CN113484380A - 工地用石墨烯生物传感器对活菌和抗生素筛选方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开工地用石墨烯生物传感器对活菌和抗生素筛选方法及应用，属水环境检测。包括以下步骤：S1石墨烯的合成与加工：以铜箔为生长基底，甲烷为碳前驱体，采用化学气相沉积法合成大面积石墨烯薄膜；S2手工书写电极来制作手工制作的设备：通过使用CHI1202A电化学工作站从电流‑电压特性和pH灵敏度测量石墨烯器件的初始电阻来表征其电性能；S3凝集素分子选择性捕获细菌：石墨烯表面被凝集素分子非共价功能化，作为生物受体选择性捕获细菌；S4细菌的感应：在1mMCa2+和Mn2+的PB缓冲液中稀释以达到所需的细菌浓度，凝集素功能化石墨烯器件与富集PB稀释的细菌在室温下孵育1小时；S5细菌的捕获：用PB冲洗掉未结合的细菌。具有快速、稳定、简单、成本低廉的优点。

Description

工地用石墨烯生物传感器对活菌和抗生素筛选方法及应用
技术领域
本发明涉及的水环境检测技术领域，尤其涉及工地用石墨烯生物传感器对活菌和抗生素筛选方法及应用。
背景技术
目前医学与创新技术集成中心(CIMIT)已经将病毒和细菌感染的快速区分确定为一项重点开发的技术。满足这一需求的技术将减少误诊感染的数量。如果设计得当，可以用来指示正确治疗的治疗方法。CDC和PCAST都宣布耐抗生素菌株的产生与传播对社会安全是严重的威胁。目前的细菌检测方法通常具有以下一个或多个局限性：不及时、复杂和/或单分析物特异性。目前成熟的方法有PCR和ELISA。尽管有许多技术进步，如自动化和改进的样品预处理要求。但对于这些常规的方法，还是囿于昂贵试剂的使用和检测时间过长的关系，对于医护应用来说仍然过于局限性。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中不足，故此提出工地用石墨烯生物传感器对活菌和抗生素筛选方法及应用，具有快速、稳定、简单、成本低廉的优点。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
工地用石墨烯生物传感器对活菌和抗生素筛选方法，包括以下步骤：
S1石墨烯的合成与加工：以铜箔为生长基底，甲烷为碳前驱体，采用化学气相沉积法合成大面积石墨烯薄膜；
S2手工书写电极来制作手工制作的设备：通过使用CHI 1202A电化学工作站从电流-电压特性和pH灵敏度测量石墨烯器件的初始电阻来表征其电性能；
S3凝集素分子选择性捕获细菌：石墨烯表面被凝集素分子非共价功能化，作为生物受体选择性捕获细菌；
S4细菌的感应：在1mM Ca2+和Mn2+的PB缓冲液中稀释以达到所需的细菌浓度，凝集素功能化石墨烯器件与富集PB稀释的细菌在室温下孵育1小时；
S5细菌的捕获：用PB缓冲液冲洗掉未结合的细菌。
所述S1包括以下步骤：
S101：将一块1x1英寸的多晶铜箔在醋酸中清洗丙酮和异丙醇各10分钟，以去除表面残留的氧化物，清洁的铜箔在管式炉中退火处理，处理温度为在103℃，时间为30分钟，过程中炉内通入气体：每分钟180标准毫升的氩气和每分钟10标准毫升的氢气，关掉炉冷却至室温,同时保持氩气和氢气流速不变，然后，在含有石墨烯的铜箔上覆盖一层聚甲基丙烯酸甲酯，并在110℃下烘烤5分钟，然后用0.3M FeCl3溶液对铜箔进行蚀刻，并用去离子水反复洗涤。
所述S2包括以下步骤：
S201电触点用银漆直接写在石墨烯上，间隔0.5cm，用铜箔延伸，用橡胶水泥钝化处理，形成一个储层井，利用扫描电镜和拉曼光谱对石墨烯的层数和晶体结构进行表征。
所述S3包括以下步骤：
S301将裸石墨烯与连接分子PBASE孵育，然后用铅清洗连接剂修饰的石墨烯装置，并在室温下与凝集素在表面孵育2小时，用PB缓冲液反复冲洗即可使用。
一种采用上述筛选方法的应用，用于检测活菌细胞。
与现有技术相比，本发明具备以下有益效果：
本发明工艺以广泛、迅速、简单和具有成本效益的方式检测活菌，将有助于更快地实施技术和增加用水卫生，并且有助于减少误诊的数量。
附图说明
图1是分别为转移、去除和烘烤后Si/SiO2基板上的石墨烯薄膜以及感应面积为0.3x0.3厘米的电极表面。银漆电极相隔0.5厘米，宽度为0.2厘米，用橡胶水泥绝缘。
图2是大面积CVD生长石墨烯薄膜的高分辨率光学图像。
图3是通过添加1mM HCl使石墨烯电极所处环境下降到制定pH值。pH灵敏度为0.577μA/pH，数据点是3次独立测量的平均值，生物传感器的误差条为标准偏差。
图4是用于检测大肠杆菌功能化的校准曲线石墨烯装置。平均灵敏度为12nA/log(cfu/mL)。数据点来自单个独立生物传感器的3次测量的平均值，以及标准偏差。
图5是添加50mM葡萄糖后，显示该装置与大肠杆菌和H1N1病毒的特异性结合程度。数据点来自单个生物传感器的独立测量3次的平均值，误差条表示标准偏差。
图6是大肠杆菌和苏云金芽孢杆菌的花生凝集素的特异性反应。证明细菌受体的选择性。数据点来自单个生物传感器的独立测量4次的平均值，误差条表示标准偏差。
图7是正常大肠杆菌(浓度为1x107cfu/mL)和安皮西林(5mg/mL)作用30min后，以及次代大肠杆菌，分别使用10mM HCl和甘氨酸的电流变化。数据点来自单个独立生物传感器，误差条表示标准偏差。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
实施例1
工地用石墨烯生物传感器对活菌和抗生素筛选方法，包括以下步骤：
S1石墨烯的合成与加工：以铜箔为生长基底，甲烷为碳前驱体，采用化学气相沉积法合成大面积石墨烯薄膜；
S2手工书写电极来制作手工制作的设备：通过使用CHI 1202A电化学工作站从电流-电压特性和pH灵敏度测量石墨烯器件的初始电阻来表征其电性能；
S3凝集素分子选择性捕获细菌：石墨烯表面被凝集素分子非共价功能化，作为生物受体选择性捕获细菌；
S4细菌的感应：在1mM Ca2+和Mn2+的PB缓冲液中稀释以达到所需的细菌浓度，凝集素功能化石墨烯器件与富集PB稀释的细菌在室温下孵育1小时；
S5细菌的捕获：用PB缓冲液冲洗掉未结合的细菌。
所述S1包括以下步骤：
S101：将一块1x1英寸的多晶铜箔在醋酸中清洗丙酮和异丙醇各10分钟，以去除表面残留的氧化物，清洁的铜箔在管式炉中退火处理，处理温度为在103℃，时间为30分钟，过程中炉内通入气体：每分钟180标准毫升的氩气和每分钟10标准毫升的氢气，关掉炉冷却至室温,同时保持氩气和氢气流速不变，然后，在含有石墨烯的铜箔上覆盖一层聚甲基丙烯酸甲酯，并在110℃下烘烤5分钟，然后用0.3M FeCl3溶液对铜箔进行蚀刻，并用去离子水反复洗涤。
所述S2包括以下步骤：
S201电触点用银漆直接写在石墨烯上，间隔0.5cm，用铜箔延伸，用橡胶水泥钝化处理，形成一个储层井，利用扫描电镜和拉曼光谱对石墨烯的层数和晶体结构进行表征。
所述S3包括以下步骤：
S301将裸石墨烯与连接分子PBASE孵育，然后用铅清洗连接剂修饰的石墨烯装置，并在室温下与凝集素在表面孵育2小时，用PB缓冲液反复冲洗即可使用。
一种采用上述筛选方法的应用，用于检测活菌细胞。
K-12大肠杆菌(e.c oli)在37℃的Luria肉汤培养基中不断振荡培养。在指数生长期(6～9h)，用Eppendorf 5415D微离心机以4000rpm收集细菌。细胞反复洗涤，在10mM pH7.54的磷酸盐缓冲液中重悬。用Beckman Coulter DU800分光光度计测定OD600，测定细菌浓度。
图1显示了将CVD石墨烯转移到Si/SiO2衬底和银膏电触点上的手工制作的器件。该器件的传感面积为0.3cm x0.3cm，平均初始电阻为1kω。高分辨率光学显微镜(如图2所示)显示，大面积石墨烯薄膜看起来相当连续，没有任何结构缺陷，如撕裂或皱纹。这些缺陷产生于石墨烯薄膜生长和转移过程中的多个步骤，如残留聚合物(PMMA)存在以及石墨烯边缘位置和晶界上的自由悬空键。然而，据报道，已知这些原子尺度缺陷可以增强石墨烯的电催化活性和pH敏感性。缺陷部位与周围空气的反应产生末端羟基，根据溶液的pH值而发生质子化或脱质子化。我们通过测量加入1mm HCl后器件电流的变化，测试了所制备的石墨烯器件的pH敏感性。如图3所示，石墨烯器件的平均pH敏感性为0.577A/pH。高pH敏感性能够通过实时监测捕获的细菌细胞的葡萄糖触发的代谢活动来确认细菌的生存能力。在对结构和化学性质进行表征后，以PBASE为连接分子，将凝集素分子对石墨烯表面进行了非共价功能化。在每一个连续的表面功能化步骤后，导电通道的电阻增加了。电阻的变化与文献一致，是由于不同分子在石墨烯表面的固定所产生的π堆叠、电子贡献和/或散射电位，从而降低了载流子浓度和迁移率。如前所述，对于细菌的选择性检测，我们探索凝集素-碳水化合物的相互作用。虽然凝集素与单糖的结合亲和力通常较弱，结合常数(Ka)在10-3M-10-1M范围内，但凝集素与单糖的相互作用具有较高的选择性。使用两种模型凝集素，菜豆蛋白A(conA)和花生低聚糖(Arachis)证明了这一点，已知这两种凝集素分别对葡萄糖/甘露糖和半乳糖有很高的亲和力。为了选择性捕获大肠杆菌，选择conA凝集素作为生物受体，因为其脂多糖(LPS)链中存在高含量的葡萄糖。将conA修饰的石墨烯表面与增加的大肠杆菌浓度孵育后，凝集素与糖基的结合转化为电信号，并通过测量导电通道电流随时间的变化来量化细菌浓度。图4显示了电流随细菌浓度对数的实时变化。该生物传感器呈线性响应，平均响应为12nA/log(cfu/ml)。为了证实电导通道电流的变化是由凝集素单糖结合引起的，并验证conA对大肠杆菌的捕获效果，我们进行了一些对照实验。在第一个对照实验中，石墨烯表面直接与细菌细胞孵育，不进行conA功能化，并测量电流变化。如图5所示，由于没有conA(生物受体)，添加细菌细胞后，电流的变化可以忽略不计。测量到的响应较小在conA存在的情况下，目前观察到的变化中有超过10％证实大肠杆菌与石墨烯没有任何非特异性结合。
为了检测捕获细菌的生存能力，通过实时电流监测葡萄糖诱导的代谢活性。做了一个阴性对照实验，证明在没有细菌细胞的情况下，添加葡萄糖对检测信号没有帮助，这得到了文献报道的支持。直接将50mM葡萄糖添加到conA修饰的石墨烯上后，没有记录到电流的变化(图5)。然而，在表面存在活细菌细胞的情况下，葡萄糖的代谢会产生有机酸，从而局部改变石墨烯的pH值，从而影响导电通道中的电流。如图5所示，在conA改性石墨烯(细菌浓度:1×107cfu/ml)上捕获活菌后，记录了器件电流的显著变化。由于病毒细胞无法代谢葡萄糖，从而改变石墨烯通道的pH值，因此该生物传感器的检测方案可用于区分细菌和病毒细胞。该装置与H1N1病毒(1×107pfu/ml)在Madin Darby犬肾(MDCK)细胞中繁殖孵育。添加葡萄糖后，电流没有变化，这证实了生物传感器能够区分病毒和细菌细胞(图5)。上述结果表明，该生物传感器能够基于conA-葡萄糖/甘露糖的相互作用检测大肠杆菌。我们进一步扩展了平台，使用不同的凝集素，探索类似的凝集素-糖的相互作用，以靶向不同的细菌。在发明的实验中，石墨烯被花生糖(Arachis hypoganea)非共价功能化，花生糖是一种具有高亲和力半乳糖的凝集素。它的表面功能化步骤(孵育时间、反应条件)与conA相同，然后分别与含有大肠杆菌和苏云金芽孢杆菌溶液中孵育。基于这种小阵列的凝集素，生物传感器区分不同的能力通过测量所有4种可能的凝集素细菌组合的器件电流变化来确定细菌类型。如图6所示，conA对t杆菌和大肠杆菌的结合效果优于花生凝集素。这是由于两个原因：结合杆菌t.表面缺乏有针对性的糖类，因为在这种情况下半乳糖与conA的亲和力是远低于conA结合葡萄糖的。虽然这些初步的结果并不能清楚地显示出区分细菌感染的能力，但是有可能建立一个阵列来产生独特的结合谱来达到这个目的。
最后，利用所提出的生物传感器测定细胞活力的能力来筛选抗生素。氨苄西林是一种广谱抗生素，通常用于革兰氏阴性菌，据报道对大肠杆菌的杀灭效果低到中等。图7显示健康细胞在氨苄西林治疗前后的应答，治疗后呈下降趋势。通过从凝集素中释放细菌细胞来实现电极的再生，方法是将设备表面暴露在10mm的HCl/甘氨酸溶液中。从图7可以看出，用抗生素或再生液孵育电极不会对电极表面造成损伤，也不会影响设备的灵敏度，从新鲜细菌在抗生素处理和再生步骤后产生的信号可以看出。诱导代谢导致pH值的变化，监测相关设备的电流变化来区分细菌和病毒感染和筛选抗生素。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
本发明工艺以广泛、迅速、简单和具有成本效益的方式检测活菌，将有助于更快地实施技术和增加用水卫生，并且有助于减少误诊的数量
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此。所述替代可以是部分结构、器件、方法步骤的替代，也可以是完整的技术方案。根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.工地用石墨烯生物传感器对活菌和抗生素筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1石墨烯的合成与加工：以铜箔为生长基底，甲烷为碳前驱体，采用化学气相沉积法合成大面积石墨烯薄膜；
S2手工书写电极来制作手工制作的设备：通过使用CHI 1202A电化学工作站从电流-电压特性和pH灵敏度测量石墨烯器件的初始电阻来表征其电性能；
S3凝集素分子选择性捕获细菌：石墨烯表面被凝集素分子非共价功能化，作为生物受体选择性捕获细菌；
S4细菌的感应：在1mM Ca2+和Mn2+的PB缓冲液中稀释以达到所需的细菌浓度，凝集素功能化石墨烯器件与富集PB稀释的细菌在室温下孵育1小时；
S5细菌的捕获：用PB缓冲液冲洗掉未结合的细菌。
2.根据权利要求1所述的基于石墨烯生物传感器对活菌和抗生素的筛选方法，其特征在于：所述S1包括以下步骤：
S101：将一块1x1英寸的多晶铜箔在醋酸中清洗丙酮和异丙醇各10分钟，以去除表面残留的氧化物，清洁的铜箔在管式炉中退火处理，处理温度为在103℃，时间为30分钟，过程中炉内通入气体：每分钟180标准毫升的氩气和每分钟10标准毫升的氢气，关掉炉冷却至室温,同时保持氩气和氢气流速不变，然后，在含有石墨烯的铜箔上覆盖一层聚甲基丙烯酸甲酯，并在110℃下烘烤5分钟，然后用0.3M FeCl3溶液对铜箔进行蚀刻，并用去离子水反复洗涤。
3.根据权利要求2所述的基于石墨烯生物传感器对活菌和抗生素的筛选方法，其特征在于：所述S2包括以下步骤：
S201电触点用银漆直接写在石墨烯上，间隔0.5cm，用铜箔延伸，用橡胶水泥钝化处理，形成一个储层井，利用扫描电镜和拉曼光谱对石墨烯的层数和晶体结构进行表征。
4.根据权利要求3所述的基于石墨烯生物传感器对活菌和抗生素的筛选方法，其特征在于：所述S3包括以下步骤：
S301将裸石墨烯与连接分子PBASE孵育，然后用铅清洗连接剂修饰的石墨烯装置，并在室温下与凝集素在表面孵育2小时，用PB缓冲液反复冲洗即可使用。
5.一种采用权利要求1所述筛选方法的应用，其特征在于：用于检测活菌细胞。
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