IT201900006066A1

IT201900006066A1 - Uso di un metodo citofluorimetrico per valutare la stabilità e vitalità di una biomassa di cellule di batteri liofilizzate

Info

Publication number: IT201900006066A1
Application number: IT102019000006066A
Authority: IT
Inventors: Vera MOGNA; Marco Pane; Serena Allesina
Original assignee: Probiotical Spa
Priority date: 2019-04-18
Filing date: 2019-04-18
Publication date: 2020-10-18
Also published as: JP2022529940A; CA3136168A1; KR20220008276A; EP3956463A1; US20220195482A1; WO2020212934A1

Description

DESCRIZIONE dell ́invenzione avente per titolo:

“Uso di un metodo citofluorimetrico per valutare la stabilità e vitalità di una biomassa di cellule di batteri liofilizzate”

CAMPO DELL’INVENZIONE.

La presente invenzione si riferisce all’uso di un metodo citofluorimetrico per valutare la stabilità e la vitalità di una biomassa di cellule di batteri liofilizzate.

SFONDO DELL’INVENZIONE.

Nel settore della produzione di ceppi probiotici finalizzati alla prevenzione e alla cura di differenti patologie, nonché nella progettazione e realizzazione di prodotti finiti probiotici e simbiotici specifici per diverse aree terapeutiche è importante che le cellule di batteri probiotici siano stabili e vitali. Cellule di batteri stabili e vitali sono utili affinché, da un lato, le cellule di batteri possano avere un decadimento in funzione del tempo quanto più ridotto possibile anche in paesi con condizioni climatiche appartenenti a zona IV.A e zona IV.B e, dall’altro, le cellule di batteri siano efficaci una volta somministrate ad un soggetto.

L’attuale metodo di conta delle cellule di batteri effettuato mediante conta in piastra che esprime la vitalità (viability) in UFC (Unità Formanti Colonie) presenta limiti ed inconvenienti che ne limitano fortemente la sua applicazione anche nei riguardi di un procedimento di preparazione di una biomassa di cellule di batteri liofilizzate.

Infatti, il metodo di conta cellulare in piastra presenta i seguenti inconvenienti: 1) non esiste una singola metodologia applicabile a tutti gli organismi probiotici a causa dell’elevata variabilità, tra le specie e tra i ceppi della stessa specie; 2) il metodo della conta cellulare in piastra è molto laborioso e i risultati sono di solito disponibili anche dopo 72 ore a causa del periodo di incubazione che dev’essere osservato; 3) spesso vi sono considerevoli difficoltà tecniche nel determinare le adatte condizioni di crescita per ciscuna specie, in particolare con riferimento alle specie sensibili all’ossigeno; 4) la precisione del metodo e la riproducibilità dei risultati sperimentali condotti tra operatori diversi in laboratori diversi sono basse; 5) la quantificazione dei batteri in UFC può essere significativamente sotto stimata rispetto alla conta reale o effettiva di cellule vitali presenti in un campione in quanto le cellule vitali ma non coltivabili (VBNC Viable But Not Culturable) per definizione non danno luogo a colonie, e perché gli aggregati o catene di cellule microbiche possono dare solamente una colonia.

In aggiunta permangono ancora molti limiti negli attuali procedimenti di preparazione di una biomassa di cellule di batteri liofilizzate che non consentono di conservare e mantenere in un buono stato fisiologico la parete cellulare messa a dura prova durante le fasi produttive.

Inoltre la presenza, da una parte, di pochi metodi ISO disponibili per determinare la conta dei batteri e, dall’altra, la presenza nel mercato dei ceppi di batteri probiotici di una vasta gamma di metodi di conta interni, sviluppati dalle aziende del settore, rende difficile poter confrontare o confermare la quantità/concentrazione dei ceppi di batteri presenti in un prodotto finito.

La mancanza di un metodo unico per determinare la quantità o concentrazione dei ceppi di batteri presenti in un prodotto finito che sia riconosciuto a livello mondiale, affidabile, preciso e ripetibile crea molte incertezze nel settore dei prodotti a base di ceppi di batteri probiotici perché chi produce e chi compra i ceppi di batteri probiotici non ha modo di eseguire le necessarie verifiche nonché non riesce a dosare in maniera ponderata le quantità dei prodotti finiti in funzione anche della loro efficacia.

Pertanto è auspicabile poter disporre di un procedimento di produzione di una biomassa di ceppi di batteri probiotici liofilizzati, detto procedimento essendo in grado di stabilire e determinare la quantità e la concentrazione dei ceppi di batteri presenti nella biomassa in maniera affidabile, precisa e ripetibile.

Allo stesso tempo è altresì auspicabile poter disporre di una biomassa di cellule di batteri liofilizzate stabili anche in paesi aventi condizioni climatiche di zona IV.A (Clima caldo e umido – Condizioni di stoccaggio a lungo termine: 30°C/65% U.R.) e zona IV.B (Clima caldo e molto umido – Condizioni di stoccaggio a lungo termine: 30°C/75% U.R.) vitali, ad elevata concentrazione (misurabile in termini di vitalità (vitality)) e di facile preparazione.

RIASSUNTO DELL’INVENZIONE

La presente invenzione si riferice all’impiego di un metodo citofluorimetrico applicato a un procedimento per la preparazione di una biomassa di cellule di batteri liofilizzate, in cui le cellule di batteri hanno una parete cellulare, e in cui detto metodo citofluormetrico consente di valutare l’integrità di detta parete cellulare di dette cellule di batteri liofilizzate prodotte.

Le cellule di batteri liofilizzate, oggetto dell’invenzione, sono cellule con una parete cellulare (o parete di membrana cellulare) ben conservata in un buono stato fisiologico e, quindi, sono cellule integre e vitali. L’integrità della parete cellulare (o della parete di membrana cellulare) viene misurata e valutata mediante un metodo di citofluorimetria applicato a tutte le fasi del procedimento di preparazione di una biomassa di cellule di batteri. L’integrità della parete cellulare conferisce alle cellule stesse una maggiore stabilità in termini di vitalità espressa in AFU e determinata mediante un metodo citofluorimetrico. La stabilità è maggiore rispetto alla stabilità determinata sulle stesse cellule mediante conta in piastra ed espressa in UFC. Una maggiore stabilità consente di avere una biomassa di cellule di batteri con una shelflife prolungata, mentre una maggiore vitalità delle cellule consente di avere un’attività ed un’efficacia superiore una volta impiegate o somministrate ad un soggetto in trattamento. Inoltre, la possibilità di misurare e determinare la quantità e la concentrazione di cellule vitali in una biomassa consente di avere un procedimento di preparazione ripetibile, affidabile e sistematico.

Forma oggetto della presente invenzione l’uso di un metodo citofluorimetrico applicato ad una biomassa di cellule di batteri liofilizzate, avente le caratteristiche come indicato nelle unite rivendicazioni.

Forma un altro oggetto della presente invenzione l’uso di un metodo citofluorimetrico applicato a un procedimento per la preparazione di una biomassa di cellule di batteri liofilizzate, avente le caratteristiche come indicato nelle unite rivendicazioni.

Forma infine un altro oggetto ancora della presente invenzione l’uso di un metodo citofluorimetrico per valutare l’integrità di parete cellulare presente in cellule di batteri liofilizzate prodotte con un procedimento per la preparazione di una biomassa di cellule di batteri liofilizzate, avente le caratteristiche come indicato nelle unite rivendicazioni.

Forme preferite della presente invenzione sono di seguito riportate in maggior dettaglio senza voler in nessun modo limitare la portata della presente invenzione.

BREVE DESCRIZIONE DEI DISEGNI.

La presente invenzione verrà ora descritta con l’ausilio delle tavole allegate, fornite a solo scopo illustrativo, in cui:

- la figura 1 illustra una correlazione AFU/ml vs. UFC/ml in biomasse liquide quali le biomasse ottenute dalla fase (i), dalla fase (ii) oppure dalla fase (iii); - la figura 2 e la figura 3 mostrano una correlazione UFC/g (figura 2); metodo di riferimento AFU/g (figura 3) su biomasse liofilizzate ottenute dalla fase (iv) a varie concentrazioni di cellule di batteri.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE.

La Richiedente dopo una lunga ed intensa attività di ricerca e sviluppo ha realizzato l’importanza che svolge la determinazione e la valutazione dell’integrità della parete delle cellule dei batteri (parete cellulare) presenti in una biomassa (insieme di cellule di batteri). In pratica, la Richiedente ha realizzato che l’integrità (una integrità maggiore corrisponde ad una permeabilità minore) della parete cellulare e la sua determinazione/misurazione in maniera ripetibile, affidabile e precisa consente di poter quantificare la stabilità e la vitalità di una biomassa di cellule di batteri liofilizzate.

Le risultanze sperimentali hanno confermato che l’uso di un metodo citofluorimetrico consente di determinare e di valutare lo stato di conservazione ed integrità della parete cellulare durante tutte le fasi di preparazione di una biomassa di cellule di batteri liofilizzate consentendo di produrre cellule di batteri con una stabilità, in termini di vitalità espressa in AFU e misurata/determinata mediante un metodo citofluorimetrico, maggiore rispetto alla stabilià determinata sulle stesse cellule mediante conta in piastra ed espressa in UFC.

Sorprendentemente, l’applicazione di un metodo citofluorimetrico consente di correlare il parametro cellulare di “coltivabilità” (UFC) - ossia la capacità delle cellule batteriche di replicare in piastra - con un parametro fisico/fisiologico di integrità e vitalità della cellula (AFU) ossia unità fluorescenti attive nelle diverse fasi del processo (i), (ii) e/o (iii), e (iv).

La presente invenzione si riferisce ad un uso di un metodo citofluorimetrico applicato ad una biomassa di cellule di batteri liofilizzate (biomassa liofilizzata), in cui tale metodo citofluorimetrico è per valutare la stabilità di dette cellule di batteri liofilizzate.

In accordo con una forma di realizzazione, le cellule di batteri nella biomassa liofilizzata sono cellule nude, vale a dire prive di un rivestimento esterno.

In accordo con un’altra forma di realizzazione, le cellule di batteri nella biomassa liofilizzata sono cellule micro-incapsulate, preferibilmente in una matrice lipidica oppure in una matrice glicoproteica.

In accordo con una forma di realizzazione, la biomassa liofilizzata è prodotta mediante un procedimento per la preparazione di una biomassa di cellule di batteri liofilizzate che comprende le seguenti fasi:

(i) fermentare una biomassa di cellule di batteri (biomassa di batteri) precedentemente preparata comprendente almeno un ceppo di cellule di batteri per ottenere una biomassa di cellule di batteri fermentata (biomassa fermentata);

(ii) concentrare la biomassa fermentata ottenuta dalla fase (i) fino ad ottenere una biomassa di cellule di batteri concentrata (biomassa concentrata) avente una concentrazione di cellule di batteri compresa da 1x10<6 >cellule/ml di biomassa liquida a 1x10<12 >cellule/ml di biomassa liquida;

(iii) miscelare la biomassa concentrata ottenuta dalla fase (ii) con una soluzione che comprende o, alternativamente, consiste di: (a) almeno un sale del fosforo scelto dal gruppo comprendente o, alternativamente, consistente di un sale dello ione fosfato o acido fosforico, un sale dello ione fosfito o acido fosforoso, un sale dello ione mono-idrogeno fosfato, un sale dello ione di-idrogeno fosfato, un sale dello ione pirofosfato o acido pirofosforico, e loro miscele, e (b) almeno una sostanza poli-idrossi scelta dal gruppo comprendente o, alternativamente, consistente di saccarosio, fruttosio, lattosio, lattitolo, trealosio o mannitolo, e loro miscele, e preferibilmente (c) L-cisteina, per ottenere una biomassa di cellule di batteri crioprotette (biomassa crioprotetta);

(iv) liofilizzare la biomassa crioprotetta ottenuta dalla fase (iii) per ottenere la biomassa liofilizzata.

Il procedimento per la preparazione della biomassa liofilizzata secondo una forma di realizzazione della presente invenzione comprende la fase (i) nella quale la biomassa di batteri precedentemente preparata e comprendente almeno un ceppo di cellule di batteri viene fermentata per ottenere la biomassa fermentata.

In accordo con una forma di realizzazione, la biomassa di batteri destinata alla fase (i) comprende almeno un ceppo di cellule di batteri scelto dal gruppo comprendente o, alternativamente, consistente dei ceppi di cellule batteriche appartenenti alle famiglie: Firmicutes, Actibacteria, Bacteroidetes, Proteobacteria, e loro miscele. Detto almeno un ceppo di cellule batteriche è scelto dal gruppo comprendente o, alternativamente, consistente dei ceppi di cellule batteriche appartenenti ai generi: Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus, Lactococcus, Akkermansia, Intestinimonas, Eubacterium, Faecalibacterium, Neisseria, Roseburia, Cutibacterium e loro miscele. Detto almeno un ceppo di cellule di batteri è scelto dal gruppo comprendente o, alternativamente, consistente dei ceppi di cellule di batteri appartenenti alle specie: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus salivarius subsp. salivarius, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus paracasei subsp. paracasei, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus brevis, Lactobacillus casei, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus johnsonii, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium animalis subsp. lactis, Bifidobacterium breve, Bifobacterium catenulatum, Bifobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, Akkermansia munichipila, Intestinimonas butyriciproducens, Eubacterium hallii, Faecalobacterium prausnitzii, Neisseria lactamica, Roseburia hominis, Cutibacterium acnes, e loro miscele.

Al termine della fase di fermentazione (i) si ottiene una biomassa di batteri la quale viene sottoposta ad una concentrazione in accordo con la fase (ii).

In accordo con una forma di realizzazione, la fase (ii) viene realizzata mediante una fase di separazione, in cui una frazione liquida viene separata da una frazione solida o cellulare costituita appunto dalle cellule di batteri cresciuti nel substrato di fermentazione liquido (o brodo di fermentazione) della fase (i). In una realizzazione, detta fase di separazione può essere realizzata mediante centrifugazione.

La fase di separazione consente di separare dalla biomassa di batteri, che si trova nello stato fisico di una soluzione, la frazione liquida in essa contenuta in modo che la stessa biomassa si concentri sempre più delle altre componenti quali ad esempio le cellule di batteri.

Nella fase (iii) la biomassa concentrata ottenuta dalla fase (ii) è miscelata con la soluzione che comprende o, alternativamente, consiste di: sale del fosforo (a) e sostanza poli-idrossi (b) (vale a dire: saccarosio, fruttosio, lattosio, lattitolo, trealosio o mannitolo, e loro miscele, e preferibilmente (c) L-cisteina.

Tale soluzione (o soluzione di crioprotezione) è in grado conferire alla biomassa concentrata, una crioprotezione nel senso che la biomassa di batteri viene crioprotetta. Questo significa che le cellule del ceppo di batteri impiegato, contenute in detta biomassa di batteri, vengono crioprotette. La crioprotezione delle cellule comporta che i tessuti biologici (ad esempio la membrana cellulare) delle cellule del ceppo di batteri risultano protetti da possibili danni conseguenti ad un congelamento nella fase di liofilizzazione (iv) della biomassa crioprotetta. A titolo di esempio, un danno alle cellule potrebbe comprendere una lacerazione o una lesione della membrana cellulare, accompagnata da un possibile aumento della permeabilità attraverso la membrana stessa.

In accordo con una forma di realizzazione, almeno un sale del fosforo (a) è scelto dai composti di potassio fosfato (K3PO4), potassio mono-idrogeno fosfato (K2HPO4), potassio di-idrogeno fosfato (KH2PO4) e/o potassio pirofosfato (K4P2O7; CAS N. 7320-34-5).

In accordo con una forma di realizzazione, il saccarosio potrebbe essere impiegato nel ruolo di sostanza poliidrossi (b).

In accordo con una forma di realizzazione, il saccarosio potrebbe essere presente in una concentrazione compresa da 25%P/V a 45%P/V, preferibilmente di 40%P/V, laddove % P/V intende una percentuale in peso (ossia grammi) del saccarosio rispetto al volume totale della soluzione di crioprotezione (considerando tale soluzione prima della propria miscelazione alla biomassa di batteri nella fase (iii).

In accordo con una forma di realizzazione, la concentrazione del sale o dei sali del fosforo (a) nella soluzione utilizzata nella fase (iii) potrebbe essere compresa da 6 a 20%P/V, preferibilmente compresa da 6 a 15%P/V, ancora più preferibilmente compresa da 10 a 14%P/V, laddove % P/V intende una percentuale in peso (ossia grammi) dei suddetti composti rispetto al volume totale della soluzione.

In accordo con una forma di realizzazione, la L-cisteina nella soluzione utilizzata nella fase (iii) potrebbe essere presente in una quantità compresa da 0,5 grammi di L-cisteina a 5 grammi di L-cisteina per ogni litro di soluzione, preferibilmente compresa da 1 grammo a 4 grammi di L-cisteina per ogni litro di soluzione, ancora più preferibilmente compresa da 2 grammi a 3 grammi di L-cisteina per ogni litro di soluzione.

Nello specifico, la L-cisteina (CAS N. 52-90-4) funziona da sequestrante dell’ossigeno e pertanto, quando aggiunta nella soluzione, limita o impedisce la formazione di specie radicaliche dell’ossigeno (ROS; reactive oxygen species). Inoltre, la L-cisteina è caratterizzata da un basso peso molecolare, e pertanto può penetrare facilmente le membrane cellulari delle cellule di batteri, in tal modo aumentando la protezione dai danni derivanti dai radicali liberi dell’ossigeno, e migliorando l’integrità di struttura della membrana stessa.

Nella fase (iv) la biomassa crioprotetta ottenuta dalla fase (iii) viene liofilizzata per ottenere la biomassa liofilizzata.

L’espressione "liofilizzare" o "liofilizzazione" - salvo che non sia diversamente indicato - farà riferimento a una disidratazione controllata della biomassa crioprotetta preventivamente congelata, e si riferirà all'intero processo di liofilizzazione (congelamento, essicamento primario ed essicamento secondario).

In accordo con una forma di realizzazione, la liofilizzazione della fase (iv) comprende, dopo la fase (iii), le seguenti fasi:

(iv.a) congelamento della biomassa crioprotetta ottenuta dalla fase (iii) per ottenere una biomassa congelata; (iv.b) sublimazione del ghiaccio (o essiccamento) della biomassa congelata ottenuta dalla fase (iv.a) a dare la biomassa liofilizzata.

Preferibilmente, la sublimazione della fase (iv.b) comprende una fase di essiccamento primario (iv.b.1) della biomassa congelata ottenuta dalla fase (iv.a), e un successivo essiccamento secondario (o desorbimento) (iv.b.2), sulla biomassa ottenuta dalla fase (iv.b.1), a dare la biomassa liofilizzata.

Nella fase di essiccamento primario (iv.b.1), la biomassa congelata ottenuta dalla fase (iv.a) è inizialmente sottoposta ad una pressione ridotta, in modo da sublimare una parte della soluzione congelata, a dare una biomassa a pressione ridotta e successivamente, nella fase di essiccamento secondario (iv.b.2), la biomassa a pressione ridotta viene riscaldata a dare la biomassa liofilizzata.

Preferibilmente, la fase di essiccamento secondario (iv.b.2) inizia quando è sublimato tutto il ghiaccio dalla biomassa a pressione ridotta nella precedente fase di essiccamento primario (iv.b.1). Nella fase di essiccamento secondario (iv.b.2) viene desorbita la soluzione adsorbita sulla biomassa a pressione ridotta ottenuta dalla fase di essiccamento primario (iv.b.1), tramite un innalzamento della temperatura della biomassa a pressione ridotta.

In accordo con una forma di realizzazione, la fase di essiccamento secondario (iv.b.2) termina quando l’umidità della biomassa è compresa da 0,5% a 2,5% in peso, preferibilmente compresa da 0,75% a 2,0% in peso, più preferibilmente compresa da 0,9% a 1,5% in peso, ancora più preferibilmente compresa da 0,95% a 1,1% in peso della biomassa.

In accordo con una forma di realizzazione, il metodo citofluorimetrico applicato alla biomassa liofilizzata è ulteriormente applicato alla biomassa fermentata ottenuta dalla fase (i), alla biomassa concentrata ottenuta dalla fase (ii) e/o alla biomassa crioprotetta ottenuta dalla fase (iii), per valutare la vitalità/integrità delle cellule di batteri nella biomassa fermentata, nella biomassa concentrata e/o nella biomassa crioprotetta, preferibilmente per valutare la vitalità/integrità delle cellule di batteri in tutte le biomasse, vale a dire nella biomassa fermentata, nella biomassa concentrata e nella biomassa crioprotetta.

In accordo con una forma di realizzazione preferita, la valutazione della vitalità/integrità delle cellule di batteri nella biomassa fermentata, nella biomassa concentrata, e/o nella biomassa crioprotetta, e nella biomassa liofilizzata, può essere utilizzata per monitorare e/o regolare i parametri di processo che governano la fase (i), la fase (ii) e/o la fase (iii), e la fase (iv).

In altre parole, il monitoraggio e la valutazione della vitalità/integrità delle cellule di batteri eseguite in almeno una parte delle, preferibilmente in tutte le, fasi del procedimento di preparazione della biomassa di cellule di batteri, consente di ottimizzare il processo in ciascuna delle singole fasi del procedimento di preparazione al fine di ottenere una biomassa di cellule di batteri liofilizzate, stabili, vitali ed ad elevata concentrazione, mediante un processo riproducibile, affidabile e ottimizzato.

Secondo una forma di realizzazione, il procedimento può comprendere, oltre alle fasi (i), (ii), (iii) e (iv), una fase (v) successiva alla fase (iv).

Nella fase preferita (v) la biomassa liofilizzata ottenuta dalla fase (iv) viene frantumata a dare una biomassa frantumata.

Infatti, nel caso in cui la biomassa liofilizzata ottenuta dalla fase (iv) sia una massa compatta (cake), tale massa deve essere frantumata, o macinata, o disgregata, al fine di ottenere la biomassa frantumata. Preferibilmente, la frantumazione della fase (v) viene eseguita tramite una rete o un setaccio.

Più precisamente, nella fase preferita (v) la massa compatta o cake ottenuta dalla fase (iv) viene forzata attraverso la suddetta rete oppure il suddetto setaccio al fine di frantumare, o macinare, o disgregare la massa compatta.

Una biomassa frantumata, ottenuta al termine della fase (v), è in forma di polvere o di granulo, ed è più facilmente gestibile e manipolabile rispetto alla biomassa liofilizzata della fase (iv). Ad esempio, tale migliorata manipolazione si può rivelare utile in successive operazioni di pesatura e/o di confezionamento.

Secondo una forma di realizzazione, il procedimento può comprendere, oltre alle fasi (i), (ii), (iii) e (iv), una fase (vi) successiva alla fase (v).

Nella fase preferita (vi), la biomassa frantumata ottenuta dalla fase (v) viene confezionata in un contenitore sterile, preferibilmente in assenza di umidità, a dare una biomassa confezionata.

In una forma di realizzazione, la biomassa confezionata ottenuta dalla fase (vi) è confezionata nel contenitore sterile in modo tale che la quantità di spazio di testa nel contenitore sterile (nello specifico, la quantità di aria tra la biomassa confezionata e la parte superiore del contenitore) sia molto ridotta. Preferibilmente, la quantità di spazio di testa è trascurabile (ossia, quasi nulla).

In accordo con una forma di realizzazione, la biomassa confezionata ha una concentrazione di cellule di batteri compresa da 1x10<8 >cellule/g a 1x10<11 >cellule/g, preferibilmente una concentrazione compresa da 1x10<9 >cellule/g a 1x10<10 >cellule/g, per ogni grammo di biomassa confezionata ottenuta al termine della fase (vi).

Secondo una forma di realizzazione, il procedimento può comprendere, oltre alle fasi (i), (ii), (iii) e (iv), una fase (vii) successiva alla fase (vi).

Nella fase preferita (vii), la biomassa confezionata ottenuta dalla fase (vi) viene ricostituita con acqua dopo un tempo predefinito, a dare una biomassa ricostituita.

In accordo con diverse forme di realizzazione, l’acqua utilizzata nella fase (vii) è selezionata dal gruppo comprendente oppure, alternativamente, consistente di acqua pura, soluzione fisiologica, o soluzione tampone.

In merito al tempo predefinito della fase (vii), tale tempo è preferibilmente compreso da 1 minuto a 10 anni, preferibilmente compreso da 1 giorno a 5 anni, più preferibilmente compreso da 4 mesi oppure da 12 mesi a 48 mesi, ancora più preferibilmente da 18 mesi a 32 mesi, ulteriormente preferibilmente da 24 mesi a 30 mesi, anche in condizioni di zona IV.A e zona IV.B (zone geografiche individuate dall’Organizzazione Mondiale della Sanità; World Health Organization).

In accordo con una forma di realizzazione, la ricostituzione della fase (vii) prevede una riaddizione di un volume di acqua alla biomassa confezionata ottenuta dalla fase (vi), tipicamente, ma non necessariamente, equivalente al volume ridotto durante la liofilizzazione della fase (iv).

In accordo con una forma di realizzazione, la biomassa liofilizzata confezionata ottenuta dalla fase (vi) potrebbe essere ricostituita (idratata) nella fase (vii) come soluzione acquosa, preferibilmente tramite una soluzione acquosa isotonica, ancora più preferibilmente ad un valore di pH sostanzialmente neutro o comunque compreso da 6.0 a 7.0. Tale valore di pH compreso da 6.0 a 7.0 è particolarmente preferito per una biomassa confezionata ottenuta dalla fase (vi) in cui le cellule di batteri sono cellule nude, vale a dire prive di un rivestimento esterno.

In accordo con una forma di realizzazione, la biomassa liofilizzata confezionata ottenuta dalla fase (vi) potrebbe essere ricostituita (idratata) nella fase (vii) come soluzione acquosa di una soluzione tampone borato a pH 8,4. Tale valore di pH 8,4 è particolarmente preferito per una biomassa confezionata ottenuta dalla fase (vi) in cui le cellule di batteri sono cellule micro-incapsulate, preferibilmente in una matrice lipidica oppure in una matrice glicoproteica.

Secondo una forma di realizzazione, nella ricostituzione della fase (vii), la biomassa confezionata ottenuta dalla fase (vi) è diluita sino ad ottenere una concentrazione di cellule di batteri nella biomassa ricostituita compresa da 10<5 >a 10<7 >cellule/ml, preferibilmente circa 10<6 >cellule/ml.

A tal proposito, la concentrazione di cellule di batteri nella biomassa ricostituita compresa da 10<5 >a 10<7 >cellule/ml, preferibilmente circa 10<6 >cellule/ml, è preferibilmente ottenuta tramite diluzioni successive con acqua.

In accordo con un’altra forma di realizzazione, il procedimento comprende, oltre alle fasi (i), (ii), (iii) e (iv), le seguenti fasi:

(viii) mettere a contatto la biomassa fermentata ottenuta dalla fase (i), la biomassa concentrata ottenuta dalla fase (ii), la biomassa crioprotetta ottenuta dalla fase (iii), e/o la biomassa liofilizzata ottenuta dalla fase (iv) con due diversi coloranti fluorescenti, in modo da ottenere una biomassa fermentata fluorescente, una biomassa concentrata fluorescente, una biomassa crioprotetta fluorescente e/o una biomassa liofilizzata fluorescente (complessivamente indicate con l’espressione “biomasse fluorescenti”);

(ix) successivamente alla fase (viii), tramite citofluorimetria a flusso, rilevare una quantità di cellule di batteri con membrane cellulari integre (e pertanto vitali oppure stabili) nella biomassa fermentata fluorescente, nella biomassa concentrata fluorescente, nella biomassa crioprotetta fluorescente e/o nella biomassa liofilizzata fluorescente.

In accordo con una forma di realizzazione, nella fase di rilevazione della fase (ix) e in accordo al metodo sancito dalla norma ISO 19344:2015(E), un primo colorante permeabile attraverso le membrane cellulari (preferibilmente: arancio di tiazolo oppure, alternativamente, SYTO® 24 - un colorante fluorescente nello spettro del verde) è in grado di penetrare in tutte le cellule di batteri, fornendo le unità o cellule fluorescenti totali (TFU; total fluorescent units) delle biomasse fluorescenti. Un secondo colorante (preferibilmente: propidio ioduro) è in grado di penetrare solamente nelle cellule di batteri con una membrana cellulare danneggiata, fornendo le unità o cellule di batteri fluorescenti non attive o non vitali (nAFU= non active fluorescent unit) delle biomasse fluorescenti.

In accordo con una forma di realizzazione, la quantità del primo colorante nella biomassa fermentata ottenuta dalla fase (i), oppure nella biomassa concentrata ottenuta dalla fase (ii), oppure nella biomassa crioprotetta ottenuta dalla fase (iii), oppure nella biomassa liofilizzata ottenuta dalla fase (iv) – in quest’ultimo caso, la biomassa liofilizzata essendo ottenuta come biomassa ricostituita dalla fase (vii) – è compreso da 0,1 µmol/litro a 1 µmol/litro, per litro di una biomassa da analizzare avente una concentrazione di cellule di batteri compresa da 10<5 >a 10<7 >cellule/ml, preferibilmente di 10<6 >cellule/ml.

In accordo con una forma di realizzazione, la quantità del secondo colorante nella biomassa fermentata ottenuta dalla fase (i), oppure nella biomassa concentrata ottenuta dalla fase (ii), oppure nella biomassa crioprotetta ottenuta dalla fase (iii), oppure nella biomassa liofilizzata ottenuta dalla fase (iv) – in quest’ultimo caso, la biomassa liofilizzata essendo ottenuta come biomassa ricostituita dalla fase (vii) – è compreso da 1 µmol/litro a 50 µmol/litro, per litro di una biomassa da analizzare avente una concentrazione di cellule di batteri compresa da 10<5 >a 10<7 >cellule/ml, preferibilmente di 10<6 >cellule/ml.

In accordo con una forma di realizzazione, la modalità di preparazione dei coloranti fluorescenti è eseguita in accordo al par. 5.3.1.3 e 5.3.2 (Protocollo B) della norma ISO 19344:2015(E). Tali coloranti fluorescenti sono addizionati alla biomassa da analizzare, diluita nei quantitativi descritti al paragrafo 9.2.2 della stessa norma, con una successiva incubazione della biomassa per un tempo di 15 minuti ad una temperatura di 37°C in modo da ottenere una biomassa fluorescente da analizzare. Dopodiché, la biomassa fluorescente viene sottoposta alla fase di rilevazione (ix) tramite citofluorimetria a flusso.

In accordo con una forma di realizzazione alternativa della fase (viii), la biomassa fermentata ottenuta dalla fase (i), la biomassa concentrata ottenuta dalla fase (ii), la biomassa crioprotetta ottenuta dalla fase (iii), e/o la biomassa liofilizzata ottenuta dalla fase (iv) può essere messa a contatto con un kit di colorazione pronto all’uso BD™ Cell Viability Kit (Cat. N.o 349480), seguendo le istruzioni corredate, in modo da ottenere una biomassa fermentata fluorescente, una biomassa concentrata fluorescente, una biomassa crioprotetta fluorescente e/o una biomassa liofilizzata fluorescente.

Secondo una forma di realizzazione particolarmente preferita, la quantità di cellule di batteri vitali, con membrane cellulari integre, può essere espressa come unità o cellule fluorescenti attive (AFU; active fluorescent units), ossia le unità che risultano positive solo al primo colorante nell’analisi in fluorescenza (preferibilmente: arancio di tiazolo oppure, alternativamente, SYTO® 24), per le quali vale la seguente correlazione:

TFU = AFU+nAFU

dove:

- TFU (total fluorescent units) sono le unità o cellule di batteri fluorescenti totali;

- nAFU (non active fluorescent units) sono le unità o cellule di batteri fluorescenti non attive, con una membrana cellulare non integra o danneggiata (ossia le unità che risultano positive al secondo colorante, preferibilmente ioduro di propidio).

In accordo con una forma di realizzazione, il citofluorimetro a flusso della fase (ix) è configurato e/o calibrato per effettuare una determinazione volumetrica delle biomasse fluorescenti analizzate, e per calcolare direttamente la concentrazione cellulare (AFU e TFU).

Secondo un’altra forma di realizzazione, per ricavare i valori di AFU e di TFU nelle biomasse fluorescenti, il citofluorimetro a flusso della fase (ix) utilizza almeno uno standard interno fluorescente aggiunto alle biomasse fluorescenti.

In accordo con una forma di realizzazione, lo standard interno fluorescente è in forma di sfera o di biglia fluorescente ed è aggiunto a ciascuna biomassa fluorescente da analizzare in concentrazione nota. Il valore di AFU e di TFU nella biomassa fluorescente analizzata potrà quindi essere calcolato in proporzione rispetto alle quantità note dello standard interno.

In accordo con una forma di realizzazione, la quantità di standard interno fluorescente è aggiunto a ciascuna biomassa fluorescente da analizzare in un volume a concentrazione nota compreso da 20 µl a 100 µl, preferibilmente di 50 µl, per un volume di biomassa diluita da analizzare compreso da 0,100 ml a 1,000 ml, preferibilmente di 0,500 ml, laddove con “biomassa diluita” si intende una biomassa da analizzare avente una concentrazione di cellule di batteri compresa da 10<5 >a 10<7 >cellule/ml, preferibilmente di 10<6 >cellule/ml.

La presente invenzione si riferisce inoltre ad un uso di un metodo citofluorimetrico applicato ad un procedimento per la preparazione di una biomassa di cellule di batteri liofilizzate (biomassa liofilizzata), in cui le cellule di batteri hanno una parete cellulare, e in cui tale metodo citofluormetrico è per valutare l’integrità di detta parete cellulare di dette cellule di batteri liofilizzate prodotte.

La presente invenzione si riferisce infine ad un uso di un metodo citofluorimetrico per valutare l’integrità di una parete cellulare presente in cellule di batteri liofilizzate prodotte con un procedimento per la preparazione di una biomassa di cellule di batteri liofilizzate.

Caratteristiche preferite dell’uso del metodo citofluorimetrico applicato al procedimento per la preparazione della biomassa liofilizzata, oppure dell’uso del metodo citofluorimetrico per valutare l’integrità della parete cellulare presente in cellule di batteri liofilizzate prodotte con il procedimento per la preparazione della biomassa liofilizzata, sono illustrate almeno in relazione alle fasi (i), (ii), (iii), (iv) della descrizione che precede.

Una correlazione AFU/ml rispetto a UFC/ml in biomasse liquide quali le biomasse ottenute dalla fase (i), dalla fase (ii) oppure dalla fase (iii) è esemplificata in figura 1.

Una correlazione UFC/g ed una correlazione AFU/g ottenute sulle stesse biomasse liofilizzate ottenute dalla fase (iv), a varie concentrazioni di cellule di batteri, sono rispettivamente mostrate nella figura 2 e nella figura 3.

Come si può osservare da tali figure 2 e 3, la conta delle cellule di batteri mostra una differenza significativa tra il numero di cellule ottenuto tramite conta in piastra, ed il numero di cellule ottenuto con il metodo citofluorimetrico a flusso.

La differenza tra i due metodi è sperimentalmente riconosciuta, e deriva dalle tipologie di cellule, dal loro stato fisiologico che i due metodi mettono implicitamente in evidenza. La conta in piastra dipende dall’abilità della singola cellula di crescere e replicarsi in un terreno di coltura in accordo al proprio stato fisiologico e ai parametri di incubazione adottati. Al contrario, la citofluorimetria a flusso legge ogni cellula integra e vitale all’interno di ciascun campione indipendentemente dai parametri di incubazione.

Questa differenza è evidente dall’espressione analitica dei risultati, UFC/g (figura 2) rispetto a AFU/g (figura 3). Tramite i risultati delle figure 2 e 3 è possibile calcolare un fattore di correlazione FC (definito come un rapporto AFU/UFC) tra i due metodi, compreso tra 1,25 e 1,3.

Come si può notare, sorprendentemente, il fattore di correlazione FC risulta prossimo a 1, in media ≥ 1 sulle biomasse liquide ottenute dalla fase (i), dalla fase (ii) e dalla fase (iii) a parità di volume (ml) di biomassa.

Tale fattore FC aumenta progressivamente durante le successive fasi del procedimento per la preparazione della biomassa liofilizzata, in quanto le fasi arrecano inevitabilmente una sofferenza alle cellule e dei danni tali per cui le cellule di batteri possono perdere la capacità replicativa pur rimanendo vitali e conservando l’integrità di membrana. Questa frazione di cellule è relativa alle cellule vitali non coltivabili (VBNC; viable but not culturable).

Il FC calcolato su biomasse liofilizzate ottenute dalla fase (iv) può superare un fattore 1,2 (in media essendo ≥ 1,25) e crescere ulteriormente nel caso di biomasse in cui le cellule di batteri sono micro-incapsulate, stante lo scioglimento della matrice (preferibilmente lipidica oppure glicoproteica) e la separazione delle singole cellule che non danno origine ad una singola colonia in piastra con conseguente sottostima della popolazione batterica analizzata.

L’uso del metodo citofluorimetrico applicato alla biomassa liofilizzata consente di ottenere una biomassa stabile, con cellule di batteri con una parete cellulare ben conservata in un buono stato fisiologico e, quindi, cellule integre e vitali.

L’uso del metodo citofluorimetrico applicato al procedimento per la preparazione della biomassa liofilizzata consente di misurare e valutare integrità/vitalità delle cellule di batteri in una parte o in tutte le fasi del procedimento per la preparazione della biomassa liofilizzata, in modo da monitorare ed eventualmente regolare i parametri del procedimento per tale preparazione.

Vantaggiosamente, i presenti usi consentono di fornire una metodologia applicabile ad un procedimento plasmabile con ampia libertà in funzione della tipologia di cellule di batteri che si desidera ottenere in forma liofilizzata.

Vantaggiosamente, i presenti usi del metodo citofluorimetrico sono compatibili con le tempistiche tecnologico-produttive di biomasse liofilizzate su scala industriale, che devono essere drasticamente minori rispetto al reperimento di informazioni tramite conta in piastra.

Vantaggiosamente, i presenti usi del metodo citofluorimetrico sono indipendenti dallo stato fisico del campione di biomassa da analizzare, in quanto la tecnica citofluorimetrica può essere sfruttata per biomasse in fase liquida e in fase solida (previa ricostituzione).

Vantaggiosamente, i presenti usi del metodo citofluorimetrico forniscono informazioni estremamente accurate sulle biomasse intermedie o finali ottenute con il procedimento per la preparazione qui discusso.

Vantaggiosamente, i presenti usi del metodo citofluorimetrico permettono di individuare anche cellule vitali non coltivabili (VBNC; viable but not culturable) nei campioni di biomassa. Infatti, il valore di CFU ottenibile tramite la tradizionale conta in piastra sulle cellule di batteri non rende conto di cellule dormienti o che non generano colonie, ma che comunque manifestano un’attività metabolica oppure che – in condizioni ambientali opportune (ad esempio a contatto con il sistema enterico) – potrebbero recuperare da danni subletali.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Un uso di un metodo citofluorimetrico applicato a una biomassa di cellule di batteri liofilizzate (biomassa liofilizzata), in cui detto metodo citofluorimetrico è per valutare la stabilità di dette cellule di batteri liofilizzate.
2. L’uso secondo la rivendicazione 1, in cui detta biomassa liofilizzata è prodotta mediante un procedimento per la preparazione di una biomassa di cellule di batteri liofilizzate che comprende le seguenti fasi: (i) fermentare una biomassa di cellule di batteri (biomassa di batteri) precedentemente preparata comprendente almeno un ceppo di cellule di batteri per ottenere una biomassa di cellule di batteri fermentata (biomassa fermentata); (ii) concentrare la biomassa fermentata ottenuta dalla fase (i) fino ad ottenere una biomassa di cellule di batteri concentrata (biomassa concentrata) avente una concentrazione di cellule di batteri compresa da

cellule/ml di biomassa liquida a cellule/ml di biomassa liquida; (iii) miscelare la biomassa concentrata ottenuta dalla fase (ii) con una soluzione che comprende o, alternativamente, consiste di: (a) almeno un sale del fosforo scelto dal gruppo comprendente o, alternativamente, consistente di un sale dello ione fosfato o acido fosforico, un sale dello ione fosfito o acido fosforoso, un sale dello ione mono-idrogeno fosfato, un sale dello ione di-idrogeno fosfato, un sale dello ione pirofosfato o acido pirofosforico, e loro miscele, e (b) almeno una sostanza poli-idrossi scelta dal gruppo comprendente o, alternativamente, consistente di saccarosio, fruttosio, lattosio, lattitolo, trealosio o mannitolo, e loro miscele, e preferibilmente (c) L-cisteina, per ottenere una biomassa di cellule di batteri crioprotette (biomassa crioprotetta); (iv) liofilizzare la biomassa crioprotetta ottenuta dalla fase (iii) per ottenere la biomassa liofilizzata.
3. L’uso secondo la rivendicazione 2, in cui detto metodo citofluorimetrico è ulteriormente applicato alla biomassa fermentata ottenuta dalla fase (i), alla biomassa concentrata ottenuta dalla fase (ii) e/o alla biomassa crioprotetta ottenuta dalla fase (iii), per valutare la vitalità/integrità delle cellule di batteri in detta biomassa fermentata, in detta biomassa concentrata e/o in detta biomassa crioprotetta.
4. L’uso secondo la rivendicazione 3, in cui detta valutazione della vitalità/integrità di dette cellule di batteri è utilizzata per monitorare e/o regolare i parametri di processo che governano la fase (i), la fase (ii) e/o la fase (iii), e la fase (iv).
5. L’uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 2-4, in cui il procedimento comprende, oltre alle fasi (i), (ii), (iii) e (iv), le seguenti fasi: (viii) mettere a contatto la biomassa fermentata ottenuta dalla fase (i), la biomassa concentrata ottenuta dalla fase (ii), la biomassa crioprotetta ottenuta dalla fase (iii), e/o la biomassa liofilizzata ottenuta dalla fase (iv) con due diversi coloranti fluorescenti, in modo da ottenere una biomassa fermentata fluorescente, una biomassa concentrata fluorescente, una biomassa crioprotetta fluorescente e/o una biomassa liofilizzata fluorescente; (ix) successivamente alla fase (viii), tramite citofluorimetria a flusso, rilevare una quantità di cellule di batteri con membrane cellulari integre nella biomassa fermentata fluorescente, nella biomassa concentrata fluorescente, nella biomassa crioprotetta fluorescente e/o nella biomassa liofilizzata fluorescente.
6. L’uso secondo la rivendicazione 5, in cui detta quantità è espressa come unità o cellule fluorescenti attive (AFU; active fluorescent units) per le quali vale la seguente correlazione: TFU = AFU+nAFU in cui: - TFU (total fluorescent units) sono le unità o cellule di batteri fluorescenti totali; - nAFU (non active fluorescent units) sono le unità o cellule di batteri fluorescenti non vitali, con una membrana cellulare danneggiata.
7. L’uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui le cellule di batteri nella biomassa liofilizzata sono cellule nude, prive di un rivestimento esterno.
8. L’uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-6, in cui le cellule di batteri nella biomassa liofilizzata sono cellule micro-incapsulate in una matrice lipidica oppure in una matrice glicoproteica.
9. Un uso di un metodo citofluorimetrico applicato ad un procedimento per la preparazione di una biomassa di cellule di batteri liofilizzate, in cui le cellule di batteri hanno una parete cellulare, ed in cui detto metodo citofluormetrico è per valutare l’integrità di detta parete cellulare di dette cellule di batteri liofilizzate prodotte.
10. Un uso di un metodo citofluorimetrico per valutare l’integrità di una parete cellulare presente in cellule di batteri liofilizzate prodotte con un procedimento per la preparazione di una biomassa di cellule di batteri liofilizzate.