CN113125530A - 石墨烯生物传感器及制备方法与检测大肠杆菌的方法 - Google Patents

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CN113125530A CN202110254782.1A CN202110254782A CN113125530A CN 113125530 A CN113125530 A CN 113125530A CN 202110254782 A CN202110254782 A CN 202110254782A CN 113125530 A CN113125530 A CN 113125530A
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许士才
宋瑞洪
李正华
王铁军
刘国锋
乔梅
沈丛丛
孟繁露
王吉华
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Abstract

本发明公开了石墨烯生物传感器及制备方法与检测大肠杆菌的方法，石墨烯生物传感器包括结型场效应管，结型场效应管的源极和漏极之间通过石墨烯膜连接，石墨烯膜上设有样品池，栅极设置在样品池上，所述石墨烯膜负载核酸适配体；所述核酸适配体由5’端至3’的序列为：ATCCGTCACACCTGCTCTACGGCGCTCCCAACAGGCCTCTCCTTACGGCATATTATGGTGTTGGCTCCCGTAT。本发明提供的石墨烯生物传感器能够对大肠杆菌进行特异性检测，检测灵敏度高，操作简单，成本低廉，并且在较低的使用电压下具有较高的灵敏性，安全性好。

Description

石墨烯生物传感器及制备方法与检测大肠杆菌的方法
技术领域
本发明属于微生物检测技术领域，涉及石墨烯生物传感器及制备方法与检测大肠杆菌的方法。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)又叫做大肠埃希氏菌，在1985年被德国科学家Theodor Escherich首次发现，是一种革兰氏阴性菌，是一种埃希氏菌属的代表菌，大小为0.5-1.3μm左右，在自然界中具有顽强的抵抗力，可在各种水体中存活。大肠杆菌主要附着于人或动物的肠道内，也是人类肠道中已知数量最多的一种细菌，大部分不致病，但是部分大肠杆菌可以作为致病菌通过水或食物进行传播，是最常见的一种食源性致病菌，通常表现为腹泻、腹膜炎等疾病，严重的还会导致死亡。我国水质控制也采用大肠菌群作为指示菌，《生活饮用水卫生标准》(GB 5749-85)规定，生活饮用水中大肠菌群不大于3个/L。因此，大肠杆菌的快速检测对于疾病控制以及维护人类公众健康具有重要意义，此外在食品工业、水和环境质量控制及临床诊断方面具有重大的应用价值。
据本发明的发明人了解，目前针对于大肠杆菌等细菌的检测方法主要包括传统检测方法和现代检测方法两类。传统检测方法主要包括菌落平板计数法、滤膜法、多管发酵法等方法。但是传统检测方法虽然使用范围广，精度较高，但是过程复杂，整个检测周期较长，对于实验操作人员的技能要求较高。现代检测法主要包括基于免疫学的方法，如酶联免疫吸附法(ELISA)、聚合酶链式反应(PCR)技术等，但是这些实验均需进行富集实验，且成本高；通过荧光强度的进行检测的荧光法和基于生物传感器的电化学方法等等。但是这些检测方法仍然存在着操作复杂、成本高、精度低、周期长等不足之处。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供石墨烯生物传感器及制备方法与检测大肠杆菌的方法，该石墨烯生物传感器能够对大肠杆菌进行特异性检测，检测灵敏度高，操作简单，成本低廉，并且在较低的使用电压下具有较高的灵敏性，安全性好。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
一方面，一种石墨烯生物传感器，包括结型场效应管，结型场效应管的源极和漏极之间通过石墨烯膜连接，石墨烯膜上设有样品池，栅极设置在样品池上，所述石墨烯膜负载核酸适配体；
所述核酸适配体由5’端至3’的序列为：
ATCCGTCACACCTGCTCTACGGCGCTCCCAACAGGCCTCTCCTTACGGCATATTATGGTGTTGGCTCCCGTAT。
本发明中选择特殊的核酸适配体，该核酸适配体具有特殊的三维构象，通过这种三维构象的改变与大肠杆菌进行结合后，能够在石墨烯膜层产生电荷转移，从而影响石墨烯膜表面的电势变化，从而实现对大肠杆菌的检测。
另一方面，一种石墨烯生物传感器的制备方法，在铜箔基底上制备石墨烯膜，将石墨烯膜转移到玻璃基底上，使石墨烯膜覆盖玻璃基底上并连接表面两侧的氧化铟锡，在石墨烯膜的上表面安装样品池，向样品池中插入栅极，将核酸适配体通过1-芘丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯连接到石墨烯膜表面；
所述核酸适配体由5’端至3’的序列为：
ATCCGTCACACCTGCTCTACGGCGCTCCCAACAGGCCTCTCCTTACGGCATATTATGGTGTTGGCTCCCGTAT。
第三方面，一种上述石墨烯生物传感器在检测大肠杆菌中的应用。
第四方面，一种检测大肠杆菌的方法，提供上述石墨烯生物传感器，通过样品池向石墨烯膜添加含有大肠杆菌的待测液，通过检测栅极电压的变化对待测液中的大肠杆菌进行检测。
本发明的有益效果为：
本发明选择特定的核酸适配体与石墨烯生物传感器石墨烯膜配合，该核酸适配体具有特殊的三维构象，通过这种三维构象的改变与大肠杆菌进行结合后，能够在石墨烯膜层产生电荷转移，从而影响石墨烯膜表面的电势变化，从而实现对大肠杆菌的检测。与传统的检测技术比较耗时，步骤复杂，灵敏度低和检测范围有限，本发明技术无需标记，操作简单，周期短，检测灵敏度高。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例1制备的石墨烯传感器的制备过程示意图；
图2为本发明检测实施例1制备的石墨烯传感器的传输曲线；
图3为本发明检测实施例1制备石墨烯生物传感器过程的传输曲线；
图4为本发明实施例1检测大肠杆菌的结果表征图；
图5未本发明对比例1检测金黄色葡萄球菌与大肠杆菌的结果表征图；
图6为本发明实施例1制备的石墨烯传感器的实物图；
图7为本发明对比例2检测大肠杆菌的结果表征图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
鉴于现有检测大肠杆菌的方法存在操作复杂、成本高、精度低、周期长等不足，本发明提出了石墨烯生物传感器及制备方法与检测大肠杆菌的方法。
本发明的一种典型实施方式，提供了一种石墨烯生物传感器，包括结型场效应管，结型场效应管的源极和漏极之间通过石墨烯膜连接，石墨烯膜上设有样品池，栅极设置在样品池上，所述石墨烯膜负载核酸适配体；
所述核酸适配体由5’端至3’的序列为：
ATCCGTCACACCTGCTCTACGGCGCTCCCAACAGGCCTCTCCTTACGGCATATTATGGTGTTGGCTCCCGTAT。
本发明中选择特殊的核酸适配体，该核酸适配体具有特殊的三维构象，通过这种三维构象的改变与大肠杆菌进行结合后，能够在石墨烯膜层产生电荷转移，从而影响石墨烯膜表面的电势变化，从而实现对大肠杆菌的检测。
该实施方式的一种或多种实施例中，石墨烯膜通过1-芘丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯连接核酸适配体。
该实施方式的一种或多种实施例中，所述源极为氧化铟锡。
该实施方式的一种或多种实施例中，所述漏极为氧化铟锡。
该实施方式的一种或多种实施例中，源极的电阻为0.9～1.1KΩ。
该实施方式的一种或多种实施例中，漏极的电阻为0.9～1.1KΩ。
该实施方式的一种或多种实施例中，所述栅极为Ag/AgCl栅极。
该实施方式的一种或多种实施例中提供了一种较优的石墨烯生物传感器，包括玻璃基底，玻璃基底两端镀有氧化铟锡导电膜，两个氧化铟锡导电膜分别作为源极和漏极，两个氧化铟锡导电膜通过石墨烯膜连接，石墨烯膜上设有样品池，样品池设有与源极、漏极配合的栅极，所述石墨烯膜负载核酸适配体。玻璃基底两端的氧化铟锡导电膜使玻璃基底中间形成玻璃沟道，石墨烯膜覆在玻璃沟道之上，两边分别连接两个氧化铟锡导电膜。
本发明的另一种实施方式，提供了一种石墨烯生物传感器的制备方法，在铜箔基底上制备石墨烯膜，将石墨烯膜转移到玻璃基底上，使石墨烯膜覆盖玻璃基底上并连接表面两侧的氧化铟锡，在石墨烯膜的上表面安装样品池，向样品池中插入栅极，将核酸适配体通过1-芘丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯连接到石墨烯膜表面；
所述核酸适配体由5’端至3’的序列为：
ATCCGTCACACCTGCTCTACGGCGCTCCCAACAGGCCTCTCCTTACGGCATATTATGGTGTTGGCTCCCGTAT。
该实施方式的一种或多种实施例中，采用化学气相沉积法在铜箔基底制备石墨烯膜。
该实施方式的一种或多种实施例中，制备石墨烯膜后将铜箔基底刻蚀去除后，再将石墨烯膜转移到玻璃基底上。
该实施方式的一种或多种实施例中，向石墨烯膜添加1-芘丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯进行第一次孵育，然后再加入核酸适配体溶液进行第二次孵育。
该系列实施例中，第一次孵育的时间为16～20h。第一孵育的温度为室温。本发明所述的室温是指室内的环境温度，一般为15～30℃。
该系列实施例中，第二次孵育的时间为30～50min。第二孵育的温度为室温。
本发明的第三种实施方式，提供了一种上述石墨烯生物传感器在检测大肠杆菌中的应用。
本发明的第四种实施方式，提供了一种检测大肠杆菌的方法，提供上述石墨烯生物传感器，通过样品池向石墨烯膜添加含有大肠杆菌的待测液，通过检测栅极电压的变化对待测液中的大肠杆菌进行检测。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
如图1所示，一种石墨烯传感器制成需要经过刻蚀、石墨烯转移、固定样品池过程。
一种石墨烯传感器的制备方法，包括步骤如下：
(1)选择尺寸为30×30mm的玻璃板作为基底。在玻璃板两侧镀有氧化铟锡(ITO)导电薄膜，中间留有30×5mm的玻璃沟道，覆有氧化铟锡(ITO)导电薄膜的两端分别作为源极、漏极。玻璃基底使用之前需要分别使用丙酮、乙醇、去离子水超声清洗20min，去除玻璃基底上的杂质分子。
(2)使用化学气相沉积(CVD)法制备石墨烯，以铜箔为基底，以甲烷为碳源，制备石墨烯。
(3)将石墨烯/铜箔剪裁成1×1cm大小，置于1mol/l的FeCl3溶液中进行刻蚀。
(4)将铜箔基底刻蚀之后，将石墨烯薄膜置于去离子水中进行清洗去除石墨烯表面的残留FeCl3，然后将其转移至ITO玻璃基底之上，使其覆盖在ITO玻璃沟道之上，连接两侧的源、漏极。
(5)在石墨烯表面上固定样品池，该样品池为在尺寸大小为25×20×10mm的固体PMMA板上打造的Φ＝0.5mm的通孔，将Ag/AgCl电极作为栅极插入样品池中，制备好的石墨烯传感器实物如图6所示。
基于石墨烯传感器检测大肠杆菌稀释液的具体操作如下：
(1)将石墨烯传感器接入检测电路；
(2)在器件样品池中加入0.1×PBS缓冲液进行空白器件的传输曲线检测，结果如图2所示，以及调节检测电路中栅极电压范围为-1V～1V，调节检测电路中源-漏电极的恒电压为0.5V。
(3)去除传感器件样品池中的0.1×PBS，使用去离子水冲洗样品池，然后添加100mM1-芘丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(PBASE)在室温下孵育1h，之后依次使用0.1×PBS溶液与去离子水进行清洗，然后测量传输特性，结果如图3所示；
(4)在样品池中添加核酸适配体溶液，在室温下孵育18h，孵育结束后，依次使用0.1×PBS溶液、去离子水冲洗样品池，获得石墨烯生物传感器，然后测量传输特性，结果如图3所示。
核酸适配体序列：
5’-NH2-ATCCGTCACACCTGCTCTACGGCGCTCCCAACAGGCCTCTCCTTACGGCATATTATGGTGTTGGCTCCCGTAT-3’，如SEQ ID NO.1。
(5)在样品池中添加不同菌含量的大肠杆菌稀释液，在室温下孵育40min，孵育结束后分别使用0.1×PBS缓冲液、去离子水冲洗样品池，然后依次测量不同浓度大肠杆菌稀释液的传输特性，结果如图4所示。
大肠杆菌稀释液浓度：8.8cfu/ml、8.8×10cfu/ml、8.8×102cfu/ml、8.8×103cfu/ml、8.8×104cfu/ml。
图2中石墨烯的导电性随着栅极电压的变化表现出明显的双极性变化，呈“V”型。其中，沟道中的载流子密度和类型(电子/空穴)由栅极电压决定。石墨烯转移特性是由电子和空穴浓度决定的，并由电中性点电压(Vcnp)分开。
图3中在通过PBASE在石墨烯生物传感器件固定核酸适配体之后，Vcnp向正栅极电压方向偏移。这一现象是由负静电门控效应导致的，主要时由于核酸适配体中的三磷酸基团带有负电荷，可以通过载流子密度调节石墨烯的费米能级。
图4中随着不同浓度的大肠杆菌稀释液的加入，发现Vcnp产生偏移。该结果表明该生物传感器可用作大肠杆菌的检测研究。
对比例1
(1)将石墨烯传感器接入检测电路；
(2)在器件样品池中加入0.1×PBS缓冲液进行空白器件的传输曲线检测，结果如图2所示，以及调节检测电路中栅极电压范围为-1V～1V，调节检测电路中源-漏电极的恒电压为0.5V。
(3)去除传感器件样品池中的0.1×PBS，使用去离子水冲洗样品池，然后添加100mM1-芘丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(PBASE)在室温下孵育1h，之后依次使用0.1×PBS溶液与去离子水进行清洗，然后测量传输特性，结果如图3所示；
(4)在样品池中添加核酸适配体溶液，在室温下孵育18h，孵育结束后，依次使用0.1×PBS溶液、去离子水冲洗样品池，获得石墨烯生物传感器，然后测量传输特性，结果如图3所示。
核酸适配体序列：
5’-NH2-ATCCGTCACACCTGCTCTACGGCGCTCCCAACAGGCCTCTCCTTACGGCATATTATGGTGTTGGCTCCCGTAT-3’，如SEQ ID NO.2。
(5)在样品池中添加金黄色葡萄球菌稀释液，在室温下孵育40min，孵育结束后分别使用0.1×PBS缓冲液、去离子水冲洗样品池，检测传输曲线，结果如图5所示；
(6)去除传感器件样品池中的金黄色葡萄球菌稀释液，使用去离子水冲洗样品池，然后在样品池中添加大肠杆菌稀释液，在室温下孵育40min，孵育结束后分别使用0.1×PBS缓冲液、去离子水冲洗样品池，检测传输曲线，结果如图5所示。图5中随着就金黄色葡萄球菌与大肠杆菌的加入，发现大肠杆菌Vcnp的偏移明显，但是金黄色葡萄球菌Vcnp基本不偏移。该结果表明该生物传感器不但可用作大肠杆菌的检测研究，而且在大肠杆菌与金黄色葡萄球菌之间具备选择性。
对比例2
本对比例与实施例1相比，不同在于：采用另一种大肠杆菌核酸适配体序列：
5’-NH2-GGACCGAGAAGTTACCCTGTAATCTTAGGATGAATCGCATGCTCTAGCG ACCTTTTCGGCTTCGGCGTACGCACATCGCAGCAAC-3’，如SEQ ID NO.3。
对100cfu/ml、10-1cfu/ml、10-2cfu/ml大肠杆菌稀释液进行检测，如图7所示。图7表明，采用该种大肠杆菌核酸适配体序列的生物传感器无法进行不同浓度大肠杆菌稀释液的检测。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 德州学院
<120> 石墨烯生物传感器及制备方法与其检测大肠杆菌的方法
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atccgtcaca cctgctctac ggcgctccca acaggcctct ccttacggca tattatggtg 60
ttggctcccg tat 73
<210> 2
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atccgtcaca cctgctctac ggcgctccca acaggcctct ccttacggca tattatggtg 60
ttggctcccg tat 73
<210> 3
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggaccgagaa gttaccctgt aatcttagga tgaatcgcat gctctagcga ccttttcggc 60
ttcggcgtac gcacatcgca gcaac 85

Claims (10)

1.一种石墨烯生物传感器，其特征是，包括结型场效应管，结型场效应管的源极和漏极之间通过石墨烯膜连接，石墨烯膜上设有样品池，栅极设置在样品池上，所述石墨烯膜负载核酸适配体；
所述核酸适配体由5’端至3’的序列为：
ATCCGTCACACCTGCTCTACGGCGCTCCCAACAGGCCTCTCCTTACGGCATATTATGGTGTTGGCTCCCGTAT。
2.如权利要求1所述的石墨烯生物传感器，其特征是，石墨烯膜通过1-芘丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯连接核酸适配体。
3.如权利要求1所述的石墨烯生物传感器，其特征是，所述源极为氧化铟锡；
或，所述漏极为氧化铟锡。
4.如权利要求1所述的石墨烯生物传感器，其特征是，源极的电阻为0.9～1.1KΩ；
或，漏极的电阻为0.9～1.1KΩ。
5.如权利要求1所述的石墨烯生物传感器，其特征是，所述栅极为Ag/AgCl栅极。
6.一种石墨烯生物传感器的制备方法，其特征是，在铜箔基底上制备石墨烯膜，将石墨烯膜转移到玻璃基底上，使石墨烯膜覆盖玻璃基底上并连接表面两侧的氧化铟锡，在石墨烯膜的上表面安装样品池，向样品池中插入栅极，将核酸适配体通过1-芘丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯连接到石墨烯膜表面；
所述核酸适配体由5’端至3’的序列为：
ATCCGTCACACCTGCTCTACGGCGCTCCCAACAGGCCTCTCCTTACGGCATATTATGGTGTTGGCTCCCGTAT。
7.如权利要求6所述的石墨烯生物传感器的制备方法，其特征是，采用化学气相沉积法在铜箔基底制备石墨烯膜；
或，制备石墨烯膜后将铜箔基底刻蚀去除后，再将石墨烯膜转移到玻璃基底上。
8.如权利要求6所述的石墨烯生物传感器的制备方法，其特征是，向石墨烯膜添加1-芘丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯进行第一次孵育，然后再加入核酸适配体溶液进行第二次孵育；
优选的，第一次孵育的时间为16～20h；
优选的，第二次孵育的时间为30～50min。
9.一种权利要求1～5任一所述的石墨烯生物传感器或权利要求6～8任一所述的制备方法获得的石墨烯生物传感器在检测大肠杆菌中的应用。
10.一种检测大肠杆菌的方法，其特征是，提供权利要求1～5任一所述的石墨烯生物传感器或权利要求6～8任一所述的制备方法获得的石墨烯生物传感器，通过样品池向石墨烯膜添加含有大肠杆菌的待测液，通过检测栅极电压的变化对待测液中的大肠杆菌进行检测。
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