CN110684652A - 一种石墨烯核酸生物传感器、其制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本公开属于核酸生物传感器技术领域，具体涉及一种石墨烯核酸生物传感器、其制备方法及应用。本公开提供了一种改进后的石墨烯的核酸生物传感器，所述核酸传感器采用Ag/AgCl作为栅极(G)，氧化铟锡(ITO)作为源极(S)及漏极(D)，采用多层石墨烯晶体作为导电层，玻璃作为衬底。本公开分别采用DNA和PNA为探针对RNA进行检测，研究结果表明：(1)PNA作为探针相比DNA具有显著的灵敏度提升；(2)采用多层石墨烯作为导电层时，相比单层石墨烯具有更好的检测效果，还能够帮助缩短孵育所需时间。上述研究结果提供了PNA探针在基于石墨烯核酸生物传感器中的应用，该检测系统能够显著降低孵育所需要的时间，提高检测灵敏度，具有显著的技术效果和推广意义。

Description

一种石墨烯核酸生物传感器、其制备方法及应用
技术领域
本公开属于核酸检测传感器技术领域，具体涉及一种基于PNA探针的石墨烯核酸生物传感器、其制备方法及应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本公开的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
石墨烯是一种新兴的功能材料。目前，关于石墨烯的研究已经引起了多数科学家的关注。石墨烯是一种新型的单原子厚的二维碳材料，由于其具有优良的光学、电学以及易于与生物分子通过π-π键堆积作用结合的特性，可以用作导电通道制备用于核酸检测的石墨烯核酸传感器。这种先进的核酸检测技术将在医学界具有广阔的前景。
基于核酸杂交原理的RNA生物传感器已广泛用于临床诊断，生物医学研究和环境测试。在过去的几年中，新颖、稳定的RNA传感器探针的开发已成为从基因分型到分子诊断的许多不同领域的研究热点。通常，DNA作探针用于检测核酸DNA或RNA。DNA探针是具有特殊碱基序列的单链DNA。经过几十年的快速发展，DNA探针技术已取得丰硕成果。然而，仍然存在一些问题，例如与靶物质结合的稳定性与特异性较差且杂交时间较长。幸运的是，丹麦哥本哈根大学的教授Nielen在1991年通过将DNA、RNA遗传信息的碱基连接到肽骨架上，建立了一种新型的肽核酸分子(PNA)。PNA是一种人工合成的DNA类似物，用中性酰胺键主链取代了磷酸盐主链，其结构在多肽和DNA之间。
发明内容
本公开发明人的在先研究中提供了一种基于石墨烯的核酸生物传感器，所述石墨烯核酸生物传感器采用石墨烯薄膜作为导电层，采用DNA序列作为探针，应用于靶RNA的检测具有良好的检测灵敏度。发明人针对上述传感器进行了进一步的调整，并且以PNA作为探针进行检测，研究结果表明，采用上述传感器与PNA探针结合可以实现显著的技术效果提升。
本公开第一方面，提供一种核酸传感器，所述核酸传感器采用Ag/AgCl作为栅极(G)，氧化铟锡(ITO)作为源极(S)及漏极(D)，石墨烯作为导电层，采用玻璃作为衬底。
优选的，所述石墨烯是多层晶体石墨烯。
本公开第二方面，提供一种核酸传感器的制备方法，所制备方法包括以下步骤：通过化学气相沉积法制备石墨烯作为导电层，通过湿转移法将石墨烯转移至玻璃基底上；石墨烯两侧设置氧化铟锡薄膜层作为源极及漏极，在玻璃衬底上设置样品池，将栅极插入样品池构成该核酸传感器。
优选的，所述化学气相沉积法采用Cu作为基底，乙醇作为碳源。
本公开的在先研究中提供了一种采用石墨烯作为导电层的核酸生物传感器，采用Cu作为生长基底，采用甲烷作为碳源，该方法得到的石墨烯晶体多为单层晶体结构。本公开的进一步研究中，发现采用多层晶体状的石墨烯导电层具有更好的检测效果和探针亲和效果。发明人针对上述制备方法进行改进，发现采用乙醇作为碳源时，可以获得较为稳定的多层晶体的石墨烯薄膜。
优选的，所述样品池材料为固体PMMA板。
优选的，所述栅极材料为Ag/AgCl。
本公开第三方面，提供PNA探针在第一方面所述核酸传感器中的应用。
本公开第四方面，提供一种RNA检测方法，所述检测方法包括采用第一方面所述石墨烯核酸生物传感器及PNA探针进行检测。
优选的，所述检测方法包括以下步骤：
将所述核酸传感器接入电路，记录传输特性A1；向样品池中加入缓冲溶液，记录传输特性A2；
将缓冲溶液去除后加入1-芘丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(PBASE)孵育一段时间后，记录传输特性A3；
将PBASE去除后加入PNA探针溶液，记录传输特性A4；
将PNA探针溶液去除后加入待测RNA溶液，记录传输特性A5。
进一步优选的，所述缓冲溶液为PBS缓冲液，pH＝6～8。
进一步优选的，所述PNA探针溶液的浓度为90～110nM。
进一步优选的，所述检测过程中，栅极电压范围为-1V-1V。
进一步优选的，所述检测过程中，源-漏电极的恒电压为0.1V
与现有技术相比，本公开的有益效果是：
1.本公开在以往研究的基础上发现，采用多层晶体的石墨烯薄膜作为导电层时，可以帮助提高检测效果，并且提供了能够较为稳定获得多层晶体石墨烯薄膜的方法。
2.本公开分别采用DNA探针及PNA探针基于上述石墨烯核酸生物传感器对RNA序列进行检测，检测结果表明，采用PNA作为探针能够显著提高检测灵敏度，检测限可达到0.1aM，相比DNA作为探针(100aM)降低了3个数量级。
附图说明
构成本公开的一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。
图1为实施例1中石墨烯核酸传感器件的制备流程示意图；
其中，1为石墨烯薄膜，2为Cu基底，3为PMMA胶，4为源极(S)，5为Ag/AgCl栅电极(G)，6为样品池，7为漏极(D)，8为氧化铟锡(ITO)，9为玻璃基底。
图2为实施例3中基于DNA和PNA探针的石墨烯核酸传感器检测RNA的示意图；
图3为实施例3中PBASE修饰的石墨烯核酸传感器件与探针功能化后的传输特性曲线图；
其中，图3(a)为PBASE修饰及DNA探针功能化后的核酸生物传感器传输特性曲线图；
图3(b)为PBASE修饰及PNA探针功能化后的核酸生物传感器传输特性曲线图。
图4为实施例3中DNA与PNA探针与不同浓度RNA相互作用的浓度传输特性曲线示意图；
其中，图4(a)为DNA探针与不同浓度RNA相互作用的浓度传输曲线；
图4(b)为PNA探针与不同浓度的RNA相互作用的浓度传输曲线。
图5为实施例3中RNA浓度与石墨烯核酸传感器△Vcnp变化回归曲线图。
图6为探针与非互补RNA和互补RNA相互作用的传输特性曲线图；
其中，图6(a)为DNA探针与非互补RNA和互补RNA相互作用的传输特性曲线图；
图6(b)为PNA探针与非互补RNA和互补RNA相互作用的传输特性曲线图。
图7为实施例2中多层石墨烯的拉曼光谱表征示意图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，为了克服现有技术中的不足，本公开提供了一种基于PNA探针的石墨烯核酸生物传感器。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本公开的技术方案。
以下实施例中所提及的试剂及耗材均为市售产品，本领域技术人员可自行购买。
实施例1
本实施例中，提供一种基于石墨烯核酸生物传感器件的制备方法，制备流程如图1所示，具体包括如下步骤：
(1)通过化学气相沉积法制备石墨烯薄膜：选用铜作为基底，甲烷作为碳源。基底清洗，所述化学气相沉积条件采用发明人在先公开论文中的方法(“石墨烯核酸生物传感器及其应用研究”)，将制备得到石墨烯裁剪为1×1cm大小进行涂胶；将涂好胶的石墨烯/铜放在加热板上进行烘烤；待冷却后，将PMMA/石墨烯/铜放入1M FeCl3溶液中进行刻蚀；待将铜基底刻蚀掉，采用去离子水将PMMA/石墨烯薄膜清洗干净，转移到玻璃基底上，无PMMA的一面与玻璃基底接触。转移后，将PMMA/石墨烯/玻璃放在加热板上进行烘烤，加热温度为140℃，时间为30min，以保证胶更好的固化在石墨烯表面，冷却后采用丙酮溶液除胶。
(2)衬底制备：
上述玻璃基底上还覆有氧化铟锡(ITO)导电膜，所述氧化铟锡(ITO)导电膜位于石墨烯薄膜的两侧，作为该生物传感器的源极(S)或漏极(D)，所述源极与漏极与石墨烯薄膜接壤。
(3)生物传感器的构建
在石墨烯/玻璃基底上粘贴样品池，并将Ag/AgCl栅极插入样品池形成石墨烯核酸传感器件，从而进行生物分子的检测。所述步骤(8)中样品池的材料为固体PMMA板，尺寸为25×20×10mm()。
所述步骤(2)中玻璃基底及两侧的ITO尺寸分别为30×30mm及30×12mm，ITO的厚度为185nm。
所述步骤(2)中源极与漏极的电阻为1.0KΩ。
其中，所述步骤(1)中玻璃基底清洗可采用化学清洗剂超声清洗工艺清洗，所选用的清洗剂为丙酮、乙醇和去离子水，每次清洗时间为20～25min，以使基底表面更加干净。
实施例2
在发明人后期研究过程中发现，采用多层晶体状的石墨烯能够帮助提升检测效果。本实施例中提供一种多层石墨烯作为导电层的采用乙醇作为碳源进行石墨烯的生长，可以稳定获得多层晶体状的石墨烯薄膜。
本实施例提供又一种基于石墨烯的核酸生物传感器，所述石墨烯薄膜采用铜作为基底，乙醇作为碳源，其他方法与实施例1中相同，所述多层石墨烯晶体的拉曼光谱表征结果如图7所示。
实施例3
本实施例中，提供一种基于实施例1中的核酸生物传感器检测RNA的方法，包括以下步骤：
将实施例1中制备的石墨烯核酸生物传感器放在探针台上接入检测电路，加入0.1x磷酸盐缓冲液(PBS)，获取空器件的传输特性以及调节检测电路中栅极电压范围和源-漏电极的恒电压；所述PBS的pH值为7.0，栅极电压范围为-1V-1V，源-漏电极的恒电压为0.1V。
将PBS吸出样品池，清洗干净，加入100mM 1-芘丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(PBASE)孵育1h，记录传输特性；将PBASE吸出样品池，清洗干净，加入DNA探针或PNA探针溶液孵育一段时间(t1)，进行检测，记录传输特性；吸出样品池中的探针溶液，清洗干净，再加入不同浓度的靶RNA后孵育一段时间(t2)相互作用，记录在不同浓度下的传输特性。更换新核酸生物传感器器件，重复上述操作至洗去探针溶液，分别加入相同浓度的非互补RNA和互补RNA，记录传输特性。上述操作中，采用0.1xPBS作为清洗溶液。
上述检测过程中，所述探针溶液采用0.1xPBS溶解，稀释为100nM加入样品池中孵育一段时间后进行检测，待测RNA(靶RNA、非互补RNA和互补RNA)浓度为200nM。
上述待测RNA的浓度为0.1aM、1aM、10aM、100aM、1fM、10fM、100fM、1pM，孵育时间都为1h。
实施例4
本实施例中，采用实施例3中的方法分别采用DNA探针及PNA探针对靶RNA进行检测，其中，
DNA探针序列为：
5’-H2N-TGTACATCACAACTA-3’；
PNA探针序列为：
5’-H2N-TGTACAT-3’
非互补RNA和互补RNA的序列分别为：
5’-UGCAGCUUAGCUGUA-3’；
5’-UAGUUGUGAUGUACA-3’。
实验参数如表1所示：
表1
Figure BDA0002254087640000091
如图3所示，经过PBASE修饰的石墨烯核酸传感器在DNA探针功能化之后，Vcnp向正栅极电压方向偏移。石墨烯的这种电位变化可以用负静电门控效应来解释。由于DNA具有带负电荷的三磷酸基团，它可以通过诱导过量的空穴载流子调节石墨烯的费米能级，进而导致Vcnp向正栅极电压方向偏移。一般情况，PNA探针功能化后，传输特性曲线不会发生改变，这是因为PNA不具有三磷酸基团结构，不带电荷，并且不会诱导载流子(电子和空穴)的产生。
如图4所示，随着互补RNA浓度的增加，DNA和PNA探针修饰的石墨烯核酸传感器显示出了不同的响应曲线，Vcnp连续向栅极负方向移动，这种转变可以解释为由RNA和石墨烯层之间的非静电堆积相互作用引起的电子转移效应。研究发现，DNA作为探针时，检测限达到了100aM，而PNA探针与其相比，检测限达到了0.1aM，比DNA-RNA检测低了3个数量级，检测灵敏度得到了显著提高。
如图5所示，随着不同浓度RNA的引入，DNA和PNA探针修饰的石墨烯核酸传感器测量出了的△Vcnp与RNA浓度之间的线性关系。R2是用于验证探针与靶分子之间的杂交稳定性和杂交亲和力的有效指标。与不同浓度的互补RNA杂交后，DNA-RNA的相关系数为R2 1＝0.9671，而PNA-RNA的相关系数为R2 2＝0.9825。发生这种变化的原因是DNA和RNA都带有负电荷，磷酸酯骨架之间的静电排斥使它们很难彼此靠近，即使它们结合在一起也是不够稳定的。然而，PNA-RNA不存在静电排斥作用，使杂交系统更稳定。
如图6所示，为了验证PNA探针修饰的石墨烯核酸传感器的高选择性，本实施例选择了相同浓度的非互补RNA和互补RNA分别添加到由DNA和PNA探针修饰的传感器设备中。DNA探针修饰的传感器转移特性曲线显示，互补RNA的Vcnp的偏移量比非互补RNA大得多，最大偏移为0.038V。通过PNA探针修饰的传感器检测到的互补RNA的最大偏移量为0.074V，这比DNA探针修饰的传感器偏移量大。并且两次实验结果中非互补RNA的Vcnp都发生了微小变化，可忽略不计，发生这种变化的原因可解释为非特异性吸附所致。上述实验表明，该核酸传感器可以容易地区分非互补RNA和互补RNA，并且PNA探针修饰的石墨烯核酸传感器具有更高的选择性。
实施例5
本实施例中，针对实施例1和实施例2中提供的核酸生物传感器进行比较研究，实验参数采用实施例3中所述实验条件，结果如下表2所示：
表2
Figure BDA0002254087640000111
以上所述仅为本公开的优选实施例而已，并不用于限制本公开，对于本领域的技术人员来说，本公开可以有各种更改和变化。凡在本公开的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种核酸传感器，其特征在于，所述核酸传感器采用Ag/AgCl作为栅极，氧化铟锡作为源极及漏极，石墨烯作为导电层，采用玻璃作为衬底。
2.如权利要求1所述核酸传感器，其特征在于，所述石墨烯多层晶体石墨烯。
3.一种核酸传感器的制备方法，其特征在于，所制备方法包括以下步骤：通过化学气相沉积法制备石墨烯作为导电层，采用湿转移法将石墨烯转移至玻璃基底上；石墨烯两侧设置氧化铟锡薄膜层作为源极及漏极，在玻璃衬底上设置样品池，将栅极插入样品池构成该核酸传感器；优选的，所述化学气相沉积法采用Cu作为基底，乙醇作为碳源。
4.如权利要求3所述核酸传感器的制备方法，其特征在于，所述样品池为材料为固体PMMA板；或，所述栅极材料为Ag/AgCl。
5.PNA探针在权利要求1或2所述核酸传感器中的应用。
6.一种RNA检测方法，其特征在于，所述检测方法包括权利要求1或2所述石墨烯核酸生物传感器及PNA探针进行检测。
7.如权利要求6所述RNA检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
将所述核酸传感器接入电路，记录传输特性A1；向样品池中加入缓冲溶液，记录传输特性A2；
将缓冲溶液去除后加入1-芘丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(PBASE)孵育一段时间后，记录传输特性A3；
将PBASE去除后加入PNA探针溶液，记录传输特性A4；
将PNA探针溶液去除后加入待测RNA溶液，记录传输特性A5。
8.如权利要求7所述所述RNA检测方法，其特征在于，所述缓冲溶液为PBS缓冲液，pH＝6～8。
9.如权利要求7所述所述RNA检测方法，其特征在于，所述PNA探针溶液的浓度为90～110nM。
10.如权利要求7所述所述RNA检测方法，其特征在于，所述检测过程中，栅极电压范围为-1V-1V，源-漏电极的恒电压为0.1V。
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