DE69009497T2

DE69009497T2 - Mit zellularer apoptosis assoziiertes zelloberflächenantigen.

Info

Publication number: DE69009497T2
Application number: DE69009497T
Authority: DE
Inventors: Peter H. D-6900 Heidelberg Krammer
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Current assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date: 1990-01-19
Filing date: 1990-01-19
Publication date: 1994-11-24
Anticipated expiration: 2010-01-20
Also published as: DE69009497D1; EP0511202A1; EP0511202B1

Description

Zelloberflächenmoleküle spielen kritische Rollen bei der Wachstumskontrolle von Lymphocyten. Solche Moleküle können als Rezeptoren für die wachstumsstimulierenden Cytokine funktionieren oder können mit Rezeptoren assoziiert sein und Signale, die für die Regulation des Wachstums wesentlich sind, übertragen. Die Blockade des Rezeptors oder die Entfernung der stimulierenden Cytokine kann zu einem erniedrigten Lymphocyten Wachstum führen. Beispielsweise erniedrigt der Entzug der Interleukine das Wachstum der menschlichen Lymphocyten und führt schließlich zu einer charakteristischen Form des Zelltods, welche "programmierter Zelltod" oder Apoptose genannt wird. E. Duvall und H. H. Wyllie, Immunol Today 7, 115 (1986). Apoptose ist die häufigste Form des Tods von eukaryontischen Zellen und kommt bei der Embryogenese, bei der Metamorphose, der Gewebsatrophie und der Tumorregression vor. A.H Wyllie, J.F.R. Kerr, A.R. Currie, Int. Rev. Cytol. 68, 251 (1980). Sie wird auch durch die cytotoxischen T-Lymphocyten und die natürlichen Killerzellen und Killerzellen, durch Cytokine, wie den Tumornecrosefaktor (TNF) und das Lymphotoxin (LT) und durch Glucocorticoide induziert. Die charakteristischen Zeichen der Apoptose sind die Segmentierung des Zellkerns, die Verdichtung des Cytoplasmas, Bildung von Membranbläschen (Zeiose) und die Fragmentierung der DNA in Multimere zu etwa 180 Basenpaaren (genannt eine "DNA-Leiter").
Jüngst wurde gezeigt, daß Anti-CD3 die Apoptose von unreifen Thymocyten in vitro induziert. C.A. Smith et al., Nature 337, 181 (1989). Es wurde vorgeschlagen, daß eine CD3-getriggerte Apoptose für die negative Selektion der T-Zellen im Thymus verantwortlich sein könnte.
Die selektive Induktion der Apoptose in Zellen, wie erkrankten Zellen, könnte sich als ein nützliches therapeutisches Mittel erweisen.
Die durch monoklonale Antikörper vermittelte Tumorregression durch Induktion von Apoptose ist in Science, Band 245, Juli 1989, S. 301-305, beschrieben.
Die Erfindung betrifft die Verwendung eines Antikörpers, der spezifisch an ein mit der zellulären Apoptose assoziiertes Antigen unter für die Antikörper vermittelte zelluläre Apoptose geeigneten Bedingungen bindet, zur Herstellung eines therapeutischen Präparats, zur Hemmung der Proliferation einer durch das HTLV-1-Virus infizierten Zelle sowie die Verwendung eines Antikörpers, der spezifisch an ein mit der zellulären Apoptose assoziiertes Antigen unter für die Antikörper vermittelte, zelluläre Apoptose geeigneten Bedingungen bindet, zur Herstellung eines therapeutischen Präparats, zur Abtötung eines wesentlichen Prozentsatzes einer Population von durch das HTLV-1-Virus infizierten Zellen.
APO-1 ist mit der zellulären Apoptose assoziiert und besitzt ein Molekulargewicht von etwa 52 kD und wird von aktivierten und malignen, lymphoiden Zellen exprimiert. Die Bindung eines Antikörpers an APO-1 induziert die Apoptose und so können Antikörper oder analoge Bindungsmittel verwendet werden, um die Wachstumshemmung oder Apoptose in Zellen, wie lymphoiden Tumorzellen, die das APO-1-Antigen tragen, zu induzieren.
Die Fig. 1 zeigt ein Autoradiogramm eines SDS-Polyacrylamid-Elektrophoresegels zur Bestimmung des Molekulargewichts von APO-1.
Die Fig. 2 zeigt die Induktion der Wachstumshemmung und Apoptose durch Anti-APO-1.
Die Fig. 3 zeigt die Anti-APO-1-induzierte Regression eines Lymphoms bei Mäusen.
Die Fig. 4 zeigt die Lokalisation eines Anti-APO-1-Antikörpers in Heterotransplantaten eines lymphoiden Tumors.
Das APO-1-Antigen ist ein zelluläres Membran-Antigen mit einem Molekulargewicht gemäß der SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese von etwa 52 kD. APO-1 wird von aktivierten normalen, menschlichen, lymphoiden Zellen und lymphoiden Tumorzellen einschließlich B-Zellen, T-Zellen und von HTLV-1-assoziierten, malignen Zellen, wie adulten T-Zell-Leukämiezellen, exprimiert. Die Bindung des Anti-APO-1-Antikörpers an Zellen, die APO-1 exprimieren, führt zu einer Wachstumshemmung und/oder Apoptose. Dieser Effekt ist komplementunabhängig und wird nur durch den Antikörper allein vermittelt.
APO-1 kann aus der Zellmembran von Zellen (wie lymphoide Zellen), die das Antigen exprimieren, nach herkömmlichen Techniken isoliert werden. Ferner kann das Gen, das APO-1 codiert, cloniert und exprimiert werden, um das isolierte Antigen oder einen Teil davon zu ergeben. Isoliertes APO-1 kann als Immunogen verwendet werden, um einen Anti-APO-1- Antikörper (polyclonal oder monoclonal) zu erzeugen oder um nach der Produktion von Anti-APO-1-Antikörpern durch Hybridome, von chimeren Anti- APO-1-Antikörpern durch transfizierte Myelomazellen oder von einkettigen Anti-APO-1-Antikörpern durch transformierte Bakterienzellen zu suchen.
Antikörper, die an APO-1 binden, sind zur Induktion der Hemmung des Zellwachstums oder Apoptose in Zellen, die APO-1 exprimieren nützlich. Zu diesem Zweck sind monoclonale Anti-APO-1-Antikörper bevorzugt. Monoclonale Anti-APO-1-Antikörper werden von kontinuierlichen (immortalisierten), stabilben antikörperproduzierenden Zellinien produziert. Die bevorzugten antikörperproduzierenden Zellinien sind Hybridomazellinien. Im Prinzip können jedoch die Zellinien von beliebigen Zellen abgeleitet sein, die funktionell neu angeordnete Gene, die verschiedene Regionen der leichten und/oder schweren Ketten einer Anti-APO-1-Spezifität codieren, enthalten und sie exprimieren können. Bevorzugt sollte die Zellinie die Fähigkeit besitzen, die Kette (im Falle eines einkettigen Antikörpers) oder Ketten zu funktionellen Antikörpern oder Antikörperfragmenten zusammenzubauen. So sind lymphoide Zellen, die natürlicherweise Immunglobulin produzieren, bevorzugt.
Hybridomazellen, die monoclonale Anti-APO-1-Antikörper produzieren, können nach dem Standard-Hybridisierungsverfahren für somatische Zellen nach Kohler und Milstein, Nature 256: 495 (1975), hergestellt werden. Kurz ausgedrückt ist ein Verfahren wie folgt: die monoclonalen Anti-APO- 1-Antikörper werden durch Immunisieren eines Tieres mit ganzen Zellen, die APO-1 tragen oder Membranen dieser Zellen, produziert. Alternativ können die Tiere mit gereinigtem oder teilgereinigtem APO-1 oder Peptidsegmenten, die ein oder mehrere immunogene Epitope von APO-1 tragen, immunisiert werden. Solche Peptide können synthetisiert und an Trägerprotein, wie Napfschneckenhämocyanin, konjugiert werden, um als Immunogen verwendet zu werden.
Das bevorzugte Tier für die Immunisierung ist die Maus. Verschiedene Immunisierungsprotokolle können verwendet werden. Beispielsweise können den Mäusen etwa 107 APO-1-tragende Zellen einmal pro Woche im Verlauf einer vierwöchigen Zeitspanne durch intraperitoneale Injektion verabreicht werden.
Antikörperproduzierende, lymphoide Zellen (z.B. Milzlymphocyten) werden dann von dem immunisierten Tier erhalten und mit immortalisierenden Zellen (bevorzugt ein Myelom oder Heteromyelom) fusioniert. Viele geeignete Myelomazellinien sind auf dem Fachgebiet bekannt. Zur Produktion von Maushybridomen ist ein Beispiel das Myelom P3. X63.Ag8-653. Vergleiche Kohler und Milstein, a.a.O. Die Fusion zwischen den Milzzellen und dem Fusionspartner kann in Gegenwart von Polyethylenglykol nach etablierten Verfahren durchgeführt werden. Techniken der Elektrofusion können ebenfalls verwendet werden.
Die so erhaltenen Hybridzellen werden clonal gezüchtet und dann auf die Produktion von Anti-APO-1-Antikörpern abgesucht. Die Hybridome können auf die Sekretion von Antikörpern, die die Apoptose induzieren, gegen eine Zellinie, die das APO-1-Antigen exprimiert, abgesucht werden. Ein Beispiel für eine solche Zellinie ist die maligne, menschliche B-Zellinie SKW6.4. Zusätzliche Zellinien sind in der nachstehenden Tabelle 1 dargestellt. Gereinigtes oder teilgereinigtes APO-1 kann zum Absuchen auf Hybridome, die Antikörper mit APO-1-Spezifität sezernieren, nach Standard-Immunoadsorbantassays verwendet werden.
Obwohl tierische Antikörper für die menschliche Therapie verwendet werden können, kann es bevorzugt sein, tierische Antikörper in eine Form umzuwandeln, die von einem Menschen besser vertragen wird. Monoclonale Antikörper, die in Mäusen oder anderen Tiersystemen produziert werden, können in chimere Tier/Mensch-Antikörper oder in "annähernd menschliche" Antikörper nach Standardtechniken umgewandelt werden.
APO-1-bindende Fragmente oder Analoga von Anti-APO-1-Antikörpern können ebenfalls produziert werden. Beispielsweise können Antikörperfragmente, wie F(ab')&sub2;, Fab und Fv durch enzymatische Spaltung produziert werden. Zusätzlich können synthetische Oligopepetide, die Fab- und Fv- Analoga (einkettige Antikörper) darstellen, in Bakterienzellen auf gentechnischem Weg produziert werden.
Die Antikörper können verwendet werden, um die Wachstumshemmung oder Apoptose in lymphoiden Zellen (normal oder malignen) oder anderen Zellen, die APO-1 tragen, zu induzieren. Beispielsweise kann ein Anti- APO-1-Antikörper verwendet werden, um Tumore, die das APO-1-Antigen tragen zu behandeln. Wie vorstehend erwähnt, können die Wachstumshemmung und/oder Apoptose durch Antikörper in verschiedenen Typen von Lymphoidzellentartungen, die APO-1 exprimieren, induziert werden. Diese Lymphoid zellentartungen umfassen Entartungen der B- oder T-Zellymphocyten. Insbesondere kann adulte T-Zelleukämie, ein HTLV-1-assoziierter Tumor mit einem Anti-APO-1-Antikörper behandelt werden. Zusätzlich sind nichtlymphoide Tumore, die APO-1 tragen, Kandidaten für die Antikörpertherapie.
Die Anti-APO-1-Antikörper werden einem Tumorpatienten in einer Menge, die die Wachstumshemmung oder Apoptose von APO-1-tragenden Zellen induziert, verabreicht. Effektive Anti-Tumordosen oder Dosierungsschemata können für die verschiedenen Tumortypen bestimmt werden. In allgemeinen können die Antikörper intravenös in einem pharmazeutischen Träger, wie Kochsalzlösung, verabreicht werden.
Lymphoide Tumore, die APO-1 exprimieren, können auch extrakorporal behandelt werden. Blutzellen oder Blutleukocyten werden dem Patienten entnommen und mit Anti-APO-1-Antikörpern in Mengen, die zur Verringerung oder Beseitigung der Tumorzellen ausreichen, in Kontakt gebracht. Nach der Behandlung werden die Blutzellen oder Leukocyten in den Patienten zurückgeführt.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiele

Beispiel 1

Verfahren

Produktion von Anti-APO-1-Antikörpern

Balb-C-Mäuse wurden einmal wöchentlich im Verlauf einer vierwöchigen Zeitspanne durch intraperitoneale Injektion von 1 x 10&sup7; SKW6.4-Zellen immunisiert. Vier Tage nach der letzten Injektion wurden Milzzellen aus den immunisierten Tieren mit dem P3.X63.Ag8.653-Myelom[G. Kohler und C. Milstein, Nature 256, 495 (1975)] fusioniert. 12 Tage nach der Fusion wurden die Kulturüberstände aus den Vertiefungen, die für das Wachstum von SKW6.4-Zellen positiv waren, auf ihre Fähigkeit, das Wachstum von SKW6.4-Zellen zu hemmen, getestet. Hybridome, die blockierende monoclonale Antikörper (MAks) produzierten, wurden dreimal durch Grenzverdünnung in einer Konzentration von 0,5 Zellen pro Vertiefung cloniert. Die MAks wurden aus serumfreiem Kulturüberstand mittels einer Protein A-Diasorbsäule (Diagen, Düsseldorf, BRD) gereinigt. Die gebundenen MAks wurden mit 0,1 M NaCl und 0,1 M Glycin, pH 2,8, eluiert, gegen phosphatgepufferte Kochsalzlösung dialysiert und sterilisiert. Der Isotyp der MAks wurde mit einem Enzym-linked-Immunosorbentassay [S. Kiesel, et al., Leuk. Res. 11, 1119 (1987)] mit dem isotypspezifischen Ziege-Anti-Maus-Ig, der mit Meerrettichperoxidase konjugiert worden war (Dunn, Asbach, BRD) bestimmt.

Bestimmung der Bindungsaffinität und der Anzahl der Bindungsstellen

Die Affinität und die Anzahl der Anti-APO-1-Bindungsstellen pro Zelle wurden in einer Scatchard-Analyse, wie beschrieben [I. von Hoegen, W. Falk, G. Kojouharoff, P.H. Krammer, Eur. J. Immunol 19, 239 (1989)], bestimmt. Kurz ausgedrückt, wurden die MAks nach dem IODO-GEN-Verfahren [P.J. Fraken und J.C. Speck, Biochem. Biophys. Resp Commun. 80, 849 (1989)] iodiert. Aliquote von 5 x 10&sup6; Zellen wurden in 200 ul Kulturmedium, enthaltend 0,1 % NaN&sub3; und unterschiedlicher Konzentrationen von ¹²&sup5;I-markierten MAks resuspendiert. Nach 4-stündiger Inkubation bei 4ºC wurden zwei 95 ul Aliquote entfernt und, wie vorstehend von Hoegen et al beschrieben, zentrifugiert.

SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) zur Bestimmung des Molekulargewichts

Zellen (3 x 10&sup6;) wurden mit 60 uCi &sup7;&sup5;Se-markiertem Methionin (Amersham, Braunschweig, BRD) in 6 ml methioninfreiem Kulturmedium (Biochrom, Berlin) 48 h lang markiert. Nach dem Waschen wurden die Zellen entweder mit einem Kontroll-MAk oder Anti-APO-1 (1 ug/ml) bei 4ºC 45 min lang inkubiert. Die Zellen wurden gewaschen und in Lysepuffer (tris-gepufferte Kochsalzlösung, pH 7,3, 1 % Nonidet P-40, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 0,1 % Aprotinin) bei Raumtemperatur 30 min lang resuspendiert. Die Lysate wurden zentrifugiert, und die Überstände wurden mit Protein A-Sepharosekugeln (Pharmacia, Uppsala, Schweden) bei 4ºC 1 h lang inkubiert. Die Immunkomplexe wurden viermal mit Puffer (tris-gepufferte Kochsalzlösung, pH 7,3, 0,25 % Nonidet P-40) gewaschen und in SDS-PAGE-Probenpuffer, enthaltend 5 % SDS und 5 % 2-Mercaptoethanol, resuspendiert. Die Proben wurden auf 95ºC erhitzt zentrifugiert und die Counts pro min der Überstände wurden in einem γ-Counter bestimmt. Eine Gesamtmenge von 15.000 cpm wurde auf jede Bahn gegeben und mit einer 10%igen SDS-PAGE (V.K. Laemmli, Nature 277, 680 (1970)) analysiert. Das Gel wurde getrocknet und einer Autoradiografie unterworfen. Das Autoradiogramm ist in Fig. 1 gezeigt; die Banden geben die Immunpräzipitation des biosynthetisch markierten APO-1 mit entweder dem im Isotyp passenden Kontroll-MAk (linke Bahn) oder dem Anti-APO-1 (rechte Bahn) wieder. Die Ziffern am linken Rand geben die Positionen der Größenmarker an.

Induktion der Wachstumshemmung und Apoptose durch Anti-APO-1

(A) Die T-Zellinie CCRF-CEM.S2 wurde in Gegenwart von gereinigtem MAk (1 ug/ml) in einer Mikrotiterplatte 2 h lang vor der Fotografie gezüchtet (linker Abschnitt der Fig. 2, Kontroll-MAk 13BI; rechter Abschnitt, Anti-APO-1). Der Subclon CCRF-CEM.S2 wurde durch Clonieren der Zellen unter Bedingungen für die Grenzverdünnungen aus der T-Zellinie CCRF-CEM.S2 mit einer Zelle pro Vertiefung in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen erhalten. CCRF-CEM.S2 wurde wegen ihrer hohen Empfindlichkeit gegenüber dem durch APO-1 (500 ng/ml) hervorgerufenen programmierten Zelltod, gemessen durch mikroskopische Betrachtung in einer 4-Stunden- Kultur ausgewählt. (B) CCRF-CEM.S2-Zellen (10&sup6; pro ml) wurden mit dem MAk (1 ug/ml) in einem Kulturmedium bei 37ºC inkubiert. Zu verschiedenen Zeiten wurden Aliquote von 10&sup6; Zellen entfernt, und die DNA wurde hergestellt. (In Fig. 2B steht M für Marker, I für Kontroll-MAk 13BI 2 h, die Bahnen 3 bis 7 für Anti-APO-1 für die angegebenen Zeiten). (C) SKW6.4-Zellen wurden jeweils mit dem bezüglich des Isotyps passenden Kontroll MAk FII20 ( ), FII23 (nicht-bindender MAk) (o) oder Anti-APO-1 ( ) in Mikrokulturen 24 h vor der Markierung mit [³H] Thymidin 4 h lang inkubiert. Die Daten geben den Mittelwert von zwei Kulturen mit einer Variation von weniger als 5 % an. Die Zellen wurden in RPMI 1640-Medium (Gibco, Grand Island, New York), daß mit 2 mM L-Glutamin, Streptomycin (100 ug/ml), Penicillin (100 E/ml), 20 mM Hepes-Puffer, pH 7,3 und 10 % hitzeinaktiviertem, fötalem Rinderserum (Conco Lab-Division, Wiesbaden, BRD) supplementiert war, gezüchtet. Für die Mikrokulturen wurden 1 x 10&sup4; Zellen pro Vertiefung in doppelten Ansätzen in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen mit flachem Boden (Tecnomara, Fernwald, BRD) (200 ul Endvolumen pro Vertiefung) gezüchtet. Nach 24 h wurden die Zellen mit 0,5 uCi [³H] Thymidin (Amersham, Braunschweig, BRD) 4 h lang markiert. Vor dem Ernten wurden die Mikrokulturen durch mikroskopische Betrachtung untersucht. 1 x 10&sup8; Zellen mit DNA-Fragmentierung wurden mit kalter, phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen und mit NTE-Puffer, pH 8 (100 mM NaCl, 10 mM tris, 1 mM EDTA), enthaltend 1 % SDS und Proteinase K (0,2 mg/ml) aufgebrochen. Nach 24-stündiger Inkubation bei 37ºC wurden die Proben zweimal mit Phenol plus Chloroform (1:1, Vol/Vol) extrahiert und durch Ethanol gefällt. Die DNA wurde in 38 ul NTE-Puffer aufgelöst und mit Ribonuclease (1 mg/ml) 30 min lang bei 37ºC gespalten. Jeder Probe wurden 10 ul Ladungspuffer, enthaltend 15 % Ficoll 400 (Pharmacia, Uppsala, Schweden), 0,5 % SDS, 50 mM EDTA, 0,05 % Bromphenolblau, 0,05 % Xylolcyanol in TBE-Puffer (2 mM EDTA, 89 mM Borsäure, 89 mM tris, pH 8,4) zugesetzt. Das Gemisch wurde auf ein 1%iges Agarosegel geladen und nach der Elektrophorese mit Ethidiumbromid (0,5 ug/ml) angefärbt. Der Größenmarker war mit HindIII und EcoRI-gespaltene λ-DNA.

Reaktivität von Anti-APO-1 mit verschiedenen Zellen

Aliquote von 10&sup8; Zeilen wurden bei 4ºC in 100 ul Medium mit einem Kontroll-MAk (FII23 oder 13BI) oder Anti-APO-1 30 min lang inkubiert. Dann wurden die Zellen gewaschen und mit Fluoresceinisocyanat-gekoppelten Ziege-Anti-Maus-IgF(ab')&sub2; (70 ug/ml) gefärbt und mittels eines Cytofluorografen (Ortho Diagnostic Systems, Westwood, Massachusetts) analysiert.
Zur Bestimmung der Wirkung von Anti-APO-1 auf die Aufnahme von tritiiertem Thymidin wurden die Zellen (10&sup4; pro Kavität) in Gegenwart des MAks (500 ng/ml) 24 h lang gezüchtet und 2 h lang vor der Ernten mit [³H] Thymidin markiert. Die Daten in Tabelle 1 geben den Mittelwert der Doppelkulturen mit einer Variation von weniger als 5 % an.
Leukämiezellen von Patienten wurden wie folgt erhalten. Knochenmarkszellen, die von den Patienten isoliert wurden, waren morphologisch zu mehr als 95 % Stammzellen und zeigten den folgenden Phänotyp: prä T-ALL, cytoplasmatisch CD3&spplus;, CD5&spplus;, CD7&spplus;, CD34&spplus;, Tdt&spplus;, CD2&supmin;, Oberfläche CD3&supmin;, CD4&supmin; und CD8&supmin;, T-ALL, CD2&spplus;, cytoplasmatisch CD3&spplus;, CD5&spplus;, CD7&spplus; und Tdt&spplus;, Oberfläche CD3&supmin;, CD4&supmin;, CD8&supmin; und CD34&supmin;, allgemein ALL CD10&spplus;, CD19&spplus;, CD22&spplus;, CD24&spplus;, CD20&spplus;. Die Wirkung von Anti-APO-1 auf diese Leukämiezellen wurde nicht getestet, weil sie unter normalen Kulturbedingungen abstarben.
Normale menschliche Lymphocyten wurden wie folgt erhalten. Periphere mononukleare Blutzellen (PBMC) aus gesunden Freiwilligen wurden durch Ficoll Paque (Pharmacia Inc., Uppsala, Schweden) dichter Zentrifugation isoliert. Die anhaftenden Zellen wurden durch Adhäsion an Plastikkulturgefäße über Nacht entfernt. Die T-Zellen wurden aus PBMC durch Rosettenbildung mit 2-Aminoethylisothiuronium-bromid (AET)-behandelte Schaferythrocyten, wie beschrieben (20), isoliert. Frisch hergestellte, ruhende T-Zellen (2 x 10&sup6; pro ml, 96 % OKIII&spplus;, 1 % Tac&spplus;) wurden mit Phytohemagglutinin-M (50 ug/ml) und PMA (10 ng/ml) (Sigma Chemical Co., München, BRD) aktiviert. 2, 7 und 12 Tage später wurden die T-Zellen mit 20 bis 30 E/ml oder rekombinantem, menschlichem Interleukin- 2 (20 bis 30 E/ml) beschickt. Die T-Zellen (5 x 10&sup5; pro ml), die 12 Tage lang aktiviert worden waren (90 % OKTII&spplus;, 60 % Tac&spplus;) wurden in Gegenwart von FII23 oder Anti-APO-1 (1 ug/ml) in drei Ansätzen 24 h lang gezüchtet und dann mit [³H]Thymidin weitere 17 h lang markiert (siehe vorstehend).
Ruhende B-Zellen (38,8 % CD19&spplus;) wurden durch zwei Runden Rosettenbildung, wie vorstehend beschrieben, mit einer anschließenden Trennung über eine Sephadex -G-10-Säule, wie beschrieben, isoliert. T.R. Jerrels, J.H. Dean, G.L. Richardson, D.B. Herberman, J. Immunol. Methods 32, 11 (1980). Vür die aktivierten B-Zellen wurde PBMC auf 2 x 10&sup6; Zellen pro ml eingestellt und in Gegenwart des Kernes Mitogens in einer Konzentration von 10 ug/ml (Serva, Heidelberg, BRD) 6 Tage lang gezüchtet. Die toten Zellen und die T-Zellen wurden dann durch Rosettenbildung mit AET- behandelten Schaferythrocyten und anschließende Zentrifugation über Ficoll Plaque entfernt. Die Interphasenzellen wurden als aktivierte B-Zellen (84 % sIgM+) verwendet.

Wirkung von Anti-APO-1 auf das Tumorwachstum in vivo

BJAB-Zellen (4 x 10&sup7;) wurden subkutan in die linke Flanke von ηu/ηu Mäusen injiziert. Nach 5 Wochen (Tag 0) wurden den Mäusen 500 ug MAk in die Schwanzvene injiziert. Die Ergebnisse sind grafisch in Fig. 3 gezeigt. Kontroll-MAk FII20 ( ); FII23 (o); I3BI (Δ) und Anti-APO-1 ( ). 14 Tage später wurde die Größe der Tumoren an der Basise des Tumors gemessen; die Tumore aus den einzelnen Mäusen sind durch Punkte angegeben.

Lokalisation von Anti-APO-1 in Tumorfremdtransplantaten

Die Lokalisation von Anti-APO-1 in Fremdtransplantaten von BJAB in ηu/ηu-Mäusen und die Induktion der Apoptose des Tumors ist in Fig. 4 gezeigt. Fig. 1A, obere Reihe, zeigt die Aufnahme von ¹²&sup5;I-markiertem Anti-APO-1-MAk (50 ug, 50 uCi pro Maus) in den Tumor bei 12 h (1), 48 h (2) und 96 h (3) nach der intravenösen Injektion des MAks. Die untere Reihe zeigt die Aufnahme des ¹²&sup5;I-markierten Anti-APO-1-MAk (500 ug, verwendet für die Therapie; 50 uCi pro Maus) (4) und FII20 (Kontroll-MAk bindet an BJAB, 50 ug, 50 uCi pro Maus) (5) bzw. des ¹²&sup5;I-markierten FII23 (Kontroll-MAk, bindet nicht an BJAB, 50 ug, 50 uCi pro Maus) (6) in 48 h.
10 Tage nach der intravenösen Injektion von 500 ug MAk pro Maus wurde das verbleibende Tumorgewebe entnommen und mit Formalin fixiert. Paraffinschnitte des Tumors wurden mit Hämatoxylin/Eosin angefärbt.
In Fig. 4B zeigt der linke Abschnitt den Tumor nach der Behandlung mit dem Kontroll-MAk FII20; der rechte Abschnitt zeigt den Tumor nach der Behandlung mit Anti-APO-1. Pfeile zeigen Wirtsgefäße an. (Endvergrößerung x 92). Die MAks wurden nach dem IODO-Gen-Verfahren (siehe vorstehend) min Radioiod markiert. Die markierten MAks wurden in die Schwanzvene injiziert und die Tiere wurden durch Etheranästesie zu vorbestimmten Zeitpunkten getötet. Die Tumore wurden herausgeschnitten und in Methylcellulose eingebettet und 20 um Cryotomschnitte wurden angefertigt. Die lyophilisierten Abschnitte wurden auf einem Koda-X-omat AR-Film zur Autoradiografie gegeben.

Ergebnisse und Diskussion

Ein MAk (Anti-APO-1) wurde identifiziert, der das Wachstum von SKW6.4-Zellen blockiert und deren Apoptose induziert. Der Anti-APO-1 (IgGG3, χ, KD = 1,9 x 10&supmin;¹&sup0;) band an etwa 4 x 10&sup4; Stellen auf der Oberfläche der SKW6.4-Zellen. Der Antikörper fällte spezifisch ein endogen synthetisiertes Protein-Antigen (APO-1) von den SKW6.4-Zellen aus, das unter reduzierenden Bedingungen auf der SDS-Polyacrylamid- Elektrophorese (SDS-PAGE) als Hauptbande mit 52 kD beobachtet wurde (Fig. 1). Abgesehen von Actin (43 kD), das unspezifisch mit IgG3 ausgefällt wurde, fällte Anti-APO-1 spezifisch eine Minorbande mit 25 kD aus. Dieses 25 kD-Protein könnte entweder ein Abbauprodukt oder nicht kovalent mit dem 52 kD-Protein assoziiert sein.
Es gibt zwei Hauptarten von Tod in kernhaltigen eukaryotischen Zellen. Necrose als Ergebnis beispielsweise des Angriffs des Komplements ist durch Schwellen der Zellen und Aufbrechen der Plasmamembran, verursacht durch eine Permeabilitätserhöhung, gekennzeichnet. Zellen, die Apoptose erleiden, zeigen jedoch ein unterschiedliches biochemisches und morphologisches Muster. Dieses Muster entspricht einem, das durch Anti-APO-1 induziert wurde; Kondensation des Cytoplasmas, Bildung von Membranbläschen (Fig. 2a) und endonucleaseinduzierte DNA-Fragmentierung (A.H. Wyllie, Nature 284 555 (1980)) in Multimere mit etwa 180 bp (Fig. 2b). Affinitätsgereinigtes Anti-APO-1 induzierte eine Wachstumsverzögerung und Zelltod (Fig 2c), was weder mit einem im Isotyp passenden Kontroll-MAk (FII20) [Anti-MHC(Haupthistokompatibilitätskomplex) Klasse I-Antigene] noch dem nicht-bindenden MAk FII23 beobachtet wurde. Eine Beendigung des [³H]-Thymidineinbaus zusammen mit einer erhöhten Aufnahme von Trypanbiau in die toten Zellen wurde beobachtet, und das Wachstum von 10&sup4; SKW6.4- Zellen in 200 ul Kulturen wurde um mehr als 95 % durch eine Anti-APO-1- Konzentration von nur 10 ng/ml (Fig. 2c) blockiert. Die Spezifität des Zelltods, der durch Anti-APO-1 induziert wurde, geht aus der Tatsache hervor, daß die folgenden zusätzlichen Kontroll-MAks bezüglich der Induktion der Apoptose inaktiv waren: 18 nicht-bindende und 9 bindende MAks des IgG3-Isotyps (getestet mit Immunfluoreszenz auf SKW6.4-Zellen) und eine Gruppe von MAks gegen bekannte Antigene auf der Zelloberfläche von SKW6.4-Zellen einschließlich CD19, CD20, CD22, MHC Klasse II, IgM (immunglobulin M) und dem SKW6.4-Idiotyp. Monoclonale Anti-CD19 (HD37)- Antikörper und Anti-CD22 (HD39)-Antikörper wurden freundlicherweise von B. Dorken (Polyclinik der Universität Heidelberg, BRD) und monoclonale Anti-CD20-Antikörper von G. Moldenhauer (IV Leucocyte typing workshop and conference, Wien, Österreich. 1989) bereitgestellt. Die 18 nicht-bindenden und 9 bindenden MAks des IgG3-Isotyps (getestet mit Immunfluoreszenz an SKW6.4-Zellen) und die MAks gegen MHC Klasse II, IgM und SKW6.4Ig-Idiotypen wurden im Labor der Erfinder erzeugt).
Der durch Anti-APO-1 induzierte Zelltod war komplementunabhängig und trat unter serumfreien Kulturbedingungen oder in Kulturmedium plus Serum, das 30 min lang bei 56ºC inaktiviert worden war, ein. Er unterschied sich vom Tod, der durch die komplementabhängige Lyse vermittelt wurde durch: (i) Morphologie und Bildung einer DNA-Leiter (Fig. 2, a und b), (ii) Unabhängigkeit von exogenem Ca²&spplus; und (iii) verzögerte Freisetzung von &sup5;¹Cr aus radioaktiv markierten Zielzellen. Die Kinetiken der Bildung der Membranbläschen, die durch Anti-APO-1 induziert wurden (innerhalb von 30 min, Fig. 2a), wurde durch das Vorhandensein von 10 mM EDTA oder EGTA nicht beeinflußt. Zusätzlich wurde die endonuclease-vermittelte DNA-Fragmentierung, die durch Anti-APO-1 induziert wurde, durch Blocker des Ca²&spplus;-Kanals Furamicin (50 uM) oder Nifedipin (50 uM) nicht gehemmt. Wenn mit &sup5;¹Cr-markierte SKW6.4-Zellen mit Anti-APO-1 (1 ug/ml) 2, 4, 8 und 24 h inkubiert wurden, wurde gefunden, daß die spezifische Freisetzung von &sup5;¹Cr [R.C. Duke, R. Chervenak, J.J. Cohen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 6361 (1983)] 2,9 %, 7,6 %, 21,3 % bzw. 32,5 % betrug. Die Trypanblauaufnahme wurde zu den gleichen Zeitpunkten gemessen: 2,5 % 4,7 %, 10,6 % bzw. 73,6 % der Zellen waren Trypanblau positiv. Im Gegensatz dazu betrug 2 h nach der Zugabe der MAks plus Komplement die spezifische Freisetzung von &sup5;¹Cr 108,7 % und 92,7 % der mit Trypanblau gefärbten Zellen. Diese Versuche zeigen an, daß der durch Anti-APO-1 induzierte Zelltod sich grundlegend von der antikörper- und komplementabhängigen Zellyse unterscheidet.
Um die Spezifität von Anti-APO-1 zu bewerten, wurde eine umgrenzte Gruppe von Tumorzellinien auf die Expression von APO-1 und die Empfindlichkeit gegenüber Wachstumshemmung und Apoptose abgesucht. APO-1 wurde an verschiedenen menschlichen lymphoiden B- und T-Zellinien exprimiert und wurde bei einer Gibbon- oder Maus-T-Zellinie oder einer menschlichen monocytischen Zellinie (Tabelle I) nicht gefunden. Die Anti APO-1- blockierte Proliferation der APO-1-positiven Zellinien, die in Tabelle 1 aufgeführt sind, über die Induktion von Apoptose und die Bildung einer DNA-Leiter wurden in jedem Fall beobachtet. 2 h nach der Zugabe der MAks (1 ug/ml) wurde die genomische DNA jeder Tumorlinie isoliert und auf Agarosegelent wie vorstehend beschrieben, analysiert. Die Hemmung der [³H]Thymidinaufnahme durch Anti-APO-1 wurde durch Fragmentierung der genomischen DNA begleitet. Dies wurde nach der Behandlung mit dem Kon- troll-MAk (I3BI) nicht beobachtet.
Die Expression von APO-1 war nicht auf Zellinien in vitro beschränkt, sondern konnte an Leukämiezellen, die von Patienten frisch isoliert wurden, gefunden werden (Tabelle 1). Da APO-1 sich nicht auf allen Leukämiezellen fand, kann Anti-APO-1 eine Subpopulation von Leukämiearten definieren.
Die Erfinder untersuchten auch menschliche B und T-Zellen auf die Expression von APO-1. Sie wiesen kein APO-1 auf ruhenden B-Zellen nach. Jedoch wurde APO-1 an aktivierten B-Zellen (Tabelle 1) exprimiert und die IgM-Sekretion wurde etwa vierfach 3 Tage nach der Behandlung mit Anti- APO-1 verringert. Aktivierte B-Zellen (10&sup6; pro ml) wurden in Gegenwart von MAk FII23 oder Anti-APO-1 in einer Konzentration von 1 ug/ml inkubiert. Nach 3 Tagen wurden die Kulturüberstände gewonnen und die IgM- Konzentration wurde mit einem menschlichen IgM-spezifischen ELISA, enthaltend HRPO-konjugierten Ziege-Anti-menschlichen IgM (Medac, Hamburg, BRD) gemessen. Die IgM-Sekretion nach der Behandlung mit FII23 oder Anti- APO-1 betrug 2100 bzw. 550 ng/ml. Tabelle 1. Aktivität von Anti-APO-1 mit verschiedenen Zellen Zellen* Wirkung der MAks auf die [³H] Thymidinaufnahme (10³ cpm) Bezeichung APO-1 positive Zellen (%) Relative Fluoreszenzintensität (Anti-APO-1/Kontrolle) Typ Kontrolle Anti-APO-1 Hu B-Zellen Hu T-Zellen Hu-Myeloid-Zellen Gibbon T-Zellen Maus T-Zellen Prä T-ALL T-ALL allgemeine ALL T-Zellen B-Zellen Magligne Zellinie Leukämiezellen von Patienten Normale menschliche Lymphocyten ruhend aktiviert * Hu = human, ALL = akute lymphocytäre Leukämie.
Periphere ruhende T-Zellen exprimierten kein APO-1. Aktivierte T- Zellen exprimierten jedoch APO-1 und Anti-APO-1-induzierte Apoptose und Wachstumshemmung dieser Zellen (Tabelle 1). Somit legen die Daten der Erfinder nahe, daß APO-1 ein Spezies-spezifisches Antigen ist, das auf aktivierten oder maligen Lymphocyten exprimiert wird.
Die überraschende Wirkung von Anti-APO-1 in vitro regte die Erfinder an, dessen Wirkung auf das Tumorwachstum in vivo zu testen. Obwohl Eppstein-Barr-Virus (EBV)-negativ war, war das burkittartige Lymphom BJAB gegenüber Anti-APO-1 von der B-Zellgruppe in Tabelle 1 am wenigsten empfindlich und exprimierte nur etwa 1,5 x 10&sup4; APO-1-Epitope pro Zelle (4). Trotzdem wählten die Erfinder BJAB für die in vivo Versuche. Der Grund für diese Wahl war, daß nur BJAB zu großen Tumormassen in nicht-bestrahlten ηu/ηu-Mäusen wuchs. Fünf Wochen nach der Injektion von BJAB-Zellen trugen die ηu/ηu-Mäuse Tumore mit einem Durchmesser von etwa 1,0 bis 2,5 cm (Fig. 3) Diesen Mäusen wurde intravenös gereinigter Anti-APO-1 (500 ug pro Maus) oder die gleichen Mengen verschiedener im Isotyp passender Kontroll-Antikörper (FII20, Anti-MHC Klasse I-Antigene, welche 5,8 x 10&sup5; Stellen pro Zelle erkennen oder einer der beiden nicht-bindenden MAks FII23 und 13BI) injiziert. Als Kontrolle wurde auch Anti-APO-1 (500 ug pro Maus) in drei ηu/ηu-Mäuse, die den APO-1-negativen B-Zelltumor OCI.LYI mit Tumordurchmessern von 1,5, 1,8 bzw. 3,4 cm trugen, injiziert (OCI.LYI wurde von H. Messner, Ontario Cancer Institute, Toronto, Kanada bezogen) (vgl. auch Tabelle 1). Zwei Tage nach der Anti-APO-1-Injektion wurde eine weißliche Entfärbung der BJAB-Tumore beobachtet, auf die eine rasche Tumorregression folgte. Die makroskopische Tumorregression wurde bei 10 der 11 behandelten Mäuse innerhalb von weniger als 14 Tagen beobachtet. Die Kontroll-Antikörper besaßen keine Wirkung (Fig. 3). Zusätzlich wurde keine Tumorregression bei den Mäusen, die OCI.LYI trugen, wie erwartet, beobachtet. Zusätzlich wurde keine Tumorregression in Mäusen, die OCI.LYI trugen, wie erwartet, beobachtet.
Um die richtige Lokalisation und Anreicherung der injizierten Antikörper nachzuweisen, wurden markierte MAks durch Autoradiografie von Schnitten des BJAB-Tumorgewebes sichtbar gemacht (Fig. 4a). Diese Autoradiogramme zeigten eine ausgeprägte Bindung von Anti-APO-1 in der Peripherie, aber nur eine geringe Anhäufung in der Mitte des Tumors. Die Bindung des Kontroll-MAks FII20 zeigte ein qualitativ ähnliches Bindungsmuster. Es gab keine Lokalisation des nicht-bindenden Kontroll-MAks FII23 über dem Hintergrund. Ferner zeigten Versuche mit Markerpaaren (D. Pressman et al., Cancer Res. 17, 845 (1957)) mit markiertem Anti-APO-1 und FII23, daß die spezifische Anreicherung von Anti-APO-1 gegenüber FII23 in dem Tumor das 4- und 6-fache nach 48 bzw. 96 h betrug.
Der Hauptzweck der Versuche der Erfinder war die Bewertung, ob Anti-APO-1 auch in vivo wirken kann. Daher erhielten die tumortragenden Mäuse nur eine intravenöse Injektion von Anti-APO-1 in einer Dosis im Bereich, der bei den MAk-Therapien verwendet wurde. Bei anderen Therapieschemata werden jedoch die MAks wiederholt injiziert (vgl. z.B. S.L. Brown et al., Blood 73, 651 (1989)). In den Versuchen der Erfinder wurde das erneute Wachstum des BJAB-Tumors bei drei von zehn Mäusen beobachtet bei denen eine Tumorregression beobachtet worden war (Fig. 3). Das erneute Wachstum wurde am Rand des Ursprungstumors etwa 3 Monate nach der anfänglichen makroskopischen Tumorregression beobachtet. Einer dieser Tumore wurde entfernt, und es wurde mittels Immunfluoreszenz gefunden, daß er APO-1 exprimiert und gegenüber Anti-APO-1 in vitro in einer MAk-Konzentration, die der der ursprünglichen in vitro BJAB-Tumorzellinie ähnlich ist, empfindlich ist (Tabelle 1).
Um die Histologie der sich zurückbildenden BJAB-Tumore zu bestimmen, wurden dünne Tumorschnitte aus MAk-behandelten ηu/ηu-Mäusen hergestellt. 10 Tage nach der intravenösen Injektion von FII20 erschien BJAB als ein fester Tumor aus dicht gepackten, großen Stammzellen mit zahlreichen Mitosen, einigen Tumorriesenzellen und seltenen apoptotischen Figuren (Fig. 4b, linke Gruppe). Der Tumor war von den Gefäßen des Wirts durchdrungen. Im Gegensatz dazu zeigten fast alle verbleibenden BJAB-Zellen von mit Anti-APO-1 behandelten Mäusen (Fig. 4b, rechte Gruppe) schwere cytopathische Veränderungen einschließlich nuclearer Pycnose und in den perivaskularen Mikrobereichen äußerst ausgeprägten zellulären Einschlüssen. Die morphologischen Veränderungen sind für die Apoptose charakteristisch.
Zusammenfassend legen diese Daten stark nahe, daß die Apoptose durch Anti-APO-1 induziert wird und der Mechanismus für Tod und Regression von BJAB-Tumorzellen in vivo ist. Die Tatsache, daß FII20, das stark an die Zelloberfläche von BJAB-Tumorzellen bindet, keine Regression von BJAB verursacht, schließt auch die Möglichkeit aus, daß Killerzellen oder das Komplement, das an Anti-APO-1 gebunden haben könnte, an der Wachstumshemmung und Tumorregression beteiligt sein könnten.

Beispiel 2

Material und Methoden

Zellkulturmedium und Reagentien

Alle Zellen wurden in RPMI 1640, das mit L-Glutamin (Endkonzentration 2 mM), Streptomycin (100 ug/ml), Penicillin (100 E/ml), HEPES (Endkonzentration 25 mM) und 10 % fötalem Kälberserum (FCS, Advanced Biotechnologies Inc., Silver Spring, MD) supplementiert war, gezüchtet. Rekombinantes IL-2 (Endkonzentration 20 E/ml) und rekombinantes IL-4 (Endkonzentration 5 ng/ml) wurden von Boehringer Mannheim, BRD, bezogen. Die Kulturen wurden bei 37ºC in 95 % Luft, 5 % CO&sub2; bei einer relativen Feuchtigkeit von 90 % gehalten.

Zellinien und Leukämiezellen von ATL-Patienten

Verschiedene HTLV-1-transformierte T-Zellinien wurden untersucht. C91/P1 ist eine Nabelschnurblut-T-Zellinie, die durch HTLV-I transformiert wurde und in Kultur kontinuierlich in Gegenwart von IL-2 gehalten wurde. Alle anderen verwendeten T-Zellinien stammten ursprünglich von Patienten mit ATL:JGCL und DCL und sind IL-2-abhängige Zellinien. MJCL und MT1 sind IL-2-unabhängige Zellinien, die noch auf IL-2 mit erhöhter Proliferation ansprechen. CRII2 und HUT102 sind der Prototyp von HTLV-I- positiven Leukämiezellinien, in denen HTLV-1 ursprünglich beschrieben wurde. Das Wachstum dieser Zellinien hängt nicht von IL-2 im Kulturmedium ab.
Als ein Prototyp für eine APO-1-positive und Anti-APO-1- empfindliche Zellinie wurden die B-Zellinie SKW6.4 als Kontrolle in alle Versuche aufgenommen. Trauth B.C., Klas C., Peters A.M.J., Matzku S., Moller P., Falk W., Debatin K-M, Drammer PH. "Monoclonal antibody-induced tumor regression by activation of an endogenous suicide programm." Science 1989; 245; 301-305.
Aufgetaute Leukämiezellen aus fünf Patienten mit ATL wurden für die Versuche verwendet. Die Zellen von den Patienten mit einer hohen Leukämiezellzahl wurden gefroren und in flüssigem Stickstoff in einem Medium, das 20 % FCS und 10 % DMSO enthielt, gelagert. Nach vorsichtigem Auftauen gab es einen beträchtlichen Verlust von Zellen, der für die ATL-Zellen charakteristisch zu sein scheint. Lebensfähige Zellen wurden nach dem Auftauen durch Dichtegradientenzentrifugation (LSM, Organon Technika Corp., Durham, N.C.) isoliert und in vitro für die weiteren Versuche gezüchtet.

Immunfluoreszenzanalyse

Die Immunfluoreszenzfärbung wurde durch Durchflußcytometrie mit den folgenden Antikörpern bestimmt: Ein Anti-Tac-Antikörper wurde in einer Konzentration von 1 ug/10&sup6; Zellen verwendet. Anti-APO-1 (IgG3) und ein bezüglich des Isotyps passender, nicht-bindender Kontroll-Antikörper wurden als eine 10%ige Verdünnung des Originalhybridomaüberstandes verwendet. Antikörper gegen CD3, CD4, CD8 wurden von Becton Dickinson (Mountain View, CA.) bezogen und nach den Anleitungen des Herstellers verwendet. Zur Anfärbung der Zelloberfläche wurden 1 x 10&sup6; Zellen in 100 ul Medium mit den geeigneten Verdünnungen der Antikörper in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), enthaltend 1 % FCS und 0,3 % Na- Azid, inkubiert. Vor der Zugabe der Antikörper wurde menschliches IgG bis zu einer Endkonzentration von 100 ug/ml zugesetzt. Nach 30-minütiger Inkubation wurden die Zellen gewaschen und mit einem zweiten FITC-markierten Ziege-Anti-Maus-Ig-Antikörper (TAGO Burlingame, Ca.) inkubiert.

Zellproliferation

Die Zellproliferation bei den angegebenen Zellkonzentrationen wurde in Platten mit 96 Vertiefungen mit flachem Boden (Costar, Cambridge Mass.) bestimmt. Nach der angegebenen Zeit wurden 0,1 uCi [³H]Thymidin (³H-TdR, Dupond NEN, Boston, Mass.) jeder Vertiefung der Kultur zugesetzt. Die Proliferation wurde durch Ernten der Platten bewertet, und die ³H-TdR-Aufnahme wurde in einem Flüssigszintillationszähier bestimmt.

Zelltod

Nach der Inkubation der Zellen mit dem Anti-APO-1-Antikörper wurden die Lebensfähigkeit und der Zelltod durch das Trypanblau-Farbstoffausschlußverfahren bestimmt.

Ergebnisse

APO-1-Expression auf HILV-I-positiven T-Zellinien

Es wurde zuerst die Expression des APO-1-Antigens auf verschiedenen T-Zellinien, die ursprünglich von den Patienten mit ATL bestimmt wurden, untersucht. Bei der Immunfluoreszenzfärbung zeigten alle verwendeten Zellinien einen charakteristischen Phänotyp für reife T-Zellen (CD4&spplus;, CD8&supmin;, Tac&spplus;). Nur die JGCL-Zellinie war CD4&supmin;, CD8&spplus;, Tac&spplus;. Eine starke Expression des APO-1-Antigens fand sich auf allen Zellinien. Die Intensität der APO-1-Expression war vergleichbar der Expression, die auf aktivierten normalen T-Zellen oder auf APO-1-positiven B- und T-Zellinien gefunden wurde.

Hemmung der Proliferation und anti-APO-1-induziertes Apoptose von HTLV-I-positiven T-Zellinien

Um die Wachstumshemmung und Apoptose von HTLV-I-positiven T-Zellinien durch Anti-APO-1 zu bewerten, wurden die Zellinien in vitro für zwei Tage in Gegenwart von verschiedenen Anti-APO-1-Konzentrationen gezüchtet. Als Kontrolle wurden parallele Kulturen mit 10 ug/ml eines im Isotyp passenden, nicht-bindenden Kontroll-Antikörpers inkubiert. Die Proliferation aller getesteten T-Zellinien wurde durch den Anti-APO-1-Antikörper gehemmt. Als positive Kontrolle wurde SKW6.4, die hoch-anti-APO-1-empfindliche Zellinie eine B-Lymphoblastoidlinie, gegen die Anti-APO-1 ursprünglich erzeugt wurde (siehe Beispiel 1), in jeden Versuch mitaufgenommen. Die Wachstumshemmung von verschiedenen Zellinien, z.B. JGCL und MJCL, war quantitativ vergleichbar der Wachstumshemmung der SKW6.4- Zellinie.
Alle hochempfindlichen Zellinien zeigten die charakteristischen, morphologischen Besonderheiten der Apoptose (Bildung von Membranbläschen Verdichtung des Zellkerns und des Cytoplasmas) nach Inkubation mit Anti- APO-1. Nach zweitägiger Inkubation mit Anti-APO-1 wurde gefunden, daß 50 bis 98 % der Zellen gemäß dem Trypanblau-Farbstoffausschlußverfahren tot waren.

Expression von APO-1 auf gezüchteten ATL-Zellen

Nachdem die APO-1-Expression und die Induktion der Apoptose durch Anti-APO-1 auf den HTLV-1-positiven T-Zellinien beobachtet worden war, wurde getestet, ob APO-1 auch auf den Leukämiezellen von Patienten mit ATL exprimiert wird. Aufgetaute Zellen aus gefrorenen peripheren Blutzellen (mehr als 50 % maligne T-Zellen) wurden untersucht. Die Gewinnung der ATL-Zellen nach dem Auftauen ist üblicherweise niedrig. Nach dem Auftauen betrug die Gewinnung 2 bis 35 %. Diese Zellen zeigten eine niedrige Tac- und variable APO-1-Expression (3 bis 15 % bzw. 1 bis 53 % positive Zellen). Für weitere Untersuchungen wurden die Zellen in mit IL-2 supplementiertem Medium 5 Tage lang gezüchtet. Unter diesen Bedingungen erhöhten die ATL-Zeilen die APO-1- und Tac-Expression. Erneut war die Intensität der APO-1-Expression derjenigen auf HTLV-1 transformierten T- Zellinien und anderen empfindlichen Zellen, wie aktivierten T-Zellen oder malignen T- oder B-Zellinien, vergleichbar.

Wirkung von Anti-APO-1 auf die Proliferation von ATL-Zellen in vitro

Da APO-1 auf gezüchteten ATL-Zellen exprimiert wurde, wurde getestet, ob Anti-APO-1 die Proliferation dieser Zellen in vitro hemmte. Die ATL-Zellen wurden entweder in Medium allein oder in Medium plus IL-2 und IL-4 gezüchtet. Der Grund für die Züchtung der Zellen in IL-2 oder IL-4 war, daß in einigen Fällen ATL-Zellen eine proliferative Antwort auf IL-2 oder lL-4 ohne vorherige Aktivierung zeigten Arima N., Daitoku T., Ohgaki S. et al., "Autocrine growth of interleukin-2 producing cells in a patient with adult T cell leukemia", Blood 1986; 68; 779-782; Uchiyama T., Kamio M., Kodaka T. et al., "Leukemic cells from some adult T cell leukemia patients profilerate in response to interleukin-4", Blood 1988; 72; 1182-1186. Die Tabelle 1 zeigt, daß ATL-Zellen von den Patienten 1 und 4 bereits eine hohe spontane Proliferation zeigten. In den Zellen von den Patienten 3, 4 und 5 wurde die Proliferation durch Zugabe von IL-2 oder IL-4 erhöht. Die Zugabe von Anti-APO-1 zu den Kulturen hemmte die Proliferation der malignen Zellen stark. Die Inkubation mit einem Kontroll-Antikörper hatte keinerlei Wirkung. Tabelle 2. Wirkung von Anti-APO-1 auf die Proliferation von ATL-Zellen in vitro Zellen von Patient Nr. Inkubation mit Proliferation der Zellen im Medium (cpm) Wachstumshemmung durch Anti-APO-1 (%) Medium * n.d. = nicht bestimmt
Nach dem Auftauen wurden 2 x 10&sup5; Zellen/Vertiefung in einer Platte mit 96 Vertiefungen mit flachem Boden gezüchtet. Sofern angegeben, wurden IL-2 (20 E/ml) oder IL-4 (5 ng/ml) zugesetzt. Die Zellen wurden 3 Tage lang in Gegenwart von Medium allein oder mit 1 ug/ml Anti-APO-1 oder 1 ug/ml im Isotyp passenden Kontroll-Antikörper gezüchtet. 0,5 uCi ³H-TdR wurden für die letzten 8 h der Kultur zugesetzt.
Die Proliferation wurde durch Bestimmung der ³H-TdR-Aufnahme bestimmt. Die Daten sind als absoluter cpm-Wert (Mittelwert) für die Kultur in Medium allein (cpm-Kontrolle) und als Prozentsatz der Hemmung dem ³H-TdR-Aufnahme durch Anti-APO-1 angegeben. Die Standardabweichung für dreifach angesetzte Kulturen betrug weniger als 10 %. Die Inkubation mit dem bezüglich des Isotyps passenden Kontroll-Antikörper zeigte keine Wirkung verglichen mit der Kultur im Medium allein (nicht gezeigt).

Induktion der Apoptose gezüchteter ATL-Zellen durch Anti-APO-1-Behandlung in vitro

Um die Induktion der Apoptose von ATL-Zellen durch Anti-APO-1 zu untersuchen, wurden aufgetaute ATL-Zellen zuerst fünf Tage lang in Gegenwart von IL-2 (20 E/ml) gezüchtet. Während dieser Zeit wurde kein Nettozuwachs der Zellzahlen während der Kultur beobachtet. Die gezüchteten Zellen wurden 48 h lang mit 1 ug/ml Anti-APO-1 bzw. Kontroll-Antikörper inkubiert. Unter diesen Bedingungen waren 75 bis 100 % der ATL- Zellen nach der Anti-APO-1-Behandlung tot.

Schlußfolgerung

Es wurde gefunden, daß alle HTLV-I-positiven T-Zellinien die ursprünglich von Patienten mit ATL eingerichtet wurden, APO-1 exprimieren. Die Inkubation dieser Zellen mit Anti-APO-1 führte zur Hemmung der Proliferation über die Induktion von Apoptose, ähnlich aktivierten T-Zellen. Die Empfindlichkeit der HTLV-I-positiven T-Zellinien für die Anti-APO-1- vermittelte Apoptose variierte zwischen den verschiedenen Zellinien (Antikörperkonzentration, die für eine 50%ige Wachstumshemmung nötig ist: 70 bis 50 ng/ml < JGCL und MJCL> und 1000 bis 2000 ng/ml < HUT102 und C91 P1> ). Die empfindlichsten Zellinien (JGCL und MJCL) waren so empfindlich wie die empfindlichste Zellinie (SKW6.4), die in den vorherigen Experimenten gefunden wurde und gegen die der Antikörper ursprünglich erzeugt wurde. Interessanterweise schien die Proliferation von JGCL und MJCL von exogenem IL-2 abzuhängen. Dies kann eine Verbindung zwischen der Ansprechbarkeit auf IL-2 und der Empfindlichkeit für die Anti-APO-1-induzierte Apoptose nahelegen.
Die Expression von APO-1 wurde auch auf gezüchteten Zellen aus dem peripheren Blut von Patienten mit ATL gefunden. Aufgetaute Zellen von solchen Patienten konnten nicht direkt untersucht werden, da die Lebensfähigkeit nach dem Auftauen zu niedrig war. Jedoch wurde bei Züchtung in vitro in Medium allein oder in Gegenwart von Cytokinen (IL-2 oder IL-4) gefunden, daß diese Zellen APO-1 exprimieren. Die Behandlung dieser Zellen in vitro mit Anti-APO-1 hemmte stark die spontane Proliferation und die durch IL-2- oder IL-4-erhöhten proliferativen Antworten. Schließlich wurde die Hemmung der Proliferation von der Induktion des apoptotischen Zelltods begleitet. Diese Daten auf gezüchteten ATL stehen im Gegensatz zu Daten, die mit normalen T-Zellen erhalten wurden. Bei normalen T- Zellen benötigt die APO-1-Expression eine vorherige Aktivierung mit Mitogenen, und Anti-APO-1-Behandlung besitzt keine Wirkung auf die kurzzeitige Proliferation.
Zusammenfassend zeigten die Erfinder, daß die Expression von APO-1 eine charakteristische Besonderheit von HTLV-I-transformierten T-Zellinien und gezüchteten, malignen T-Zellen von Patienten mit ATL ist. Die Inkubation dieser Zellen und Zellinien mit dem Anti-APO-1-Antikörper induziert Apoptose.

Claims

1. Verwendung eines Antikörpers, der spezifisch an ein mit der zellulären Apoptose assoziiertes Antigen unter Bedingungen, die für die Antikörper vermittelte zelluläre Apoptose geeignet sind, bindet, zur Herstellung eines therapeutischen Präparats zur Hemmung der Proliferation einer durch das HTVL-1 Virus infizierten Zelle.

2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen das APO-1 Antigen ist.

3. Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.

4. Verwendung eines Antikörpers, der spezifisch an ein mit der zellulären Apoptose assoziiertes Antigen unter Bedingungen, die für die Antikörper vermittelte zelluläre Apoptose geeignet sind, bindet, zur Herstellung eines therapeutischen Präparats zur Abtötung eines wesentlichen Prozentsatzes einer Population von durch das HTVL-1 Virus infizierten Zellen.

5. Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen das APO-1 Antigen ist.

6. Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.