CN101839913B - 用于石房蛤毒素的快速检测的微流控芯片及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属生物分析检测技术领域，具体为一种用于石房蛤毒素快速检测的微流控芯片及其制备方法。该芯片采用模塑法以光学透明的聚二甲基硅氧烷等为材料，主要由样品反应微通道层，阀门控制层及基片层构成。芯片内含样品富集及免疫分析模块和信号采集模块，模块由并行的几个纳升体积的免疫色谱柱微分析室组成，每个分析室固定了石房蛤毒素抗体蛋白或抗原，实现对样品中石房蛤毒素的快速现场检测。本发明快速、高效、便携、低价和易自动化控制的特点，可完成自动信号采集、远程传输和信号分析，适合于水环境中石房蛤毒素的现场快速检测及大范围内遥控检测。

Description

用于石房蛤毒素的快速检测的微流控芯片及其制备方法

技术领域

本发明属于生物分析检测控技术领域，具体涉及一种用于现场快速检测检麻痹性贝毒石房蛤毒素(Saxitoxin)的微流控芯片，并提供了该芯片的制备方法。

背景技术

赤潮对海洋环境，海洋渔业，养殖业，旅游业以及人类的健康都有严重的影响。赤潮爆发时会破坏水生生态，导致大量水生生物死亡。赤潮中的一些藻类含有各种海洋毒素，能够直接毒死鱼、虾、贝类，严重影响海水养殖业以及渔业。更为严重的是这些毒素还可以在鱼虾贝类体内富集，被人类食用后会引起中毒，严重时导致死亡。赤潮时海水对人类皮肤也有刺激。同时也破坏海洋景观从而影响旅游业。

有毒藻类毒素的结构差别很大，主要有复杂的多聚醚类化合物，和环聚氨基酸。海洋毒素种类比较复杂，主要包括西加鱼毒素(ciguatoxin)，麻痹性贝毒素(PSP)，腹泻性贝毒素(DSP)，记忆缺失贝毒素(ASP)和神经毒素(NSP)。淡水环境中的主要藻毒素是微囊藻毒素(microcystins，MCs)，多数藻类毒素的毒性很大，有些藻毒素致死量仅为0.3mg，毒性近乎氰化物的千倍。其中麻痹性贝毒(Paralytic Shellfish Poisoning，PSP)是自然水体藻毒素中分布最广、危害最大的一类毒素。是石房蛤毒素(Saxitoxin，STX)及其20余种衍生物的统称，其中STX和新石房蛤毒素(neo-STX)最为稳定且毒性最高。在藻类污染的海洋和淡水水体中都广泛存在。PSP是一类神经肌肉麻痹剂，属于甲氨酯酸类生物碱，是典型的Na+通道阻滞剂，阻滞Na+通过膜进入细胞内，使膜失去极化状态，从而广泛的阻断神经肌肉的传导。人因偶然口服食入有毒贝的致死剂量为1-4mg(Schantz et al.，1992)。我国已将PSP列为贝类产品卫生质量的监测指标。(王云峰等，2003)PSP还具有重要的潜在军事意义，STX已被收入《化学武器公约》中禁止化学品的第二类清单中(胡晗华，2005)，其在赤潮研究、分子生物学、神经生物学、医学药学及军事防化等方面的应用已逐渐成为国际研究的热点。

“赤潮”和淡水中“水华”现象是一个全球性的问题。全球主要的江河入海区都有过“赤潮”现象。目前“赤潮”和“水华”的发生频率和范围日趋严重，我国的主要海湾以及内陆主要湖泊(太湖、滇湖，巢湖)都有多次爆发的报道，严重影响生态环境，养殖业和人类的健康。由藻类毒素引起的中毒现象也有多次报道，美国佛罗里达州人口800万，仅1994年到2005年便有500次相关中毒事件报道。根据记载，1970年以前人类PSP中毒事件约有1600次(Prakash et al.，1971)，而1970到1984年就发生了900次。(WHO，1984)发生地覆盖美国、欧洲、日本、亚太地区、南美洲及澳大利亚等地区。

为了保护人类健康，为了保护水生环境和保护养殖业，在环保、卫生、养殖、商检以及军事防化方面，国内外市场都急需一种高效、可靠、低价，易操作的藻类毒素检测手段。另外国家(海洋局，环保部门)也需要一个“赤潮”或“水华”的预警系统，而这种系统的关键构件就是能快速、实时检测各种代表性藻类毒素的核心技术，用以实现高通量、高灵敏性、高准确度、低成本的快速检测各类水样或食物样品中的代表性藻类毒素含量，尽早对有毒藻类的危害进行预警和防治，防患于未然。

国内外现行的藻类毒素检测技术主要包括：

1)生物检测法。主要采用喂食小鼠、家蝇等毒素的方法，缺点是周期长，费用高，重复性差，而且需要专门培训的人员来操作。

2)物理化学法。主要通过高效液相色谱，毛细管电泳，色谱质谱联用方法，重现性好，但设备功能单一，体积大和价格昂贵，便携性、选择性差。

3)细胞毒性检测技术。直观方法来观察加入毒素后，细胞的反应来判断毒素种类，灵敏度高，但只能做定性测量，不能测定浓度而且需要良好的细胞培养技术。

4)放射性标定法。仪器昂贵，测试费用高，并且适用毒素检测范围窄。

5)免疫检测技术。免疫技术主要利用抗原和抗体专一、特异结合的特点对毒素进行定性，定量检测，现主要有直接竞争检测法，间接法，“三明治”法。这种方法专一性强，灵敏度高，是非常有潜力的一种方法，但操作比较繁琐，商业化试剂盒价格昂贵，主要为手工操作，自动化程度低而且需要专业人员。

目前，大多数藻类毒素使用价格昂贵、体积庞大的HPLC-MS或GC-MS检测，样品制备过程复杂、耗时长，需要专业技术人员操作，检测费用很高。因此限制了常规检测次数。近年来，美国、德国和我国的科学家运用免疫技术结合计算机、传感器技术，研究水中藻毒素的原位免疫检测方法。但这些方法存在样品前处理繁琐、需要检测仪器配合、检测时间较长和检验人员需要较高的素质及受过良好的培训、不适合野外操作，时间分辨率低，检测成本高等缺点。现在急需要一种高效，快速，便携和低价的检测技术。

迄今为止国内外尚无实用的代表性藻类毒素快速检测系统。未来的技术发展主要集中在检测仪器的多功能化和微型化上。国外多功能化仪器集中在用于海洋环境分析的可同时测定水体多种营养成分的自动化仪器上。但设备体积较大，不太适合淡水湖泊的环境。当前的藻类毒素检测的发展趋势是：(1)连续分析来达到监控和预警的目的；(2)快速分析来达到在线检测和快速预警；(3)高通量来达到对多种样品多种毒素的检测；(4)高度自动化来完成在自然水域的普及；(5)便携性来适应快速布置和军事防化的需要。

仪器的微型化集中在微流体芯片在环境分析的应用方面。该技术在化学、生物、生物医学工程尤其在生物分析方面有着广泛的应用。以微流体芯片为基础的微型传感器或者分析仪器是未来环境分析的发展趋势。除了环境保护部门(EPA)外，美国军方也在寻求用于快速分析水体组分(包括微生物及各种污染物的种类、含量和浑浊度、PH值等常规水样参数)的芯片技术。

20世纪90年代发展起来的微流体学科是指操作微小网络通道(5-500微米)中流体的科学技术。是分子生物学技术、微加工技术、机械制造技术、计算机技术等多种现代技术的发展与融合。是基于大规模平行处理生物信息分子原理的微型装置，具有信息通量大、自动化、系统化的特点。微流体芯片用于操作，传输微升(10-6L)至毫微微升(10-15L)量级的流体。可将生化反应的若干步骤包括分析、洗涤、检测等集成在一块或几块微流体芯片上，其微通道孔径只有微米级大小，具有浓缩和富集的作用，可以加速反应缩短测试时间，从而大大降低了测试成本。和常规的实验技术相比，该技术极大降低了试剂的消耗量(至少3个数量级)、同时分析产生的废液极少。在微小范围内的能量传递、物质分散更快更均匀，热能传导快，也更易实现各种操控，因此反应快、收率高，污染少、成本低。新一代的微流体芯片由高分子材料，例如硅酮polydimethylsiloxane(PDMS)，制成(见附图1)，材料造价低廉(少于10美金/片)，制造周期短(少于24小时)，所需设备为少数常规设备，不需要大型机密仪器，适合于大规模生产，可用于生产一次性使用产品。该技术的发展的趋势是芯片实验室，即可将整个生化实验室功能集成在一块芯片上完成。

另外，由于PDMS材料的物理弹性，多种功能性模块，例如微阀门，流体泵以及流体混合器，都可以集成到微流体芯片中。而这些微阀门，流体泵等功能模块的可通过计算机编程控制。这样的集成化、数控式微流体芯片，便可以完成一些复杂的操作。例如分离，进样，清洗，色谱柱分离鉴定等化学或生物分析操作。以微流体芯片为基础的仪器例如PCR，蛋白结晶仪，DNA测试仪都已经被设计制造出来。同常规方式相比，它的主要特点是：

1)低价，因为使用的试剂的量极其微量，完成测试需要的费用极低；

2)高效，在微流体芯片中反应速度快，传热传质效率高，测试速度快；

3)应用模版技术制造，适用于大规模生产；

4)容易集成，不同目标的测试模块可很方便的集成到一块芯片中，完成多目标并行分析；

5)自动化程度高，它可以很方便和现代电子技术结合，不仅使芯片分析测试自动，而且信号传输以及信号分析也可以自动完成。

6)兼容性好，其他的微分析技术，例如微电极技术，生物传感器技术也可以整合到微流体芯片技术中。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于对代表性藻类毒素石房蛤毒素(saxitoxin)现场快速检测的微流控芯片及其制备方法。该芯片同现行的检测技术相比具有高效、低价、便携和自动化的特点。

本发明提供得包括对实际样品(水样和鱼类、贝类等食物样品)溶液中石房蛤毒素进行快速检测的微流控芯片；以光学透明材料为基材，依次由样品通道层，阀门控制层及基片层构成；其中，样品通道层内含样品富集及免疫分析模块；其中样品富集及免疫分析模块由一个或几个并联或串联的纳升体积的免疫色谱柱微分析室所组成。每个微分析室连接有多个进样口和出样口，每个微分析室通过聚合填料键合固定有石房蛤毒素抗体蛋白或抗原，能够和样品混合物中的saxitoxin发生特异性免疫反应，免疫分析信号由标记的反应物(抗体或抗原)实现，经过多次洗涤之后，免疫标记信号的产生的变化如荧光强度的变化可以被信号采集模块采集分析；信号采集模块由紫外LED和荧光光敏器件阵列组成，抗体/藻类毒素间的特异性结合导致的光学信号都可被光敏器件阵列采集并传至到微处理器(计算机)中和数据库相比较，来分析样品所含石房蛤毒素的浓度。

本发明用于快速检测saxitoxin的微流控芯片的光学透明材料为选自无机材料：石英、玻璃，硬质高分子聚合物：聚碳酸脂、聚甲基丙烯酸甲酯、聚对本二甲酸乙二醇脂、聚苯乙烯或聚丙烯，弹性聚合物：聚二甲基硅氧烷；模具材料为硅片。

本发明中样品通道层中有免疫色谱柱微分析室。阀门控制层含有气压控制阀门，控制样品通道层相关孔道的开关。阀门控制层的阀门通过气压或电子元件控制，阀门通道的直径为1～3μm。

本发明微流控芯片的免疫色谱柱微分析室为整体柱或聚合填料灌柱，聚合填料为硅胶填料或其它有机聚合物。

本发明的免疫色谱柱微分析室的个数可由实际情况确定，如样品数及其中各成分的性质差别，在本发明的具体实施中制备了一个单样品的微流控芯片，可根据实际情况将该单通道以不同方式并联、串联。

整个测试系统控制硬件部分主要由控制部分(计算机)，操作系统(集成化微流体芯片，数控界面)和数据采集，数据分析部分(计算机)。软件系统主要包括LABVIEW程序(控制)和ImagePro程序(数据分析)。

本发明提供了上述微流控芯片的制备方法具体如下(以正胶为例)：

(1)基片准备：将硅片放入Piranha溶液去氧化后用氮气吹干，用SU-82050系列经旋涂机甩涂，在恒温加热板上软烘；

(2)曝光和烘焙：将设计好的样品通道层，阀门控制层的硅片模板分别放置在甩涂好的基片上，应用紫外曝光机曝光，之后在加热板上烘焙；

(3)显影：将硅片放入显影液中显影，之后分别用异丙醇和去离子水清洗干净，并用氮气吹干；

(4)硬烘：在热板上缓慢加热固定；

(5)浇注：PDMS(聚二甲基硅氧烷)单体及固化剂按质量配比5∶1至20∶1混合均匀，分别倒在相应的硅片模具上，在烘箱内固化，剥离；

(6)键合：将两层PDMS芯片校准键合形成微通道腔，再与基片层键合。

附图说明

图1一种用于麻痹性贝毒saxitoxin的快速检测微流控芯片的设计图。

图2用于麻痹性贝毒saxitoxin的快速检测微流控芯片具体实施示意图。

图中标号：1气阀气体入口，2样品入口，3气阀气体通道，4样品通道，5填料进/出口，6微分析室，7样品出口。

具体实施方式

基片准备。将硅片放入Piranha溶液(98％浓硫酸∶30％双氧水＝7∶3)煮沸清洗15min。用去离子水冲洗5遍后用氮气吹干，并在200℃烘焙30min.

甩涂。将Microchem公司的SU-8胶(下同)倒在硅片中央，用手握住硅片边缘使之倾斜并缓慢旋转，使SU-8覆盖住硅片大部分区域，静置15min。用旋涂机(Spin-CoaterKW-4A，Chemat Technology，Inc.)进行甩涂：3000转/min旋涂60s，使胶分布较为均匀，静置10min缓解边缘突起效应。

软烘。软烘的目的是使SU-8光刻胶中的溶剂挥发。软烘时，使溶剂挥发以可控的速率进行。在65℃和95℃分别保持3min和6min。之后以0.5℃/min的速率缓慢降至室温。

曝光。采用接触式曝光机(波长365nm)。

曝光后烘焙(PEB，post exposure bake)。在热板上以5℃/min的速率由室温逐步升到95℃，期间在65℃和95℃分别保持1min和5min。之后以0.5℃/min的速率缓慢降至室温。

显影。显影液的主要成分是丙二醇甲醚醋酸酯(PGMEA)。在SU-8模具与显影液分别静置达到室温后，将模具放入显影液中显影6min，之后分别用异丙醇和去离子水清洗干净，并用氮气吹干。

硬烘。在热板上缓慢加热到200℃，保持30min，再缓慢降至室温。

浇注PDMS聚合物成型。把上述制作好的带有印章的硅片经三甲基氯硅烷处理。PDMS单体与固化剂按照5∶1的质量配比混合均匀，除净气泡。倒在经三甲基氯硅烷处理过的SU-8模具上，在调整好的水平热板上65℃保持2h固化。形成上层具有反应微通道层的基片。

具有控制通道的PDMS层制作。在硅片上甩涂光刻胶，经紫外曝光、显影，制成硅基光阳模，并于115℃退火30min，使光刻胶软化，硅基光胶阳模用三甲基氯硅烷在气相中处理3min，使其表面硅烷化，以防止在注塑过程中PDMS的粘附。并且具有控制通道的PDMS层单体与固化剂的比例为15∶1，相对较软。在甩胶机上2000转/min甩涂35s。形成下层具有控制阀门通道的基片。

键合及接口制作。将上层基片打孔，下层基片打孔用于控制通道。上下两片仔细对合，80℃过夜固化。再最后将具有控制通道的一面用乙醇淋洗后，与玻璃盖片热键合。

单个免疫微分析室的体积为180μm×30μm×2μm。

若免疫微分析室色谱柱为聚合材料填充柱，可经图1三个进样通道中任一个将聚合材料填料灌注装柱，闭合柱底阀门，控制阀门气压不超过20psi，同时控制装柱速度，待填料装满后进缓冲液平衡色谱柱，包被二抗或抗原，实际样品(水样和鱼类、贝类等食物样品)溶液、特异性抗体及标记竞争物经图一中任一进样孔进入色谱柱，温育10-20分钟，进洗涤缓冲液洗去过量的抗体及标记竞争物，加入显色缓冲液显色，抗体/藻类毒素间的特异性结合导致的光学信号都可被信号采集模块的光敏器件阵列采集并传至到微处理器(计算机)中和数据库相比较，来分析样品所含毒素的浓度。整个测试系统控制硬件部分主要由控制部分(计算机)，操作系统(集成化微流体芯片，数控界面)和数据采集，数据分析部分(计算机)。软件系统主要包括LABVIEW程序(控制)和ImagePro程序(数据分析)如图二所示。

Claims (5)

1.一种用于石房蛤毒素快速检测的微流控芯片，该芯片以光学透明材料为基材，依次由样品通道层，阀门控制层及基片层构成；其特征在于所述样品通道层中有样品富集及免疫分析模块，该样品富集及免疫分析模块由一个或几个并联或串联的纳升体积的免疫色谱柱微分析室组成，每个分析室通过聚合填料键合固定了石房蛤毒素抗体蛋白，以便发生免疫反应；阀门控制层含有气压控制阀门，控制样品通道层相关孔道的开关。

所述光学透明材料选自无机材料、硬质高分子聚合物或弹性聚合物；其中

自无机材料为石英或玻璃；硬质高分子聚合物为聚碳酸脂、聚甲基丙烯酸甲酯、聚对本二甲酸乙二醇脂或聚苯乙烯或聚丙烯；弹性聚合物为聚二甲基硅氧烷。

2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于免疫色谱柱为整体柱或聚合填料灌柱，聚合填料为硅胶填料。

3.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于免疫分析模块的键合物为二抗或抗原，免疫分析信号由标记的反应物实现，标记物为各种染料或荧光。

4.一种如权利要求1所述的微流控芯片的制备方法，其特征在于采用模塑法，具体步骤如下：

(1)基片准备：将硅片放入Piranha溶液去氧化后用氮气吹干，用SU-8 2050系列经旋涂机甩涂，在恒温加热板上软烘；

(2)曝光和烘焙：将设计好的样品通道层，阀门控制层的硅片模板分别放置在甩涂好的基片上，应用紫外曝光机曝光，之后在加热板上烘焙；

(3)显影：将硅片放入显影液中显影，之后分别用异丙醇和去离子水清洗干净，并用氮气吹干；

(4)硬烘：在热板上缓慢加热固定；

(5)浇注：聚二甲基硅氧烷单体及固化剂按质量配比5∶1至20∶1混合均匀，分别倒在相应的硅片模具上，在烘箱内固化，剥离；

(6)键合：将两层聚二甲基硅氧烷芯片校准键合形成微通道腔，再与基片层键合。

5.如权利要求1所述微流控芯片的在分析检测石房蛤毒素中的应用，其特征在于具体步骤如下：

样品溶液由所述微流控芯片的进样口进入芯片，芯片微分析室中的石房蛤毒素抗体蛋白或抗原与样品中的石房蛤毒素发生特异性免疫反应，免疫分析信号由标记的抗原实现，经过多次洗涤之后，免疫标记信号产生的变化被信号采集模块采集分析；信号采集模块由紫外LED和荧光光敏器件阵列组成，抗体/藻类毒素间的特异性结合导致的光学信号都可被光敏器件阵列采集并传至到微处理器中和数据库相比较，来分析样品所含石房蛤毒素的浓度。

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