CN110699431A - 基于三维石墨烯生物传感器检测癌症标志物MicroRNA的方法 - Google Patents

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李崇辉
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    • G01N27/4145—Ion-sensitive or chemical field-effect transistors, i.e. ISFETS or CHEMFETS specially adapted for biomolecules, e.g. gate electrode with immobilised receptors

Abstract

本发明涉及基于三维石墨烯生物传感器检测癌症标志物MicroRNA的方法，其三维石墨烯生物传感器由玻璃基底和三维石墨烯片层组成，所述玻璃基底的上表面两侧设有氧化铟锡(ITO)，两侧氧化铟锡的部分上表面被三维石墨烯片层覆盖，一侧未被三维石墨烯覆盖的部分作为源极，另一侧未被三维石墨烯覆盖的部分作为漏极。本发明的方法无需标记，操作简单，使用方便，并且在较低的使用电压下具有较高的选择性和特异性，安全性好。

Description

基于三维石墨烯生物传感器检测癌症标志物MicroRNA的方法
技术领域
本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及一种基于三维石墨烯生物传感器检测癌症标志物MicroRNA的方法。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
MicroRNA(miRNA)是一类长度大约为18-24个核苷酸组成的非编码单链RNA分子，主要由内源基因编码，可以调节真核基因的表达，而且参与多种生物学过程，例如细胞的增殖、分化、凋亡以及RNA的加工、翻译等过程，在生物的基因调控中起着关键作用，可以导致大量疾病和功能性失调，例如大多数疾病的发病机理，神经退行性疾病等，miRNA已经被证实为有一定研究价值的疾病生物标志物。因此，对于生物学研究和临床诊断来说，开发一种灵敏性高、成本低、操作简单的miRNA检测方法至关重要。
目前，传统的miRNA的检测技术主要包括Northern blotting、定量即时聚合酶链锁反应 (qRT-PCR)、微阵列等方法，然而这些方法还有很多不足之处，例如操作耗时，步骤复杂，灵敏度低和检测范围有限等，因此开发一种灵敏且高效的miRNA检测方法是非常急迫的。近些年来，以纳米材料作为导电基底制备生物传感器在灵敏度、选择性及检测范围内都表现出了优异的性能，其中基于三维石墨烯的场效应管生物传感器(FET)更是表现出了广阔的应用前景。泡沫石墨烯，是一种由碳原子构成的六角型呈蜂巢晶格状的三维石墨烯材料，不但具有二维石墨烯的固有特性，而且还具有很多独特的优良性质，如独特的机械特性，优异的电导率，高比表面积等，使其成为生物传感器领域的优良材料。
发明内容
为了克服上述问题，本发明提供了一种检测癌症标志物MicroRNA的一种三维石墨烯生物传感器，该三维石墨烯生物传感器灵敏度高，操作简单，成本低廉，并且在较低的使用电压下具有较高的灵敏性，安全性好。
为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：
一种检测癌症标志物MicroRNA的三维石墨烯生物传感器，包括：
基底；
所述基底上表面的两侧设置氧化铟锡；
所述基底中部设置有三维石墨烯层；
所述三维石墨烯层覆盖部分氧化铟锡；
未被覆盖的氧化铟锡分别位于基底的两侧，分别作为源极和漏极。
本发明的原理为：选用三维石墨烯为导电层制备场效应管生物传感器，以互补DNA作为探针将其固定在生物传感器件导电沟道，让待测miRNA溶液在导电沟道表面流过，由于碱基互补配对原则，待测miRNA通过探针吸附在导电沟道表面，使导电材料表面电势发生变化，通过电路系统记录电势变化，从而传输探针与互补miRNA相互作用的电化学信号。
本发明中对基底材料的类型并不做特别的限定，因此，在一些实施例中，所述基底为玻璃基底，以提高负载效率和检测效率；
在一些实施例中，所述石墨烯层的上表面设有样品池，所述样品池的池底为三维石墨烯层；三维石墨烯的结构为三维立体结构，相对于二维石墨烯而言，大大的增加了石墨烯的比表面积，增加了探针分子在石墨烯上的结合位点，有助于更多的待测分子在石墨烯骨架上的连接；其次，三维石墨烯在刻蚀转移时并不需要进行涂胶、烘烤等步骤，使得转移方法更为简洁，并且减少了在转移过程中对石墨烯骨架造成的伤害。
在一些实施例中，所述氧化铟锡的电阻均为0.9～1.1KΩ，以使其具有较好的电化学性能。
在一些实施例中，所述三维石墨烯层制备方法如下：
采用化学气相沉积法在金属基底表面制备三维石墨烯层；
刻蚀掉金属基底，即得。泡沫镍是一种多孔结构，由相互连接的镍三维支架构成，充当石墨烯生长的模板。在1050℃高温下分解CH4。将碳引入泡沫镍中，沉积在泡沫镍的三维骨架上，形成三维石墨烯。将镍骨架用FeCl3溶液蚀刻后，得到具有良好泡沫状多孔结构的3D- 石墨烯。去除镍模板后，3D-石墨烯保持了原有结构。三维石墨烯表面的高倍放大SEM图像中，从三维石墨烯表面观察到一些波纹和褶皱。这些波纹和褶皱结构可以看作是 CVD生长的石墨烯的典型特征，这些波纹和皱纹进一步增加了3D石墨烯的比表面积，有望实现更高的传感灵敏度。
在一些实施例中，所述刻蚀在氯化铁溶液中进行刻蚀，刻蚀时间为5-6h。所制备的三维石墨烯可以清楚地观察到两个位于～1580cm-1和～2700cm-1位置的显著波段，分别对应于石墨烯的G波段和2D波段。石墨烯层数的信息可以从2D波段强度与G波段强度的比值中提取出来。从拉曼光谱来看，2D波段的强度与G波段的强度之比约为0.6，说明3D石墨烯是一个多层结构。D波段(通常位于1350cm-1)与石墨烯的无序碳有关，通常用于分析合成的石墨烯薄膜的质量。在本发明的实验中，没有观察到明显的D波段强度，这证实了3D-石墨烯的高质量。需要注意的是，3D-石墨烯转移到玻璃基板上后，其光谱特征没有明显变化。这一事实表明，转移过程并未导致3D-石墨烯的缺陷或污染，保持了石墨烯优异的传感性能。
本发明还提供了一种检测癌症标志物MicroRNA的三维石墨烯生物传感器的制作方法，包括：
将三维石墨烯生物传感器接入检测电路；
三维石墨烯骨架的制备；
在水中，将所述三维石墨烯骨架转移到上表面两侧设置有氧化铟锡的基底上，使石墨烯的下表面覆盖玻璃基底上表面两侧的氧化铟锡。
对于二维石墨烯转移，PMMA是通常用作保护薄膜，保护石墨烯不受损害。相比之下，3D-石墨烯是自支撑的，因此可以直接转移到目标衬底上。这种无PMMA转移方法避免了石墨烯污染，保证了石墨烯优异的性能。
在一些实施例中，所述方法还包括在三维石墨烯片层的上表面安装样品池。
在一些实施例中，所述样品池的材质为胶类物质。
本发明还提供了一种基于三维石墨烯生物传感器检测MicroRNA的方法，包括：
将任一上述的三维石墨烯生物传感器接入检测电路；
将探针DNA通过1-芘丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯连接到三维石墨烯骨架表面；
向固定有探针DNA的三维石墨烯层上添加含有MicroRNA的不同浓度的溶液，根据检测栅极电压变化获得生物传感器对MicroRNA检测的灵敏性。
本发明中的miRNA检测在实验过程中，不需要对探针DNA进行发光修饰，降低了对探针分子的伤害，在实验操作过程中也更为稳定。
为了使DNA探针固定在3D-石墨烯上，PBASE因其化学稳定性高、不亲水、不溶于有机溶剂等特点，被用作修饰3D-石墨烯的中间连接剂。PBASE和琥珀酰亚胺可以共价结合DNA探针上的氨基。因此，在一些实施例中，所述探针DNA序列为： 5'-CCCCTATCACGATTAGCATTAA-3'，提高了检测的准确性。
在一些实施例中，所述MicroRNA分子配制的浓度分别为100pM～100nM。为了防止MicroRNA的降解，所有涉及到MicroRNA的实验都在无菌的环境中进行。
在一些实施例中，上述基于三维石墨烯生物传感器检测MicroRNA的方法具体包括如下步骤：
(1)将三维石墨烯生物传感器件放在探针台上接入检测电路；
(2)加入磷酸盐缓冲液PBS，检测一下空器件的传输特性以及调节检测电路中栅极电压范围和源-漏电极的恒电压；
(3)将PBS吸出样品池，清洗干净，加入100mM 1-芘丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯PBASE孵育1h，测量传输特性；
(4)将PBASE吸出样品池，清洗干净，加入探针DNA溶液进行检测，测量传输特性；
(5)吸出样品池中的探针DNA溶液，清洗干净，再分别加入不同浓度的MicroRNA溶液与探针DNA相互作用，测量在不同浓度下的传输特性；
在一些实施例中，所述步骤(2)中PBS的pH值为7.0，栅极电压范围为-1V～1V，源-漏电极的恒电压为0.5V，以减少对探针DNA的电损伤。
在一些实施例中，所述步骤(4)中探针DNA用PBS溶解，再将其稀释后进行检测。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明的操作方法简单、成本低、具有普适性，易于规模化生产。
(1)传统的检测技术步骤多，时间长，灵敏性差和检测范围有限，本发明技术无需标记，操作简单，周期短，检测灵敏度高。
(2)本发明对于miRNA检测具有较高灵敏性，并且在较低的检测范围内将最低检测浓度降至100pM。
(3)本发明的操作方法简单、成本低、具有普适性，易于规模化生产。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为三维石墨烯生物传感器的制作过程示意图；
图2为空三维石墨烯生物传感器传输特性曲线示意图；
图3为PBASE修饰的生物传感器件和探针DNA功能化后的传输特性曲线示意图；
图4为四种待测MicroRNA浓度与三维石墨烯生物传感器△Vcnp变化的示意图；
图5为三维石墨烯生物传感器件的实物图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，现有技术中存在检测miRNA的时间长、步骤复杂、灵敏度低、检测范围有限的不足，为了解决如上的技术问题，本公开提出了基于三维石墨烯生物传感器检测miRNA的方法。
本发明一方面是提供一种检测癌症标志物MicroRNA的三维石墨烯生物传感器，由玻璃基底和三维石墨烯层组成，所述玻璃基底的上表面两侧设有氧化铟锡(ITO)，两侧氧化铟锡的部分上表面被三维石墨烯层覆盖，一侧未被石墨烯覆盖的部分作为源极，另一侧未被石墨烯覆盖的部分作为漏极。
本发明的另一方面提供了一种上述三维石墨烯生物传感器的制备方法，在泡沫镍基底上制备石墨烯层，将金属基底刻蚀去除保留下三维石墨烯骨架，然后将三维石墨烯层转移到玻璃基底上，使石墨烯的下表面覆盖玻璃基底上表面两侧的氧化铟锡。
本发明的第三方面提供了一种基于三维石墨烯生物传感器检测癌症标志物MicroRNA的方法，将上述三维石墨烯生物传感器接入检测电路，探针DNA通过1-芘丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯连接到石墨烯骨架上，然后向固定有探针DNA的石墨烯层上添加含有可作为癌症标志物的的不同浓度的溶液，通过检测栅极电压变化即可获得三维石墨烯生物传感器检测miRNA的灵敏性。
本公开的一种典型实施方式，提供了一种检测miRNA的三维石墨烯生物传感器，由玻璃基底和三维石墨烯层组成，所述玻璃基底的上表面两侧设有氧化铟锡(ITO)，两侧氧化铟锡的部分上表面被三维石墨烯层覆盖，一侧未被三维石墨烯覆盖的部分作为源极，另一侧未被三维石墨烯覆盖的部分作为漏极。
该实施方式的一种或多种实施例中，三维石墨烯层的上表面设有样品池，所述样品池的池底即为三维石墨烯层。所述样品池内设有栅极。
该实施方式的一种或多种实施例中，玻璃基底的上表面两侧设有氧化铟锡的电阻均为 0.9～1.1KΩ。
本公开的另一种实施方式，提供了一种上述三维石墨烯生物传感器的制备方法，在金属基底上制备三维石墨烯层，将金属基底刻蚀去除仅保留三维石墨烯骨架，然后将三维石墨烯转移到玻璃基底上，使三维石墨烯骨架覆盖玻璃基底上表面两侧的氧化铟锡，即可获得。
该实施方式的一种或多种实施例中，采用化学气相沉积法在金属基底表面制备三维石墨烯层。
该实施方式的一种或多种实施例中，在金属基底的材质为泡沫镍，以甲烷为碳源生长三维石墨烯层。刻蚀该金属基底的溶液为三氯化铁溶液。
该实施方式的一种或多种实施例中，刻蚀掉金属基底后在三维石墨烯层的上表面安装样品池。然后向样品池中插入栅极。所述栅极为Ag/AgCl栅极。为了防止样品池的材质对传感器的影响，所述样品池的材质与胶的材质一致。
本公开的第三种实施方式，提供了一种基于三维石墨烯生物传感器检测miRNA的方法，将上述三维石墨烯生物传感器接入检测电路，探针DNA通过1-芘丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯连接到三维石墨烯骨架上，然后向固定有探针DNA的三维石墨烯层上添加含有miRNA的不同浓度的溶液，通过检测栅极电压变化即可获得三维石墨烯生物传感器对miRNA检测灵敏性。
该实施方式的一种或多种实施例中，具体步骤为：
(1)将三维石墨烯生物传感器件放在探针台上接入检测电路；
(2)加入磷酸盐缓冲液(PBS)，检测一下空器件的传输特性以及调节检测电路中栅极电压范围和源-漏电极的恒电压；
(3)将PBS吸出样品池，清洗干净，加入100mM 1-芘丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(PBASE) 孵育1h，测量传输特性；
(4)将PBASE吸出样品池，清洗干净，加入探针DNA溶液进行检测，测量传输特性；
(5)吸出样品池中的探针DNA，清洗干净，再分别加入不同浓度的互补miRNA与探针DNA相互作用，测量在不同浓度下的传输特性；
该实施方式的一种或多种实施例中，所述步骤(2)中PBS的pH值为7.0，栅极电压范围为 -1V～1V，源-漏电极的恒电压为0.5V。
该实施方式的一种或多种实施例中，所述步骤(4)中探针DNA用PBS溶解，再将其稀释后进行检测。探针DNA序列为：5'-CCCCTATCACGATTAGCATTAA-3'
该实施方式的一种或多种实施例中，所述步骤(5)中互补miRNA序列为：
5'-UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGG-3'。互补miRNA配制的浓度分别为100pM、1nM、10nM、100nM。
该实施方式的一种或多种实施例中，所述步骤(3)(4)(5)中清洗样品池用的溶液是0.1xPBS。
下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。
实施例1三维石墨烯生物传感器的制备
如图1所示，一种三维石墨烯生物传感器件制成需要经过刻蚀基底、转移、粘贴样品池过程。
一种三维石墨烯生物传感器件的制备方法，包括步骤如下：
(1)选用覆有氧化铟锡(ITO)导电膜的玻璃作为基底。氧化铟锡设于玻璃基底的两侧，一侧为源极，一侧为漏极。源极与漏极的电阻均为1KΩ。玻璃基底的尺寸为30×30mm，氧化铟锡导电膜的尺寸分别为30×12mm，厚度为185nm。基底依次采用丙酮、乙醇和去离子水进行超声清洗，每次清洗时间为20min，以使基底表面更加干净。
(2)将采用化学气相沉积法，以泡沫镍为基底，甲烷为碳源来生长三维石墨烯，生产的三维石墨烯裁剪为1×1cm大小。
其中，具体步骤为在1050℃泡沫镍基板上生长3D石墨烯。为了提高三维泡沫镍的晶体质量，首先将泡沫镍在1050℃下退火10min，在90mtorr下通入H2,H2为15sccm。对于石墨烯的生长，CH4和H2的气体混合物在460mtorr下，分别以16和30sccm速度流动，持续15 分钟。最后，样品石墨烯/泡沫镍迅速冷却至室温，H2的流动速度为15sccm，压力为90mtorr。
(3)将剪裁后的三维石墨烯/镍放入1M的三氯化铁溶液中进行刻蚀5-6h。
(4)待将泡沫镍基底刻蚀掉，将三维石墨烯采用去离子水清洗，直至无三氯化铁，然后在去离子水中将三维石墨烯层转移到覆有ITO的玻璃基底上，使三维石墨烯层与玻璃基底接触且骨架覆在源-漏极之上。
(6)在三维石墨烯/玻璃基底上粘贴样品池，然后将样品溶液加入样品池并将Ag/AgCl栅极插入样品池形成三维石墨烯生物传感器。样品池的材质为固体PMMA板，尺寸为25×20×10mm 固体PMMA板开设Φ＝0.5mm的通孔作为样品池，三维石墨烯作为样品池的池底。制备好的三维石墨烯生物传感器如图5所示。
实施例2互补miRNA的检测
基于三维石墨烯生物传感器检测miRNA的方法，步骤如下：
(1)将三维石墨烯生物传感器件放在探针台上接入检测电路；
(2)加入0.1x磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.0)，检测一下空器件的传输特性，结果如图2所示，以及调节检测电路中栅极电压范围为-1V～1V，调节检测电路中源-漏电极的恒电压为0.5V。
(3)将PBS吸出样品池，用0.1xPBS清洗干净，加入100mM 1-芘丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(PBASE)孵育1h，测量传输特性，检测结果如图3所示。
(4)将PBASE吸出样品池，用0.1xPBS清洗干净，探针DNA用0.1xPBS溶解，再将其稀释为100nM，加入至样品池进行检测，测量传输特性，检测结果如图3所示。
互补miRNA序列为：5'-UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGG-3'。
(5)吸出样品池中的探针DNA，用0.1xPBS清洗干净，再分别加入不同浓度的互补miRNA 分子与探针DNA相互作用，测量在不同浓度下的传输特性，检测结果如图4所示。
互补MicroRNA配制的浓度分别为100pM、1nM、10nM、100nM。
图2中三维石墨烯的导电性质随栅电压的变化呈现了“V”型的特征。其中，沟道中的载流子密度和类型(电子/空穴)由栅极电压决定。三维石墨烯转移特性是由电子和空穴浓度决定的，并由电中性点电压(Vcnp)分开。
图3中在通过PBASE在三维石墨烯生物传感器件修饰探针DNA之后，Vcnp向正栅极电压方向偏移。石墨烯的电位变化可以用负静电门控效应来解释。由于探针DNA具有带负电荷的三磷酸基团，它可以通过诱导过量的空穴载流子调节石墨烯的费米能级，进而导致Vcnp向正栅极电压方向偏移。
图4中随着不同浓度的miRNA的加入，发现Vcnp的偏移方向与本公开发明人所知的方向一致。该结果表明该生物传感器可用作miRNA的检测研究。
其中，(Vcnp)中电荷中性点电压(ΔVcnp)与互补miRNA浓度的变化表现出良好的线性关系，在100pM到100nM的大范围内相关系数为0.9899。
最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (10)

1.一种检测癌症标志物MicroRNA的三维石墨烯生物传感器，其特征在于，包括：
基底；
所述基底上表面的两侧设置氧化铟锡；
所述基底中部设置有三维石墨烯层；
所述三维石墨烯层覆盖部分氧化铟锡；
未被覆盖的氧化铟锡分别位于基底的两侧，分别作为源极和漏极。
2.如权利要求1所述检测癌症标志物MicroRNA的三维石墨烯生物传感器，其特征在于，所述基底为玻璃基底；
或所述石墨烯层的上表面设有样品池，所述样品池的池底为三维石墨烯层；
或所述氧化铟锡的电阻均为0.9～1.1KΩ。
3.如权利要求1所述检测癌症标志物MicroRNA的三维石墨烯生物传感器，其特征在于，所述三维石墨烯层制备方法如下：
采用化学气相沉积法在金属基底表面制备三维石墨烯层；
刻蚀掉金属基底，即得。
4.如权利要求3所述检测癌症标志物MicroRNA的三维石墨烯生物传感器，其特征在于，所述刻蚀在氯化铁溶液中进行刻蚀，刻蚀时间为5-6h。
5.一种检测癌症标志物MicroRNA的三维石墨烯生物传感器的制作方法，其特征在于，包括：
将三维石墨烯生物传感器接入检测电路；
三维石墨烯骨架的制备；
在水中，将所述三维石墨烯骨架转移到上表面两侧设置有氧化铟锡的基底上，使石墨烯的下表面覆盖玻璃基底上表面两侧的氧化铟锡。
6.如权利要求5所述的检测癌症标志物MicroRNA的三维石墨烯生物传感器的制作方法，其特征在于，所述方法还包括在三维石墨烯片层的上表面安装样品池。
7.如权利要求5所述的检测癌症标志物MicroRNA的三维石墨烯生物传感器的制作方法，其特征在于，所述样品池的材质为胶类物质。
8.一种基于三维石墨烯生物传感器检测MicroRNA的方法，其特征在于，包括：
将权利要求1-4任一项所述的三维石墨烯生物传感器接入检测电路；
将探针DNA通过1-芘丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯连接到三维石墨烯骨架表面；
向固定有探针DNA的三维石墨烯层上添加含有MicroRNA的不同浓度的溶液，根据检测栅极电压变化获得生物传感器对MicroRNA检测的灵敏性。
9.如权利要求8所述的基于三维石墨烯生物传感器检测MicroRNA的方法，其特征在于，所述探针DNA序列为：5'-CCCCTATCACGATTAGCATTAA-3'；
所述MicroRNA分子配制的浓度分别为100pM～100nM。
10.如权利要求8所述的基于三维石墨烯生物传感器检测MicroRNA的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
(1)将三维石墨烯生物传感器件放在探针台上接入检测电路；
(2)加入磷酸盐缓冲液PBS，检测一下空器件的传输特性以及调节检测电路中栅极电压范围和源-漏电极的恒电压；
(3)将PBS吸出样品池，清洗干净，加入100mM 1-芘丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯PBASE孵育1h，测量传输特性；
(4)将PBASE吸出样品池，清洗干净，加入探针DNA溶液进行检测，测量传输特性；
(5)吸出样品池中的探针DNA溶液，清洗干净，再分别加入不同浓度的MicroRNA溶液与探针DNA相互作用，测量在不同浓度下的传输特性；
优选地，所述步骤(2)中PBS的pH值为7.0，栅极电压范围为-1V～1V，源-漏电极的恒电压为0.5V；
优选地，所述步骤(4)中探针DNA用PBS溶解，再将其稀释后进行检测。
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