CN108700570B - 交联纤维蛋白分解产物的测定试剂及测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种可更加正确地测定交联纤维蛋白的纤溶酶分解产物(XDP)的试剂及方法。本发明的测定试剂含有:(1)与交联纤维蛋白的纤溶酶分解产物(XDP)进行反应,并且不与纤维蛋白原及作为其纤溶酶分解产物的片段X、片段Y、片段D1、及片段E3进行反应的抗XDP抗体;及(2)钙螯合剂。
Description
技术领域
本发明涉及交联纤维蛋白的纤溶酶分解产物的测定试剂及测定方法。
背景技术
在血液中检测到交联纤维蛋白分解产物(cross-linked fibrin degradationproducts:XDP)说明血栓溶解,该测定被广泛应用于可确认到全身性的凝固活性化与纤溶活性化的弥散性血管内凝固症候群(disseminated intravascular coagulation:DIC)的诊断中。另一方面,其还被用于伴随限定为局部的血管内血栓形成的纤溶活性化的深静脉血栓症(deep vein thrombosis:DVT)的排除诊断中,对XDP测定系统所要求的测定范围存在由低浓度至高浓度的广范围化的倾向。
作为识别XDP的抗体,已知有专利文献1所述的抗体。由于该抗体不具有与XDP(D-二聚体)以外的片段的反应性,因此可期待XDP的正确测定。此外,根据其反应性等,认为该抗体的识别部位位于进行E-D结合的XDP的D结构域和/或E结构域,E-D结合对于XDP的正确测定是重要的。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开第2011/125875号
发明内容
本发明要解决的技术问题
然而,欲使用具有专利文献1所述特性的抗体来测定XDP时,作为对E-D结合进行特异性识别的抗体特有的问题,发现存在以下可能性:即,还识别并测定存在于试样中的、D结构域中无交联结构的纤维蛋白聚合物或可溶性纤维蛋白(soluble fibrin:SF)的可能性。
如这些纤维蛋白聚合物或SF这样的物质虽然在结构上与一部分XDP具有类似点,但其来源或性质完全不同,因此由识别纤维蛋白聚合物或SF导致的假阳性可能会成为较大的问题。因此,需要将交联纤维蛋白分解产物(XDP)与纤维蛋白聚合物或SF进行区分进而进行测定。
解决技术问题的技术手段
本申请的发明人进行了研究,其结果弄清了抗体的特性,同时使区别交联纤维蛋白分解产物(XDP)、纤维蛋白聚合物及SF的测定成为了可能。具体而言,本申请发明人发现:在E结构域上存在该抗体的识别部位;为了使用该抗体进行有用的XDP测定,钙浓度是重要的。
在血液凝固中,钙是起到重要作用的离子,有报告指出,在D结构域中存在2处钙结合部位,在E结构域中存在1处钙结合部位,但本申请发明人的研究结果认为,由于纤维蛋白聚合物上的钙被螯合而不存在,因此纤维蛋白聚合物的结构发生变化,从而其反应性也发生变化。
本发明涉及如下。
[1]一种交联纤维蛋白的纤溶酶分解产物的测定试剂,其含有:
(1)与交联纤维蛋白的纤溶酶分解产物(XDP)进行反应,并且不与纤维蛋白原及作为其纤溶酶分解产物的片段X、片段Y、片段D1、及片段E3进行反应的抗XDP抗体;及
(2)钙螯合剂。
[2]一种测定方法,其为交联纤维蛋白的纤溶酶分解产物的测定方法,其中,在钙螯合剂的存在下实施XDP与抗XDP抗体的反应。
发明效果
根据本发明,可更加正确地测定XDP。
附图说明
图1-A为示意性表示a)纤维蛋白原、b)desAA纤维蛋白单体、c)纤维蛋白聚合物的结构的说明图。
图1-B为示意性表示d)交联纤维蛋白的结构的说明图。
图1-C为示意性表示e)交联纤维蛋白分解产物(DD/E)、f)解离DD/E后分离的DD、g)解离DD/E后分离的片段E1、E2、h)片段E3、i)片段D1、j)片段D3、k)D1-E1-D1、l)D1-E1的结构的说明图。
图2-A为表示使用Superdex200HR色谱柱对人D1与人E1+2的混合物进行分级的结果的色谱图。
图2-B为表示使用Superdex200HR色谱柱对人D1与人E3的混合物进行分级的结果的色谱图。
图3-A为表示使用Superdex200HR色谱柱对牛D1(bD1)与人E1+2(hE1+2)的混合物进行分级的结果的色谱图。
图3-B为表示使用Superdex200HR色谱柱对羊D1(oD1)与人E1+2(hE1+2)的混合物进行分级的结果的色谱图。
图4为表示为了研究Ca2+离子或EDTA的影响而使人DD/E或人D-E-D复合物与固相化MIF-220抗体进行反应,通过ELISA进行检测的结果的图表。
具体实施方式
本发明的测定试剂及测定方法的特征在于,使用(1)与交联纤维蛋白的纤溶酶分解产物(XDP)进行反应,并且不与纤维蛋白原及作为其纤溶酶分解产物的片段X、片段Y、片段D1、及片段E3进行反应的抗XDP抗体及(2)钙螯合剂,在钙螯合剂的存在下实施XDP与抗XDP抗体的反应。
在本说明书中,交联纤维蛋白(别名为稳定化纤维蛋白)的纤溶酶分解产物是指别名还被称作“D-二聚体”、“D-D二聚体”、“DD/E复合物”的、作为基本单位的DD/E单体及其聚合物(DD/E聚合物,例如,DXD/YY、YXY/DXXD、DXXY/YXXD)。
《抗XDP抗体》
本发明中使用的抗XDP抗体,
(1)与XDP进行反应,
(2)不与纤维蛋白原进行反应,
(3)不与纤维蛋白原的纤溶酶分解产物、即片段X、片段Y、片段D1、及片段E3中的任一者进行反应,
优选(4)不与DD/E单体解离而成的片段、即片段DD、片段E1及片段E2中的任一者反应。
作为用于本发明的抗XDP抗体,可列举出对E结构域与D结构域进行结合才会出现在E结构域侧的立体结构进行识别的抗体。
用于本发明的抗XDP抗体可通过公知的手段得到。只要具有所需的反应性则无论是单克隆抗体(MoAb)还是多克隆抗体(PoAb)均可,优选为单克隆抗体。作为所述抗体,可使用抗体本身,也能够以含有抗原结合部位的抗体片段,例如以Fab、Fab’、F(ab’)2或Fv等形式使用。所述抗体片段可利用常规方法使用蛋白质分解酶进行消化、然后根据蛋白质的分离、提纯的常规方法而得到。
作为用于制作本发明中使用的抗XDP抗体的抗原,例如可使用DD/E单体或DD/E聚合物。DD/E聚合物可列举出二聚体~五聚体,若为六聚体以上,则难溶于水。此外,该抗原可根据公知方法由纤维蛋白原制备。此外,可通过由人等进行提纯而得到,也可通过基因工程学的手法得到。还可使用市售品。
用于本发明的抗XDP抗体,可通过利用后述实施例所示的公知的免疫学的分析方法,确认与XDP、纤维蛋白原及作为其纤溶酶分解产物的片段X、片段Y、片段D1、及片段E3、DD/E单体解离而成的片段DD、片段E1及片段E2的反应性而获得。
此外,优选确认钙离子浓度对用于本发明的抗XDP抗体与下述物质的反应性的影响:将片段E1和/或片段E2(即,片段E1或片段E2中的任一者、或者它们的混合物)与片段D1混合而再构建的D-E-D复合物(D1-E-D1:参照图1-C的k)、及DD/E单体。具体而言,优选确认以下内容:对DD/E单体的反应性不受Ca2+离子浓度的较大影响;对再构建而成的D-E-D复合物的反应性受到Ca2+离子浓度的较大影响,在Ca2+离子浓度低于一定值的情况下(或者在钙螯合剂(例如,EDTA)的存在下)反应性显著减少。
DD/E单体与再构建而成的所述D-E-D复合物在结构上的很大不同在于,DD/E单体在D-D间具有交联这一点,所述D-E-D复合物在D-D间无交联,例如可看作显现纤维蛋白聚合物分解产物的特征的最小单位。因此,对于对D-E-D复合物的反应性受Ca2+离子浓度影响较大的抗XDP抗体而言,即使在D-D间无交联的纤维蛋白聚合物分解产物存在于检体中,在钙螯合剂的存在下,也能够维持对DD/E单体的反应性,并使对纤维蛋白聚合物分解产物的反应性显著减少,其结果,可进行更具有特异性的XDP的测定。
《测定方法及试剂》
本发明的测定方法中,除了使用所述的抗XDP抗体,且在钙螯合剂的存在下实施XDP与抗XDP抗体的反应以外,可使用公知的免疫学的测定方法。例如可包括以下工序:准备有可能含有XDP的被检测试样与抗XDP抗体的工序;在钙螯合剂的存在下使所述被检测试样与抗XDP抗体接触,从而形成免疫复合物的工序;对所述免疫复合物或来自该免疫复合物的信号进行分析的工序,具体而言,可列举出免疫比浊法(TIA)、酶免疫测定法(EIA)、放射免疫测定法(RIA)、乳胶凝集反应法、荧光免疫测定法、免疫色谱法等。
在凝固项目的检查中,通常将柠檬酸钠用作抗凝固剂。在日本临床检查专业医会中,众所周知在凝固检查中推荐使用柠檬酸钠作为抗凝固剂,EDTA盐并不适合。这是由于在活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)等检查中,其结果较柠檬酸长等,对检查结果产生重大的影响,不适于正确的定量。
钙螯合剂是指以将金属离子夹持在中心的形式与金属离子形成配位键的物质,在本发明中,可使用能够与钙进行配位的化合物。
作为能够用于本发明的钙螯合剂,例如可列举出氨基聚羧酸类螯合剂、芳香族或脂肪族羧酸类螯合剂、氨基酸类螯合剂、醚羧酸类螯合剂、膦酸类螯合剂、羟基羧酸类螯合剂、高分子电解质(含有低聚物电解质)类螯合剂、多元醇、二甲基乙二肟等含氮螯合剂、巯基乙酸等含硫螯合剂等。
所述螯合剂的形态任意,为酸类螯合剂时,可以是任意的酸形态,也可以是钠盐、钾盐、铵盐等盐的形态。进一步,其还可以是可水解的这些物质的酯衍生物的形态。
作为氨基聚羧酸类螯合剂,例如可列举出乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二胺二乙酸、羟基乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、二羟基乙基乙二胺四乙酸(DHEDDA)、次氮基三乙酸(NTA)、羟乙基亚氨基二乙酸(HIDA)、β-丙氨酸二乙酸、环己二胺四乙酸、次氮基三乙酸、亚氨基二乙酸、N-(2-羟乙基)亚氨基二乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、N-(2-羟乙基)乙二胺三乙酸、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(glycol ether diamine tetra acetic acid)、谷氨酸二乙酸、天冬氨酸二乙酸、甲基甘氨酸二乙酸、亚氨基二琥珀酸、丝氨酸二乙酸、羟基亚氨基二琥珀酸、二羟基乙基甘氨酸、天冬氨酸及谷氨酸、以及它们的盐类及酯类等衍生物。
作为芳香族或脂肪族羧酸类螯合剂,例如可列举出乙醛酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、己二酸、庚二酸、癸二酸、壬二酸、衣康酸、乌头酸、丙酮酸、葡糖酸、均苯四甲酸、苯并聚羧酸(benzopolycarboxylic acid)、环戊烷四羧酸、水杨酸、乙酰水杨酸、羟基苯甲酸、氨基苯甲酸(包括邻氨基苯甲酸)、邻苯二甲酸、富马酸、苯偏三酸、没食子酸及六氢邻苯二甲酸、以及它们的盐类及衍生物。
作为氨基酸类螯合剂,例如可列举出甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸、赖氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、乙硫氨酸、酪氨酸及蛋氨酸、以及它们的盐类及衍生物。
作为醚羧酸类螯合剂,可列举出羧甲基羟基丙二酸(carboxymethyl tartronicacid,CMT)、羧基甲氧基琥珀酸(carboxymethyloxy succinate,CMOS)等的醚羧酸盐、羧甲基羟基丙二酸酯、羧基甲氧基琥珀酸酯、氧基二琥珀酸酯、酒石酸单琥珀酸酯及酒石酸二琥珀酸酯、以及它们的盐类及衍生物。
作为膦酸类螯合剂,例如可列举出亚氨基二甲基膦酸、烷基二膦酸、1-羟基乙烷-1,1-二膦酸及植酸、以及它们的盐类及衍生物。
作为羟基羧酸类螯合剂,例如可列举出苹果酸、柠檬酸、乙醇酸、葡糖酸、庚糖酸、酒石酸及乳酸、以及它们的盐类及衍生物。
作为高分子电解质(含有低聚物电解质)类螯合剂,例如可列举出丙烯酸聚合物、马来酸酐聚合物、α-羟基丙烯酸聚合物、衣康酸聚合物、由2种以上的这些聚合物的构成单体构成的共聚物及环氧琥珀酸聚合物。
作为多元醇,可列举出乙二醇、邻苯二酚、邻苯三酚、双酚及单宁酸、以及它们的衍生物。
特别优选乙二胺四乙酸(EDTA)、草酸、柠檬酸、酒石酸、葡糖酸、次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、二羟基乙烯甘氨酸、三乙醇胺、羟基乙二胺四乙酸、羧甲基羟基丙二酸(CMT)、羧基甲氧基琥珀酸(CMOS)、BAPTA、Bicine、CyDTA、GEDTA(EGTA)、HIDA、IDA、NTPO、TTHA、TPEN、双吡啶、菲啰啉、卟啉、冠醚等。
此外,螯合剂可以由一种化合物构成,也可以组合使用2种以上的化合物。
螯合剂的含量可考虑其螯合能力而适当设定,在本发明的测定方法中,以EDTA为例的情况下,在抗原抗体反应时,XDP与抗XDP抗体的反应体系中的钙螯合剂的浓度优选为0.01~30mmol/L,更优选为0.2~30mmol/L,进一步优选为0.2~2mmol/L。EDTA下限浓度为0.001mmol/L以上的浓度即可。另外,优选为0.002mmol/L,更优选为0.005mmol/L以上,进一步优选为0.01mmol/L以上,更进一步优选为0.02mmol/L以上、0.05mmol/L以上,最优选为0.02mmol/L以上。EDTA浓度没有上限,本领域技术人员可进行适当设定,但优选在不对抗XDP抗体的反应造成影响的范围内进行设定。另外,所述的各下限与各上限可根据所需进行任意组合。
钙是在血液凝固中发挥重要作用的离子,有报告指出在D结构域上存在2处钙结合部位,在E结构域上存在1处钙结合部位,本申请的发明人们研究的结果认为,由于纤维蛋白聚合物上的钙被螯合而不存在,因此纤维蛋白聚合物的结构发生变化,从而其反应性也发生变化。
本发明的测定试剂除了含有所述的抗XDP抗体与钙螯合剂以外,可以制成与公知的免疫学的测定试剂相同的构成。除了抗XDP抗体及钙螯合剂以外,例如可适当添加缓冲液、敏化剂、表面活性剂、无机盐等。
试剂形态除了为由第一试剂与第二试剂组成的双试剂系统所构成的试剂形态以外,也可以是由一个试剂构成的试剂形态。从测定精度的观点等出发,优选为由第一试剂与第二试剂组成的双试剂系统,以下基于乳胶凝集反应法对测定试剂进行例示。
第一试剂由缓冲液组成,第二试剂由抗体致敏乳胶颗粒组成,可适当添加敏化剂、表面活性剂、无机盐等。作为优选例,可列举出第一试剂为由缓冲液、敏化剂及无机盐组成的试剂,第二试剂为由抗体致敏乳胶颗粒组成的试剂。钙螯合剂可添加于第一试剂或第二试剂中的任一者中,或者添加于第一试剂及第二试剂这两者中,优选添加于第一试剂中。
试剂中的钙螯合剂的浓度例如可根据试剂构成、添加顺序、添加容量等进行变动,可在XDP与抗XDP抗体的反应体系中以成为所述浓度范围的方式适当决定。
实施例
以下,通过实施例对本发明具体地进行说明,但这些实施例并不限定本发明的范围。
《实施例1:纤维蛋白/纤维蛋白原分解产物的制备》
交联纤维蛋白分解产物(XDP)具有整数n个作为最小单位的DD/E相连的结构(DD/E)n。以下的实施例中,将n≥2的XDP记为高分子XDP,将n=1的XDP记为DD/E。高分子XDP、DD/E主要以Stephanie A.Olexa与Andrei Z.Budzynski的方法(1978)、Circulation,Suppl.58,119,Olexa et al.的方法(1979)、及Biochim.Biophys.Acta 576,39~50为基准进行。向人纤维蛋白原(Enzyme Research Laboratories公司)中加入牛凝血酶(MOCHIDAPHARMA CEUTICAL CO.,LTD.)及氯化钙,在37℃下反应2小时,将纤维蛋白原转化为纤维蛋白。对其进行离心分离,从非凝固性物质中分离了纤维蛋白。使纤维蛋白在pH7.8的含有氯化钙的三盐酸缓冲液中悬浮。在37℃的环境下向悬浮液中添加了人纤溶酶(Chromogenix公司)。加入抑酶肽(Pentapharm.公司)使分解反应停止后,使其通过赖氨酸琼脂糖凝胶色谱柱,除去了纤溶酶。该通过液为分子量不同的高分子XDP与DD/E的混合物。然后,将在上述得到的通过液加入使用pH7.5的含有氯化钙的三盐酸缓冲液(溶液A)进行了平衡化的Sephacryl S-300(S-300)色谱柱中、利用使用溶液A进行展开的分子筛色谱法进行了分级。在该分级中,利用基于SDS-PAGE的电泳法、蛋白质印迹法而对高分子XDP与DD/E级分进行了鉴定、分离。
对于人纤维蛋白原分解产物(X、Y、D1、E3),向人纤维蛋白原(Enzyme ResearchLaboratories公司)中加入氯化钙后,添加人纤溶酶(Chromogenix公司),在37℃下反应了2小时。通过加入抑酶肽(Pentapharm.公司)使反应停止。将停止反应后的生成物填充在使用三盐酸缓冲液(pH7.5)进行了平衡化的Sephacryl S-300(S-300)色谱柱中,通过凝胶过滤法对片段X、片段Y、片段D1、片段E3进行了分级。
对于DD级分(DD)及E1+2级分(E1与E2的混合物:E1+2)的制备,将上述得到的DD/E在3mol/L尿素-50mmol/L柠檬酸(pH5.5)溶液中,在37℃下保温了4小时。然后填充至使用50mmol/L三盐酸缓冲液(pH7.4)-28mmol/L柠檬酸钠-0.1mol/L氯化钠溶液进行了平衡化的SepharoseCL-6B的色谱柱中,使用上述溶液进行了展开。利用基于SDS-PAGE的电泳法、蛋白质印迹法,对进行了分级的片段DD、片段E1及片段E2进行了鉴定、分离。牛及羊的DD/E及D1也以相同的方式进行了制备。以Varadi A.and Scheraga H.A.的方法(Biochemistry 25:519-28,1986)为基准进行了人D3的制备。将各个级分的示意图示于图1-A~图1-C。
所述各个级分基本悬浊在pH8.0的含有0.9%NaCl的50mmol/L三缓冲液(以下,记作TBS)中。各分解产物的纯度通过还原·非还原条件下的蛋白质印迹法、HPLC进行确认,由280nm处的分子吸光系数确定了各级分的蛋白质质量(樱井等,日本检查血液学会杂志16:128-135,2015)。
《实施例2:单克隆抗体的制作》
以人DD/E作为免疫原,使用Kohler与Milstein的方法(Nature 256:495-7,1975.)制作了单克隆抗体。使用极限稀释法,将克隆的杂交瘤的培养上清分注在将抗鼠IgG进行了固相化的96孔微孔板上。选择了与DD/E进行反应、而不与纤维蛋白原及纤维蛋白原分解产物(X、Y、D1、E3)进行反应的抗体(MIF-220)。
《实施例3:MIF-220抗体的表位的解析》
(1)利用ELISA的对纤维蛋白/纤维蛋白原分解产物的反应性的解析
在96孔微孔板中分注MIF-220抗体溶液,在室温下静置1小时以上,使用pH7.0的含0.05%聚氧乙烯(20)失水山梨醇单月桂酸酯的0.1mol/L磷酸缓冲液(以下,记作T-PBS)进行清洗,使用含0.3%牛血清白蛋白(BSA)的T-PBS进行了阻断(block)。将各种抗原分注在各孔中后,在室温下静置了1小时。然后,在使用T-PBS进行清洗后,加入使用含0.3%BSA的T-PBS进行了5000倍稀释的过氧化物酶标记抗人纤维蛋白原抗体,在室温下静置1小时,使用T-PBS进行清洗后,加入TMB(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺)试剂,以450nm测定了显色。另外,对吸光度超过0.2的抗原,判断其具有反应性。
将结果示于表1-A。
[表1-A]
OD(450nm)
MIF-220抗体与XDP(高分子XDP及DD/E)进行反应,但不与纤维蛋白原及作为其分解产物的各个X、Y、D1、E3进行反应。此外,不与利用尿素使DD/E解离而分离的DD、E1+2进行反应,但与DD与E1+2的混合物(再构建物)进行反应。
(2)基于蛋白质印迹法的解析
将纤维蛋白原、高分子XDP、DD/E、DD、E1+2、X、Y、D1、E3分别供于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)中,转印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜后,测定了MIF-220抗体对各抗原、或抗人纤维蛋白原抗体对各抗原的反应性。
在非还原条件下利用蛋白质印迹法研究了所述抗原与抗体的反应性,结果MIF-220抗体未与任何抗原进行反应。此外,即使在不存在SDS的条件下进行的蛋白质印迹法中,也未与上述的各抗原进行反应。
《实施例4:MIF-220抗体对D-E-D复合物的反应性》
(1)基于E-D结合的再构建的解析(对D1与E的反应性)
将悬浊于TBS的人D1与人E1+2或人E3进行混合,在37℃下反应30分钟,对E-D结合进行再构建,利用Superdex200HR色谱柱(GE Healthcare)进行分级,与DD/E、D1、E1+2的保持时间进行了比较。此外,利用ELISA评价了与抗体的反应性。对于来自其他动物种类的级分也以同样的方式进行了研究。
将利用ELISA研究的MIF-220抗体对D-E-D复合物的反应性的结果示于表1-B。
MIF-220抗体未与D1、E1+2、E3分别进行反应,而与D1与E1+2的混合物(再构建物)进行了反应。但其未与D1与E3的混合物(再构建物)进行反应。
[表1-B]
OD(450nm)
使用Superdex200HR色谱柱对人D1与人E1+2的混合物进行了分级,结果如图2-A所示,确认到了新的峰A及B。峰A的保持时间与DD/E的保持时间基本一致,峰B的保持时间在DD/E与D1的中间。另一方面,如图2-B所示,在人D1与人E3的混合物中未确认到新的峰。
(2)人、牛或羊的D1与人E1+2的反应性
利用ELISA评价了MIF-220抗体与各种哺乳动物的DD/E的反应性、或人、牛或羊的D1与人E1+2的反应性,将结果示于表2。
MIF-220抗体与人DD/E进行反应,但未与牛或羊DD/E进行反应。另一方面,将人E1+2与人、牛或羊D1混合时,MIF-220抗体与任意的混合物都进行了反应。另外,在表中,将人(human)抗原记为了h,将牛(bovine)抗原记为了b,将羊(ovine)抗原记为了o。
[表2]
OD(450nm)
将使用Superdex200HR色谱柱对牛D1与人E1+2的混合物、或者羊D1与人E1+2的混合物进行分级的结果分别示于图3-A、图3-B。
与人D1和人E1+2的混合物的情况(图2-A)相同,出现了相当于峰A及B的两个新的峰,确认到了人E1+2超越了动物物种间的差异与来自牛或羊的D1形成了D-E-D复合物。
《实施例5:对DD/E与D-E-D复合物的反应性的Ca2+依赖性的解析》
将人DD/E或在图2-A的峰A处得到的人D-E-D复合物0.3μg/mL悬浊于Ca2+浓度2mmol/L、EDTA浓度0.2mmol/L的缓冲液中,使其与固相化MIF-220抗体反应,利用ELISA进行了检测。将结果示于图4。
人DD/E的反应性未受Ca2+浓度、EDTA浓度较大影响,但对于D-E-D复合物,Ca2+浓度为2mmol/L时的反应性基本与DD/E相同,但当Ca2+浓度小于2mmol/L时,D-E-D复合物的反应性显著减小,当EDTA为0.2mmol/L以上时,反应性基本为空白的程度。
上述的解析显示,以人DD/E作为免疫原而取得的单克隆抗体MIF-220单克隆抗体与交联纤维蛋白分解产物XDP进行反应,但不与纤维蛋白原及纤维蛋白原分解产物(X、Y、D1、E3)进行反应,因此其为在XDP:(DD/E)n上对特征性结构进行识别的抗体。使作为XDP最小单位的DD/E(图1-C的e)解离为DD(图1-C的f)和E1+2(图1-C的g)时,对各个解离产物的反应性消失,且在蛋白质印迹法中不与XDP及纤维蛋白原分解产物中的任何抗原进行反应,因此显示MIF-220抗体为对通过E-D结合产生的立体结构进行识别的抗体。
Olexa等人报告指出,若将DD与E1+2混合,则E-D再度结合形成DD/E,在本研究中,显示了即使使用D1代替DD,仍同样地可对E-D结合进行再构建(图2-A)。通过参照DD/E的保持时间,认为图2-A所示的峰A为D-E-D的结构(图1-C的k),峰B为D-E的结构(图1-C的l)。另一方面,在相同作者的报告中显示E3不与DD结合,在本研究中,如图2-B所示,未观测到E-D结合(如图1-C的h所示,由于在E3上既不存在A反应基,也不存在B反应基,因此即使与D1进行混合也不生成D-E-D复合物、D-E复合物,故而未与MIF-220抗体进行反应)。
为了调查MIF-220抗体的表位存在于D区域与E区域的哪一处,使用人、牛及羊的DD/E、人、牛及羊的D1与人E1+2对E-D结合的再构建进行了研究。人、牛及羊的D1与人E1+2在任意的组合中均生成了D-E-D复合物(图2-A、图3-A、图3-B),由此可确认种间差不影响E-D结合。然而,MIF-220抗体在混合人E1+2与人、牛及羊D1的情况下进行反应,但不与牛及羊DD/E进行反应,因此显示在MIF-220抗体的反应中,人E区域是重要的(表2)。以上的结果显示,MIF-220受到凝血酶的作用,其为对通过E-D结合而在人E区域上新出现的立体结构进行识别的抗体。
在同一蛋白质质量中,在Ca2+存在下,DD/E、D-E-D复合物对MIF-220抗体的反应性基本相同,但在EDTA存在下,与DD/E相比,对D-E-D复合物的反应性显著减小。认为如图1-C的e、k所示,DD/E与D-E-D的不同在于D与D之间的交联结构,通过交联,DD/E在Ca结合部位的Ca结合力强于D-E-D复合物。
在本发明中,可在两个阶段使用螯合剂。例如,可在采血时使用柠檬酸等作为必要的螯合剂,在XDP测定时使用与采血时不同的螯合剂或以不同的浓度进行测定。特别是发现了通过在试剂中添加螯合剂从而减小钙的影响,由此可提高抗体的特异性,进行正确的测定。
DD/E为构成XDP的最小单位(图1-B的d、图1-C的e),D-E-D复合物为表现纤维蛋白聚合物分解产物特征的最小结构(图1-A的c),认为通过抑制MIF-220抗体对D-E-D复合物的反应性,可将本抗体临床应用于XDP检测。
工业实用性
本发明的测定试剂及测定方法例如可利用于作为弥散性血管内凝固症候群(DIC)的诊断标记而有用的交联纤维蛋白的纤溶酶分解产物(XDP)的测定中。
以上,根据特定的方式对本发明进行了说明,但对于本领域技术人员而言显而易见的变形或改良也包含在本发明的范围中。
Claims (1)
1.钙螯合剂在制备特异性测定交联纤维蛋白的纤溶酶分解产物(XDP)的试剂中的应用,所述试剂含有:
(1)与交联纤维蛋白的纤溶酶分解产物(XDP)进行反应,并且不与纤维蛋白原及作为其纤溶酶分解产物的片段X、片段Y、片段D1、及片段E3进行反应的抗XDP抗体;及
(2)钙螯合剂,
其中
所述钙螯合剂为EDTA,
所述抗XDP抗体与由E1和/或E2片段、D1片段再构建的D-E-D复合物反应,
其中所述钙螯合剂EDTA的存在使得所述抗XDP抗体与所述D-E-D复合物的反应性减少,
所述试剂用于制备XDP与所述抗XDP抗体的反应体系,在所述反应体系中,EDTA的浓度为0.2mmol/L以上。
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