CN113008967A - 一种无标记石墨烯场效应晶体管柔性生物传感器及其制备方法和应用 - Google Patents

一种无标记石墨烯场效应晶体管柔性生物传感器及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于核酸检测的生物传感器及其制备方法和应用。一种无标记石墨烯场效应晶体管柔性生物传感器，包括衬底和PDMS盖板；所述衬底上铺设有单层石墨烯，所述单层石墨烯上镀有源/漏电极；所述PDMS盖板盖在所述源/漏电极之间的单层石墨烯上；所述PDMS盖板上的微流道与所述单层石墨烯连通；所述单层石墨烯表面修饰有探针结合材料。本发明采用多聚懒氨酸等对单层石墨烯进行修饰，功能化修饰后的单层石墨烯，通过静电吸附作用，将DNA探针分子吸附固定在单层石墨烯表面，以便对miRNA进行检测。本发明的柔性生物传感器，制备工艺简单、成本低、灵敏度高、检测极限低。

Description

一种无标记石墨烯场效应晶体管柔性生物传感器及其制备方 法和应用
技术领域
本发明属于电化学技术领域，涉及一种用于核酸检测的生物传感器及其制备方法和应用。
背景技术
MicroRNAs（miRNAs）是一种小的（19-25核苷酸）非编码RNA，通过mRNA降解或翻译抑制调节基因表达。超过一半的人类编码基因可以选择性地与miRNAs配对。根据序列的互补程度，miRNAs可以引起靶基因的降解或抑制mRNA的翻译，从而抑制蛋白质合成，实现基因调控。miRNAs是调节其他功能基因表达的重要调控分子，在生物体的各种生理活动、生长发育中发挥着重要作用。MiRNAs的表达水平与多种疾病有关，被认为是一种有前途的生物标志物。因此，开发一种灵敏、选择性、简便、低成本的miRNA检测方法对生物学研究和临床诊断具有重要意义。
一般来说，miRNAs的检测方法包括northern杂交分析、微阵列、分子克隆、实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）等，但这些方法存在分析量小、灵敏度差、操作繁琐、耗时长、成本高等局限性。近几十年来，基于纳米材料的生物传感器，如硅纳米线（SiNWs）、碳纳米管（CNTs）和石墨烯量子点（GQD）器件，在化学和生物材料的无标签检测中受到了广泛的关注。石墨烯是一种单原子厚度的二维材料，具有载流子迁移率高、双极场效应、探测面积大、易于功能化、本征电噪声低等优点，更适合作为生物传感器。
现有技术中，石墨烯场效应晶体管作为生物传感器时，为了实现检测的选择性，需要在石墨烯表面修饰生物识别分子，如抗体、酶、核酸等。为了实现生物识别分子的修饰，往往需要在石墨烯上先修饰连接层，如AuNPs、PtNPs、1-芘丁酸丁二酰酯（PASE）苝四羧酸（PTCA）等。专利201410750676.2使用1-羟基琥珀酰亚胺酯-1-芘丁酸(PASE)作为连接剂，首先将石墨烯场效应晶体管在室温下，置于PASE的DMSO溶液中1h，PASE一端的芘基通过π-π键与石墨烯紧密连接。然后将PASE修饰后的石墨烯场效应晶体管在室温下，置于PNA探针的溶液中2h，另一端的酰胺键与PNA探针的氨基发生反应，从而固定住PNA探针。完成上述工艺步骤后，即用于检测能与PNA杂交的DNA。此外1-芘丁酸也被用作连接剂，使用时需使用NHS/EDC活化-COOH。
纳米粒子常被用于连接层，其中纳米金粒子(AuNPs)最为普遍，AuNPs是至直径在1-100nm的金颗粒，它具有很好的生物相容性并能够与多种生物分子相结合。蔡冰洁在其毕业论文中，将石墨烯场效应晶体管浸入HAuCl4的溶液中反应30min，即得到了AuNPs修饰的石墨烯。通过Au-S共价键，在AuNPs表面修饰巯基乙胺，连接层上有了胺基，再通过戊二醛固定PNA探针或者酶等。
以上两种方法，都是基于非共价键的，为了更加牢固的固定生物识别分子，人们直接对导电沟道石墨烯进行共价键功能化，如胺基石墨烯、羧基石墨烯等，但共价键的引入，破坏了石墨烯的结构，极大的降低了石墨烯的电子迁移率。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有的生物传感器存在的问题，提供一种无标记石墨烯场效应晶体管柔性生物传感器，采用单层石墨烯液体栅极晶体管，实现无标记免修饰检测miRNA。
本发明解决其技术问题采用的第一种技术方案是：一种无标记石墨烯场效应晶体管柔性生物传感器，包括衬底和PDMS盖板；所述衬底上铺设有单层石墨烯，所述单层石墨烯上镀有源/漏电极；所述PDMS盖板盖在所述源/漏电极之间的单层石墨烯上；所述PDMS盖板上的微流道与所述单层石墨烯连通，微流道内设有栅电极；所述单层石墨烯表面修饰有探针结合材料，用于固定探针分子。
作为本发明的一种优选方式，所述的探针结合材料通过静电吸附作用结合探针分子，选自多聚懒氨酸、氧化石墨烯、石墨烯量子点、戊二醛、环氧基中的任一种。
作为本发明的一种优选方式，所述的衬底为柔性材料或绝缘材料。
作为本发明的一种优选方式，所述的源/漏电极为Ti/Au或Cr/Au电极。
进一步优选地，液态栅电极采用Ag/AgCl或pt作为参比电极。
本发明还提供了上述无标记石墨烯场效应晶体管柔性生物传感器的制备方法，包括：
（1）在铜片基底表面生长单层石墨烯；
（2）将带有单层石墨烯的铜片旋涂一层PMMA；
（3）将旋涂好的铜片置于刻蚀液中，制备连续的带有一层PMMA的单层石墨烯；
（4）将带有一层PMMA单层石墨烯置于衬底上；
（5）去除单层石墨烯上PMMA；
（6）将衬底上的单层石墨烯盖上掩膜板，镀上源/漏电极；
（7）将带有微流道的PDMS盖板盖源/漏电极之间的单层石墨烯上；
（8）向微流道里注入探针结合材料溶液静置8-15小时；
（9）将栅电极置于微流道中。
本发明还提供了一种基于石墨烯场效应管的miRNA检测方法，该方法采用上述柔性生物传感器，包括：
向微流道里注入DNA探针，孵育一段时间后冲洗干净；
向微流道内注入待测miRNA，连接参比电极进行Gr-FET的转移特性测试；通过FET电特性的改变量测出miRNA的量。
本发明进一步提供了上述柔性生物传感器的应用，该柔性生物传感器用于制备便携式可穿戴设备。
本发明的无标记石墨烯场效应晶体管柔性生物传感器，采用多聚懒氨酸、氧化石墨烯、石墨烯量子点、戊二醛、环氧基等对单层石墨烯进行功能化修饰，功能化修饰后的单层石墨烯，通过静电吸附作用，将DNA探针分子吸附固定在单层石墨烯表面。miRNA与探针DNA杂交后，石墨烯表面电荷量的改变引起Gr-FET狄拉克点变化，通过Gr-FET的转移特性来测定miRNA，实现未修饰和无标记miRNA的检测。本发明的柔性生物传感器，制备工艺简单、成本低、灵敏度高、检测极限低。
本发明的柔性生物传感器采用柔性材料衬底，具有优异的柔性，可弯曲，可以附着在任意设备表面进行miRNA监测，在便携式和可穿戴电子产品方面有广阔的应用前景。
附图说明
图1是本发明实施例中柔性生物传感器的结构示意图；
图2是对本发明实施例中提供的生物传感器进行特异性测试的结果示意图；
图3是对本发明实施例中提供的生物传感器进行灵敏度测试的结果示意图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面结合附图和具体实施例，对本发明进行更详细的说明。附图中给出了本发明的较佳的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
本发明提供的第一个实施例是：一种无标记石墨烯场效应晶体管柔性生物传感器，该生物传感器的结构如图1所示，主要由PDMS盖板1、Ti/Au电极2、单层石墨烯4和衬底5组成。单层石墨烯4设置在衬底5上，Ti/Au电极2镀在单层石墨烯4的两侧，PDMS盖板1盖在Ti/Au电极2之间的单层石墨烯上方。
其中，PDMS盖板1带有微流道3，微流道3与其下方的单层石墨烯4相通，使得进入微流道3的溶液能够流到单层石墨烯4的表面。微流道3内设有栅电极。液态栅电极采用Ag/AgCl作为参比电极，也可以采用pt作为参比电极。
本实施例中，在单层石墨烯4的表面修饰有多聚赖氨酸（PLL），用于结合DNA探针分子。
本实施例中，衬底5采用柔性材料制成，优选聚酰亚胺材料。
本实施例中的柔性生物传感器，以Ti/Au电极作为源/漏电极，以Ag/AgCl参比电极作为液态栅电极，以PBS缓冲液为栅介电层，以单层石墨烯作为半导体材料，通过单层石墨烯表面修饰的PLL吸附固定DNA探针，miRNA与探针DNA杂交后石墨烯表面电荷量改变引起Gr-FET狄拉克点变化，检测Gr-FET的转移特性，通过FET电特性的改变量测出miRNA的量，实现miRNA的测定。
本发明提供的第二个实施例是：制备上述柔性生物传感器的方法，该方法的具体步骤如下：
1、以5×5cm2 99.99%纯度铜片为生长基底，在丙酮中超声清洗10分钟后，用去离子水冲洗并浸泡于1mol/L的盐酸溶液中10h，然后用去离子水及乙醇交替清洗3次；
2、将处理好的铜片放入石英管式炉中，以氩气(400sccm)和氢气(80sccm)为载气，管式炉以25度/分钟的升温速率加热至1000℃，通入甲烷(60sccm)为碳源，在1000℃生长15分钟，生长结束后关闭甲烷和氢气，冷却到室温，取出样品，得到表面生长有石墨烯的铜片；
3、将生长好石墨烯的铜片旋涂PMMA。铜基石墨烯粘在基片（平皿）上，放入旋涂仪，先均匀滴一层PMMA，匀胶参数：600转10秒，2000转一分钟；
4、将悬涂PMMA的石墨烯铜片切成2×1mm2小块放入氯化铁(0.5mol/L)溶液中浸泡10小时，直至铜被完全刻蚀掉，得到漂浮在溶液中的带有PMMA的单层石墨烯；
5、用去离子水将刻蚀后的溶液多次(5次以上)置换，除去溶液中的金属离子。随后将带有一层PMMA单层石墨烯置于2×2 cm2的柔性聚酰亚胺(PI)衬底上；
6、将带有石墨烯的柔性衬底放入丙酮内浸泡，每三十分钟换一次丙酮，换三次液，去除表面的PMMA，然后置于退火炉中200℃退火三个小时，使PMMA去除的更加彻底，留下干净的单层石墨烯；
7、将PI衬底上的石墨烯盖上掩膜板，用电子束/热蒸发镀膜机镀上Ti/Au（10nm/50nm）；
8、将带有微流道（5000×250×40um3）的PDMS盖在源漏电极之间的石墨烯上，作为盛放miRNA的介质，向微流道里注入1g/ml PLL溶液静置15小时；至此，柔性生物传感器制备完成。
检测miRNA时，向微流道里注入1uL 100uM的DNA探针，孵育一段时间后冲洗干净；向微流道内注入待测miRNA，连接Ag/AgCl参比电极，测试Gr-FET的转移特性。
本实施例制备的柔性生物传感器，由于采用柔性聚酰亚胺（PI）衬底，器件在不同弯曲半径（R=8mm,12mm）下仍然保良好的灵敏度。同时基于PLL使DNA探针固定在单层石墨烯上，实现了无标记可弯曲的miRNA检测。可以制备成便携式穿戴设备，进行miRNA检测，非常方便。
为了验证本发明提供的柔性生物传感器的特异性和灵敏度，本发明提供了如下验证实验。
一、特异性测试
将乳腺癌标志物miR-4484的DNA探针注入生物传感器的微流道内，孵育24h，miR-4484的DNA探针与PLL通过静电吸附结合固定在单层石墨烯表面。
另外选取3种与该探针非互补的miRNA，包括miR-3346、miR-K12-5和miR-4732，作为对照组。
向微流道内加入PBS溶液冲洗后，再注入PBS缓冲液，实验组加入miR-4484，对照组分别加入miR-3346、miR-K12-5和miR-4732，进行转移特性曲线测试。
如图2（a）所示，在探针P-4484固定后和靶标miRNA杂交后，进行了Gr-FET的转移特性测试。在图2（b）中，Gr FET的狄拉克点电压为47 mV，实验组加入100 pM miR-4484后狄拉克点向左移动37 mV。
对照组加入非互补miRNA后，VDirac无明显位移，miR-3646、miR-4732和miR-K12-5分别向左侧移动3、2和4mV。miRNA测试表明，基于Gr-FET的miRNA生物传感器具有很高的检测特异性，在miRNA传感中具有广阔的应用前景
二、灵敏度测试
miRNA检测的灵敏度决定了生物传感器的传感能力。本发明研究了基于Gr-FET的生物传感器对各种浓度的互补miRNA（从1 fM到100 pM，10倍浓度梯度）的响应。
用移液枪吸取1uL 10uM DNA探针注入微流道，室温静置24h，以使探针分子与石墨烯充分结合；然后用PBS缓冲液冲洗3次去掉弱结合的DNA探针。再注入PBS缓冲液进行转移特性曲线测试。
然后向PLL修饰石墨烯表面加入PBS缓冲液，测试电学性能，作为空白对照。
测试完加入1uL 10uM DNA探针，室温静置24h，以使探针分子与石墨烯充分结合；然后用PBS缓冲液冲洗3次去掉弱结合的DNA探针。再分别注入1fM、10fM、100fM、1pM 、10pM、100pM 靶miRNA，依次进行晶体管转移特性曲线测试。
图3（a）显示，随着靶miRNA浓度从1 fM增加到100 pM，所测得的VDirac向左移动，并且基于线性拟合得出，该器件灵敏度达到5.99 mV/decade，如图3（b）所示。

Claims (9)

1.一种无标记石墨烯场效应晶体管柔性生物传感器，包括衬底和PDMS盖板；所述衬底上铺设有单层石墨烯，所述单层石墨烯上镀有源/漏电极；所述PDMS盖板盖在所述源/漏电极之间的单层石墨烯上；所述PDMS盖板上的微流道与所述单层石墨烯连通，微流道内设有栅电极；其特征在于：所述单层石墨烯表面修饰有探针结合材料，用于固定探针分子。
2.根据权利要求1所述的无标记石墨烯场效应晶体管柔性生物传感器，其特征在于：所述的探针结合材料通过静电吸附作用结合探针分子，选自多聚懒氨酸、氧化石墨烯、石墨烯量子点、戊二醛、环氧基中的任一种。
3.根据权利要求1所述的无标记石墨烯场效应晶体管柔性生物传感器，其特征在于：所述的衬底为柔性材料或绝缘材料。
4.根据权利要求1所述的无标记石墨烯场效应晶体管柔性生物传感器，其特征在于：所述的源/漏电极为Ti/Au或Cr/Au电极。
5.根据权利要求1所述的无标记石墨烯场效应晶体管柔性生物传感器，其特征在于：液态栅电极采用Ag/AgCl或pt作为参比电极。
6.一种如权利要求1-5任一项所述的无标记石墨烯场效应晶体管柔性生物传感器的制备方法，其特征在于，包括：
（1）在铜片基底表面生长单层石墨烯；
（2）将带有单层石墨烯的铜片旋涂一层PMMA；
（3）将旋涂好的铜片置于刻蚀液中，制备连续的带有一层PMMA的单层石墨烯；
（4）将带有一层PMMA单层石墨烯置于衬底上；
（5）去除单层石墨烯上PMMA；
（6）将衬底上的单层石墨烯盖上掩膜板，镀上源/漏电极；
（7）将带有微流道的PDMS盖板盖在源/漏电极之间的单层石墨烯上；
（8）向微流道里注入探针结合材料溶液静置8-15小时；
（9）将栅电极置于微流道中。
7.一种基于石墨烯场效应管的miRNA检测方法，该方法采用如权利要求1-5任一项所述的生物传感器，其特征在于，包括：
向微流道里注入DNA探针，孵育一段时间后冲洗干净；
向微流道内注入待测miRNA，连接参比电极进行Gr-FET的转移特性测试；
通过FET电特性的改变量测出miRNA的量。
8.一种如权利要求1-5任一项所述的无标记石墨烯场效应晶体管柔性生物传感器的应用，其特征在于，该柔性生物传感器用于制备可穿戴设备。
9.一种可穿戴设备，其特征在于，包含如权利要求1-5任一项所述的柔性生物传感器。
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