MX2010009318A - Metodos para producir fluoroforos de perlillas magneticas de aptameros adherentes al plastico homogeneos y otros ensayos intercalados. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a métodos para montaje de conjugado de perlilla magnética ("MB") de aptámero de ADN más nanopartículas fluorescentes de aptámero de puntos cuánticos de aptámero ("QD") u otros fluoróforos de aptámeros, reportero quimioluminiscente de aptámero, radioisótopo de aptámero u otros ensayos intercalados de conjugado reportero-aptámero, que permiten la adherencia al vidrio, poliestireno y otros plásticos. La adherencia a vidrio o plásticos permite la detección división concentrada de superficie de fluorescencia contra fluorescencia antecedente (solución de volumen) en una etapa (sin una etapa de lavado), aún cuando el campo magnético externo para concentrar el ensayo se elimina. Este formato de ensayo permite ensayos rápidos, de una etapa (homogéneos), para una variedad de analitos sin etapas de lavado que no sacrifican la sensibilidad.

Description

MÉTODOS PARA PRODUCIR FLUORÓFOROS DE PERLILLAS MAGNÉTICAS DE APTAMEROS ADHERENTES AL PLÁSTICO HOMOGÉNEOS Y OTROS ENSAYOS INTERCALADOS REFERENCIA CRUZADA A LAS SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud se basa y reivindica la prioridad de la solicitud Provisional Estadounidense números de series 61/066,506 y 61/132,147, las cuales se incorporan en la presente por referencia.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al campo de diagnósticos a base de ácido nucleico y aptámero. Más particularmente, se refiere a métodos para la producción y uso de conjugados de perlillas magnéticas ("MB") de aptámero de ADN de auto-montaje, combinados con ensayo de esfera cuántica de aptámero ("QD") u otros ensayos intercalados de fluoróforo-aptámero que se adhieren de manera natural al vidrio y ciertos plásticos tales como poliestireno (o derivados de los mismos) , para permitir las pruebas de una etapa (homogéneas) sin una etapa de lavado, aún después que un campo magnético externo se elimina. La conjugación de aptámeros a los MB o QD u otros fluoróforos ' puede ser realizada por reacciones simples de acoplamiento químico a través de enlazadores bifuncionales, o grupos funcionales clave tales como aldehidos, carbodiimidas, carboxilos, ésteres de N-hidroxi-succinimida ("NHS") , ésteres de N-oxi-succinimida ("NOS"), tioles, etc., o vía biotina-avidina, histidina-Níquel u otros sistemas de enlace de alta afinidad. Este formato de ensayo sin lavado, de una etapa, tiene numerosas aplicaciones para la detección sensible de patógenos transmitidos por alimentos sobre y en carnes, aves de corral, fluidos serosos, productos lácteos, frutas, vegetales y otras matrices de alimentos. Este ensayo también es aplicable a análisis ambientales en muestras de agua turbia o sucia y diagnósticos veterinarios y clínicos realizados directamente en sangre completa, orina, saliva u otros fluidos corporales con o sin dilución de muestra, pero sin una etapa de lavado. La etapa típica de lavado involucra purificación por remoción de materiales indeseados que contribuyen a la fluorescencia antecedente.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las más deseables de todas las estrategias de ensayos de diagnóstico son ensayos de una etapa, rápidos, "unen y detectan" u "homogéneos", que no requieren una etapa de lavado y aún no sacrifican un grado significante de sensibilidad. Ejemplos de estrategias exitosas de ensayos de una etapa incluyen, ensayos a base de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia ("FRET") y polarización de fluorescencia (""FP") . Mientras ambos de estos formatos son populares, tienden a sacrificar la sensibilidad para velocidad en la obtención de los resultados de prueba. Por lo tanto, los ensayos FP y FRET son típicamente relegados diagnósticos clínicos por ciertos analitos que existen en concentraciones relativamente altas (intervalos micro a miliMolares) en sangre, orina u otros fluidos corporales. Para analitos que existen a concentraciones muy bajas, se requieren ensayos de etapas múltiples tales como ensayos inmunosorbentes ligado a la enzima ("ELISA"), radioinmunoensayos ("RIA") y otros ensayos formateados intercalados, tales como ensayos de electroquimioluminiscencia inmunomagnética ("IM-ECL") , para detectar nanogramos, nanoMolares o cantidades inferiores de varios analitos objetivo. Típicamente, estos tipos de ensayos intercalados requerirán una o más etapas de lavado, con ello reduciendo su velocidad de ejecución. Las etapas de lavado pueden ser conocidas por un experto en la técnica como una etapa en general necesaria para remover materiales indeseados (además del analito objetivo detectado), para prevenir señales elevadas de fluorescencia antecedente. Se encuentra deseable eliminar la necesidad de una etapa de lavado en la presente invención, debido a que puede mejorar la velocidad y exactitud de muchos ensayos.

El ADN es bien conocido por adherirse a algunas superficies vitreas especialmente si la superficie es cargada por frotamiento. Este principio se usa en la recolección electrostática de ADN genómico a partir de Usados celulares los cuales se conocen como "colas" de ADN con una varilla de vidrio cargada. De manera similar, Allemand et al., Bensimon et al., Buck and Andrews, Dudley et al., Klein et al., Labit et al., Michalet et al., Moscoso et al., y Torres et al., muestran la adherencia de ADN, bacteria, biopelículas, y otros materiales a poliestireno por fuerzas electrostáticas e hidrofóbicas u otras débiles. Sin embargo, Allemand et al., Bensimon et al., y Klein et al., enfatizan que el ADN es mucho más probable que se una a poliestireno y otros plásticos en sus extremos libres 3' o 5' que en las regiones medias y que tal enlace no es instantáneo (requiere uno o más minutos de tiempo de residencia para que el ADN se una al plástico) y es dependiente del pH con pH óptimo para enlazarse siendo acídico (a un pH aproximado de 5.5, el cual está por debajo del intervalo de la mayoría de ensayos biológicos) . Bensimon et al., (1994) ha sugerido aún que el ADN puede acoplarse covalentemente a poliestireno por adición electrofílica de extremos de fosfato 3' o 5' (en sus formas de ácido fosfórico) a los enlaces dobles pi de los anillos estireno o extremos alqueno no polimerizados libres de fibras de poliestireno. Tal enlace covalente de aptámeros de ADN a poliestireno podrían explicar la adherencia muy estable y de acción prolongada de materiales de ensayo observada y reportada en la presente y por Bruno et al. (2008) por su ensayo de Campylobacter.

Mientras algunas especies de bacterias pueden unirse a plásticos y vidrios, no todas las especies pueden formar tales biopeliculas . En los ensayos actualmente descritos, la unión de los componentes del ensayo (aptámeros de ADN, MB y QD) , ha ocurrido en la presencia y ausencia de bacteria objetivo. De manera inversa, los ensayos intercalados inmunomagnéticos ("anticuerpo-MB") , no se adhieren al poliestireno muy bien a pH neutral o acídico, presumiblemente debido a que los anticuerpos de proteínas no se adhieren bien a materiales vitreos o plásticos a pH neutral o acídico. Las proteínas tales como anticuerpos, son bien conocidos por adherirse a cavidades de placa microtituladora de poliestireno a valores de pH alcalino como en los formatos de pruebas populares de ELISA. Sin embargo, el pH para adherencia de anticuerpos y proteínas en ensayos ELISA es típicamente 8.0-9.5 y claramente no acídico como en los ensayos adherentes de ADN descritos actualmente. Por lo tanto, el aptámero de ADN es considerado por ser el componente clave el cual permite la adherencia a poliestireno o vidrio o derivados de los mismos y de este modo, permite ensayos sin lavado de una etapa. Mientras algunas especies de bacterias pueden contribuir a adherencia total en la cara interna de una cubeta, el componente aptámero de ADN parece suficiente para permitir la adherencia de los ensayos mencionados anteriormente en la región magnetizada debido a que componentes de ensayo (conjugado aptámero-MB) , se adherirán a plástico y vidrio aún en la ausencia de células de bacterias capturadas.

Literatura Relacionada Allemand J.F., et al. pH-dependent specific binding and combing of DNA. Biophys. J. 73:2064-2070, 1997.

Bensimon A., et al. Alignment and sensitive detection of DNA by a moving interface. Science. 265:2096-2098, 1994.

Bensimon D., et al. Stretching DNA with a receding meniscus: experimente and models. Phys . Rev. Lett. 74:4754-4757, 1995.

Bruno J.G., Phillips T., Carrillo M.P., Cro ell R. Plastic-adherent DNA aptamer-magnetic bead and quantum dot sandwich assay for Campylobacter detection. J. Fluorescence . In Press, 2008.

Bruno J.G., Carrillo M.P., Phillips T., Crowell R. Initial development of competitive FRET-aptamer assays for monitoring bone metabolism. J. Clin. Ligand Assay. In Press, 2008.

Bruno J.G., Carrillo M.P., Crowell R. Preliminary development of DNA aptamer-Fc conjúgate opsonins. J. Biomedical Materials Research-Part A, In Press, 2008.

Bruno J.G., Carrillo M.P., Phillips T. In vitro antibacterial effects of anti-lipopolysaccharide DNA aptamer-Clqrs complexes. Folia Microbiologica . 53:295-302, 2008.

Bruno J.G., Carrillo M.P., Phillips T., King B. Development of DNA aptamers for cytochemical detection of acetylcholine . In Vitro Cell. Develop. Biol. - Animal. 44:63-72, 2008.

Bruno J.G., Carrillo M.P., Phillips T. Development of DNA aptamers to a Foot-and-Mouth Disease peptide for competitive FRET-based detection. J. Biomolecular Techniques. 19:109-115, 2008.

Bruno J.G., Carrillo M.P., Phillips T. Effects of immobilization chemistry on enzyme-linked aptamer assays for Leishmania surface antigens. J. Clinical Ligand Assay. 30:37-43, 2007.

Bruno J.G., Francis K . , Ikanovic, M., et al. Reovirus detection using immunomagnetic-fluorescent nanoparticle sandwich assays. J. Bionanoscience . 1:84-89, 2007.

Buck J. . and Andrews J.H. Localized, positive charge mediates adhesión of Rhodosporidium torulides to barley leaves and polystyrene. Appl . Environ. Microbiol. 65:2179-2183, 1999.

Dudley E.G., et al. An Indi plasmid contributes to the adherence of the atypical enteroaggregative Escherichia coli strain C 1096 to cultured cells and abiotic surfaces. Infect. Immun. 74:2102-2114, 2006.

D arakanath S., Satyanarayana S., Bruno J.G., et al. Ultra sensitive fluorescent nanoparticle-based binding assays for foodborne and waterborne pathogens of clinical interest. J. Clinical Ligand Assay. 29:136-142, 2006.

Ikanovic M., Rudzinski .E., Bruno J.G., Dwarakanath S., et al. Fluorescence assay based on aptamer-quantum dot binding to Bacillus thuringiensis spores. J. Fluorescence. 17:193-199, 2007.

Joshi S. et al. Selection, characterization, and application of DNA aptamers for the capture and detection of Salmonella entérica serovars. Molec. Cell Probes. In Press, 2008.

Klein D.C.G., et al. Ordered stretching of single molecules of deoxyribose nucleic acid between microfabricated polystyrene lines. Appl . Phys . Lett. 78:2396-2398, 2001.

Labit H., et al. A simple and optimized method of producing silanized surfaces for FISH and replication mapping on combed DNA fibers. BioTechniques . 45:649-658, 2008.

Michalet X., et al. Dynamic molecular combing: stretching the whole human genome for high-resolution studies. Science. 277:1518-1523, 1997.

Moscoso M. et al. Biofilia formation by Streptococcus pneumoniae: Role of choline extracellular DNA, and capsular polysaccharide in microbial accretion. J. Bacteriol. 188:7785-7795, 2006.

Quast B. A compact, handheld laboratory fluorometer. American Biotechnol Lab 18:68, 2001.

Torres A.G., et al. Differential binding of Escherichia coli 0157 :H7 to alfalfa, human epithelial cells, and plástic is mediated by a variety of surface structures. Appl. Environ. Microbiol. 71:8008-8015, 2005.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Descrito en la presente está un nuevo tipo de ensayo intercalado de aptámero-MR-aptámero-QD y sus formados derivados con variaciones en el componente fluoróforo que puede ser realizado en una etapa, obviando una etapa de lavado, recolectando el MB con un fuerte campo magnético externo sobre una superficie revestida o vitrea, poliestireno, u otro plástico tal como la cara interna de una cubeta. La recolección del MB y todos los componentes del ensayo unidos, incluyendo aptámeros de ADN, MB, fluoróforos y los analitos capturados, en un área pequeña en la superficie plástica de este modo, enfoca la intensidad de fluorescencia del ensayo debido a la captura del analito en un área más planta delgada de adherencia. De este modo, cuando el material adherente se ilumina aún en matrices casi opacas tales como alimentos o sangre, la fluorescencia puede ser detectada con ultra sensibilidad sobre la autofluorescencia antecedente a partir de la solución de volumen, debido a la división y concentración de los materiales de ensayo y analitos capturados al área de adherencia. La fluorescencia de conjugados de fluoróforo-aptámero o aptámero-QD no capturado en la solución de volumen, contribuye a la fluorescencia antecedente, pero su contribución a la señal de fluorescencia total es mayormente minimizada debido a que no está concentrada al área de adherencia del ensayo. Cualquiera de los conjugados de fluoróforo-aptámero o aptámero-QD que no unen el analito y conjugados aptámero-MB, no podrá ser jalada hacia la superficie de plástico ni adherirse a la superficie significantemente y no contribuirá significantemente a la detección de señal, pero contribuirá al "ruido" de fluorescencia antecedente mucho más débil en la solución de volumen. La combinación de alfa afinidad de aptámero, la capacidad de MB para ser concentrado en un área definida, y el gran cambio Stoke de emisión roja de QD (es decir, excitación ultravioleta de alta energía con emisión en la región roja del espectro arriba de 600 nm) , contribuye a la naturaleza ultra sensible de este formato de ensayo sin lavado de una etapa. Sin embargo, la adherencia de los materiales de ensayo y analitos capturados a un área pequeña en una superficie vitrea o plástica transparente aún cuando el campo magnético externo se elimina, es un factor clave que permite la detección sin lavado de una etapa.

La presente invención se proporciona para el montaje de conjugados de aptámero de ARN y ADN-MB para la captura de analitos objetivo con conjugados de aptámero-DQ u otros de fluoróforo-aptámero . Los analito objetivo son moléculas que son deseables detectar tales como, bacteria patogénica, virus, parásitos, leucocitos, células de cáncer, proteínas, otras macromoléculas, toxinas, contaminantes, fármacos, explosivos, proteínas, proteínas de cápsido viral, polimerasas virales, biotoxinas tales como toxina bacteriana, botulina, cólera, tétano, estafilococal, enterotoxina, shigatoxinas o verotoxinas, toxinas de algas, tales como brevetoxina, ciguatoxina, cianotoxina o saxitoxina, venenos de araña y serpiente, proteínas clínicamente relevantes o porciones de proteínas (péptidos) tales como marcador óseo (por ejemplo, péptidos de rompimiento de colágeno tales como CTx, NTx, OCF, Catepsina K o su precursor ProCatepsina K, desoxipiridinolina, piridinolina, lisil piridinolina, o hidroxilisil piridinolina) citocinas e interleucinas, marcadores de infartos al miocardio (troponina, mioglobina, etc.), enfermedad renal, anticuerpos, trastornos autoinmunes, artritis, u otras macromoléculas clínicamente relevantes tales como lipopolisacáridos (LPS, endotoxinas) , y otras moléculas pequeñas (en donde "moléculas pequeñas" se definen por ser aquellas que son de menos de 1,000 Daltons) tales como con al menos dos epitopes distintos a partir de un grupo que incluye los siguientes: pesticidas, aminoácidos naturales y sintéticos y sus derivados, hidroxilisina, hidroxiprolina, histidina, histamina, homocisteína, DOPA, melatonina, nitrotirosina, productos de proteólisis de cadena corta, cadaverina, putrescina, poliaminas, espermina, espermidina, desoxipiridinolina, piridinolina, lisil piridinolina, o hidroxilisil piridinolina, bases de nitrógeno de ADN o ARN, nucleósidos, nucleótidos, formas cíclicas de nucleótidos, cAMP, cGMP, metabolitos celulares, urea, ácido úrico, farmacéuticos, fármacos terapéuticos, vitaminas, fármacos ilegales, narcóticos, alucinógenos, gama-hidroxibutirato (GHB) , mediadores celulares, citocinas, quimiocinas, moduladores inmunes, moduladores neurales, neurotransmisores tales como acetilcolina, moduladores inflamatorios, prostaglandinas, metabolitos de prostaglandina, explosivos nitroaromáticos y nitramina, productos de rompimiento explosivo (por ejemplo, DNT) o subproductos, moléculas sensibles al quorum tales como AHL, esferoides, hormonas y sus derivados.

Un fluoróforo es un componente fluorescente, o grupo funcional, unido a una molécula. Un fluoróforo puede ser un tinte, una perlilla brillante, una liposoma brillante, un esfera cuántica ("QD") , una nanoparticula fosforescente o fluorescente ("NP") , una partícula o microperlilla de látex fluorescente, una molécula de tinte fluorescente, tal como fluoresceína, carboxifluoresceína y otros derivados de fluoresceína, rodamina y sus derivados, un complejo de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia ("FRET"), tal como un aptámero-FRET competitivo o intracadena, o cualquier otra entidad brillante capaz de formar un enlace covalente con el aptámero. Como se usa en la presente, "otros conjugados de fluoróforo-aptámero", incluyen aquellos aptámeros que tienen un fluoróforo unido a este, tal como, además de aquellos listados de otro modo en la presente, conjugados de tinte fluorescente-aptámero, conjugados de microperlilla fluorescente-aptámero, o conjugados de liposoma-aptámero que contienen tintes fluorescentes. En la presente invención, el fluoróforo actúa para "reportar" la detección de los analitos objetivo en una etapa sin lavado y rápida El único requerimiento del objetivo es que contenga dos epítopes accesibles de la misma o diferente composición y conformación para permitir un ensayo intercalado con componentes de aptámero reporteros y capturados .

La presente invención utiliza un formato de ensayo de una etapa, el cual puede ser usado para ensayos intercalados para detectar y cuantificar el analito objetivo en la solución de volumen, así como también intensidad de fluorescencia, fluorescencia resuelta por tiempo, quimioluminiscencia, detección eléctrica, detección electroquímica, electroquimioluminiscencia, fosforescencia y detección radioisotópica . La naturaleza de una etapa del ensayo se basa en el hecho de que los componentes de ensayo capturan el analito y después lo pegan o adhieren a la superficie interna del sustrato de ensayo, en general esperada por ser un plástico de poliestireno, vidrio u otro tipo de cubeta que es transparente o translúcida suficiente para permitir la propagación de la luz fluorescente, en una región altamente magnetizada por un breve tiempo (5-10 minutos) .

Más específicamente, la naturaleza de una etapa del ensayo se basa de la capacidad, después de la aplicación de un campo magnético externo, para separar magnéticamente o dividir los materiales de ensayo (aptámero-MB y aptámero-QD u otros conjugados de fluoróforo-aptámero) a partir de la solución de volumen y permitir a estos materiales unirse o adherirse a una superficie tal como la cara interna de un poliestireno o cubeta de vidrio vía las fuerzas covalentes o de atracción entre el ADN y algunos plásticos o vidrios, con ello incrementando la relación señal a ruido en la superficie en donde el imán se colocó aún después que el imán o campo magnético se elimina para permitir la detección de fluorescencia. El pegado de analitos de fluorescencia brillante al plano interno de la cubeta conduce a la capacidad para discriminar la fluorescencia más intensa de la muestra a partir de la fluorescencia objetivo o antecedente de la solución de volumen o "señal de ruido" y hacer ensayos homogéneos de una etapa posibles. La adherencia de materiales de ensayo a la cubeta constituye una técnica gue aún permite la detección en densas muestras de alimento (por ejemplo, muestras de leche, jugo de carne y ave y yema de huevo) .

Un ensayo o prueba típica de perlilla magnética-aptámero de una etapa más cubeta de esfera cuántica-aptámero consistirá de los siguientes dos componentes sintetizados y agregados en cualquier orden: 1) Cien ]iq de ADN de aptámero 5'-amino modificado específico para un epítope en el analito objetivo más 10 mM BS3 [Bis ( sulfosuccinimidil ) suberato] u otro enlazador bifuncional amino-reactivo apropiado tal como EDC [clorhidrato de l-Etil-3-(3-dimetilaminopropil ) carbodiimida] , Sulfo-EGS [bis (sulfosuccinimidilsuccinato) de etilenglicol ] , Sulfo-SMCC [4- [N-maleimidometil] -ciclohexan-1-carboxilato de succinimidilo] , glutaraldehído, etc. más 8 uM de reactivo Qdot 655 ITK (Invitrogen Corp.). Estos componentes son mezclados en un volumen de 1 mi de amortiguador de enlace IX ("IXBB"; 0.5 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM MgCl2, pH 7.5-7.6) por 30 min a temperatura ambiente ("RT"). Este componente de aptámero-QD se purifica a través de Sephadex G-25 u otra matriz de cromatografía de exclusión de tamaño adecuada. 2) Cien ]ig de un segundo aptámero de ADN 5' -amina-modificado con especificidad a un segundo epítope en el analito objetivo más 10 µ? de MB tosil-activado (aproximadamente 1 X 105 MBs, 1 a 5 micrones en diámetro) . Este componente de aptámero-MB se incuba a 37°C por 2 o más horas y después se recolecta con un imán fuerte y se lava 3 veces en IXBB. Estos dos componentes principales (conjugados aptámero-QD y aptámero-MB) , se agregan a poliestireno u otra cubeta de plástico con la adición de IXBB hasta un volumen total de 2 mi. La cubeta entonces es liofilizad, lavada a chorro nuevamente con gas de nitrógeno y tapada para almacenaje a largo plazo.

La invención ha sido descrita anteriormente en una modalidad típica y suma de los componentes de ensayo para pruebas de seguridad de alimentos para números bajos de bacteria patogénica. Sin embargo, se requieren amplios intervalos de detección para otros tipos de analitos. Por lo tanto, considerando los intervalos de afinidad de aptámero e intervalos de fluorescencia detectable, los ensayos de cubeta de una etapa pueden ser descritos basados en las siguientes relaciones de intervalos para los dos componentes de ensayo principal: 1) Reactivos Aptámero-QD: 0.5 - 50 nanoMoles de aptámero 5'-amino-ADN (o 10 - 1, 000 \iq de 60-100 base de DNA en general) más 10 - 20 miliMoles de enlazador bifuncional (BS3 etc., los enlazadores están en exceso) más 0.8 - 80 uMoles de QDs . 2) Reactivos de Aptámero-MB: 0.5 - 50 nanoMoles de 5*-amino-DNA por 105 - 107 de tosil-MBs u otro MB apropiadamente derivado para conjugación de ADN.

En general, afinidades para anticuerpos y aptámeros, intervalos de 10 veces para cada componente de ensayo (es decir, 10 veces inferior y superior) , se anticipan por la invención actual. Las cantidades de los componentes de ensayo están propuestas para ser variadas, debido a que la presente invención contempla ensayos de sensibilidad variante. De este modo, el mismo ensayo básico puede tener cantidades de componente de ensayo modificadas para permitir situaciones en donde se requiere sensibilidad extrema, y otras situaciones en donde es aceptable 'la sensibilidad menor para la aplicación.

Previo al uso, el ensayo de cubeta de una etapa es reconstituido con una solución de volumen la cual es probada para determinar la presencia del analito objetivo deseado. La solución de volumen, la cual está en una cantidad anticipada por ser aproximadamente 2 mi, puede ser cualquier número de varias matrices de fluido de muestra que contienen posiblemente analitos objetivo que incluyen, pero no se limitan a: aguas naturales, amortiguador, o muestras de alimento diluidas o no diluidas (por ejemplo, leche, yogurt, quesos previos a solidificación, jugos de carne, jugos de frutas, huevos, aguas de enjuague de superficies de vegetales y frutas, mantequilla de maní diluida, etc.), sangre completa diluida, suero, orina, esputo, u otras muestras de fluido corporal .

Junto con la solución de volumen, se agregan un conjugado de perlilla magnética-aptámero ("aptámero-MB") , y un conjugado de fluoróforo-aptámero, o pueden ser liofilizadas en conjunto in situ (en una cubeta) previo a agregar el analito. Los conjugados de aptámero son elegidos basados en el aptámero-MB siendo capaz de unirse con el analito objetivo en un primer sitio de unión en el analito objetivo, y el conjugado de aptámero-fluoróforo siendo capaz de unirse con el analito objetivo en un segundo sitio de unión en el analito objetivo. De este modo, si el analito objetivo está presente en la solución de volumen, tanto los conjugados de fluoróforo-aptámero como aptámero-MB, se unen con el analito objetivo para formar un complejo de analito-aptámero-fluoróforo . También es necesario que el aptámero no se una, sea par base o hibridice con los fluoróforos-aptámeros en la solución de volumen. Si se unen entre si en alguna forma, en competición con el analito objetivo, entonces el ensayo podría producir falsos positivos debido a que el MB podría jalar el aptámero-MB-fluoróforo (sin un analito objetivo) sobre el área de superficie translúcida de la cubeta a ser ensayada.

La cubeta es tapada nuevamente, sacudida y mezclada periódicamente durante un periodo de 15-20 minutos, permitiendo al aptámero-MBs unirse con los analitos objetivos en el primer sitio de unión y los conjugados de fluoróforo-aptámero unirse con el analito objetivo en el segundo sitio de unión para formar un complejo de analito-aptámero-fluoróforo. Entonces se agrega la cubeta a una rejilla u otro dispositivo con una serie de imán externo a la altura apropiada para causar que los complejos de analito-aptámero-fluoróforo se adhieran al área de superficie translúcida de la cubeta aplicando un campo magnético externo para atraer las perlillas magnéticas. Atraído por el campo magnético, las perlillas magnéticas tiran el resto del complejo de analito-aptámero-fluoróforo el cual recolecta cualquiera de los analitos capturados en una banda (rectangular o cuadrada) o patrón circular al nivel de una trayectoria de luz de fluorómetro. Los MB con analitos objetivo y de ensayo capturado, son recolectados por 5 o más minutos y después se remueve el imán externo, dejando componentes de analito objetivo y de ensayo, MB fluorescentes adherentes, que se adhieran en la superficie interna de la cubeta de plástico como se muestra en la Figura 1. Es esta concentración y división de los analitos capturados y componentes de ensayo a una película adherente delgada sobre la cara interna de la cubeta, lo que permite la discriminación de la fluorescencia intensa del ensayo a partir de la fluorescencia muy débil de la solución de volumen detrás del material adherente. De este modo, los complejos de analito-aptámero-fluoróforo son efectivamente divididos lejos de la solución de volumen restante para permitir la capacidad de detección. Esta división proporciona un ensayo homogéneo, de una etapa, con una alta relación señal a ruido cuando el ensayo adherente se coloca en un fluorómetro y cuantifica con las longitudes de onda de emisión y excitación apropiadas.

Aunque se describe anteriormente como una cubeta, la presente invención es efectiva en cualquier número de geometrías de recipientes o contenedores. De este modo, el método de la presente invención puede ser corrido en un tubo, vial, disco, celda de flujo, cásete,, cartucho, chip microfluídico, y cualquier otro tipo similar de contenedores. Y el contenedor puede estar compuesto de una plétora de materiales, en cualquier forma y de cualquier tipo siempre que se proporcione un área más plana de material de ensayo unido en una "ventana" de revisión y los aptámeros de ácido nucleico puedan adherirse al material. Por lo tanto, el formato de ensayo puede también ser aplicado a un cásete o cartucho de vidrio o plástico aplanado, en el cual, los componentes de ensayo pueden ser magnéticamente jalados a lo largo de un canal o trayectoria por un imán externo. Después de alcanzar una ventaja de detección de vidrio o plástico transparente, los componentes de ensayo podrían permitir residir en la ventana de detección en donde podrían adherirse a la superficie de la ventana y ser concentrados lejos de la solución de volumen por el imán externo. Por lo tanto, se contemplan varias modalidades o geometrías para los recipientes de ensayo siempre que la cubeta tenga un área de superficie translúcida para así permitir un ensayo fluorescente. Por ejemplo, el área de superficie translúcida de la cubeta, en la cual el complejo de analito-aptámero-fluoróforo se adhiere, puede ser formada como un contenedor cuadrado, rectangular, redondo, ovalado o plano, vial, tubo, cilindro, cásete o cartucho.

Se anticipa que la cubeta puede ser elaborada de poliestireno, plástico transparente o vidrio. Pero además, la química de unión de ADN al vidrio o plástico no está restringida a poliestireno simple o vidrio natural. Preferentemente, los revestimientos y plásticos derivados lógicos (por ejemplo, silanos, etc.), que incluyen alquenos para adición electrofílica de ADN y recubrimientos hidrofóbicos que pueden incitar a interacciones de fuerza débil (van der aals o dipolo-dipolo) y adherencia de ADN a los plásticos o vidrios revestidos, también están contemplados .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Es una ilustración esquemática de como se forma el ensayo intercalado adherente de una etapa y se extrae a la cara interna de una cubeta de plástico o vidrio por un imán externo.

Figura 2. Muestra gráficos de lineas trazadas con relación a la intensidad de fluorescencia contra la concentración de la bacteria Campylobacter jejuni (C. jejuni) bacteria .

Figura 3. Muestra una serie de espectros de emisión de fluorescencia relacionados con la detección de diluciones de diez veces de bacteria de Campylobacter jejuni en amortiguador puro (IXBB) y varias matrices de alimento diluidas como se indica en la figura. La excitación fue a 380 nm con un tubo fotomultiplicador ajustado de 900 Volts.

Figura 4. Ilustra un ensayo típico de una etapa capaz de detectar 10 bacterias vivas de C. jejuni en "jugo" de pollo no diluido (fluido seroso recolectado de patas de pollo previo a la cocción) . Los puntos de datos representan las medias y desviaciones estándares de cinco lecturas independientes (N = 5) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Con referencia a la Figura 1, se proporciona una representación esquemática de un concepto de ensayo intercalado ad erente de una etapa. En este concepto, un ADN o posiblemente un aptámero de ARN ha sido conjugado a una perlilla magnética y usado para capturar un analito objetivo (célula de bacteria en este ejemplo) . La captura se logra por enlace especifico de aptámero a un epitope en la superficie bacteriana. Del mismo modo, otro epitope se une por un conjugado de esfera cuántica-aptámero u otro reactivo reportero de aptámero-fluoróforo simultáneamente por detección fluorescente. Debido a que el ensayo intercalado contiene ADN o ARN, se somete a adherencia a algunas formas de vidrios cargados o plásticos cargados o no cargados tales como poliestireno y sus derivados por fuerzas electrostáticas y/o otras fuerzas débiles tales como interacciones dipolo-dipolo o Van der Waals y posiblemente adición electrofilica covalente a alquenos o a los anillos estireno (Bensimon et al., 1994). La adherencia se promueve por la adición de una fuerza magnética atractiva externa tal como cobalto fuerte, neodinio u otro imán térreo raro. Después que el imán externo se desacopla, los materiales de ensayo todavía se adhieren a la cara interna de la cubeta debido a la interacción de ADN con el poliestireno u otros materiales de vidrio o plástico. Esta adherencia divide el ensayo junto con bacterias etiquetadas y capturadas u otros analitos de la solución de volumen. Si la solución se ilumina del lado opuesto por una fuerza de excitación y la cara de la cubeta con materiales de ensayo adherentes se coloca próxima a un fotodetector, se permite la detección de una etapa, sensible, rápida. Una vez que la adherencia de todos los complejos de aptámero-MB-bacteria-aptámero-QD ocurre en la superficie, el material adherente emite una señal fluorescente muy brillante que la solución de volumen la cual contiene conjugados libres de aptámero-QD o aptámero-fluoróforo .

La Figura 2 muestra gráficos de lineas trazadas con relación a la intensidad de fluorescencia contra la concentración de la bacteria Campylobacter jejuni (C. jejuni) detectada en amortiguador puro (amortiguador de enlace IX; IXBB) descendente a un nivel de aproximadamente 2 células de bacteria por mililitro usando el ensayo intercalado QD rojo de aptámero-MB-aptámero adherente de una etapa (Q-dot 655 nm) sin una etapa de lavado. Se tomaron cinco lecturas independientes por punto de datos con el canal verde (Rodamina) de un fluorómetro Turner Biosystems, Inc. Handheld. Las barras de errores las cuales no son visibles debido a sus valores numéricos pequeños, representan las desviaciones estándares de las 5 lecturas. La modalidad preferida para el ensayo de aptámero-MB/aptámero-QD o aptámero-fluoróforo sin lavado de una etapa, adherente, está en una cubeta de poliestireno plástica que usa materiales de ensayo intercalados liofilizados (secado por congelamiento) con vida de anaquel larga, que son rehidratados como se necesitan. Su fluorescencia puede ser valorada después de un periodo de recolección magnética de 5 minutos y captura de 15-20 minutos vía un espectrofluorómetro superior de mesa, o fluorómetros portátiles tales como el Turner Biosystem's Picofluor™ o Invitrogen's Q-Bit™ u otros de tales dispositivos lectores de fluorescencia. La principal fotorespuesta lineal a cambios logarítmicos en la concentración bacteriana vista en las Figuras 2 y 4 es probablemente atribuible a un detector de fotodiodo en el fluorómetro, tal como se encuentra en el Picofluor™, contra el tubo fotomultiplicador exponencialmente sensible y más sensible (PTM) usado para recolección de datos por un espectrofluorómetro en la Figura 3.

La Figura 3 muestra una serie de espectros de emisión de fluorescencia a partir de diluciones seriales de diez-veces de 25 millones de bacterias C. jejuni eliminadas por calor por mi (pico más alto) a 2.5 bacterias por mi y después cero bacterias por mi (pico más bajo) , detectadas por el uso de un espectrofluorómetro Cary-Varina y el ensayo intercalado de aptámero-MB/aptámero-QD rojo adherente al plástico de una etapa (Q-dot 644 nm) , sin una etapa de lavado directamente en varias matrices de alimentos como se indica. Las flechas indican la dirección de incremento de diluciones de 2-veces o reducción de la concentración bacteriana. Los ensayos son en general descritos en la presente usando un método reportero de intensidad de fluorescencia, el cual es una medida simple de brillo de fluorescencia, para detectar y cuantificar el conjugado de analito-aptámero .

Alternativamente, el método de reportero de intensidad de fluorescencia puede ser sustituido por fluorescencia resuelta por tiempo, quimioluminiscencia, detección eléctrica, detección electroquímica, electroquimioluminiscencia, fosforescencia o detección radioisotópica en lugar de detección basada en intensidad de fluorescencia simple.

La Figura 4 ilustra un ensayo de una etapa típico, capaz de detectar 10 bacterias C. jejuni vivas en jugo de pollo (recolectado de glóbulos de grasa y sangre a partir de un producto de pollo de tienda de comestibles frescos) . Se tomaron cinco lecturas independientes por punto de datos con el canal verde (Rodamina) de un fluorómetro Turner Biosystems, Inc. Handheld Picofluor™. Las barras de errores las cuales son escasamente visibles debido a sus valores numéricos pequeños, representan las desviaciones estándares de las 5 lecturas.

No se requieren etapas de lavado y la detección se puede lograr directamente en varias matrices de alimentos, ambientes o de fluidos corporales, como se ilustra en las Figuras 3 y .

Ejemplo 1 Detección Ultrasensible Sin lavado, de Una Etapa de Campylobacter jejuni en Varias Matrices de Alimentos La invención ha sido usada para detectar tan poco como 2 células de bacterias de C. jejuni vivas o muertas (un patógeno transmitido por los alimentos) en amortiguador puro y varias matrices de alimento como se muestra en las Figuras 2-4. En estos ensayos, dos diferentes secuencias de C. jejuni (designadas C2 y C3 o SEC ID NOs 2 y 3) fueron 5' -amina modificada durante la síntesis de ADN de fase sólida y unidas a ya sea 1,000 tosil-M280 (diámetro 2.8 micrones) Dynal (Invitrogen, Inc.) MBs o 0.24 picolitros de reactivo Q-dot 655 ITK (Invitrogen, Inc.) por prueba. El aptámero C2 (SEC ID NO. 2) se usó para captura sobre la superficie de tosil-MB y el aptámero C3 (SEC ID NO. 3) se usó como el reactivo reportero después de la unión al reactivo Q-dot 655 ITK vía BS3 (enlazador bifuncional de bis-suberato de Pierce Chemical Co.). Los reactivos se purificaron, mezclaron en conjunto y liofilizaron en cubetas de plástico. Los ensayos en polvo fueron después lavados a chorro nuevamente con nitrógeno y tapados. Después de la rehidratación, se usaron ensayos de intercalado de una etapa adherentes, para detectar células C. jejuni vivas o muertas (eliminadas por calor) con los resultados muy sensibles representados en las Figuras 2-4. Otros aptámeros elegidos para funciones de reportero y captura de las SEC ID Nos. 1-6 pueden ser sustituidos en ensayos de Campylobacter los cuales son funcionales, pero resultan en alguna detección menos sensible.

Ejemplo 2 Detección Ultrasensible Sin Lavado, De Una Etapa de Escherichia coli 0157:H7 y otras E. coli toxigénicas (que producen Shiga o Verotoxina) en Varias Matrices de Alimentos La presente invención tiene potencial para ser usada para detección de E. coli 0157 :H7 enterohemorrágica en y sobre varios alimentos vía unión de aptámeros a los sacáridos externos del lipopolisacárido 0157 (LPS) y el antigeno flagelar H7. Las secuencias de aptámero de las SEC ID NOs . 7-20 pueden ser elegidas para funciones de captura (conjugado de aptámero-MB) o reportero (conjugado de aptámero-fluoróforo) y usadas para detectar E. coli 0157 :H7 en o sobre alimentos. Alternativamente, las proteínas de la membrana externa (O P) comunes a muchas especies de E. coli, pueden ser usadas para captura a base de aptámero-MB (o identificación) de las células bacterianas de E. coli, seguidas por identificación específica de la cepa de E. coli o serotipo usando reactivos reporteros de aptámero-QD específicos de LPS para completar el ensayo intercalado. Las SEC ID Nos. 279-332 del aptámero pueden ser usadas para reconocimiento y captura de E. coli OMP. En aún otra modalidad, la bacteria de E. coli toxigénica no 0157 :H7, puede ser sensiblemente identificada por sus secreción de Shiga o Verotoxinas (tipos 1 y 2 o Stx-1 y Stx-2) . Muchas otras cepas de E. coli que incluyen 0126 pueden producir enfermedades mortales en humanos y la amenaza común entre estos patógenos letales es la secreción de Stx. Por lo tanto, una modalidad muy útil de la invención podría ser la detección de Stx-1 y/o Stx-2 usando cualquiera de las secuencias de aptámero de ADN identificadas por las SEC ID NOs. 323-352.

Ejemplo 3 Detección Ultrasensible Sin Lavado, de Una Etapa de Listeria monocytogenes en Varias Matrices de Alimentos La presente invención tiene potencial para ser usada para detección de L. monocytogenes letal en y sobre varios alimentos vía unión a la proteína de superficie listerolisina (LO) . Las secuencias de aptámero de las SEC ID NOs. 21-52 pueden ser elegidas para funciones de captura (conjugado aptámero-MB) o reportero - (conjugado aptámero-fluoróforo) y usadas para detectar LO y L. monocytogenes en o sobre alimentos.

Ejemplo 4 Detección Ultrasensible, de Una Etapa de Sal onella typhimurium en Varias Matrices de Alimentos.

La presente invención tiene potencial para ser usada para detección de S. typhimurium y otras especies de Salmonella (S. typhi etc.) en y sobre varios alimentos. S. typhimurium ha sido renombrada Salmonella entérica serovar Typhimurium, pero muchos microbiólogos y laicos todavía se refieren al microbio como S. typhimurium. Las secuencias de aptámeros de las SEC ID NOs . 53-68 puede ser elegidas para funciones de captura (conjugado aptámero-MB) o reportero (conjugado aptámero-fluoróforo) para detección de la bacteria Salmonella typhimurium LPS en o sobre alimentos. Además, las SEC ID NOs: 353-392 de aptámero pueden ser usadas para captura o identificación de S. typhimurium OMP. Estas secuencias de aptámero de ADN de S. typhimurium son únicas y no portan parecido a aquellas recientemente reportadas por Joshi et al. (2008) .

Ejemplo 5 Detección de Contaminación Fecal de Suministros de Agua La presente invención tiene el potencial para detectar todas las especies de bacterias de Escherichia coli en suministros de agua recreativos, aguas residuales tratadas y agua potable, usando las SEC ID NOS. 69-122 de ADN de aptámero dirigidas contra los componentes nucleares comunes de LPS para funciones de reportero y captura. La presente invención tiene el potencial para detectar todas las especies de bacterias de Enterococcus (otro organismo indicador fecal común) en suministro de aguas recreativas, aguas residuales tratadas y agua potable usando las SEC ID NOs. 123-130 de ADN de aptámero dirigidas contra las porciones de ácido teicoico comunes para funciones de reportero y captura.

Ejemplo 6 Detección de Parásitos de Leishmania en Lesiones de la Piel o Fluidos Viscerales La presente invención tiene el potencial para detectar parásitos de Leishmania donovani o L. trópica en lesiones de la piel de fluidos corporales y otras muestras usando secuencias de ADN de aptámero elegidas de las SEC ID NOs. 131-134 dirigidas contra las proteínas de superficie comunes a tanto especies de Leishmania para funciones de reportero y captura.

Ejemplo 7 Detección de Bacterias Vegetativas Encapsuladas de Bacillus anthracis en Sangre y Fluidos Corporales La invención tiene el potencial para detectar bacterias vegetativas de B. anthracis (ántrax) en sangre y fluidos corporales y otras muestras usando secuencias de ADN de aptámeros elegidas a partir de las SEC ID NOS. 135-138 dirigidas contra materiales capsulares de ácido poli-D-glutámico (PDGA) de la superficie para funciones de reportero y captura.

Ejemplo 8 Detección de Moléculas Pequeñas (< 1,000 Daltons) En Muestras Clínicas y Ambientales La invención tiene el potencial para detectar moléculas pequeñas de < 1,000 Daltons, si el objetivo tiene dos epitopes accesibles y distintos para unión de aptámeros reportados y de captura para permitir un formato de ensayo intercalado. Entre tales moléculas pequeñas objetivo podrían estar pesticidas organofosforosos (tales como diazinon y malatión) en muestras de agua ambiental, sucia o turbia, así como también sangre y fluidos corporales y otras muestras usando secuencias de ADN de aptámero elegidas a partir de las SEC ID NOS. 139-154 dirigidas contra diferentes extremos de la molécula pesticida para funciones de reportero y captura. Además, vitaminas tales como 25-hidroxivitamina D3 (calcidiol; SEC ID NOs . 243-274), el neurotransmisor acetilcolina (ACh; SEC ID NOS. 393-416), podrían ser objetivos viables para este nuevo formato de ensayo adherente.

Ejemplo 9 Detección de Enfermedades de Pies y Boca (FMD) y Virus Relacionados La invención tiene el potencial para detectar FMD y virus relacionados en sangre y fluidos corporales y otras muestras usando secuencias de ADN de aptámero elegidas a partir de las SEC ID Nos. 155-164 dirigidas contra un péptido de 16-aminoácidos conservados a partir de varios serotipos 0 de FMD para funciones de captura y reportero.

Ejemplo 10 Detección de Resorción Ósea o Marcadores de Síntesis en Sangre y Fluidos Corporales La invención tiene el potencial para detectar marcadores de pérdida ósea tales como catepsina, telopéptidos C-terminales (CTx) y telopéptidos N-terminales (NTx) de colágeno, hidroxilisina (HL) , fragmentos de osteocalcina (OCF) , etc., debido a los efectos de baja gravedad durante vuelos espaciales de larga duración u oesteoporosis y envejecimiento en sangre, orina y otros fluidos corporales y otras muestras usando secuencias de ADN de aptámero elegidas de las SEC ID NOs . 165-242 dirigidas contra epitopes únicos en cada tipo de marcador óseo. La invención también tiene el potencial para detectar y discriminar varios isómeros de vitamina D asociados con la formación ósea elegidos a partir de las SEC ID NOs . 243-274 para funciones de reportero y captura .

Ejemplo 11 Detección de Toxina A Botulina y Biotoxinas Relacionadas La invención tiene el potencial para detectar toxinas Clostridum botulinum las cuales afectan humanos y animales (serotipos A-F) y bacterias relacionadas, floración de algas nocivas (HAB, dinoflageladas ) , marinas (relacionadas con mariscos), o toxinas de plantas tales como toxina del tétano, toxinas de cólera y difteria, shiga y verotoxinas, enterotoxinas estafilococales, cianotoxinas, azaespiracidas, brevetoxinas, ciguatoxinas, gonyautotoxinas, isómeros de ácido domoico, maitotoxinas, palitoxinas, yesotoxinas, saxitoxinas, ricina, gelonina, abrina, venenos de araña y serpiente, etc., en sangre y fluidos corporales y otras muestras usando secuencias de ADN de aptámero en el formato intercalado adherente. Las secuencias de aptámero elegidas a partir de las SEC ID NOs. 275-278 en particular, pueden ser usadas para detección de cadenas ligeras de botulinum tipo A o la holotoxina.

Ejemplo 12 Detección de Moléculas Sensibles a Quorum en Infecciones Bacterianas Muchas especies de bacterias se conocen ahora por comunicarse químicamente vía moléculas pequeñas secretadas. Muchos patógenos bacterianos Gram negativos comúnmente usan una familia de moléculas pequeñas llamadas acilhomoserina lactonas (AHL) para comunicarse entre células bacterianas para percibir cuando una concentración crítica de células o "quorum" se ha alcanzado para permitir la infección efectiva de un organismo hospedero. Las AHL controlan la inducción de factores de virulencia y patogénesis, tal como expresión de proteínas y toxinas de adherencia. Por lo tanto, la percepción temprana de AHL podría indicar una inminente infección bacteriana Gram negativa y sugerir a un especialista administrar los antibióticos apropiados para prevenir una infección o septicemias más severas. Los AHL comúnmente poseen dos extremos diferentes o epítopes potenciales y son por lo tanto, candidatos potenciales para los ensayos aptámero-MB-aptámero QD de ADN adherente al plástico de una etapa u otros intercalados de aptámero-reportero, descritos en la presente. Las secuencias ID Nos. 417-426 ilustran las secuencias de ADN de aptámero potenciales desarrolladas contra y reactivas con la familia de AHL de bacterias Gram negativas para diagnósticos.

Aunque la invención ha sido descrita con referencia a modalidades especificas, esta descripción no significa ser construida en un sentido limitado. Varias modificaciones de las modalidades descritas, asi como también modalidades alternativas de las invenciones, llegarán a ser aparentes para las personas expertas en la técnica después de la referencia a la descripción de la invención. Por lo tanto, se contempla que las reivindicaciones adjuntas cubrirán tales modificaciones que caen dentro del alcance de la invención. Tales modalidades alternativas pueden incluir, pero no se limitan a cambios en el método reportero que incluye, quimioluminiscencia, detección eléctrica, detección electroquímica, electroquimioluminiscencia, fosforescencia y detección radioisotópica en lugar de detección a base de fluorescencia .

Claims (13)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un método de ensayo intercalado, corrido produciendo y montando conjugados de perlillas magnéticas de aptámero de ADN o ARN, para la captura y detección de un analito objetivo en una solución de volumen, caracterizado porque comprende: combinar la solución de volumen, un conjugado de perlilla magnética de aptámero ("aptámero-MB") , y un conjugado de fluoróforo de aptámero en una cubeta, en donde el aptámero-MB es capaz de unirse con el analito objetivo en un primer sitio de unión y el conjugado de fluoróforo de aptámero es capaz de unirse con el analito objetivo en un segundo sitio de enlace para formar un complejo de analito-aptámero-fluoróforo, y en donde la cubeta tiene un área de superficie translúcida para permitir un ensayo fluorescente; permitir al aptámero-MB unirse con el analito objetivo en el primer sitio de unión y al conjugado de fluoróforo de aptámero unirse con el analito objetivo en el segundo sitio de unión para formar el complejo de analito-aptámero-fluoróforo; adherir el complejo de analito-aptámero-fluoróforo al área de superficie translúcida de la cubeta aplicando un campo magnético externo para atraer la perlilla magnética; y someter a ensayo el complejo de analito-aptámero-fluoróforo que se adhiere al área de superficie translúcida de la cubeta.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el método no incluye una etapa de lavado .

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el complejo de analito-aptámero-fluoróforo es efectivamente dividido lejos de la solución de volumen para permitir la detectabilidad.

4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la cubeta se elabora de poliestireno, plástico transparente o vidrio.

5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el área de superficie translúcida de la cubeta, en la cual se adhiere el complejo de analito-aptámero-fluoróforo, se forma como un contenedor cuadrado, rectangular, redondo, ovalado, o plano, vial, tubo, cilindro, cásete o cartucho.

6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el aptámero-MB y el aptámero-fluoróforo, no se una, · sea par base o hibridice entre si en la solución de volumen.

7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el fluoróforo en el conjugado de fluoróforo-aptámero es una esfera cuántica ("QD") , nanoparticula fosforescente o fluorescente ("NP") , una partícula de látex fluorescente o microperlilla, una molécula de tinte fluorescente, tal como fluoresceína, carboxifluoresceína y un derivado de fluoresceína, o una rodamina o sus derivados.

8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el fluoróforo es un complejo de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia ("FRET"), tal como un FRET-aptámero competitivo o intracadena .

9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa de ensayo es un ensayo intercalado para detectar y cuantificar el analito objetivo en la solución de volumen.

10. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el analito objetivo es una célula completa, tal como una célula de bacteria, parásito, leucocito, o de cáncer.

11. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el analito objetivo es una proteína, proteína de cápsido viral, polimerasa viral, biotoxina tal como toxina bacteriana, tal como botulinum, cólera, tétanos, enterotoxina estafilococal, shigatoxinas o verotoxinas, toxina de alga, tal como brevetoxina, ciguatoxina, cianotoxina, o saxitoxina, veneno de araña o serpiente, proteina clínicamente relevante o porciones de proteína (péptidos), tales como marcador óseo (por ejemplo, péptidos de rompimiento de colágeno tales como CTx, NTx, OCF, Catepsina K o su precursor ProCatepsina K, desoxipiridinolina, piridinolina, lisil piridinolina, o hidroxilisil piridinolina) citocinas e interleucinas , marcadores de infartos al miocardio (troponina, mioglobina, etc.), enfermedad renal, anticuerpos, trastornos autoinmunes, artritis, u otras macromoléculas clínicamente relevantes tales como lipopolisacáridos (LPS, endotoxinas) .

12. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el analito objetivo incluye moléculas pequeñas (moléculas de menos de 1,000 Daltons) con al menos dos epítopes distintos a partir de un grupo que incluye los siguientes: pesticidas, aminoácidos naturales y sintéticos y sus derivados, hidroxilisina, hidroxiprolina, histidina, histamina, homocisteína, DOPA, melatonina, nitrotirosina, productos de proteólisis de cadena corta, cadaverina, putrescina, poliaminas, espermina, espermidina, desoxipiridinolina, piridinolina, lisil piridinolina, o hidroxilisil piridinolina, bases de nitrógeno de ADN o ARN, nucleósidos, nucleótidos, formas cíclicas de nucleótidos, cAMP, cGMP, metabolitos celulares, urea, ácido úrico, farmacéuticos, fármacos terapéuticos, vitaminas, fármacos ilegales, narcóticos, alucinógenos, gama-hidroxibutirato (GHB) , mediadores celulares, citocinas, quimiocinas, moduladores inmunes, moduladores neurales, neurotransmisores tales como acetilcolina, moduladores inflamatorios, prostaglandinas, metabolitos de prostaglandina, explosivos nitroaromáticos y nitramina, productos de rompimiento explosivo (por ejemplo, DNT) o subproductos, moléculas sensibles al quorum tales como AHL, esteroides, hormonas y sus derivados.

13. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa de ensayo de un analito objetivo se realiza usando uno de: intensidad de fluorescencia, fluorescencia resuelta por tiempo, quimioluminiscencia, detección eléctrica, detección electroquímica, electroquimioluminiscencia, fosforescencia o detección radioisotópica .