中将测试样品与包含对于所述产物残留物特异性的捕获抗体或其抗原结合片段的基质接触，并且抗体-抗原复合物的检测指示生物技术产物残留物的存在。
2.权利要求1的方法，其中通过监测能够结合所述抗体-抗原复合物的标记的检测抗体的结合来实现所述抗体-抗原复合物的检测。
3.权利要求1的方法，其中所述生物技术产物残留物的存在指示产物遗留。
4.权利要求1的方法，其中所述生物技术产物残留物的量指示清洁过程的效率。
5.权利要求1的方法，其中所述产物残留物源自核酸产物。
6.权利要求1的方法，其中所述产物残留物源自蛋白产物。
7.权利要求6的方法，其中所述蛋白产物选自：酶；肽激素；多克隆抗体；人单克隆抗体；人源化单克隆抗体；嵌合单克隆抗体；单链抗体；Fab抗体片段；F(ab')2抗体片段；Fd抗体片段；Fv抗体片段；分离的CDR；双抗体；和免疫粘附分子。
8.权利要求1的方法，其中所述捕获抗体或其抗原结合部分选自：抗人IgG (H+L)、抗人IgG F(ab')2、抗人IgG κ、抗人IgG λ、抗小鼠IgG (H+L)抗体；以及其组合。
9.权利要求1的方法，其中所述基质包含两种或更多种具有不同结合特异性的捕获抗体或其抗原结合片段。
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