CN105264358A - 生物样品的图像分析及测量 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于图像分析的方法、设备、装置和系统。图像分析方法可包括对生物样品和其他样品的图像的观察、测量和分析；本文提供的设备、设备和系统对于此类样品的图像的观察、测量和分析是有用的。本文公开的方法、设备、装置和系统提供了相比于其他方法、设备、装置和系统的优势。

Description

生物样品的图像分析及测量
背景技术
对来自受试者的生物样品的分析对于受试者的健康相关诊断、监测或治疗可以是非常重要的。已知有许多方法可用于生物样品的分析。然而，为了对受试者提供更好的诊断、监测或治疗，还希望在生物样品的分析方面取得改进。
援引并入
本说明书中所提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度犹如具体地和单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请均通过引用而并入。
发明内容
本文描述的方法、设备、系统和装置可用于生物样品和其他样品的光学和图像分析或测量。
本文公开的实施方式包括样品架，其适合于保持样品，包括生物样品，以用于光学检查，用于光学测量以及用于其他检查和测量。在实施方式中，提供一种样品架，其具有光学透射部分和被配置用于在该样品架内提供光的内反射的部分。在实施方式中，内反射可包括部分内反射，还可包括光的全内反射。来自外部光源并且从样品架的一侧射入的入射光有效地从多个方向照射样品架内的样品。在实施方式中，安置于样品架的一侧的外部光源可以向样品架内的样品提供落射照射；可以向样品架内的样品提供透射照射；或者可以向样品架内的样品既提供落射照射又提供透射照射。
本文公开的实施方式包括这样的系统：其包括适合于保持样品的样品架。这样的系统适用于通过例如光学检查、光学测量来检查和测量样品，包括生物样品，以及用于其他检查和测量。在实施方式中，本文公开的系统包括样品架，该样品架具有光学透射部分和被配置用于在样品架内提供光的内反射的部分。在实施方式中，本文公开的系统的样品架内的内反射可包括部分内反射，还可包括光的全内反射。本文公开的系统可包括光源。来自样品架外部的光源并且从样品架的一侧射入的入射光有效地从多个方向照射样品架内的样品。在实施方式中，安置于样品架的外部并且处于其一侧的光源可以向样品架内的样品提供落射照射；可以向样品架内的样品提供透射照射；或者可以向样品架内的样品既提供落射照射又提供透射照射。本文公开的系统可包括一个检测器或多个检测器；这样的检测器可包括光学检测器，并可包括其他检测器。这样的检测器适合于并且被配置用于对样品架内的样品、样品的物体和特征以及样品内的物体进行测量；这样的测量可包括定性测量和定量测量。本文公开的系统的实施方式可包括滤光器、光圈、光栅、镜头和其他光学元件。本文公开的系统的实施方式可包括用于定位、移动及调节样品架、光源、镜头、滤光器或本文公开的系统的其他元件或组件的机械装置。本文公开的系统的实施方式可包括用于转移、等分、保持、加热、混合、染色、调节或以其他方式制备、操作或改变样品的组件和元件。本文公开的系统的实施方式可包括用于传送、固定、填充或以其他方式操纵样品架的组件和元件。本文公开的系统的实施方式可包括用于物理操作和处理样品以及用于物理操纵样品架的组件和元件；其中这样的组件和元件可包括但不限于移液管、泵、离心机、其他用于移动和操作样品、样品架、移液管尖端、器皿和与样品一起使用的试剂的机械装置，或其部分。本文公开的系统的实施方式可包括用于化学分析的组件和元件，该化学分析包括核酸分析、蛋白质分析、普通化学分析、电化学分析和样品或其部分的其他分析。
本文公开的样品架和系统可以在任何位置使用，且本文公开的方法可以在任何位置进行，该位置包括临床实验室、研究实验室、诊所、医院、医生办公室、服务点位置以及其他任何合适的位置。由本文公开的样品架保持的样品以及使用本文公开的系统和方法检查的样品包括任何生物样品，并且可以是小量的生物样品。在实施方式中，样品可以是小量的血液或尿液样品，并且可以具有小于约250μL或小于约150μL或小于约100μL或小于约50μL或小于约25μL或小于约15μL的体积，或者可以等于或小于由手指针刺获得的血液的体积。
在一个实施方式中，提供了一种测量样品内细胞群体的细胞中的感兴趣组分的方法，其包括：a)获得对该样品内细胞群体的细胞中存在的标记物的定量测量值；b)借助于计算机，基于部分a)的测量值，确定该样品中存在的细胞群体内的细胞的近似量；c)基于部分b)的结果，选择向该样品添加的试剂的量，其中该试剂与该细胞群体的细胞中的感兴趣组分特异性地结合，并且被配置为可容易地检测；d)基于部分c)的结果，向该样品添加选定的量的该试剂；e)针对与感兴趣组分结合的试剂对该样品中的细胞进行测定；以及f)基于与感兴趣组分结合的试剂的量，确定该样品的细胞群体的细胞中感兴趣组分的量。在该方法的一个实施方式中，部分c)的试剂是抗体。
申请人在此进一步公开了一种测量样品内细胞群体的细胞中的感兴趣组分的方法，其包括：a)获得对该样品内细胞群体的细胞中存在的标记物或细胞性质的定量测量值；b)借助于计算机，基于部分a)的测量值，确定该样品中存在的细胞群体内的细胞的近似量；c)向该样品添加一定量的细胞标记物，其中添加的所述细胞标记物的量基于部分b)的结果，并且其中该细胞标记物与该细胞群体的细胞中的感兴趣组分特异性地结合，且被配置为可容易地检测；d)针对与感兴趣组分结合的标记物对该样品中的细胞进行测定；以及e)基于与感兴趣组分结合的标记物的量确定该样品的细胞群体的细胞中感兴趣组分的量。
在另一个实施方式中，提供了一种对显微镜进行对焦的方法，其包括：a)将含有供显微镜分析的物体的样品与具有已知大小的参照颗粒混合，以生成含有该样品和参照颗粒的混合物；b)将步骤a)的混合物置于显微镜的光路中；c)使步骤a)的混合物暴露于配置用于对参照颗粒进行可视化的光束；以及d)基于该混合物内参照颗粒的位置或者基于该参照颗粒的图像的清晰度，对该显微镜进行对焦。
在又一个实施方式中，本文提供了一种鉴定含有多种细胞的样品中的细胞的方法，其包括：a)测定所述多种细胞中的细胞的至少一个以下方面：(i)细胞表面抗原的存在；(ii)细胞表面抗原的量；或(iii)细胞大小；b)测定a)中的细胞的至少一个以下方面：(i)细胞核大小；或(ii)细胞核形状；以及c)测定a)和b)中的细胞的定量细胞光散射，其中使用来自步骤a)、b)和c)的信息的组合来鉴定含有多种细胞的样品中的细胞。
在又一个实施方式中，本文提供了一种系统，其包括与保持待检查的样品的样品架一起使用的检测器组件。在一个非限制性示例中，该样品架是容槽，其内具有使得容槽能够接合并从一个位置移动到检测器组件的特征或材料。在一些实施方式中，该检测器组件具有配置成以一种方式与样品架的表面相接合的第一表面，该方式使得两者之间的界面对从检测器组件到样品架内的样品的光学路径不产生光学干扰。在一个实施方式中，在检测器组件上可以有一个以上的位置对应于一个或多个样品架。一些实施方式可具有相同的样品架对应于每一个位置。可选地，一些实施方式可具有不同的样品架对应于至少一些与检测器组件相关的位置。
在本文公开的一个实施方式中，提供了一种样品架，例如但不限于具有光学性质、尺寸、材料或物理特征的容槽，这使其能够支持样品以便通过检测器组件进行分析，同时使之保持与检测器组件物理分开而不直接接触。这对于其中含有成形组分的样品流体可能特别有用。
在本文公开的一个实施方式中，检测器组件可以是多通道显微镜检查单元，其被配置用于检测、获取或测量样品中的一种细胞或多种细胞的形状以及物理、光学和生物化学性质，所有这些都在同一个设备内。这既可以提供定量信息也可以提供描述性信息。该检测器组件的一个实施方式可以使用相同颜色或波长的多种标记物，其中该检测器组件被配置用于对源自样品中的(例如，与样品中的细胞结合的)这类标记物的信号进行解卷积，从而允许减少该组件内需要的光谱通道和光源的数目。
应当理解，本文的一些实施方式可包括样品架，例如但不限于在容槽材料的形状中具有增加暗视野照射的物理特征的容槽，其中一些特征被配置用于提供光反射(包括但不限于容槽内的光反射)，并且一些特征可以可选地被配置用于机械支撑；在实施方式中，一些特征可以提供机械支撑并且也提供光反射。在实施方式中，样品架被配置成通过样品架内的光反射向样品提供透射照射。在实施方式中，样品架被配置成通过样品架内的光反射向样品提供透射照射；这样的反射可包括部分内反射(PIR，也称为菲涅尔反射)，并且这样的反射可包括全内反射(TIR)。在实施方式中，样品架被配置成通过样品架内的光反射向样品提供透射照射，其中反射光的光源与用来检测和测量光的光学器件被安置在样品架的同一侧(例如，光源是落射照射光源)。
本文的系统可以同时在暗视野成像中使用落射(直接)和透射(反射)照射。这不同于传统的暗视野成像，后者使用落射照射或透视照射，但不会同时使用两种类型的照射，并且不会从单一光源或单一方向或位置进行两种类型的照射。因此，本文公开的落射和透射照射的组合不同于已知的系统，其中透射照射与落射照射源自于同一光源。可选地，可以使用成形的样品架如容槽来提供透射照射。在实施方式中，成形的样品架被配置用于通过光反射提供透射照射。在实施方式中，成形的样品架被配置用于通过样品架内的光反射提供透射照射。在实施方式中，成形的样品架的尺寸、形状、表面、材料或其他特征中的一个或多个有效地在该成形的样品架内提供光的内反射。在实施方式中，成形的样品架的尺寸、形状、表面、材料或其他特征中的一个或多个有效地在成形的样品架内提供光的部分内反射(PIR)。在实施方式中，成形的样品架的尺寸、形状、表面、材料或其他特征中的一个或多个有效地在成形的样品架内提供光的全内反射(TIR)。可选地，透射照射的强度是不可忽略的。在实施方式中，成形的样品架可包括有效增加透射照射光强度的反射表面。暗视野光源可以是发光二极管(LED)、激光或其他可以提供所需照射或激发波长的照射源。
在一个实施方式中，显微镜物镜与光源例如但不限于环形灯(用于暗视野显微术)的组合在它们之间具有允许形成用于检测器组件的紧凑尺寸的物理距离。在一个实施方式中，只有所需波长或在所需波长范围内的光才能射向样品。在一个实施方式中，该光是非偏振光。在另一个实施方式中，该光是偏振光。
在又一个实施方式中，从细胞计数测定获得的信息，无论是来自样品制备阶段还是来自分析阶段，均用来指导或触发继发规程。在实施方式中，这样的继发规程可以是提供让人直接检查的警报。在实施方式中，这样的继发规程可以是使用估计的细胞计数或在规程的样品制备步骤过程中获得的其他信息来指导进行测定，其中这样的测定可以是该规程的稍后步骤中的测定，或者可以是另一规程中的测定。
细胞计数技术还可以提供处理具有不均匀的形状或腔室表面的样品架的方式。一种方法包括使用：a)体积计量的通道技术将已知体积的样品引入分析区域，例如样品架中的通道内。该方法可包括对样品架中的所有细胞进行计数。由于知道样品的体积，因此也知道体积中细胞的浓度(这可以在疏水性容器或容槽或包含具有类似表面的腔室的样品架中进行)。另一种方法包括：b)基于比例的度量技术，以将样品与已知量的微珠混合，利用该技术基于观察到的微珠数目计算样品中的细胞浓度。
在本文描述的另一个实施方式中，提供了一种方法，其包括测量成形的血液组分，例如但不限于通过使RBC呈现基本为球形的形状来测量血液样品中的红细胞(RBC)体积，以及使用暗视野显微术测量RBC体积。
在本文描述的另一个实施方式中，提供了一种方法，其包括测量血小板体积。该方法可包括用荧光染料标记血小板并测量观察到的血小板的大小；将已知大小的微珠加入样品中；并将观察到的微珠图像的大小与观察到的血小板图像进行比较，用微珠作为校准来确定血小板的大小，并确定样品中血小板的体积。
在本文描述的进一步的实施方式中，提供了用于检测和测量样品中的细胞形态学、测量细胞数、检测颗粒、测量颗粒数、检测晶体、测量晶体数、检测细胞聚集体、测量细胞聚集体数目以及样品的或样品中的其他性质和量的方法。
因此，申请人在此公开了：
一种用于分析样品的系统，该系统包括：包含被配置用于保持所述样品的样品室的样品架，所述样品架的至少一部分包含光学透射材料，所述光学透射材料包含光学透射表面和反射表面；以及照射源，其被配置用于提供照射并穿过所述光学透射表面的光；其中所述样品架被配置成有效地使来自所述照射源的所述光向该样品架中的样品同时提供落射照射和透射照射，其中落射照射包含从所述照射源行进到所述样品，而在该样品架的光学透射材料的表面上没有反射的光，并且其中透射照射包含在该光学透射材料内行进，且在从所述光学透射材料的至少一个表面上经至少一次反射后到达该样品的光。在实施方式中，具有本文公开的特征的系统的样品架可包含具有配置用于保持样品的细长通道的容槽。在实施方式中，该样品架可具有一个或多个光学非透射表面。
在本文公开的系统的实施方式中，所述透射照射可以至少部分地由光在表面上的内反射所提供，并且可以至少部分地由光在容槽内的全内反射所提供。在本文公共的系统的实施方式中，所述透射照射可以至少部分地由光在表面上的部分内反射所提供，并且可以至少部分地由光在容槽内的部分内反射所提供。
在实施方式中，样品架可以具有两个或更多个用于保持样品的样品室。具有本文公开的特征的样品架，例如容槽，可以具有矩形的水平横截面形状；可以具有圆形的水平横截面形状；可以具有锯齿形的垂直横截面形状；可以具有阶梯形的垂直横截面形状；或者可以具有另一种形状。
在实施方式中，样品架可以相对于照射源是可移动的，并且可以可移动至多个位置，其中该样品架的光学透射表面在每个位置都可以被照射源照射。
在实施方式中，照射源可包括环形灯。在实施方式中，环形灯可选自基于发光二极管(LED)的环形灯和基于激光的环形灯。
在实施方式中，本文公开的系统可以包括支撑结构，该支撑结构具有其形状设置为与样品架的光学透射表面相接合的光学透射表面。
在实施方式中，本文公开的系统可以具有压迫设备，该压迫设备被配置用于将样品架保持在所需位置，以便被所述照射源照射。
在实施方式中，本文公开的系统可以包括检测器，该检测器被配置用于对样品架中的通道的至少一部分进行成像。
在实施方式中，本文公开的样品架可包括被配置用于容纳样品的至少一部分的细长通道，并且其中检测器被配置用于对样品架中的整个细长通道进行成像。
在实施方式中，本文公开的样品架可以被配置为在成像期间以静止的、非流动方式保持样品；在实施方式中，样品架可以被配置为以静止的、非流动方式保持样品的一部分，而以流动方式保持样品的另一部分。
在实施方式中，本文公开的照射源可以相对于样品架是可移动的。
在实施方式中，本文公开的样品架可以被配置成在成像期间以流动方式保持样品。
在实施方式中，本文公开的样品架可以包括完全限制在该样品架内的流体回路，并且其中样品位于所述流体回路内，有效地使该样品与所述检测器保持分开。
在实施方式中，本文公开的样品架相对于检测器是可移动的。在实施方式中，本文公开的检测器相对于样品架是可移动的。
在实施方式中，本文公开的样品架和照射源包含光学分析单元的至少一部分，并且所述系统进一步包括被配置用于对样品进行临床分析的临床分析单元。
在实施方式中，本文公开的系统被配置用于向光学分析单元和临床分析单元提供单一样品的等分试样，有效地使临床分析单元和光学分析单元可以同时对样品的部分进行光学分析和临床分析。在实施方式中，这样的临床分析可以选自普通化学分析、核酸分析和酶联结合分析。
在实施方式中，本文公开的系统可以包括多个临床分析单元，其中这些临床分析单元中的每一个都被配置用于提供选自普通化学分析、核酸分析和酶联结合分析的临床分析。
申请人进一步提供了一种容槽，其包含被配置用于保持样品的样品室，所述容槽的至少一部分包含光学透射材料，所述光学透射材料包含光学透射表面和反射表面，其中所述光学透射表面和所述反射表面被配置成有效地使穿过该光学透射表面的光向该样品室中的所述样品同时提供落射照射和透射照射，其中落射照射包含从所述照射源行进到该样品，而在该光学透射材料的表面上没有反射的光，并且其中透射照射包含在该光学透射材料内行进，且在从所述光学透射材料的至少一个表面上经至少一次反射后到达该样品的光。
在实施方式中，本文公开的容槽具有包含细长通道的样品室。在实施方式中，本文公开的容槽包含两个或更多个用于保持样品的样品室。在实施方式中，容槽可包含弯曲的通道，包括U形通道。在实施方式中，容槽可包含多个通道。在实施方式中，样品室包含入口端口。在实施方式中，样品室包含有效地使空气或气体进入或离开(例如，在用样品填充该室过程中)的通气孔。在实施方式中，入口端口可以包含或者可以充当通气孔。在实施方式中，通气孔可以包含或覆盖有有效地减少或防止保持在通道内的流体蒸发的膜。在实施方式中，容槽的细长通道可以包含覆盖有多孔膜的通气孔，该多孔膜有效地减少或防止保持在通道内的流体的蒸发。在实施方式中，在容槽的制造中可以使用粘合剂、用粘合层涂覆在一侧或两侧的膜、超声焊接或其组合。
在实施方式中，本文公开的容槽可以具有一个或多个光学非透射表面。
在实施方式中，可以在本文公开的容槽中至少部分地由光在容槽内的内反射提供透射照射。在实施方式中，可以在本文公开的容槽中至少部分地由光在容槽表面上的部分内反射提供透射照射。在实施方式中，可以在本文公开的容槽中至少部分地由光在容槽表面上的全内反射提供透射照射。
在实施方式中，本文公开的容槽可以具有矩形的水平横截面形状；在实施方式中，本文公开的容槽可以具有圆形的水平横截面形状。在实施方式中，本文公开的容槽可以具有锯齿形的垂直横截面形状；在实施方式中，本文公开的容槽可以具有阶梯形的垂直横截面形状。
申请人在此公开了方法。例如，申请人在此公开了一种鉴定包含多种细胞的样品中的细胞的方法，其包括：(a)将所述样品置于包含配置用于保持该样品的样品室的样品架内，所述样品架的至少一部分包含光学透射材料，所述光学透射材料包含光学透射表面和反射表面，其中所述光学透射表面和所述反射表面被配置成有效地使穿过该光学透射表面的光向该样品室中的样品同时提供落射照射和透射照射，其中落射照射包含从所述照射源行进到该样品，而在该光学透射材料的表面上没有反射的光，并且其中透射照射包含在该光学透射材料内行进，且在从所述光学透射材料的至少一个表面上经至少一次反射后到达该样品的光；(b)照射所述样品架以有效地向该样品同时提供落射照射和透射照射；以及(c)鉴定该样品中的细胞。在实施方式中，本文公开的方法包括以下方法，其中所述鉴定包括用配置用于对所述样品室的至少一部分进行成像的检测器鉴定所述细胞。在本文公开的实施方式中，用于这类方法的样品室可以包含细长通道。
申请人在此进一步公开了一种对显微镜进行对焦的方法，其包括：a)将含有供显微镜分析的物体的样品与具有已知大小的参照颗粒混合，其有效地生成含有该样品和参照颗粒的混合物；b)将步骤a)的混合物置于显微镜的光路中；c)使步骤a)的混合物暴露于配置用于对参照颗粒进行可视化的光束；以及d)基于该混合物内参照颗粒的位置或者基于该参照颗粒的图像的清晰度，对该显微镜进行对焦。
申请人在此进一步公开了处理样品的方法，其包括将样品直接与包含微珠和抗体的试剂混合，其中该微珠具有已知的大小和已知的浓度，并且该抗体可用于标记样品内的靶标。在实施方式中，申请人公开了处理血液样品的方法，其包括将全血样品与包含微珠和抗体的试剂混合，其中该微珠具有已知的大小和已知的浓度，并且该抗体可用于标记样品内的血细胞。此类方法提供了提高的样品分析准确度和精确度，例如，提高的血细胞数和特性的准确度和精确度，并且减少了样品分析对由样品转移、混合和等分引起的不准确性的敏感性。在一个非限制性实施方式中，如果细胞与微珠之比已知并且该比例在每个稀释步骤中得到保持，则通过分析样品中微珠的数目，可以推断细胞的数目。应当理解，由于样品分配和稀释剂分配，每个稀释步骤可能有差异。通过从加入了未被稀释的样品的微珠和试剂的溶液开始，只要成形的组分(例如但不限于微珠和细胞)的此例不变，所述系统对分配步骤的不准确性变得不敏感。
申请人在此公开了一种鉴定含有多种细胞的样品中的细胞的方法，其包括：a)测定所述多种细胞中的细胞的至少一个以下方面：(i)细胞表面抗原的存在；(ii)细胞表面抗原的量；或(iii)细胞大小；b)测定a)中的细胞的至少一个以下方面：(i)细胞核大小；或(ii)细胞核形状；以及c)测定a)和b)中的细胞的定量细胞光散射，其中使用来自步骤a)、b)和c)的信息的组合来鉴定含有多种细胞的样品中的细胞。
在本文描述的至少一个实施方式中，一种用于对样品进行成像的系统，该系统包括：包含所述样品的样品器皿；载物台，其包含具有光学透明表面的样品器皿接收部；光源，其用于通过该载物台照射该样品中的成形组分，其中该样品器皿具有界面表面，该界面表面被配置成与该样品器皿接收部的光学透明表面相接合，由此该界面表面与该光学透明表面相符合，而穿过该界面表面的光没有明显的畸变。
应当理解，本文的实施方式可以被配置成包括一个或多个以下特征。例如，样品器皿的界面表面可以由聚合物材料形成。可选地，这可以是透明材料。可选地，样品器皿的界面表面由此用来形成样品器皿接收部的光学透明表面的材料更软的材料形成。可选地，提供了压迫单元，该压迫单元用于施加压力，以使界面表面符合被配置成与样品器皿接收部的光学透明表面相符的形状。可选地，处理单元可以被配置成与样品器皿相耦合，以促进样品器皿加载至及离开载物台的传送，并提高样品器皿的机械刚性。可选地，处理单元可以是被配置成与样品器皿相耦合的光学不透明单元。可选地，处理单元可以由物理特征、突起等形成，以促进与自动操纵器、移液管单元或其他机械转移器的接合。可选地，该处理单元可以由磁性、电磁性或其他特征形成，以促进接合或脱离。可选地，样品的所有成像可以在不需要使光基本呈直线地穿过一个表面并从对侧表面穿出而到达检测器的情况下进行。可选地，所述光源不位于样品器皿的一侧来将光传输到该样品器皿的对侧的检测器。
在一个非限制性示例中，所述容槽可以具有多个通道，其中至少一些通道具有不同的横截面宽度或其他横截面尺寸。可选地，一些容槽也可以具有许多不同的通道形状。可选地，一些实施方式可以具有当从上向下观察时具有螺旋构型的至少一个通道。可选地，一些实施方式可以具有形成为同心圆、同心椭圆和/或同心多边形的多个通道。一些实施方式可以具有容槽通道，其中至少两个具有不同的长度。
在实施方式中，亲水性填充模式或疏水性填充模式可以用于所述容槽。大多数微流体依赖于毛细管作用(亲水性的)来填充容槽中的通道。相反，本文的至少一些实施方式可以使用疏水性填充模式。在疏水性填充模式的一个非限制性示例中，液体分配尖端与容槽的至少一个端口形成密封，并且该尖端可用于在正压力下将液体推入容槽通道中，其中在容槽中的通道的末端或其他部分处一般具有通气孔，以促进该类型的液体填充。通过在通道的全部或部分中使用疏水性表面，人们可以通过控制压力来控制液体进入通道多远。在疏水性填充模式中使用的容槽的一个非限制性示例中，容槽的顶层可以是丙烯酸的，并且容槽的底部是不同的材料。在一个实施方式中，容槽的底部可以限定通道的三个侧面(底部和两侧)，而覆盖层限定通道的顶部表面。大多数光学透明材料是疏水的，所以为了用这些材料来实施，使用基于压力的填充技术可以促进这些类型的通道的填充。
应当理解，可以修改本公开内容中的实施方式，以使之具有本公开内容中描述的一个或多个特征。
提供本发明内容是为了以简化形式介绍概念的选择，这些概念在以下具体实施方式中进一步描述。本发明内容并非旨在确定请求保护的主题的关键特征或基本特征，也并非旨在用于限制请求保护的主题的范围。
附图说明
图1A显示了混合细胞的侧向散射强度(x-轴)相对于荧光强度的图，该混合细胞包括用可识别CD16的荧光结合剂标记的自然杀伤细胞和嗜中性粒细胞。
图1B显示了一张条形图，其示出了自然杀伤细胞(“NK”)和嗜中性粒细胞(“Neu”)的细胞核面积与所有细胞面积的比例。
图1C显示了用抗-CD16抗体(左列)和细胞核染色剂(右列)染色的自然杀伤细胞；
图1D显示了用抗-CD16抗体(左列)和细胞核染色剂(右列)染色的嗜中性粒细胞。
图2A显示了用荧光偶联的抗CD41和CD61抗体标记的血小板(亮点)。
图2B显示了在10倍(左)和20倍(右)放大倍数下，荧光标记的血小板的图像的强度分布。
图2C显示了荧光标记的血小板的强度分布，示出了测量的强度(浅灰色)和该测量的强度的曲线拟合(深灰色)。
图3显示了一张曲线图，其示出了标准颗粒的标称直径(μm)(x-轴)与基于荧光强度的大小测量值(任意单位，a.u.；y-轴)之间的关系。该图还显示了在沿该曲线的不同点处的代表性微珠。
图4A显示了在仅允许落射照射的容槽中通过暗视野显微术成像的球形红细胞。
图4B显示了在允许混合的落射和透射照射的容槽中通过暗视野显微术成像的球形红细胞。
图5A显示了用抗-CD16抗体和细胞核染色剂染色的推定的带状核嗜中性粒细胞。
图5B显示了用抗-CD16抗体和细胞核染色剂染色的推定的分叶核嗜中性粒细胞。
图6A显示了光学系统的实施方式，其适合作为本文公开的设备或系统的一部分，并且适用于本文公开的方法，包括示例性的光学器件(例如，显示为环形灯的光源，和物镜)、容槽和配置用于保持并定位容槽以供成像的支撑结构。在这个实施方式中，该容槽具有矩形的水平横截面形状。
图6B显示了光学系统的实施方式，其适合作为本文公开的设备或系统的一部分，并且适用于本文公开的方法，包括示例性的光学器件(例如，显示为环形灯的光源，和物镜)、容槽和配置用于保持并定位容槽以供成像的支撑结构。在这个实施方式中，该容槽具有圆形的水平横截面形状。
图7A显示了光学系统的实施方式，其适用于本文公开的设备或系统，并且适用于本文公开的方法。
图7B显示了光学系统的实施方式，其适用于本文公开的设备或系统，并且适用于本文公开的方法，包含适合于限制到达检测器的散射光角度范围的另外的透镜和光圈。
图8A提供了光学系统的实施方式的视图，包括用于保持容槽以供对样品进行成像的支撑结构，其中来自环形灯照射系统的光直接落在样品上(落射照射)，并且光还从容槽的特征上反射，以便提供透射照射。在这个实施方式中，该容槽具有阶梯形的垂直横截面形状。
图8B提供了光学系统的实施方式的视图，包括用于保持容槽以供对样品进行成像的支撑结构，其中来自环形灯照射系统的光直接落在样品上(落射照射)，并且光还从容槽的特征上反射，以便提供透射照射。如图所示，入射光可在表面处完全反射(全内反射，TIR)，或者仅有入射光的一部分可在表面处反射(部分内反射，PIR)。在这个实施方式中，该容槽具有锯齿形的垂直横截面形状。
图8C显示了光学系统的实施方式，其适合作为本文公开的设备或系统的一部分，并且适用于本文公开的方法，包括示例性的光学器件(例如，显示为环形灯的光源，和物镜)、容槽和配置用于保持并定位容槽以供成像的支撑结构。在这个实施方式中，该容槽包括对照射该容槽和该容槽内的样品的光路具有影响的特征。
图8D显示了光学系统的实施方式，其适合作为本文公开的设备或系统的一部分，并且适用于本文公开的方法，包括示例性的光学器件(例如，以横向射出光的光源)、容槽和配置用于保持并定位容槽以供成像的支撑结构。在这个实施方式中，该容槽包括对照射该容槽和该容槽内的样品的光路具有影响的特征。
图8E提供了容槽从样品制备位置向接近光学检测器(标记为D)的样品观察位置传送的示意图。
图8F提供了系统的进一步的、详细的示意图，该系统包括用于将容槽从样品制备位置传送到接近光学检测器的样品观察位置的传送机构。
图9A是一幅暗视野图像，其显示了从全血中获得的代表性血细胞的图像。图9中的其他图也是从全血中获得的血细胞的代表性图像，其中使用了不同的成像技术和染料。
图9B是显示从附着在单核细胞上的标记的抗-CD14抗体发出的荧光的图像。
图9C是显示从附着在嗜碱性粒细胞上的标记的抗-CD123抗体发出的荧光的图像。
图9D是显示从附着在嗜中性粒细胞上的标记的抗-CD16抗体发出的荧光的图像。
图9E是显示从附着在白细胞上的标记的抗-CD45抗体发出的荧光的图像。
图9F是显示用细胞核染色剂染色的白细胞和血小板细胞的图像(缺乏细胞核的红细胞不被染色)。
图10是显示了从全血中获得的血细胞的代表性图像的合成图像，示出了单核细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜中性粒细胞。
图11A显示了通过将CD14标记强度(FL-17)相对于散射强度(FL-9)作图而对单核细胞的鉴定。该图像和图11B-11D中的其他图像显示了从用不同标记物(针对不同细胞表面标记物或其他标记物的标记的抗体)标记的细胞上检测到的荧光的图形；这样的多重标记方法对鉴定细胞是有用的。
图11B显示了通过将CD123强度(FL-19)相对于CD16强度(FL-15)作图而对嗜碱性粒细胞的鉴定。
图11C显示了通过将CD16强度(FL-15)相对于CD45强度(FL-11)作图而对淋巴细胞的鉴定。
图11D显示了通过将CD16强度(FL-15)相对于散射强度(FL-9)作图而对嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的鉴定。
图12A将通过本发明方法获得的白细胞计数相对于利用商用血液分析仪获得的白细胞计数作图。图12A-12F显示了通过本发明方法获得的(从同一血液样品的等分试样测量的)细胞计数与通过其他方法(使用商用血液分析仪)获得的细胞计数的比较。
图12B将通过本发明方法获得的红细胞计数相对于利用商用血液分析仪获得的红细胞计数作图。
图12C将通过本发明方法获得的血小板计数相对于利用商用血液分析仪获得的血小板计数作图。
图12D将通过本发明方法获得的嗜中性粒细胞计数相对于利用商用血液分析仪获得的嗜中性粒细胞计数作图。
图12E将通过本发明方法获得的单核细胞计数相对于利用商用血液分析仪获得的单核细胞计数作图。
图12F将通过本发明方法获得的淋巴细胞计数相对于利用商用血液分析仪获得的淋巴细胞计数作图。
图13A显示了使用显微术获得的白细胞(WBC)的暗视野图像。图13A-13E显示了使用显微术获得的WBC图像，用于进行连续分割分析以确定每个细胞的轮廓并由此将细胞图像从背景图像中区分出来。
图13B是示出了用抗-CD45抗体标记细胞的荧光图像。
图13C是示出了用细胞核染色剂标记细胞的荧光图像。
图13D是示出了用抗-CD16抗体标记细胞的荧光图像。
图13E是示出了用抗-CD123抗体标记细胞的荧光图像。
图14A是使用显微术获得的白细胞(WBC)的暗视野图像。图14A-14E示出了使用显微术获得的WBC图像，与图13一样，用于进行连续分割分析以确定每个细胞的外(例如，细胞膜)和内(例如，细胞核)轮廓，并由此鉴定细胞核以及将细胞的感兴趣区域(细胞ROI)从背景区域中区分出来。如通过连续分割分析所确定的，细胞图像内的线确定每个细胞的WBC核的边界。
图14B是示出了用抗-CD45抗体标记细胞的荧光图像。
图14C是示出了用细胞核染色剂标记细胞的荧光图像。
图14D是示出了用抗-CD16抗体标记细胞的荧光图像。
图14E是示出了用抗-CD123抗体标记细胞的荧光图像。
图15A是图13和14所示的细胞的合成图像，其具有通过进行一次分水岭分割而获得的细胞轮廓。图15A和15B示出了图13和14所示的白细胞(WBC)的合成图像。
图15B是对图13和14所示的细胞的合成图像应用本文所述的连续分割的结果，示出了通过该分析获得的细胞轮廓。
具体实施方式
可以帮助理解本文公开的设备、系统和方法的完整范围和优势的描述和公开内容可见于，例如，美国专利7,888,125；美国专利8,088,593；美国专利8,158,430；美国专利8,380,541；2013年7月25日提交的PCT申请号PCT/US2013/052141；2012年9月25日提交的PCT申请号PCT/US2012/057155；2011年9月25日提交的PCT申请号PCT/US2011/053188；2011年9月25日提交的PCT申请号PCT/US2011/053189；2013年12月5日提交的美国专利申请序列号14/098,177；2013年7月25日提交的美国专利申请序列号13/951,063；2013年7月25日提交的美国专利申请序列号13/951,449；2013年2月18日提交的美国专利申请序列号13/769,798；2013年2月18日提交的美国专利申请序列号13/769,779；2013年2月18日提交的美国专利申请序列号13/769,818；2013年2月18日提交的美国专利申请13/769,820；2012年1月20日提交的美国专利申请序列号13/355,458；2011年9月26日提交的美国专利申请序列号13/244,947；2011年9月26日提交的美国专利申请序列号13/244,946；2011年9月26日提交的美国专利申请13/244,949；2011年9月26日提交的美国专利申请13/244,950；2011年9月26日提交的美国专利申请13/244,951；2011年9月26日提交的美国专利申请13/244,952；2011年9月26日提交的美国专利申请13/244,953；2011年9月26日提交的美国专利申请13/244,954；2011年9月26日提交的美国专利申请13/244,956；2011年9月26日提交的美国专利申请序列号61/673,245；2012年7月25日提交的美国专利申请序列号61/675,811；2012年7月26日提交的美国专利申请序列号61/676,178；2012年9月6日提交的美国专利申请61/697,797；2013年2月18日提交的美国专利申请61/766,113；2013年2月18日提交的美国专利申请61/766,116；2013年2月18日提交的美国专利申请61/766,076；2013年3月15日提交的美国专利申请61/786,351；2013年3月15日提交的美国专利申请序列号61/802,194；2013年6月19日提交的美国专利申请序列号61/837,151；2014年1月29日提交的美国专利申请61/933,270；2014年1月22日提交的美国专利申请61/930,419；2014年1月22日提交的美国专利申请14/161,639；以及2014年1月29日提交的美国专利申请14/167,264，所有这些专利和专利申请的公开内容均通过引用而整体并入本文。
应当理解，前文的概括性描述和以下的详细描述都仅仅是示例性的和解释性的，而不对所请求保护的本发明构成限制。可以注意到，如本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代对象，除非上下文另有明确规定。因此，举例而言，提到“一种材料”可包括多种材料的混合物，提到“一种化合物”可包括多种化合物，等等。本文引用的参考文献通过引用而整体并入于此，除非它们与本说明书中明确阐述的教导相冲突。
除非另有明确说明，或除非上下文另外指明，本文所用的术语“或”的含义同时包括转折(“或”)和连接(“和”)的含义。
在接下来的说明书和权利要求书中，将会提到一些术语，这些术语应被定义为具有以下含义：
“可选的”或“可选地”意指随后描述的事件可能发生或者可能不发生，从而该描述包括发生该事件的情况和不发生该事件的情况。例如，如果设备可选地包含针对样品收集单元的特征，这意味着该样品收集单元可能存在或者可能不存在，并且因此，该描述同时包括其中设备具有该样品收集单元的结构和其中不存在该样品收集单元的结构。
如本文所用的，术语“基本上的”意指多于最小的或不显著的量；并且“基本上地”意指超出最小地或不显著地。因此，举例而言，如本文所用的短语“基本上不同的”表示两个数值之间有足够高的差异程度，以至于本领域技术人员将会认为这两个值之间的差异在由所述值所测量的特性的背景内具有统计显著性。因此，作为参考值或此较值的函数，两个基本上不同于彼此的值之间的差异通常大于约10％，并且可大于约20％，大于约30％，大于约40％，或大于约50％。
如本文所用的，“内反射”是指在一种材料(第一材料)内，在第一材料与另一材料(第二材料)之间的边界处的光反射。例如，第一材料可以是固体，例如玻璃或塑料，而第二材料可以是，例如，空气。内反射的光在被反射之前在第一材料内行进。内反射可以是部分的(部分内反射：PIR)或完全的(全内反射：TIR)。因此，所有在表面处入射的光被反射回第一材料内的内反射是TIR；而不是所有在表面处入射的光都被反射回材料内的内反射是PIR。(对于PIR，一些光可以穿过边界，而一些光在表面处被反射回该材料内。)入射角是确定内反射程度的重要因素；它是所测量的入射光线与垂直于边界表面的直线之间的角度。是否发生TIR取决于光线相对于第一材料与第二材料间边界的表面的入射角、第一材料的折射率、第二材料的折射率以及其他因素(例如光的波长可影响TIR，因为折射率通常随波长而变化)。光线被完全内反射的角度被称为临界角；入射角大于临界角的入射光将被完全地内反射(将保留在材料内：TIR)。然而，对于PIR，入射角小于临界角的入射光中的一部分也将被内反射(剩余的光被折射并穿出第一材料进入第二材料)。
如本文所用的，“样品”可以是但不限于血液样品，或尿液样品，或其他生物样品。样品可以是，例如，血液样品(例如，由手指针刺或静脉穿刺获得的样品，或动脉血样品，并且可以是全血、血清、血浆或其他血液样品)、尿液样品、活检样品、组织切片、粪便样品或其他生物样品；水样品、土壤样品、食物样品、空气样品；或其他样品(例如，鼻拭子或鼻咽冲洗液、唾液、尿液、泪液、胃液、脊髓液、粘液、汗液、耳垢、油、腺体分泌物、脑脊髓液、组织、精液、宫颈分泌物、阴道分泌物、滑液、咽拭子、呼吸物、毛发、指甲、皮肤、活检物、胎盘液、羊水、脐带血、淋巴液、腔液、痰、粘液、脓、微生物群样品、胎粪、乳汁或其他分泌物)。
因此，如本文所用的，“样品”包括血液、尿液或其他生物样品的一部分，可以是任何合适的尺寸或体积，并且优选地是小尺寸或体积。在本文公开的系统、测定和方法的一些实施方式中，可以使用小体积血液样品或者不超过小体积的血液样品的部分来进行测量，其中小体积包括不超过约5mL；或者包括不超过约3mL；或者包括不超过约2mL；或者包括不超过约1mL；或者包括不超过约500μL；或者包括不超过约250μL；或者包括不超过约100μL；或者包括不超过约75μL；或者包括不超过约50μL；或者包括不超过约35μL；或者包括不超过约25μL；或者包括不超过约20μL；或者包括不超过约15μL；或者包括不超过约10μL；或者包括不超过约8μL；或者包括不超过约6μL；或者包括不超过约5μL；或者包括不超过约4μL；或者包括不超过约3μL；或者包括不超过约2μL；或者包括不超过约1μL；或者包括不超过约0.8μL；或者包括不超过约0.5μL；或者包括不超过约0.3μL；或者包括不超过约0.2μL；或者包括不超过约0.1μL；或者包括不超过约0.05μL；或者包括不超过约0.01μL。
在实施方式中，通过手指针刺采集的样品的体积可以是，例如，约250μL或更少，或约200μL或更少，或约150μL或更少，或约100μL或更少，或约50μL或更少，或约25μL或更少，或约15μL或更少，或约10μL或更少，或约10μL或更少，或约5μL或更少，或约3μL或更少，或约1μL或更少。
如本文所用的，术语“服务点位置”可以包括受试者可在其中接受服务(例如，检测、监测、治疗、诊断、指导、样品收集、ID验证、医疗服务、非医疗服务等)的位置，并且可以包括但不限于受试者的住所、受试者的工作场所、医疗保健提供者(例如，医生)的位置、医院、急诊室、手术室、诊所、医疗保健专业人员的办公室、实验室、零售商[例如药房(例如，零售药房、临床药房、医院药房)、药店、超市、杂货店等]、交通工具(例如，轿车、舟船、卡车、公共汽车、飞机、摩托车、救护车、移动单元、消防车/救火车、应急车辆、执法车辆、警车或者被配置用于将受试者从一个点传送到另一点的其他运载工具等)、巡回医护单元、移动单元、学校、日托中心、安检地点、作战地点、医疗辅助生活住所、政府机关、办公建筑、帐篷、体液样品采集地点(例如，血液采集中心)、受试者可能希望进入的地点的入口处或其附近的场所、受试者可能希望访问的设备处或其附近的场所(例如，计算机的位置——如果受试者希望访问该计算机)、样品处理设备接收样品的位置，或者本文其他地方描述的任何其他服务点位置。
在生物样品的语境下所使用的术语“细胞”包括尺寸大体上与单个细胞相似的样品，包括但不限于囊泡(诸如脂质体)、细胞、病毒体以及与诸如微珠、纳米颗粒或微球等小颗粒相结合的物质。
如本文所用的，术语“结合”是指两种材料之间的反应或相互作用，其导致这两种物质的紧密组合；例如，配体与受体之间的反应，其中该配体变得与该受体牢固地连接，就提供了一个结合的例子。抗体与其靶抗原之间的组合，以及载体蛋白与其负载物之间的组合，例如内在因子与维生素B之间的组合，都是一种物质与另一种物质结合的反应的进一步示例。
如本文所用的，术语“结合剂”通常是指能够牢固地或特异性地与靶标结合的任何化合物或大分子，例如抗体。结合剂包括但不限于抗体(多克隆或单克隆的，抗体片段、免疫粘附素以及其他这样的抗体变体和模拟物)、自然结合蛋白质(例如，对维生素B12有特异性的内在因子蛋白质)、与其目标受体结合的配体、与特定酶结合的底物、结合对如亲合素和生物素、与靶分子牢固且特异性地结合的小分子，等等。细菌、病毒、合成支架以及其他结合或粘附于特定物体和材料可以用作结合剂。结合剂可以是或者可包括或者可连接至标记物，如染料或荧光团或其他可检测的部分。
如本文所用的，“标记物”是一种可检测的物质，其存在使得靶标变为可见或以其他方式可检测到；或者其在某位置或地点的存在指示了靶标在该位置或地点的存在。标记物可用来标记细胞、结构、颗粒或其他靶标，并且可用于检测、确定存在、定位、鉴定、量化或以其他方式测量样品中的靶标或样品的性质。标记物可包括但不限于染色剂、染料、配体、抗体、颗粒以及其他可结合或定位于特定靶标或位置的物质；可以生长于或定位于特定靶标或位置的细菌、病毒或细胞液也可以用作标记物；细胞或其他靶标的可检测的属性或性质也可以用作标记物。
如本文所用的，术语“染色剂”和“染料”可以互换，是指使得样品中的物体或组分比没有经过染色剂或染料处理时更容易被检测到的元素、化合物和大分子。例如，用DNA染料如碘化丙啶处理血液样品使有核细胞的细胞核更为可见，并且使这类细胞的检测和量化此不处理时更容易，甚至在存在无核细胞(例如红细胞)时依然如此。
如本文所用的，术语“表面活性剂”是指有效减少液体如水的表面张力的化合物。表面活性剂通常是两亲性化合物，同时具有亲水性和疏水性，并且可以有效地帮助其他化合物的溶解。表面活性剂可以是，例如，亲水性表面活性剂、亲脂性表面活性剂或其他化合物，或其混合物。一些表面活性剂包含长链脂肪族碱或酸的盐，或亲水性部分如糖。表面活性剂包括阴离子型、阳离子型、兼性离子型以及非离子型化合物(其中术语“非离子型”是指在溶液中不电离的分子，即，为“电离”惰性的)。示例性的可商购的两亲性化合物包括TergitolTM非离子型表面活性剂；DowfaxTM阴离子型表面活性剂；聚乙二醇及其衍生物，包括TritonTM表面活性剂；聚山梨醇酯(聚乙烯失水山梨醇)如化合物，和泊洛沙姆(例如，环氧乙烷/环氧丙烷嵌段共聚物)如化合物；硬脂酸盐及其衍生物；月桂酸盐及其衍生物；油酸盐及其衍生物；磷脂及其衍生物；溶血磷脂及其衍生物；甾醇及其衍生物；及其组合。
如本文所用的，“检测器”可以是提供来自信号、图像的信息或其他与靶标如样品相关的信息的任何设备、仪器或系统。可检测的信号和信息可包括，例如，光学、电学、机械、化学、物理或其他信号。检测器可以是，例如，光学检测器或电学检测器或化学检测器或电化学检测器或声学检测器或温度检测器或机械检测器或其他检测器。
如本文所用的，“光学检测器”检测电磁辐射(例如光)。光学检测器可以检测图像或与图像一起使用，或者可以检测光强度而不考虑图像，或者检测二者。光学检测器可以检测或测量光强度。一些光学检测器可能对检测或测量特定波长或波长范围是敏感的或限制于此。例如，光学检测器可包括，例如，光电二极管检测器、光电增倍管、电荷耦合设备、激光二极管、分光光度计、相机、显微镜或测量(单一波长的、多个波长的或一个范围或多个范围的光波长的)光强度、形成图像或二者兼具的其他设备。
如本文所用的术语“倍性”是指细胞内的DNA的量，并且指对样品内细胞的DNA含量的测定和测量。倍性测量提供了一种测度，该测度是关于细胞或细胞群体是否具有正常或异常的DNA量，或者由于DNA在细胞分裂和增殖期间复制，群体中是否有正常数目的细胞正在增殖。倍性测量可以在用DNA特异性染料对样品内的有核细胞进行染色后通过成像技术来进行。
定量显微术
在一些实施方式中，本文提供了用于定量显微术的方法、系统和设备。定量显微术可以涉及定量荧光显微术、定量暗视野显微术、定量亮视野显微术和定量相差显微术方法中的一种或多种，以测量一种或多种细胞属性。这些方法中的任何方法都可提供关于细胞的形态测定信息。这类信息可以定量测量。在一些实施方式中，对于定量显微术，通过定量荧光显微术、定量暗视野显微术、定量亮视野显微术和定量相差显微术中的两种或更多种来分析样品。定量显微术可以包括使用图像分析技术或统计学习和分类方法来处理通过显微术获得的图像。
在定量显微术中可以测量多种不同的细胞属性。可以测量的细胞属性包括但不限于：
物理属性：例如，细胞大小、体积、传导性、低角度和高角度散射以及密度。其他可以测量或量化的物理属性包括但不限于细胞或颗粒的圆度、细胞或颗粒的纵横比、细胞或颗粒的周长、细胞或颗粒的凸度、细胞或颗粒的粒度、细胞或颗粒的图像强度、细胞或颗粒的高度(例如，穿过几个焦平面的大小)、细胞或颗粒的平坦度以及其他物理属性。
形态学属性：例如，细胞形状、面积、大小和分叶性；细胞核形状、面积、大小和分叶性；线粒体形状、面积、大小和分叶性；以及细胞核体积与细胞体积之比。
细胞内属性：例如，细胞核质心/细胞质心距离(即细胞核中心与细胞中心之间的距离)；细胞核核叶质心距离(即细胞核的不同核叶的中心之间的距离)；细胞内蛋白质(例如肌动蛋白、微管蛋白等)的分布；细胞内细胞器(例如溶酶体、线粒体等)的分布；蛋白质与其他蛋白质和细胞器的共定位，以及其他属性。
生物化学属性：例如，细胞蛋白质、细胞表面蛋白质、胞质蛋白质、核蛋白质、细胞核酸、细胞表面核酸、胞质核酸、细胞核核酸、细胞碳水化合物、细胞表面碳水化合物、胞质碳水化合物和细胞核碳水化合物的表达水平。
在一些实施方式中，本文提供了用于定量测量样品内细胞的两种、三种、四种、五种或更多种属性的方法、系统和设备，其中这些属性选自物理属性、形态学属性、细胞内属性和生物化学属性。在一些实施方式中，本文提供了用于定量测量样品内细胞的两种、三种、四种、五种或更多种属性的方法、系统和设备，其中这些属性选自：细胞大小、细胞体积、细胞传导性、细胞低角度光散射、细胞高角度光散射、细胞密度、细胞形状、细胞面积、细胞分叶性、细胞核形状、细胞核面积、细胞核大小、细胞核分叶性、线粒体形状、线粒体面积、线粒体大小、线粒体分叶性、细胞核体积与细胞体积之比、细胞核质心/细胞质心距离、细胞核核叶质心距离、细胞内蛋白质(例如肌动蛋白、微管蛋白等)的分布；细胞内细胞器(例如溶酶体、线粒体等)的分布、细胞蛋白质的表达水平、细胞表面蛋白质的表达水平、胞质蛋白质的表达水平、核蛋白质的表达水平、细胞核酸的表达水平、细胞表面核酸的表达水平、胞质核酸的表达水平、细胞核核酸的表达水平、细胞碳水化合物的表达水平、细胞表面碳水化合物的表达水平、胞质碳水化合物的表达水平和细胞核碳水化合物的表达水平。
在一些实施方式中，本文提供了通过显微术定量测量生物样品内细胞的两种、三种、四种、五种或更多种属性的方法，其中该方法可包括一个或多个以下步骤或元素。定量测量的细胞属性可选自紧接的上一段所列举的属性。生物样品可以在显微术之前预处理。预处理可以包括任何有助于通过显微术分析样品的规程，包括：处理样品以富集感兴趣的细胞以用于显微术、处理样品以减少样品中可能干扰显微术的组分、向样品中加入有助于通过显微术分析样品的物质(例如稀释剂、减少染料与细胞的非特异性结合的阻断分子等)。可选地，在显微术之前，样品可以与一种或多种特异性结合细胞组分的结合剂相接触。结合剂可以直接与染料或其他颗粒相连接以便对该结合剂进行可视化。样品还可以与第二结合剂相接触，第二结合剂结合与细胞组分相结合的结合剂。第二结合剂可以直接与染料或其他颗粒相连接以便对该结合剂进行可视化。在显微术之前，可以在分光光度计中测定样品。对于显微术，可以将包含或怀疑包含供显微分析的物体的生物样品引入样品架如载玻片或容槽内。可以将包含样品的样品架引入配置用于对该样品进行定量显微术的设备中。显微镜可以与图像传感器耦合，以捕捉通过显微镜物镜生成的图像。在该设备中，可以通过显微术获得样品的多幅图像。定量荧光显微术、定量暗视野显微术、定量亮视野显微术和定量相差显微术中的任意一种或多种可以用来获取样品的图像。可选地，可以通过显微术获得样品架中的整个样品的图像。可能需要显微镜的多个视野来捕捉样品架内的整个样品的图像。样品架可以相对于显微镜移动，或者显微镜可以相对于样品架移动，以便生成不同的视野来检查样品架内的样品的不同部分。可以获得样品架内的样品在同一个视野内的多幅图像。可选地，同一类型的显微术和样品的同一视野可以使用多种滤光器，以便对同一样品获得不同的图像，这些图像包含与该样品有关的不同信息。可以使用的滤光器包括但不限于带通滤光器和长通滤光器。滤光器可以允许特定波长的光通过，但阻断其他光通过。可选地，可以使用多种类型的显微术(例如荧光、暗视野、亮视野等)获取样品的同一视野的图像，以便对同一样品获取不同的图像，这些图像包含与该样品有关的不同信息。可选地，可以使用视频来采集显微镜图像。可选地，显微镜图像可以以三维形式采集。对于如本文所述进行的显微术，所述设备或系统可以被配置用于将样品的一幅图像中关于细胞的信息与该样品的不同图像中的相同细胞相关联。基于同一样品或相同细胞的不同图像，可以确定样品中的细胞的多种属性。在一些方面，关于样品中的细胞的多种属性/多条信息的组合可以用来达成临床决定或得出关于该细胞的结论，这些仅基于来自该细胞的单一属性的信息是不可能获得的。
一些实施方式中，提供了用于通过显微术定量测量生物样品中的细胞的两种、三种、四种、五种或更多种属性的设备和系统。在一些实施方式中，该设备或系统同时包含显微镜或细胞计数器和分光光度计。该设备或系统可以进一步包含被配置成在分光光度计与显微镜或细胞计数器之间移动样品的流体处理装置。在一些实施方式中，用于执行本文公开的方法的设备和系统如美国专利申请号13/244,947和美国专利申请序列号13/769,779(均通过引用而整体并入本文)中所述的那样配置。尽管上述方面已经在细胞的情况下描述，但是还应理解，上述一些或全部方面也可以适用于晶体、颗粒、丝或其他可能在样品中发现的细胞大小的物体。
动态稀释
一些实施方式中，本文提供了用于动态稀释含有细胞的样品的方法、系统和设备。
举非限制性示例而言，一种用于动态稀释样品的方法可以包括一个或多个以下步骤或元素，以确定该样品中的细胞或物体的所需数目或浓度，并使用该信息作为调节下游样品处理中的考虑因素。在这个非限制性示例中，将一种或多种染色剂或染料添加至含有细胞的生物样品中。可以温育染色剂与样品的混合物。可以洗涤染色剂与样品的混合物中的细胞以除去多余(未结合)的染色剂。经染色、洗涤的细胞可以制备成所需体积以备进一步分析。可以分析经染色、洗涤的细胞以确定该样品或其部分中的细胞的近似数目或浓度。基于该样品或其部分中经染色的细胞的数目或浓度，可以获得一定体积的样品以备进一步分析，这样，即获得了用于进一步分析的所需数目或浓度的细胞。在一些实施方式中，可以如美国专利申请号13/355,458(通过引用而整体并入本文)中所述稀释样品。
在本文所述的一个实施方式中，期望提供另一种检测技术，例如但不限于用于对细胞进行计数的基于荧光的方法，用以估计细胞的浓度而不是使用细胞计数器。描述这种估计的原因在于，为了对患者的样品进行准确和可重复的染色，常常需要针对细胞的特定数目/浓度对染色剂(DNA染料/抗体/结合剂等)进行最佳滴定。例如，将已知浓度的染色剂应用到特定数目的细胞(例如，每千个白细胞(WBC)0.2微克染色剂)。温育一段时间后，洗涤该样品以除去多余(未结合)的染料，制备成适当的细胞密度，并进行成像。
在这个非限制性示例中，为了针对目标细胞类型对细胞浓度进行估计，会采用与用于细胞计数法的形式不同的形式，例如但不限于分光光度计，非破坏性地测量样品，以便告知用于细胞计数测定的样品处理。该方法可以包括选择对感兴趣的细胞群体而言独特的另一种标记物。在一个非限制性示例中，对于B细胞，可以选择CD20。该过程包括用偶联至与CD5不同颜色的荧光团的抗CD20结合剂标记样品。然后使用例如但不限于荧光分光光度计的设备非破坏性地快速测量该样品的荧光信号。使用校准，有可能以有限的精确度预测B细胞的浓度，以提供估计值。在一个非限制性示例中，这种校准可将信号强度与针对该信号类型的细胞数关联起来。这些校准曲线的创建可以用来估计细胞或物体的数目。不排除基于例如但不限于光学、电学、声学等总信号强度估计细胞数的其他技术。基于B细胞的近似浓度，该系统可以估计出抗CD5结合剂的适当的量和浓度，从而保持CD5表达与CD5荧光之间的比例关系。以这种方式，可以针对特定的细胞数对染色剂和染色规程进行优化/标准化。
为了使患者样品的利用最大化(该样品可以是小体积样品，例如，由手指针刺获得的血液，其体积等于或小于约120μL)，希望开发出可以对给定体积的血液中所包含的WBC数目进行计数(例如，确定浓度WBC/μL)的方法。这允许在添加染色剂以前确定、至少是估计WBC的数目。数目一旦确定，就可以等分所需数目的细胞以备与已知浓度的染色剂一起温育，从而产生细胞亚群的最佳分辨率。
在需要测量细胞的倍性的应用中，可以用DNA染料对样品中的细胞进行染色，然后可以对染色强度进行量化(其中“染色强度”是指由染料引起的光信号的强度)。由这样的染色引起的染料信号的强度依赖于DNA/染料之比(即，用染料染色的DNA的量与添加的染料的量之比)。如果无论样品的特性如何，向每个样品中添加预先设定的量的染料，则具有极高细胞浓度的样品均将比具有低细胞浓度的样品亮度更低。这种情况将会混淆对每个细胞中DNA量的量化。如本文所公开的，在添加染料之前获得样品中的有核细胞数目的估计值允许人们调整染料的量，以便可以对样品中每个细胞的DNA和DNA量进行量化。因此，举例而言，可以用染色剂或染料处理样品或样品的等分试样，该染色剂或染料针对于指示待量化的一种或多种细胞的细胞表面标记物，而该表面标记物用来非破坏性地估计样品中的细胞浓度。这种估计的浓度然后可用于计算需要添加到样品中的染料的量，以便始终维持一致的DNA∶染料比(摩尔∶摩尔)以供后续测量。
在用于细胞计数的基于荧光的方法的第一示例中，一种方法可包括确定细胞的倍性(例如，通过荧光团偶联的抗体染色对细胞进行计数)。在这个非限制性示例中，需要对血液样品中的WBC进行计数，以使得可以用预定浓度的DNA染料(例如，4’-6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)，或1，5-二{[2-(二甲基氨基)乙基]氨基}-4，8-二羟基蒽-9，10-二酮()，或碘化丙啶，或其他DNA染色染料)对特定数目的WBC进行染色。该示例的方法包括使用荧光团偶联的抗体和分光光度计对WBC进行计数。应当理解，当用DNA染料对细胞进行染色并确定倍性时，该方法可能是有帮助的，其中细胞数与DNA染料浓度之比(细胞数：[DNA染料])需要能够生成可比较的且一致的数据。鉴于健康人群中每微升血液的细胞数不同，因此一般需要在试图针对倍性进行染色之前确定每微升中的WBC数目。
在一个实施方式中，该规程包括使用首先用荧光团偶联的抗体(其中该抗体优选地针对广泛表达的抗原，如CD45，或针对亚群特异性抗体，如针对T细胞的CD3)或能标记所有细胞的荧光染料(例如，细胞膜或胞质染色剂，如曙红，或凝集素或其他染色剂或染料)染色的细胞，其中来自该荧光团的荧光的波长与DNA染料的发射波长在光谱学上不同(并且优选地远离)。温育一段时间后，洗涤样品以除去多余(未结合)的抗体，制备成适当的体积，并通过分光光度计进行分析。得到的数据允许确定血液样品中的WBC数目，以使得特定体积的血液可以被等分(产生特定/所需数目的WBC)并用DNA染料染色。得到的数据可用于根据使用所述荧光团偶联的抗体所确定的WBC数目，计算并调整将在样品染色中使用的DNA染料的量。
进一步的实施方式包括在细胞的表面染色之前确定细胞的数目(通过DNA染色)。额外的细节还可见于本文下面的细胞计数部分。有时需要对血液样品中的WBC进行计数，以使得特定数目的WBC可以用最佳浓度的抗体来染色。在一个实施方式中，该方法包括，例如，如上所述，使用DNA染料和分光光度计对WBC进行计数。
或者，如果在染色前已经确定了每微升中的细胞数，则已知数目的细胞可以被等分并针对每个样品进行染色，而不管(i)健康人群中的差异和(ii)疾病状态如何。为了确定每微升血液中的细胞数，可能要使用DNA染料，如DAPI、或碘化丙啶。可选地，可以洗去未结合的染料。可以用分光光度计确定每微升血液中的有核(例如，阳性)细胞的数目。
血液的等量等分试样中的白细胞(WBC)数目和浓度可能在受试者之间不同。然而，为了充分地分析血液样品中的WBC，可以添加足够的量的试剂(例如针对特定WBC-特异性抗原的抗体)，而足够的量取决于血液样品中的WBC数目和浓度。可以使用被称为“动态稀释”的规程来确保足够的抗体试剂被添加至样品中。在一个非限制性示例中，该规程处理血细胞以便获得临时细胞计数，该临时细胞计数用来计量将要与该样品一起使用以便提供完全的细胞染色的试剂(例如，用于对白细胞(WBC)进行染色的抗体混合物)的正确量。在该规程中，该细胞用DNA染料(例如DAPI、或碘化丙啶)染色，该DNA染料与后续步骤或测定中使用的荧光团偶联的抗体的发射波长在光谱学上不同/远离。可选地，温育一段时间后，可以洗涤该样品以除去多余(未结合)的DNA染料。温育一段时间后，可以将该样品制备成适当的体积，并使用分光光度计进行成像或测量。得到的数据允许计数/确定已知体积的样品中的WBC数目，以便指定体积的血液可以被等分(产生特定/所需数目的WBC)并用适量的抗体所染色(即，基于使用DNA染料确定的WBC的估计数目，可以确定为了提供抗体染色的所需饱和度而需要的抗体的量)。因此，通过DNA染色提供的估计值允许计算并添加样品等分试样中的WBC数目所需的适量的抗体染料。
动态稀释方案：
在一个实施方式中，动态稀释方案涉及取得含有白细胞(WBC)的血液样品(例如，全血，或含有WBC的血液部分)的等分试样，以便估计样品分析所需的、含有针对WBC的抗体的试剂的量。
在这个非限制性的示例中，取得已知体积的血液样品。向这个已知体积的样品中添加已知量的细胞核染料(例如，DNA染色染料，如碘化丙啶、DAPI或)。该混合物然后在25℃至40℃的温度下温育2至10分钟。
接下来，添加红细胞(RBC)裂解缓冲液。在这个非限制性的示例中，该混合物在25℃至40℃的温度下(也可以使用更低的温度)温育2至10分钟。合适的裂解缓冲液可以是，例如，低渗生理盐水溶液；低张蔗糖溶液；等渗氯化铵溶液；包括诸如皂苷的温和表面活性剂的等渗溶液；或者RBC在其中将会裂解的其他缓冲液。可使用本文公开的其他表面活性剂；例如，可以适合在裂解缓冲液中使用的表面活性剂包括但不限于聚山梨醇酯(例如，TWEENTM)、聚乙二醇(例如，TritonTM表面活性剂)、泊洛沙姆(例如，PLURONICSTM)、去污剂和其他两亲性化合物。在实施方式中，这样的裂解缓冲液包含固定剂(诸如，例如，甲醛、低聚甲醛、戊二醛或其他固定剂)以帮助稳定WBC。诸如皂苷的表面活性剂会导致在细胞膜上形成大量的孔洞。红细胞由于其独特的膜性质而对这种孔洞形成特别敏感，并完全裂解，其内容物漏出到周围的液体中。固定剂的存在防止了白细胞的非故意裂解。血小板也保持未裂解状态。这个步骤的目的是从混合物中去除完整的红细胞，因为它们以约1000∶1的比例远远超过白细胞的数目。血小板不干扰成像，因此不是该过程中的考虑因素。在实施方式中，裂解缓冲液还可以包含已知浓度的非荧光微珠；这些微珠可充当大小或浓度的标记物。RBC的裂解与该方案的后续步骤一起基本上去除了RBC对成像或对WBC光学测量的任何干扰。对裂解剂与固定剂(例如，皂苷与低聚甲醛)的此例的这种优化用最小体积的裂解缓冲液提供了RBC的有效裂解，并且对样品中的WBC(或血小板)具有最小的负面影响。通过同时提高裂解剂和固定剂浓度(例如，分别是皂苷和低聚甲醛的浓度)，申请人已经能够将裂解缓冲液浓度与样品体积之此从约20∶1减少至约4∶1(裂解缓冲液：样品体积)。裂解剂浓度的进一步提高导致WBC裂解以及所需的RBC裂解有过度增加的风险。
接下来对处理过的样品进行分离，其中该分离可以通过任何合适的方法来进行，例如但不限于在离心机中以1200xg对处理后的样品离心3分钟。
分离(例如离心)后去除上清液；然后重悬浮剩下的沉淀物。在实施方式中，将沉淀物重悬浮于一些或全部上清液中。这一步骤产生含有重悬浮的沉淀物的已知体积的溶液。
如果需要，可以进行进一步的分离步骤和进一步的重悬浮步骤。这些步骤提供了具有浓缩约10倍的细胞的浓缩样品(忽略每一步中任何可能的细胞丢失)。
然后测量重悬浮、浓缩后的样品中DNA染色染料的量。例如，可以在分光光度计中测量来自诸如的荧光DNA染色染料的荧光。在实施方式中，该样品可以用632nm波长(的激发波长)的光照射，由细胞悬浮液发射的光束可以通过650nm长通滤光器过滤，然后可以在分光光度计中测量发射的光。然后将这种发射测量与以前生成的校准曲线进行关联，以估计出细胞悬浮液中自细胞的大概浓度。通常，细胞浓度在约1000个细胞/微升到约100,000个细胞/微升的范围内。以这种方式获得的WBC数目的估计值可用来计算适当的稀释因数，以确保在后续定量测量中使用时，样品中的细胞浓度被限制在预先限定的目标浓度的范围内(例如两倍或其他范围)。然后按照计算出的稀释因数稀释该样品，以提供WBC浓度在所需浓度范围内的样品。
该“动态稀释”步骤的目的是确保WBC在样品中不会以过高或过低的浓度存在。如果细胞浓度过高，图像处理算法的准确性会受到损害，而如果细胞浓度过低，则会采集到数目不足的细胞。如本文公开的浓缩样品的稀释提供了在理想范围内的WBC浓度，并且确保了分析过程中来自该样品的信号处于用于检测和分析的最佳范围内。
此外，以这种方式估计WBC数目允许计算对样品应用进一步的测定和方法步骤所需的试剂的量，因为样品中的WBC数目可能有变化，而各种测定所需的试剂的量可能依赖于待测样品中的WBC数目。例如，通过动态稀释方案对WBC数目进行估计后所添加的试剂包括针对特定抗原的抗体，该抗原在不同类型的WBC上发现，或者，如果这些抗原在多个类型的WBC中均发现，则以不同的量存在于不同类型的WBC上。在缺乏对样品中的WBC数目的这种估计值的情况下，在样品的后续测定中必须使用预定量的染料和其他试剂，这导致不正确的试剂量，以及不准确或不完整的测定结果。因此，该动态稀释方案在对来自患者的血液样品进行全面评估中充当重要的且有用的初始步骤，并且允许比可能的其他方法更精确和准确的测量。
动态染色
在一些实施方式中，本文提供了用于对含有细胞的样品进行动态染色的方法、系统和设备。
对细胞群体的细胞中感兴趣组分的测量
在一个实施方式中，对细胞样品进行动态染色的方法涉及对样品内细胞群体的细胞中感兴趣组分进行测量的方法。
如本文所用的，“感兴趣组分”是指可以在细胞中存在的任何类型的分子。“感兴趣组分”包括蛋白质、碳水化合物和核酸。通常，“感兴趣组分”是特定的分子种类，诸如特定的抗原。细胞的“感兴趣组分”的非限制性示例包括：CD5蛋白、CD3蛋白等。
如本文所用的，“细胞群体”是指基于一种或多种共同特性的任何细胞组群。“细胞群体”可以具有任何程度的涵盖范围，并且可以包括大量的细胞或仅有少量的细胞。“细胞群体”的非限制性示例包括：红细胞(RBC)、白细胞(WBC)、B细胞、CD34+B细胞等。
在一些情况下，可能需要对来自受试者的样品中特定细胞群体的细胞中的感兴趣组分进行定量测量。例如，可能需要测量来自慢性淋巴细胞白血病受试者的细胞样品中B细胞(“细胞群体”)中的CD5(“感兴趣组分”)表达程度。对感兴趣组分的水平的检测或测量可以涉及使用对该特定感兴趣组分具有亲和力的结合剂分子，诸如抗体或单链可变片段(“scFv”)。为了用涉及使用结合剂分子的方法准确地测量细胞中特定感兴趣组分的水平，以结合剂分子与目标感兴趣组分的特定比例或此例范围使细胞暴露于结合剂分子可能是有益的。例如，可能需要向细胞集合中提供一定量的结合剂，以使得在细胞中感兴趣组分的量与结合细胞中感兴趣组分的结合剂的量之间存在线性关系。例如，可能不希望有过少的结合剂(这样就没有足够的结合剂与细胞中的所有感兴趣组分结合)或过多的结合剂(这样结合剂会非特异性地与细胞结合)。
使用传统方法可能难以向样品提供适当水平的结合剂以准确地测量该样品中细胞群体内的感兴趣组分的量，这是由于以下事实：样品中的细胞群体或感兴趣组分的大小在不同的样品之间可能显著不同。相反，本文提供了用于对细胞样品进行动态染色以适应含有大范围的细胞群体和感兴趣组分的样品的方法、设备和系统。
在一个实施方式中，提供了一种测量样品中细胞群体的细胞内的感兴趣组分的方法。该方法不限于但可以包括一个或多个以下步骤：
首先，可以获得细胞群体的细胞中存在的标记物的定量或半定量测量。该标记物可以是存在于感兴趣的细胞群体中的任何标记物，并且它可以是只存在于感兴趣的细胞群体中(即，不存在于样品中的其他任何细胞类型中)的标记物。该标记物的测量可以通过任何方法进行，条件是该方法不会破坏样品，并且可以使用任何系统或设备。识别标记物的结合剂可以与样品混合。该结合剂可以附着有利于该结合剂的检测的分子(例如荧光标记物)。在一个示例中，该标记物可以通过荧光分光光度法检测或测量。在结合剂具有荧光标记且通过荧光分光光度法测量标记物的实施方式中，可以利用荧光分光光度法测量来自样品或其部分的批量荧光，而不是测量来自单个细胞的荧光。
其次，基于细胞群体的细胞中存在的标记物的定量或半定量测量，可以确定样品中存在的细胞群体的细胞的近似量或浓度。例如，通过使用校准曲线，可以确定样品中存在的细胞群体中细胞的近似数目或浓度。可以绘制或可以获得针对不同的标记物/结合剂组合的校准曲线。例如，通过测量来自已知数目的具有特定标记物并且与特定结合剂结合的细胞的信号，可以绘制出校准曲线。在一些实施方式中，可以借助于计算机确定样品中存在的细胞群体的细胞的近似量或浓度。在一些方面，可以确定样品中存在的细胞群体的细胞的近似量或浓度，这样的确定不偏离真实浓度超过约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、400％或500％。
第三，基于确定的样品中存在的细胞群体内细胞的量或浓度，可以选择添加到该样品中的试剂的量，其中该试剂特异性地与细胞群体的细胞中的感兴趣组分相结合。该试剂可以是，或者包括与感兴趣组分特异性结合的任何分子。例如，该试剂可以是结合剂，如抗体。该试剂可以被配置成可以容易地检测(例如通过荧光或发光)，或者至少在某些情况下，它会产生可检测的信号。在一些实施方式中，该试剂可以附着至有助于该试剂的检测的分子上。添加到样品中的试剂的量可以是任何量。在一些实施方式中，可以向样品中添加一定量的试剂，以使得在细胞群体的单个细胞中感兴趣组分的水平与由结合至该细胞群体的单个细胞中感兴趣组分上的试剂所产生的信号之间存在近似线性关系。
第四，在选择添加到样品中的试剂的量之后，可以向样品中添加所选的量的试剂。
第五，可以针对与感兴趣组分结合的试剂，测定样品中的细胞。
第六，基于与感兴趣组分结合的试剂的量，可以确定样品的细胞群体的细胞中感兴趣组分的量。
在一些实施方式中，第五步和第六步可以一起进行，以使得对与感兴趣组分结合的试剂量的测量足以确认样品的细胞群体的细胞中感兴趣组分的量。
在其他实施方式中，本文提供了用于样品的动态染色的系统和设备。该系统和设备可以包括但不限于分光光度计和荧光显微镜。在一个实施方式中，用于样品的动态染色的系统或方法可以如美国专利申请号13/244,947或13/355,458(通过引用而整体并入本文)中所述的那样配置。在一个实施方式中，该系统和设备可以被自动化，以基于对细胞群体的细胞中存在的标记物的量的测量，确定添加到样品中的试剂的量，从而确定该样品中的细胞群体的细胞内感兴趣组分的量。在另一个实施方式中，该系统和设备可以被自动化，以基于对样品中细胞群体的细胞内第二组分的量的测量，确定添加到样品中的试剂的量，从而确定该样品中细胞群体的细胞内第一组分的量。
基于环境的自动对焦
在一些实施方式中，本文提供了用于基于环境的显微镜自动对焦的方法、系统和设备。
生物样品中的许多临床相关物体的大小(例如长度、高度或其他测度)跨越很宽的范围。例如，细菌通常约1μm长，红细胞通常约6-8μm长，白细胞通常约10-12μm长，上皮细胞可以约100μm长，而管型和晶体可以约200-300μm长。另外，还有一些无定形的元素，诸如尿粘液，它们以线或丝状存在，可以长约10-400μm。
显微术的一个挑战是对包含未知且任意组成的各种大小的物体(例如上面描述的物体)的视野获取精确的图像。由于许多显微镜物镜的焦深是有限的(一般约为1-10μm)，对于包含各种大小的元素的给定视野来说，可能需要获取该给定视野的多个焦平面，以便获得该视野内各种元素的准确清晰的图像。许多传统自动对焦方法的一个问题是它们被设计成对视野内的主要特征进行对焦，从而该特征的清晰度可以被最大化。这样的方法对于捕捉样品中各种大小的元素可能是无效的。
在一个实施方式中，提供了一种基于环境的显微镜自动对焦方法，其包括将已知大小的参照颗粒与用于显微术的样品混合。在实施方式中，向样品中添加一个以上的参照颗粒；优选所有或基本上所有这些参照颗粒具有相同的已知大小。在实施方式中，添加到特定体积的样品中的参照颗粒的数目是已知的。参照颗粒可以在显微术过程中检测，并且用来实现对焦。通过使用参照颗粒实现对焦，可以选择与整体图像构成无关的焦平面。一方面，该方法可用于对具有未知元素组成的样品实现对焦。另一方面，该方法可以支持精确焦平面的生成，而与显微镜或显微术相关硬件的精确度无关。例如，当基于来自视野内参照颗粒的清晰度的反馈来选择焦平面时，可以实现对样品内各种元素的精确对焦，而无论对焦硬件的准确度和精确度的水平如何[例如显微镜物镜致动、样品架(例如容槽或载玻片)的形状或样品架的不均一性]。
在一个实施方式中，参照颗粒可以包含有助于在显微术过程中检测该颗粒的分子或用该分子标记。在一个示例中，参照颗粒可以用荧光分子标记，或包含荧光分子。该荧光分子可以吸收第一光波长的光，并且响应于第一波长的光的吸收，它可以发射第二波长的光。在一个实施方式中，与参照颗粒混合的样品可以暴露于能够激发感兴趣参照颗粒中的荧光分子的波长的光，并可以测量从该荧光分子发射的光。来自参照颗粒的特定荧光可用来检测参照颗粒，而来自样品中检测到的参照颗粒的信息可以用于自动对焦。
参照颗粒可以是任何形状，例如球形或长方体。参照颗粒包括但不限于微珠和微球。参照颗粒可以是任意大小，诸如其直径或长度约为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450或500μm。参照颗粒可以由任何合适的材料制成，或包含这种材料，诸如聚苯乙烯、聚乙烯、胶乳、丙烯酸类或玻璃。例如，参照颗粒可以是聚苯乙烯微珠，例如直径在约0.1μm至约50μm之间，或在约1μm至约20μm之间，或在约5μm至约15μm之间，或直径约为10μm的聚苯乙烯微珠。
在一个实施方式中，提供了一种对显微镜进行对焦的方法，其可包括一个或多个以下步骤。首先，包含供显微分析的物体(例如细菌、红细胞等)的样品可以与参照颗粒混合。该参照颗粒可以包含有助于检测该颗粒的分子如荧光团，或用该分子标记。其次，可以将包含参照颗粒和样品的混合物置于显微镜的光路中，例如在容槽或载玻片中。可选地，参照颗粒可以沉降到容槽或载玻片中的样品的底部，使得参照颗粒停留在与样品接触的容槽或载玻片的最下层表面上。该显微镜可以是任何类型的，包括荧光显微镜。第三，可以使混合物暴露于被配置用于对参照颗粒进行可视化的光束。该光束可以是任何类型的，并且可以相对于参照颗粒处于任何方向。例如，该光束可以具有能够激发参照颗粒内的荧光团或附着至参照颗粒上的荧光团的波长。使参照颗粒暴露于该光束可以导致，例如，从参照颗粒生成并发射特定波长的光，或从参照颗粒散射光。第四，可以用显微镜检测从参照颗粒发射或散射的光，并且可以使用该信息来确定混合物内参照颗粒的位置或对显微镜进行对焦。可选地，可以使显微镜对焦到适合于与参照颗粒具有相似大小的物体的焦平面内。可以通过图像传感器获得来自显微镜的图像。该图像可以保存并用于图像分析。
在一些实施方式中，可以向样品中添加多种参照颗粒。该参照颗粒可以全都具有相同的大小，或者可以具有不同的大小。在一些实施方式中，不同大小的参照颗粒包含不同的荧光团。不同的荧光团可以具有不同的吸收波长、不同的发射波长或者二者兼具。
在一个实施方式中，提供了一种对显微镜进行对焦的方法，其包括将一种以上的已知大小的参照颗粒与供显微分析的样品相混合，其中至少两种参照颗粒拥有不同尺寸并包含不同荧光团。该方法可以包括一个或多个以下步骤。首先，可以将包含供显微分析的物体的样品与两种或更多种参照颗粒相混合，其中至少两种参照颗粒具有不同的大小并且包含不同的荧光团(即”第一参照颗粒”和“第二参照颗粒”)。其次，可以将包含参照颗粒和样品的混合物置于显微镜的光路中。该显微镜可以是任何类型的，包括荧光显微镜。第三，可以使混合物暴露于被配置用于对第一参照颗粒进行可视化的光束。该光束可以是任何类型的，并且可以相对于第一参照颗粒处于任何方向。例如，该光束可以具有能够激发第一参照颗粒内的荧光团或附着至第一参照颗粒上的荧光团的波长。使第一参照颗粒暴露于该光束可以导致从第一参照颗粒生成并发射或散射特定波长的光。第四，可以检测从第一参照颗粒发射或散射的光，并且可以使用该信息来确定混合物内第一参照颗粒的位置或将显微镜对焦到适合于与第一参照颗粒具有相似大小的物体的第一焦平面内。可选地，可以通过图像传感器获得第一焦平面的图像。该图像可以保存或用于图像分析。第五，可以使混合物暴露于被配置用于对第二参照颗粒进行可视化的光束。该光束可以是任何类型的，并且可以相对于第二参照颗粒处于任何方向。使第二参照颗粒暴露于该光束可以导致从第二参照颗粒生成并发射或散射特定波长的光。第六，可以检测从第二参照颗粒发射或散射的光，并且可以使用该信息来确定混合物内第二参照颗粒的位置或将显微镜对焦到适合于与第二参照颗粒具有相似大小的物体的第二焦平面内。可选地，可以通过图像传感器获得第二焦平面的图像。该图像可以保存或用于图像分析。
在其他实施方式中，本文提供了用于基于环境的显微镜自动对焦的系统和设备。该系统和设备可以包括但不限于荧光显微镜。在一个实施方式中，该系统和设备可以被自动化，以将具有已知大小的参照颗粒添加到供显微分析的样品中形成混合物，将混合物置于显微镜的光路中，使混合物暴露于被配置用于对参照颗粒进行可视化的光束，确定混合物内参照颗粒的位置，或基于混合物内参照颗粒的位置对显微镜进行对焦。在一个实施方式中，用于基于环境的显微镜自动对焦的系统或方法可以如美国专利申请号13/244,947或13/355,458(均通过引用而整体并入本文)中所述的那样配置。
定位样品架
在一些实施方式中，本文提供了用于确定样品架、样品架的一部分或样品架上的指示标志的位置的方法、系统和设备。这样的确定优选地是精准确定，并且可用于鉴定样品架内视野中的细胞、颗粒或其他物体，即使样品架已经移动或者视野已经改变后(例如，通过改变焦距，或通过检视样品架内的不同区域)。
在实施方式中，基于图像的反馈机构可用来准确而精确地确定在容槽中，例如在通道或其他包含样品的区域中的特定位置(参见，例如，图7和8显示的分析区域608)。特别是当样品架移动后又回到原先的位置时，这种确定对于比较在这种移动之前及这种移动之后所获取的图像和光学测量是非常重要的。源自多种来源的变异性可以影响样品相对于成像系统的轴的位置；例如，容槽部件的变异性、容槽组件的变异性、容槽在成像系统上的定位的变异性以及其他可能的变异性来源都可以影响样品相对于成像系统的位置，即使样品保持在样品架内的同一位置上。本文公开了用于识别和表征样品架相对于成像系统的位置的方法。例如，为了准确地和可重复地对容槽内的感兴趣区域进行成像，可以运行容槽注册程序。在实施方式中，这样的程序开始于分析在样品架中预先限定的位置处获取的图像，该预先限定的位置接近于视野内的注册特征或基准标志，或者可以通过程序以其他方式检测到。容槽注册程序包含图像处理程序，该图像处理程序搜索图像中基准标志的存在，并返回“是/否”的回答(关于该基准标志是否在检查的区域内被找到)或者该标志出现在图像内的可能性。在该基准标志在已检查的区域内没有被找到的情况下，之后使用搜索算法，其将检查区域移动到样品架之上或之中的不同位置，并且重复成像。重复该过程直到该程序找到基准标志(即，对在检查区域内是否发现基准标志的问题得到“是”的回答，或者使该标志在该区域内出现的概率最大化)。一旦确定了基准标志的位置，就可以确定样品架之中或之上的所有其他位置，因为该样品架的尺寸和布局是已知的。因此，在识别到基准标志的位置后，可以找到用于成像的任何感兴趣的点并对其进行成像，因为感兴趣的点的位置也是已知的(即，其相对于基准标志的距离和定向是已知的，并且，由于基准标志的位置是已知的，所以该感兴趣的点也是已知的)。在实施方式中，基准标志可以是或包括位于容槽自身上的特别构建的特征(例如，可以是孔洞、突起、压印或模塑的图案或其他特征)，这些特征可以被制造成对于每个部分都以任意期望的容差处于相同的位置。在实施方式中，基准标志可以是或包括容槽的特征(例如通道的边缘)，该特征与感兴趣的点的距离总是固定的(例如，在基准标志是通道的边缘的情况下，该基准标志与通道的中心轴的距离总是固定的)。
细胞计数/计数细胞
在一些实施方式中，本文提供了用于对样品中的细胞进行计数的方法、系统和设备。
用于对含有细胞的样品进行染色的某些传统方法涉及用特定浓度或量的染色剂对特定体积的样品(例如血液)进行染色。这可以被称为“体积染色”。体积染色有许多缺点，包括：(i)不能解决不同受试者之间的细胞亚群中的正常变异(不同的健康受试者可能具有数目非常不同的细胞亚群，诸如CD3+T细胞(其中“CD3+”表示该T细胞表达CD3标记物))；及(ii)不能解决病理样品与健康样品相比可能具有显著不同的细胞组成(例如，血液中CD3+T细胞的百分此和数目在T细胞白血病患者中比健康受试者中的百分比和数目大大升高)。
为了对含有细胞的样品进行准确的和可重复的染色，可能需要向特定数目或浓度的细胞中添加特定量的细胞染色剂(例如DNA染料、抗体、结合剂等)。例如，可能需要向样品中添加每1000个白细胞0.2微克针对白细胞的特定染色剂。将染料与细胞温育一段时间后，可以洗涤样品以除去多余(未结合)的染料，制备成对于显微术合适的细胞密度，并进行成像。以这种方式，可以针对特定细胞数对染色剂和染色规程进行优化或标准化。
在一个实施方式中，提供了一种用于对样品中的感兴趣细胞的数目进行计数的方法。该方法可包括一个或多个以下步骤或元素。可以向样品中添加与样品中的感兴趣细胞相结合的第一染色剂。可以温育第一染色剂与样品的混合物。可以洗涤第一染色剂与样品的混合物中的细胞以除去多余(未结合)的染色剂。洗涤后的用第一染色剂染色的细胞可以被制备成所需的体积以备进一步的分析。洗涤后的用第一染色剂染色的细胞可以用分光光度计进行分析。来自分光光度计的数据可用来对样品中的细胞的近似数目进行计数。例如，第一染色剂可以是与核酸结合的荧光染料，而该分光光度计可以包括发射荧光染料的激发波长的光的光源和能够检测该荧光染料的发射波长的光的光传感器。在该示例中，基于来自染料的荧光信号，可以计算样品中的核酸的近似量，并且由样品中的核酸的该近似量可以确定样品中的细胞的近似数目。基于样品中的细胞的数目，可以向样品中添加与样品中的感兴趣细胞结合的第二染色剂。在实施方式中，添加至样品中的第二染色剂的量可以基于使用第一染色剂确定的细胞的近似数目来确定。在实施方式中，添加至样品中的第二染色剂的量可以采用通过使用第一染色剂确定的细胞数来计算，以获得期望的第二染色剂/细胞的比例。可以温育第二染色剂与样品的混合物。可以洗涤第二染色剂与样品的混合物中的细胞以除去多余的染色剂。洗涤后的用第二染色剂染色的细胞可以被制备成所需的体积以备进一步的分析。洗涤后的用第二染色剂染色的细胞可以通过显微术进行分析。
在确定细胞倍性之前对样品中的细胞的计数
一个实施方式中，提供了一种在确定细胞倍性之前对样品中的细胞进行计数的方法，其中该方法包括一个或多个以下步骤或元素。可以向样品中添加第一染色剂，该第一染色剂与样品中的感兴趣细胞相结合并且在光谱学上不同于DNA染料的发射。该感兴趣细胞可以是，例如，白细胞。该第一染色剂可以是，例如，荧光团偶联的抗体。该荧光团偶联的抗体可以与例如广泛表达的抗原(例如CD45)相结合，或者可以与细胞的特定亚群所表达的抗原(例如T细胞的CD3)相结合。可以温育第一染色剂与样品的混合物。可以洗涤第一染色剂与样品的混合物中的细胞以除去多余(未结合)的染色剂。洗涤后的用第一染色剂染色的细胞可以被制备成所需的体积以备进一步的分析。洗涤后的用第一染色剂染色的细胞可以用分光光度计进行分析。来自分光光度计的数据可用来对样品中的细胞的近似数目进行计数。基于样品中的细胞数，可以向样品中添加将与样品中的感兴趣细胞结合的第二染色剂。该第二染色剂可以是DNA染料，诸如碘化丙啶或4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(“DAPI”)。在实施方式中，添加至样品中的第二染色剂的量可以基于用第一染色剂确定的细胞的近似数目来确定。在实施方式中，添加至样品中的第二染色剂的量可以采用通过使用第一染色剂确定的细胞数来计算，以获得所需的第二染色剂/细胞的比例。可以温育第二染色剂与样品的混合物。可以洗涤第二染色剂与样品的混合物中的细胞以除去多余的染色剂。洗涤后的用第二染色剂染色的细胞可以被制备成所需的体积以备进一步的分析。洗涤后的用第二染色剂染色的细胞可以通过显微术进行倍性分析。
在确定细胞倍性的方法中，为了生成关于细胞倍性的准确和一致的数据，将给定数目的用于倍性分析的细胞与特定量或浓度的DNA染色剂相组合可能是重要的。在一个示例中，健康人群内其每体积血液中的白细胞数可能各异，因此，在试图对白细胞进行染色以备倍性分析之前可能需要确定一定体积的血液中的白细胞数。
对于在确定与细胞的核酸含量相关的属性之前需要对样品中的细胞进行计数的任何方法，也可进行以上所提供的用于确定细胞倍性的方法。例如，上述方法可以与包括在确定细胞核的形态学、细胞核的大小、细胞核面积与总细胞面积之比等之前对样品中的细胞进行计数的方法一起使用。
在细胞表面染色对样品中的细胞的计数
一个实施方式中，提供了一种在细胞表面染色之前对样品中的细胞进行计数的方法，其中该方法包括一个或多个以下步骤或元素。可以向样品中添加第一染色剂，该第一染色剂与样品中的感兴趣细胞相结合并且在光谱学上不同于用来对感兴趣细胞的表面进行染色的染料的发射。该感兴趣细胞可以是，例如，白细胞。该第一染色剂可以是，例如，DNA染料(例如碘化丙啶、或DAPI)。可以温育第一染色剂与样品的混合物。可以洗涤第一染色剂与样品的混合物中的细胞以除去多余(未结合)的染色剂。洗涤后的用第一染色剂染色的细胞可以被制备成所需的体积以备进一步的分析。洗涤后的用第一染色剂染色的细胞可以用分光光度计进行分析。来自分光光度计的数据可用来对样品中的细胞的近似数目进行计数。基于样品中的细胞数，可以向样品中添加将与样品中的感兴趣细胞结合的第二染色剂。在实施方式中，添加至样品中的第二染色剂的量可以基于用第一染色剂确定的细胞的近似数目来确定。在实施方式中，添加至样品中的第二染色剂的量可以采用通过使用第一染色剂确定的细胞数来计算，以获得所需的第二染色剂/细胞的比例。该第二染色剂可以是，例如，荧光团偶联的抗体。该荧光团偶联的抗体可以与例如广泛表达的抗原(例如CD45)相结合，或者可以与细胞的特定亚群所表达的抗原(例如T细胞的CD3)相结合。可以温育第二染色剂与样品的混合物。可以洗涤第二染色剂与样品的混合物中的细胞以除去多余的染色剂。洗涤后的用第二染色剂染色的细胞可以被制备成所需的体积以备进一步的分析。洗涤后的用第二染色剂染色的细胞可以通过显微术进行细胞表面抗原分析。
在用于细胞的表面抗原染色的方法中，为了生成关于细胞表面内含物的准确和一致的数据，将给定数目的用于分析的细胞与特定量或浓度的细胞表面抗原染色剂相组合可能是重要的。在一个示例中，健康人群内每体积血液中的白细胞数可能各异(来自健康受试者的血液一般每微升(μL)具有约3000-10,000个WBC)，因此，在试图针对细胞表面抗原对白细胞进行染色之前可能需要确定一定体积的血液中的白细胞数。在另一个示例中，健康受试者与患病受试者之间每体积血液中的白细胞数可能不同(例如，淋巴瘤患者每μL血液可能具有高达100,000个WBC)，因此，在试图针对细胞表面抗原对白细胞进行染色之前可能需要确定一定体积的血液中的白细胞数。
因此，作为一个理论上的示例，健康受试者每μL血液可能具有5000个细胞，其中500个为CD3+T细胞，而淋巴瘤患者每微升血液可能具有50,000个细胞，其中45,000个为CD3+T细胞。如果按传统对100微升血液进行染色，那么来自健康受试者的样品将含有总共约500,000个细胞，其中约50,000个细胞为CD3+T细胞。来自淋巴瘤受试者的100微升样品将含有总共约5,000,000个细胞，其中约4,500,000个细胞为CD3+T细胞。在这个理论性的示例中，该病理样品含有的细胞总数十倍于来自健康受试者的样品，CD3+T细胞数九十倍于来自健康受试者的样品。如果该病理样品使用针对来自健康受试者的样品优化的传统“体积染色”法进行染色，则来自淋巴瘤受试者的样品可能会染色不充分。鉴于这个原因，举例而言，本发明的方法(其中使用样品中的细胞数的预先估计值来调整施加至样品的染料的量)提供了优于传统体积染色法的优点。
因此，为了生成关于样品的准确或一致的数据，可以使用本文提供的方法在细胞染色之前对样品中的细胞数进行计数。
方法的速度
本文所提供的方法、系统和设备可以支持样品分析结果的快速获取。本文提供的方法可以从开始该方法起在不到例如约6小时、4小时、3小时、2小时、1小时、45分钟、30分钟、15分钟、10分钟或5分钟的时间内提供分析结果。
快速分析结果可以用来提供与患者的治疗、诊断或监测相关的实时信息。例如，快速分析结果可以用来指导外科医生对患者进行手术的治疗决定。手术过程中，外科医生可以从患者身上获取生物样品以进行分析。通过接收由本文提供的方法对样品的快速分析，外科医生可以能够在手术过程中作出治疗决定。
在另一个示例中，由本文提供的方法、系统和设备提供的快速分析结果可以支持患者在对该患者提供生物样品的服务点位置的同一访视期间，在该服务点接收有关该患者提供的生物样品的信息。
例如，申请人在此描述了一种快速测定，其可以用来制备全血样品以供分析白细胞中多种标记物的存在和细胞类型。这样的测定可用于制备全血样品以供成像分析；样品在不超过约20分钟，或者不超过约15分钟内作好成像的准备。
从全血开始的快速白细胞测定
这种测定在不超过约15分钟或不超过约20分钟内制备用于白细胞的细胞计数分析的全血样品。对这样制备的细胞的自动细胞计数分析也可以快速完成，因此从全血开始的WBC细胞计数分析可以在约半小时或更短时间内完成。另外，这种测定只使用小体积的血液样品，因此与需要较大体积的血液的测定相比，其节约资源，并且对受试者造成较少的不便和不适。
该测定中使用的试剂包括：磷酸盐缓冲盐水、裂解固定缓冲液、微珠、重悬浮缓冲液以及包含染料和染料偶联的抗体的试剂混合物。该抗体针对特定的WBC标记物。
磷酸盐缓冲盐水(PBS)：137mMNaCl，3mMKCl，8mMNa2HPO4，1.5mMKH2PO4，pH调节至pH7.2至pH7.4(用HCl)。
重悬浮缓冲液(RSB)：包含5％牛血清白蛋白的PBS。
裂解固定缓冲液：包含0.0266％皂苷和10％低聚甲醛(PFA)的PBS，其中“％”表示克/100mL(最终比例约为13∶1皂苷PBS∶PFA)。
试剂混合物1：与PacificBlueTM染料偶联的抗-CD14抗体、Fc封闭剂(例如，免疫球蛋白，如小鼠IgG)，在含0.2％BSA的PBS中。
试剂混合物2：与藻红蛋白(PE)染料偶联的抗-CD16抗体、与Alexa647染料偶联的抗-CD45抗体、与PECy5染料偶联的抗-CD123抗体、Fc封闭剂(例如，免疫球蛋白)，在含15％BSA的PBS中。
测定步骤包括：
从受试者获得全血。
将50μL全血置于试管中。如果需要，可以将全血样品直接采集到试管中。如果从受试者采集的血液的总量为50μL，则将整个样品添加或采集到试管中；如果从受试者采集的样品多于50μL，则将样品以50μL等分。
将样品以1200xg离心3分钟。
从试管中移除20μL血浆。
将试管置于加热块上(升温至温度37℃)，添加20μLRSB，并充分混合。
加入混合物1(约5μL)。(在实施方式中，可以将混合物1直接加到全血中，并且可以被省略前面的离心、去除血浆部分以及用RSB代替的步骤。)
将样品在37℃下温育2分钟。
加入裂解固定缓冲液(裂解固定缓冲液与被染色的血液的比例为6∶1；约300-350μL)。已知浓度的微珠可以包含在裂解固定缓冲液中，以提供对焦目标(参照颗粒)，并且为样品浓度提供校准(例如，如以上在“基于环境的自动对焦”部分所描述的)。可以使用直径为约1微米至约30微米的聚苯乙烯或其他微珠。例如，可以使用浓度为每微升(μL)约100个微珠至约2000个微珠，或每μL约150个微珠至约1500个微珠，或每μL约200个微珠至约1000个微珠的10微米聚苯乙烯微珠。
在37℃下在裂解固定缓冲液中温育总共3分钟；在加入缓冲液约1.5分钟后，通过用移液管将溶液上下吸移五次来进行混合。
将样品混合物以1200xg离心3分钟。
移除上清液(约350μL)。保存上清液以在后面的步骤中调节体积(如果需要)。
加入混合物2(约15μL)以提供最终混合物。
将最终混合物加至预温的成像容槽内(37℃)。
成像前将该容槽在37℃下温育5分钟。
对样品进行成像。
这样，样品在不到约15分钟内即可作好成像的准备。在实施方式中，一些步骤可以缩短(例如，在替代实施方式中，可以缩短离心步骤或温育步骤)。由于以上公开的方法使用包含多种染料的混合物制备样品，因此对这些样品中是否存在数种细胞类型标记物的分析可以在单一的视野内进行，从而用最小的重复尝试提供了有效的样品成像。这些相同视野的光散射图像还提供了分析的另一方面，它可以有效地应用，而对于样品的数种图像分析模式不需要单独的样品或单独的视野。包含已知大小的参照颗粒通过允许使用自动对焦而进一步有助于成像，并且由于参照颗粒的浓度是已知的，它在每一幅图像中提供样品稀释度和细胞浓度的独立测度。
对制备好的样品的成像也可以快速完成；例如，通过使用具有如本文所述并且例如在美国专利申请13/244,947、美国专利申请13/769,779及相关申请中描述的特征的自动设备，这样的成像可以在约10分钟(通常约2分钟至约12分钟)内完成。这样，在实施方式中，整个分析，包括血液样品的制备以及对制备好的样品的成像，可以在约30分钟或更短时间内完成。
从按照上面讨论的方法(以及下面讨论的类似方法)制备的样品获得的图像和图像分析适合于从全血中鉴定WBC的不同群体。通过用不同波长的光照射样品(例如顺序地)，并且记录并分析得到的图像和光强度，这样的鉴定和量化在同一样品上快速完成。这样的方法适合于提供例如图9、10和11所示的图像和图形，它们是使用本文公开的方法(例如，上文及下文讨论的方法)制作的。图12中所示的比较证明这些方法是准确且可靠的，并且与其他方法(例如，由AbbottCELL-DYNRubySystem(AbbottDiagnostics，LakeForest，IL，USA)进行的分析)有良好的相关性，用于比较的参照分析仪显示在图12中。
病理学样品的分析
本文提供的任何方法都可用来分析含有细胞的病理学样品。如果病理学样品是组织样品，则可以处理该样品，以便将组织中的细胞分离成单个细胞，以通过本文提供的方法进行分析。
通过本文提供的任何方法对病理学样品的分析都可以支持快速病理学分析，以及病理学分析结果向针对患者的治疗决定中的快速整合。
响应于分析结果的附加规程
在一些实施方式中，本文提供的设备和系统可以被配置用于响应于通过本文提供的分析方法所获得的结果而触发附加规程。
在一个示例中，可以对设备或系统进行编程，以便当结果超出预期范围时向使用者提供警报。该警报可以提示使用者或医疗人员例如手工分析样品、检查设备或系统是否正确运行等。
在另一个示例中，可以对设备或系统进行编程，以便当结果位于或超出特定范围时自动地对样品运行一个或多个附加检测。在一些示例中，本文提供的设备和系统能够执行多个不同的测定，并且这些设备或系统可以运行额外的测定以确认或进一步研究通过本文提供的方法生成的结果。
使用非特异性染料进行的分析
加速成像的一个非限制性示例是使用“高亮”情况，其中细胞用浓度非常高的染料所标记。在本实施方式中，使用标记DNA、细胞膜或细胞的其他部分的非特异性染料。这个示例不使用针对特定或罕见蛋白质或其他标记物的抗体染料。
通过使用非特异性染料，可能不需要分离步骤(例如，通过离心或通过进行物理分离而分离)即可获得细胞信息。不使用这种分离步骤，可以更快速地直接转入样品成像，例如但不限于对细胞的大面积进行成像，该大面积可以包括a)非目标细胞，如红细胞(RBC)，以及b)目标细胞或感兴趣的物体，如白细胞(WBC)。因此，在对血液样品进行成像的一个非限制性示例中，可以对其中五百万个RBC和五千个或其他数目的WBC进行成像。还可以基于细胞内的特性例如但不限于细胞核的形状区分目标细胞。在一个实施方式中，使用细胞核染色剂对样品中的细胞的细胞核进行染色，并且基于特定细胞所具有的染色的种类和量(例如，细胞核染色的存在，或者被染色的细胞核的形状，或者其他特性)，可以根据该染色来确定其细胞类型，即使该染料是非特异性的。在另一个示例中，细胞中的其他内部形状(例如，细胞质中是否具有颗粒或其他物体)可以是指示性的或特征性的，并且用来鉴定和量化样品中的细胞。对于尿液样品，样品中存在的任何细胞和晶体形状都可以用来鉴定样品并确定是否发现异常。这样，非特异性染料的应用可以用于以能够在需要时用来确定细胞的方式对细胞进行快速成像。
使用多个激发或检测通道进行的分析
在使用甚至更小的样品体积进行细胞计数法的情况下，在先进的细胞计数测定的实施方式中，可以使用额外的激发或检测波长。例如，为了在淋巴细胞亚群测定中对WBC进行分类，将对诸如T细胞、B细胞、K细胞和其他细胞等各种细胞进行计数。在这种情况下，仅使用两种标记物来确认该细胞是淋巴细胞。为了对血液样品中的细胞进行进一步的亚分类，例如，可以再次使用两种标记物。因此，如果系统只能一次检测两种颜色，那么用于该分析的波长的数目是不够的。
在一个实施方式中，可以将样品等分为两个单独的样品部分，然后可以使用样品的不同部分，在系统的一个部分中对一个组合进行成像，而在另一个部分中对另一个组合进行成像。遗憾的是，这可能造成体积和时间倍增。内置于系统中的独立通道越多，使用的这些样品部分或体积的数目就越少。
实施例
细胞处理
在实施方式中，处理生物样品以用于成像、测试和分析通常是有用的。例如，处理含有细胞的生物样品以用于成像、检测和分析通常是有用的。
生物样品的处理可包括预处理(例如，样品的制备，以用于后续的处理或测量)、处理(例如，样品的改变以使得其不同于其原始的或先前的状态)和后处理(例如，在其测量或使用之后全部样品或者一部分样品的处置)。可将生物样品分成部分，诸如血液或尿液样品的等分试样，或者例如将组织样品切片、切碎或分成两份或更多份。对诸如血液样品等生物样品的处理可包括对样品或样品的一部分的混合、搅拌、声处理、均化或其他处理。对诸如血液样品等生物样品的处理可包括样品或其部分的离心。对诸如血液样品等生物样品的处理可包括为样品的组分提供分离或沉淀的时间，并且可包括过滤(例如，使样品或其部分穿过过滤器)。对诸如血液样品等生物样品的处理可包括允许或致使血液样品凝固。对诸如血液样品等生物样品的处理可包括样品或样品的一部分的浓缩(例如，通过血液样品的沉降或离心，或对包含来自组织样品的组织匀浆的溶液的沉降或离心)以提供沉淀物和上清液。对诸如血液样品等生物样品的处理可包括对样品的一部分的稀释。稀释可以是对样品或对样品的一部分的稀释，包括对来自样品的沉淀物或上清液的稀释。生物样品可以用水，或用盐水溶液如缓冲盐水溶液来稀释。生物样品可用可以包含或可以不包含固定剂(例如，甲醛、低聚甲醛、戊二醛或其他交联剂)的溶液来稀释。生物样品可用溶液稀释，该溶液有效地使得在周围溶液与这类细胞的内部或内部隔室之间产生渗透梯度，从而有效地使细胞体积改变。例如，在稀释之后产生的溶液浓度小于细胞内部或内部细胞隔室的有效浓度的情况下，这样的细胞的体积将会增大(即，细胞将会膨胀)。生物样品可用可以包含或可以不包含渗透物(诸如，例如，葡萄糖、蔗糖或其他糖；盐，诸如钠、钾、铵或其他盐；或者其他渗透活性化合物或成分)的溶液来稀释。在实施方式中，渗透物可通过例如稳定或减小周围溶液与这类细胞的内部或内部隔室之间可能的渗透梯度，来有效地维持样品中细胞的完整性。在实施方式中，渗透物可有效地提供或增大周围溶液与这类细胞的内部或内部隔室之间的渗透梯度，有效地使得细胞至少部分地收缩(在细胞的内部或内部隔室浓度低于周围溶液的浓度时)，或者有效地使得细胞膨胀(在细胞的内部或内部隔室浓度高于周围溶液的浓度时)。
生物样品可以与包含表面活性剂的溶液相接触，这可以破坏样品中的细胞的膜，或对细胞形态学具有其他影响。例如，使RBC与低浓度的表面活性剂相接触会导致RBC失去其盘状形状而呈现出更类似于球形的形状。
可对生物样品进行染色，或者可将标记物添加到样品中，或者可以用其他方式制备样品以供样品、样品的一部分、样品的组成部分或者样品内细胞或结构的一部分的检测、可视化或量化。例如，生物样品可与包含染料的溶液相接触。染料可染色或以其他方式使样品中的细胞或细胞的一部分或者与细胞相关联的物质或分子可见。染料可与元素、化合物或样品的其他组分结合或被其改变；例如，染料可以响应于其所存在的溶液pH的改变或差异而改变颜色，或者以其他方式改变其一种或多种性质，包括其光学性质；染料可以响应于该染料所存在的溶液中存在的元素或化合物(例如，钠、钙、CO2、葡萄糖或其他离子、元素或化合物)浓度的改变或差异而改变颜色，或以其他方式改变其一种或多种性质，包括其光学性质。例如，生物样品可与包含抗体或抗体片段的溶液相接触。例如，生物样品可与包括颗粒的溶液相接触。添加到生物样品中的颗粒可充当标准(例如，在颗粒的大小或大小分布已知的情况下可充当大小标准，或者在颗粒的数目、量或浓度已知的情况下可充当浓度标准)，或可充当标记物(例如，在颗粒结合或粘附至特定细胞或特定类型的细胞、特定细胞标记物或细胞隔室的情况下，或者在颗粒结合至样品中的所有细胞的情况下)。
细胞计数法包括观察和测量细胞，诸如红血细胞、血小板、白细胞，包括细胞数目、细胞类型、细胞表面标记物、内部细胞标记物和感兴趣的细胞的其他特征的定性和定量观察和测量。在生物样品包括血液样品或是血液样品时，可将该样品分成部分，并且可将其稀释(例如，用以提供更大的体积以便于处理，用以改变样品中的细胞组分的密度或浓度，以提供期望的稀释密度、浓度或细胞数目或这些的范围，等等)。样品可以用影响凝固的试剂来处理，或者可以经处理或处置从而浓缩或沉淀样品组分(例如，可以向样品中添加乙二胺四乙酸(EDTA)或肝素，或者可以离心该样品或使细胞沉降)。可通过添加可以与特定细胞或特定细胞组分反应并将其标记的染料或其他试剂来处理样品或样品的部分。例如，标记细胞核的染料(例如，苏木精染料、花青染料、draq染料如及其他)、标记细胞质的染料(例如，曙红染料，包括荧光素染料及其他)可以单独使用或一起使用以帮助细胞的可视化、鉴定和量化。更具体的标记物，包括对细胞靶标如细胞表面蛋白质、细胞内蛋白质和隔室以及其他靶标具有特异性的抗体和抗体片段，在细胞计数法中也是有用的。
生物样品可以使用光学装置通过细胞计数法来测量和分析，所述光学设备包括，例如，光电二极管检测器、光电倍增管、电荷耦合器件、激光二极管、分光光度计、相机、显微镜或测量(单波长的、多波长的或一个范围或多个范围的光波长的)光强度、形成图像或两者兼具的其他设备。使用这样的检测器可以对包括样品或样品的部分的视野进行成像，或可以对其进行扫描，或者两者兼具。生物样品可以在处理、稀释、分离、离心、凝固或其他改变之前通过细胞计数法测量并分析。可以在样品的处理、稀释、分离、离心、凝固或其他改变期间或之后通过细胞计数法测量并分析生物样品。例如，可以在接收样品之后立即通过细胞计数法测量并分析生物样品。在其他示例中，可以在样品的处理、稀释、分离、离心、凝固或其他改变期间或之后通过细胞计数法测量并分析生物样品。
例如，可通过沉降或离心制备血液样品或其部分以用于细胞计数法。这样的样品的沉降或沉淀部分可在细胞计数分析之前重悬浮在选择的缓冲液中(例如，通过抽吸、搅拌、声处理或其他处理)。生物样品可在细胞计数分析之前用水或用盐水溶液如缓冲盐水溶液来稀释或重悬浮。用于这样的稀释或重悬浮的溶液可以包含或可以不包含固定剂(例如，甲醛、低聚甲醛或交联蛋白质的其他试剂)。用于这样的稀释或重悬浮的溶液可以在周围溶液与样品中的细胞的内部或内部隔室之间提供渗透梯度，从而有效地使样品中的一些或所有细胞的细胞体积发生改变。例如，在稀释之后产生的溶液浓度小于细胞内部或内部细胞隔室的有效浓度的情况下，这样的细胞的体积将会增大(即，该细胞将会膨胀)。生物样品可用可以包含或可以不包含渗透物(诸如，例如，葡萄糖、蔗糖或其他糖；盐，诸如钠、钾、铵或其他盐；或者其他渗透活性化合物或成分)的溶液来稀释。在实施方式中，渗透物可通过例如稳定或减小周围溶液与这类细胞的内部或内部隔室之间可能的渗透梯度，来有效地维持样品中细胞的完整性。在实施方式中，渗透物可有效地提供或增大周围溶液与这类细胞的内部或内部隔室之间的渗透梯度，有效地使得细胞至少部分地收缩(在细胞的内部或内部隔室浓度低于周围溶液的浓度时)，或者有效地使得细胞膨胀(在细胞的内部或内部隔室浓度高于周围溶液的浓度时)。
例如，可以在用包含染料的溶液稀释样品的一部分之后测量或分析生物样品。例如，可以在用包含抗体或抗体片段的溶液稀释样品的一部分之后测量或分析生物样品。例如，可以在用包含颗粒的溶液稀释样品之后测量或分析生物样品。向生物样品添加的颗粒可充当标准(例如，例如，在颗粒的大小或大小分布已知的情况下可充当大小标准，或者在颗粒的数目、量或浓度已知的情况下可充当浓度标准)，或者可充当标记物(例如，在颗粒结合或粘附至特定细胞或特定类型的细胞、特定细胞标记物或细胞隔室的情况下，或者在颗粒结合至样品中的所有细胞的情况下)。
例如，可在处理后测量或分析生物样品，该处理可以将一种或多种细胞类型与另外一种或多种细胞类型分开。这样的分离可通过重力(例如，沉降)、离心、过滤、与基底(例如，表面，诸如壁或微珠，其包含抗体、凝集素或可优先于另一种细胞类型而与一种细胞类型结合或粘附的其他组分)接触或其他手段来实现。通过改变一种细胞类型或多种细胞类型可帮助或实现分离。例如，可向生物样品如血液样品中添加溶液，这导致样品中的一些或全部细胞膨胀。当一种细胞类型比另一种细胞类型或多种细胞类型更快地膨胀时，可通过在添加所述溶液之后观察或测量所述样品来区分细胞类型。这样的观察和测量可以进行一次或者多次，其选择是为了突出响应的差异(例如，大小、体积、内部浓度或受这种膨胀影响的其他性质)，并且以此提高观察和测量的灵敏度和准确度。在一些情况下，一种类型或多种类型的细胞可响应于这样的膨胀而爆裂，从而允许对样品中剩余的一种或多种细胞类型的观察和测量。
通过细胞计数法对生物样品进行的观察、测量和分析可包括光度测量，例如使用光电二极管、光电倍增管、激光二极管、分光光度计、电荷耦合器件、相机、显微镜或其他装置或设备。细胞计数法可包括制备和分析生物样品中的细胞的图像(例如，二维图像)，其中可对细胞进行标记(例如，利用荧光标记、化学发光标记、酶标记或其他标记)和板涂(例如，使之在基底上沉降)并且由相机进行成像。相机可包括镜头，并且可以附接到显微镜上或者与显微镜相结合地使用。细胞可在二维图像中根据其附接的标记(例如，根据由标记发射的光)来鉴定。
用本文公开的细胞计数器制备和分析的细胞的图像可以不包括细胞，包括一个细胞或多个细胞。可以如上文所公开的那样标记细胞或本文公开的细胞计数器的图像中的细胞。可以如上文所公开的那样标记细胞或本文公开的细胞计数器的图像中的细胞，以有效地鉴定图像以及从中取得样品的受试者。
在一些实施方式中，所述测定系统被配置为执行细胞计数测定。细胞计数测定一般用来光学、电学或声学地测量个体细胞的特性。对于本公开内容而言，“细胞”可包括通常与个体细胞大小类似的非细胞样品，包括但不限于囊泡(例如脂质体)、细胞小群体、病毒体、细菌、原生动物、晶体、通过脂质或蛋白质的聚合形成的实体以及与小颗粒如微珠或微球结合的物质。此类特性包括但不限于大小；形状；粒度；光散射图样(或光学特性曲线)；细胞膜是否完整；细胞内部内容物的浓度、形态和时空分布，包括但不限于蛋白质含量、蛋白质修饰、核酸含量、核酸修饰、细胞器含量、核结构、核含量、细胞内部结构、内部囊泡含量(包括pH)、离子浓度和其他小分子如类固醇或药物的存在；和细胞表面(细胞膜和细胞壁二者)标记物，包括蛋白质、脂质、碳水化合物，及其修饰。通过使用适当的染料、染色剂或其他标记分子，无论是以纯形式、与其他分子偶联还是固定在或结合于纳米颗粒或微米颗粒上，可利用细胞计数法确定特定蛋白质、核酸、脂质、碳水化合物或其他分子的存在、量或修饰。可通过细胞计数法测量的性质还包括细胞功能或活性的测度，包括但不限于吞噬作用、抗原呈递、细胞因子分泌、内部和表面分子的表达的变化、与其他分子或细胞或基底的结合、小分子的主动转运、有丝分裂或减数分裂；蛋白质翻译、基因转录、DNA复制、DNA修复、蛋白质分泌、凋亡、趋化性、迁移性、粘附、抗氧化活性、RNAi、蛋白质或核酸降解、药物反应、传染性和特定途径或酶的活性。细胞计数法也可用来确定关于细胞群体的信息，包括但不限于细胞计数、总群体的百分比和样品群体中任何上述特性的变化。本文描述的测定可用来对各个细胞测量一种或多种上述特性，其可以有利于确定不同特性之间的相关性或其他关系。本文描述的测定也可用来独立地测量多个细胞群体，例如通过用对不同细胞系具有特异性的抗体标记混合细胞群体。显微术模块可允许用设备执行组织学、病理学或形态学分析，并且也利于同时基于物理和化学特性对物体的评估。可以将组织匀浆化，洗涤，沉积在容槽或载玻片上，干燥，染色(例如使用抗体)，温育，然后成像。当与本文其他部分描述的数据传输技术结合时，这些创新推动将来自CMOS/CDD或类似的检测器的图像传输给例如有执照的病理医生进行检查，这是使用仅执行流式细胞术的传统设备所不可能的。细胞计数器可以测量表面抗原以及细胞形态学；与传统血液学实验室设备相比，表面抗原使得能够更灵敏且特异性地测试。细胞测定的判读可以通过门控一个或多个测量而自动化；门控阈值可以由专家设置或基于统计方法从训练数据学习；门控规则对于受试个体和/或受试者群体可以是特异性的。
在一些实施方式中，细胞计数器模块并入到服务点设备中提供了一般由普通实验室设备和实验室测量的细胞属性的测量，以供接受过正规训练的医务人员进行判读和检查，从而改善了作出临床决策的速度或质量。服务点设备因此可配置用于细胞计数分析。
实施例1
获得含有包括自然杀伤细胞和嗜中性粒细胞在内的血液白细胞的细胞样品。该样品用既能够结合自然杀伤细胞又能够结合嗜中性粒细胞的荧光标记的标识结合剂(抗CD16结合剂)处理。该样品还用细胞核染料()处理。该样品通过荧光显微术和暗视野显微术进行成像。记录并分析样品中不同细胞的荧光水平和光侧向散射水平。包含抗CD16结合剂信号的分割图像提供了关于每个细胞的荧光强度(对应于CD16表达水平)和每个细胞的大小的定量信息。暗视野图像提供了关于每个细胞的散射性质的定量信息。分割包含DNA染料信号的图像以确定细胞核的荧光强度、大小和形状。
如图1A中所示，基于不同细胞的CD16荧光和光散射的测量鉴定两个主要细胞组群。具有明亮/高CD16荧光信号和高散射的细胞组(图1A，右侧圆圈)为嗜中性粒细胞。具有中等CD16荧光信号和低散射的细胞组(图1A，左侧圆圈)为自然杀伤细胞。虽然对不同细胞的荧光和光散射的测量提供了足以将样品中的大部分细胞分类为自然杀伤细胞或嗜中性粒细胞的信息，但是对于一些细胞来说，对这些属性的测量并不能提供足以高准确度地对这些细胞进行分类的信息。例如，对细胞的荧光和光散射的测量没有提供足以对图1A中的最小圆圈(即，中间的圆圈)中的小组细胞进行准确分类的信息。为了鉴定在最小圆圈内的细胞是自然杀伤细胞还是嗜中性粒细胞，检查它们的细胞核染色()和全细胞(抗CD16)染色图像。获得细胞核面积和总细胞体积的定量测量值，并确定细胞核面积与总细胞面积之比。如图1B所示，自然杀伤细胞(“NK”)和嗜中性粒细胞(“Neu”)之间的细胞核面积与总细胞面积之比具有明显不同。因此，应用定量显微术检查样品中细胞的多种属性允许对细胞进行明确分类。图1C显示了来自图1A中最小圆圈内的自然杀伤细胞的图像。所有图像都具有相同的长度标度。左侧图像是对全细胞面积进行染色(抗-CD16)的细胞，而右侧图像是仅进行细胞核染色()的相同细胞。顶行和底行的图像是自然杀伤细胞的不同示例。图1D显示了来自图1A中最小圆圈内的嗜中性粒细胞的图像。所有图像都具有相同的长度标度。左侧图像是对全细胞面积进行染色的细胞，而右侧图像是仅进行细胞核染色的相同细胞。顶行和底行的图像是自然杀伤细胞的不同示例。
另外，嗜中性粒细胞的细胞核具有独特的多叶形状，而自然杀伤细胞(以及其他淋巴细胞)的细胞核是圆形的、均匀的且平滑的。图像分割算法可用来基于细胞核本身的形状对细胞进行鉴定和分类。图像分割在下面的实施例7中进一步讨论。
实施例2
获得含有血小板的样品。血小板用荧光偶联的抗-CD41和抗-CD16抗体进行标记。也向样品中添加直径为3μm的微珠。将样品在10x和20x放大倍数下进行成像(图2A)。测量单个血小板的荧光分布的强度(来自两种抗体)，并且确定其具有高斯分布形状(图2B)。将单个血小板的荧光测量值作图，并确定强度分布的拟合(图2C)。在图2C中，灰线是在单个血小板间测得的荧光强度，而黑线是拟合线。拟合参数，诸如高斯平均值、方差、体积、宽度以及基底面积等，可以作为血小板体积的预测因子进行评估。高斯体积和拟合宽度已被确定为与血小板平均体积密切相关。
对于以上测量，3μm微珠充当用于控制准确确定最佳焦平面中的变异以及该变异对体积测量的影响的参照和基准。
另外，基于拟合二维模型估计的血小板大小可以被校准至正常范围内(图3)。
实施例3
获得含有红细胞(“RBC”)的血液样品。RBC用低浓度的表面活性剂(DDAPS或SDS)处理，导致RBC呈类似于球形的形状。RBC在两个不同的容槽中通过暗视野显微术进行成像：(A)仅允许单纯的落射照射的容槽(图4A)；(B)允许混合的落射和透射照射的容槽(图4B)。与仅允许单纯的落射照射的容槽相比，在允许混合的落射和透射照射的容槽中，RBC更为可见(图4)。
实施例4
获得含有嗜中性粒细胞的样品。在嗜中性粒细胞中，细胞核的形状和染色质形态学可以指示出该细胞是不成熟的“带状核”嗜中性粒细胞还是成熟的“分叶核”嗜中性粒细胞。带状核嗜中性粒细胞是刚从骨髓中出现的不成熟的嗜中性粒细胞。带状核嗜中性粒细胞的此例的增加可以指示出进展中的感染或炎症。
将样品与荧光标记的抗-CD16抗体相混合，该抗体识别嗜中性粒细胞上的细胞表面受体CD16。样品还用荧光细胞核染料染色。样品通过荧光显微术进行成像，以从细胞中获得细胞核染色和CD16染色数据。带状核嗜中性粒细胞通常与成熟的分叶核嗜中性粒细胞具有相似的CD16表达水平，因此仅凭通过CD16染色获得的荧光强度不能对二者进行区别。
包括图像分割在内的图像分析用来识别带状核嗜中性粒细胞和分叶核嗜中性粒细胞的细胞核染色和形态学，由此允许对嗜中性粒细胞进行分类。检查了细胞核的大小、形状和荧光强度。另外，分析细胞核以确定分叶数目(细胞核区域内强度的峰)、细胞核的分叶之间的距离以及细胞核轮廓的曲率的变化(二阶导数)。图5A显示了带状核嗜中性粒细胞的代表性图像。在这些图像中，细胞核显示为浅灰色，而细胞质显示为深灰色。由于嗜中性粒细胞通过髓系谱系分化，因此它们在达到完全成熟前发展出特征性的“U”形细胞核。图5B显示了分叶核嗜中性粒细胞的代表性图像。在这些图像中，细胞核显示为浅灰色，而细胞质显示为深灰色。分叶核嗜中性粒细胞的细胞核具有多个节段/分叶(通常约3-5个)。因此，这种分析支持对血液中不同的嗜中性粒细胞亚群的鉴定和量化。图像分割在下面的实施例7中进一步讨论。
实施例5
从慢性淋巴细胞白血病(CLL)受试者中获得细胞样品。目标是对来自受试者的B细胞上的CD5表达程度进行量化。选择抗-CD20抗体作为B细胞的结合剂。用第一有色荧光团标记的抗-CD20抗体与样品混合。经过适当时间的温育后，洗涤样品，去除未结合的抗-CD20抗体。使样品暴露于能够激发第一荧光团的光源，并使用分光光度计测量荧光信号。基于该荧光信号，确定样品中B细胞的近似浓度。经确定的B细胞的近似浓度实际上在样品中B细胞的真实浓度的1.5倍内。
基于样品中B细胞的近似浓度，向样品中添加适量的抗CD5结合剂，以使CD5表达与CD5荧光之间的比例关系得到保持。该抗-CD5结合剂与第二荧光团偶联，第二荧光团与第一荧光团(附接于抗-CD20结合剂上)具有不同的峰值激发波长。将抗-CD5抗体添加至样品中，然后使样品中的单个细胞暴露于能够激发第二荧光团的光源，并测量来自单个细胞的荧光信号。基于来自细胞的荧光信号，确定样品内的B细胞中CD5的平均量。
虽然该实施例在CD5的情况下进行了描述，但是应当理解，获得近似计数来指导添加所需量的材料以用于后续步骤的这个概念并不限于CD5，不排除将此概念用于其他类型的细胞、分析物或物体。
实施例6
根据本文公开的方法，可以对血液细胞进行成像、鉴定和量化。例如，生物样品中的细胞的二维图像(其中细胞被标记(例如，用荧光、化学发光、酶或其他标记)、板涂(plate)(例如，使之沉积在基底上)并由相机进行成像)可以如本实施例所述进行准备和分析。该相机可包括镜头，并且可以附接至显微镜上，或者与显微镜结合使用。细胞可以通过其附接的标记(例如，由标记发射的光)在二维图像中鉴定。
将通过手指针刺获得的80微升全血加载至预装载有2mg/mlEDTA的带盖样品容器内。在这种情况下，使用封闭的样品容器(具有可移除的或可刺穿的盖)；应当理解，可以使用任何适合于支持这种小体积样品的器皿，包括但不限于带盖的器皿或不带盖的器皿。该样品容器以1200xg离心5分钟，以使血细胞与血浆分离。样品容器的离心导致样品容器内的血液样品分离为两个主要的组分(从样品容器的上部到底部)：1)血浆，和2)压积的血细胞。该过程确保了没有血液小滴保持分离，而是与液体的主体合并在一起。另外，该过程将细胞与血浆的元素分离开来，从而减少代谢并允许样品的更长时间储存。
将离心后的样品容器加载至包含多种流体隔离的试剂、尖端和细胞计数容槽的筒匣内。该筒匣包含测定所需的所有试剂。将筒匣加载到至少配备有离心机、移液管和用来加载容槽的平台的设备内。该设备内的移液管具有多个管嘴，一些管嘴与其他一些管嘴具有不同的尺寸。
在该设备内，使移液管上的管嘴降至容槽承载工具上，使之与该承载工具上的相应孔洞相接合。随后将该工具移动至筒匣，并降至细胞计数器容槽上。然后该工具上的针能够与容槽上相应的孔洞相接合并将其提起。将容槽转移至位于该设备其他部位的加载站。
接下来，在设备内部，使移液管的较大管嘴降至筒匣内，以与储存在该筒匣中的移液管尖端相接合。然后该移液管和尖端一起使用，以通过将移液管尖端定位于样品容器中的样品内并反复将物质吸入尖端及从尖端排出该物质，从而混合样品容器内的细胞和血浆。一旦细胞在血浆中重悬浮，使得全血样品充分混合，就吸取5微升混合的全血以提供等分试样用于测量该血液样品的性质。这5微升等分试样用于针对样品中的红细胞和血小板的测量。如下所述，除去这5微升等分试样后剩余的样品部分被用于针对样品中的白细胞的测量。
将5微升全血分配到包含磷酸盐缓冲盐水和2重量％牛血清白蛋白的混合物的容器内，以将全血稀释20倍(产生100微升的稀释样品)。剧烈混合后，将5微升该样品转移至另一器皿内，该器皿包含以下标记抗体试剂的混合物：与Alexa647(AF647)偶联的抗-CD235a、与藻红蛋白(PE)偶联的抗-CD41和抗-CD61。将该混合物温育5分钟。随后，将10微升该混合物与90微升包含＜0.1重量％的两性离子表面活性剂的缓冲液相混合。该表面活性剂分子改变红细胞膜的弯曲性质，使得所有细胞都呈现稳定的球形形状。这种变化是等体积的，因为所用的缓冲液与细胞质等渗；因此，跨细胞膜不能发生渗透性驱动的流体交换。再次温育2分钟后，将30微升该溶液与包含戊二醛、固定剂和10微米(μm)直径的非荧光微珠的溶液相混合。该混合物具有0.1％戊二醛和每微升1000个微珠的最终浓度。戊二醛快速固定细胞，从而防止细胞裂解和其他活性生物过程。
在这个非限制性示例中，移液管随后与筒匣内的尖端相接合，吸取7μL上述混合物，并将7μL混合物加载至容槽中的通道内，该容槽与承载工具一起放置在平台上。将混合物加载至容槽中后，移液管从筒匣中的容器内吸取10μL矿物油，并将一滴矿物油滴在加载的容槽通道的两个开口端。将十六烷添加至开放通道的末端，以防止液体从加载的容槽通道挥发(矿物油也有此作用)。接下来，设备水平的样品处理装置与容槽承载体/容槽组合相接合，并将该容槽承载体/容槽组合从包含筒匣的模块传送至该设备的细胞计数模块。在该细胞计数模块处，设备水平的样品处理装置将容槽承载体/容槽组合放置在细胞计数模块的显微镜载物台上。这些操作所需的时间，加上2分钟的等待时间，使膨胀细胞在成像前沉降在容槽的底部。
将容槽承载体/容槽组合放置在显微镜载物台上之后，该载物台移动到预先确定的位置，以使细胞计数器的光学系统能够观察包含样品的通道的一端。在该位置处，该光学系统中继通过来自环形灯的暗视野照射而获得的样品图像。这些图像与该光学系统在垂直于容槽平面的轴线上的致动相耦合，用来找到最佳焦平面。一旦对焦成功，该光学系统即用来在不同波长下获取样品的荧光图像，该波长与所用的荧光团相称。例如，为了使得已用偶联至Alexa647的抗-CD235标记的红细胞可视化，使用红光(630nm波长)光源来激发样品，并使用650nm与700nm之间的波长来对样品进行成像。多色镜与带通发射滤光器的组合用来从光信号中滤掉不需要的波长。由于细胞已经沉降在容槽的底部，因此在单一焦平面上的图像足以使该区域内的所有细胞可视化。
来自图像的数据由与样品处理设备相关联的控制器处理。此处使用的图像处理算法采用细胞的荧光图像，利用适应性取阈和边缘检测的组合对其进行检测。基于局部强度和强度梯度，在每个细胞周围创建感兴趣区域(RoI)。使用暗视野图像，还鉴定样品中的微珠，并在微珠周围创建RoI。对每个视野中的所有RoI进行计数，并计算其在该视野的每幅图像中的强度。由该图像处理算法输出的信息由每个RoI的形状或形态学测量值以及荧光和暗视野强度组成。该信息使用统计方法分析以将每个物体分类为红细胞(CD235a阳性，但CD41/CD61阴性)、血小板(CD41/CD61阳性且CD235a阴性)或微珠。使用诸如周长、直径和圆度的形状描述指标来计算每个红细胞和血小板的体积。由于微珠是以已知浓度添加的，所以使用整个通道上微珠与细胞的平均比例来计算细胞浓度，其单位为细胞/微升。基于为处理样品而进行的步骤，该浓度针对稀释度进行校正，以获得原始全血样品中的细胞的浓度。由样品计算以下量：1)容槽中红细胞的数目；2)容槽中红细胞的平均体积；3)容槽中红细胞的红细胞分布宽度(RDW)；4)容槽中血小板的数目；以及5)该容槽中血小板的平均体积。基于这些计算，对原始血液样品计算出以下结果：
测量的值 结果 示例性范围
红细胞的浓度(百万个细胞/微升) 4.8 4-6
红细胞的平均体积，飞升 88 80-100
红细胞分布宽度(RDW)，(％) 12 11-14.6
血小板的浓度(千个细胞/微升) 254 150-400
血小板胞的平均体积，飞升 10.4 7.5-11.5
在移取5微升等分试样用于RBC和血小板信息的分析后，使用剩余的75微升样品分析全血样品的白细胞群体。剩余的75微升全血也通过使用移液管在同一容器内反复吸取和排出样品来进行混合。将剩余的75微升混合后的全血中的约40微升吸至移液管尖端内，并用移液管转移至筒匣中的离心管内。包含血液样品的离心管被移液管接合，并且转移至并放置在该模块中的离心机内的摇摆式吊桶内。该离心机以1200xg旋转3分钟，从而将血液分离为作为上清液的含有EDTA的血浆和作为沉淀物的压积的细胞。
离心后，将离心管从离心机中取出并返回至筒匣。血浆上清液用移液管移出，并转移至筒匣中的单独的反应器皿内。利用移液管从筒匣中的反应器皿中吸取16微升重悬浮缓冲液，并将其添加至离心管中的细胞沉淀物中。然后通过用移液管在离心管中反复吸取和排出混合物，将细胞沉淀物重悬浮在重悬浮缓冲液中。接下来，移液管吸取21微升重悬浮后的全血，并将其添加至含有2微升抗CD14-PacificBlueTM和的另一器皿中，混合，并温育2分钟。然后将20微升该混合物添加至80微升裂解缓冲液中。该裂解缓冲液是包含皂苷(一种温和的表面活性剂；可以使用的其他表面活性剂包括阴离子型、阳离子型、兼性离子型和非离子型表面活性剂化合物，例如，如上讨论的)和低聚甲醛(固定剂；可以使用的其他固定剂包括甲醛、戊二醛和其他交联剂)的溶液。去污剂导致在细胞膜上形成大量的孔洞。红细胞由于其独特的膜性质而对这种孔洞形成特别敏感，并完全裂解，其内容物漏出到周围的液体中。固定剂的存在防止了白细胞的非故意裂解。血小板也保持未裂解状态。这个步骤的目的是从混合物中去除完整的红细胞，因为它们以约1000∶1的比例远远超过白细胞的数目。血小板不干扰成像，因此与该过程无关。裂解缓冲液还含有已知浓度的10μM非荧光微珠。
温育5分钟后，该器皿再次以1200xg离心3分钟。通过移液管尖端吸取上清液，去除红细胞伪影和其他细胞残渣，并将其放置在筒匣中的废物区域内。在细胞沉淀物中存在约15微升具有压积的白细胞的液体。
为了确定细胞沉淀物中存在的白细胞数目的粗略近似值，移液管首先将白细胞在器皿内进行重悬浮，然后吸取液体以供传送至分光光度计并由其进行检查。用波长为632nm的光照射白细胞悬浮液，该波长是Alexa647染料和的激发波长。该细胞悬浮液发射的光通过650nm长通滤光器滤过，并在分光光度计内进行测量。将该测量值与以前生成的校准曲线相关联，以估计出该细胞悬浮液中白细胞的粗略浓度。通常，细胞浓度在约1000个细胞/微升到100,000个细胞/微升的范围内。使用该估计值计算适当的稀释因数以确保容槽中的细胞浓度被限制在预先限定的目标浓度上下两倍的范围内。这个步骤的目的是确保细胞在容槽上不会以过高或过低的密度存在。如果细胞密度过高，图像处理算法的准确性会受到损害，而如果细胞密度过低，则会采集到数目不足的细胞。
基于在上述步骤中计算出的稀释因数，将包含标记的抗CD45(泛白细胞标记物)、CD16(嗜中性粒细胞标记物)和CD123(碱性粒细胞标记物)的抗体的稀释液添加至细胞悬浮液中并进行混合。
一旦与容槽承载体复合的容槽被置于容槽承载体区块上，就将10微升重悬浮于细胞计数缓冲液中的白细胞混合物加载至该容槽的两个通道中的每一个内。将该混合物加载至容槽通道内后，移液管从筒匣中的容器内吸取10μl十六烷，并将一滴矿物油滴在容槽中加载有白细胞的两个通道的两个开放末端上。
接下来，设备水平的样品处理装置与容槽承载体/容槽组合相接合，并将该容槽承载体/容槽组合从包含筒匣的模块传送至该设备的细胞计数模块。在该细胞计数模块处，设备水平的样品处理装置将该容槽承载体/容槽组合放置在细胞计数模块的显微镜载物台上。将容槽承载体/容槽放置在显微镜载物台上之后，如以上对于RBC/血小板混合物所述，对包含白细胞的容槽的两个通道进行成像。
白细胞的暗视野图像用于对视野内的细胞数进行计数(如图9A所示)。细胞表面标记物用来确定图像中单个白细胞的细胞类型；例如，CD14标记单核细胞；CD123标记嗜碱性粒细胞；CD16标记嗜中性粒细胞；CD45-AF647用来标记所有的白细胞(图9B-9E)。细胞核染色剂用来标记细胞核，因此将有核细胞(如白细胞)与没有细胞核的成熟红细胞区分开来(图9F)。
此处使用的图像处理算法采用细胞的荧光图像，利用适应性取阈和边缘检测的组合对其进行检测。基于局部强度和强度梯度，在每个细胞周围创建感兴趣区域(RoI)。使用暗视野图像，还鉴定样品中的微珠，并在微珠周围创建RoI边界。对每个视野中的所有RoI进行计数，并计算其在该视野的每幅图像中的强度。由该图像处理算法输出的信息由每个RoI的形状或形态学测量值以及荧光和暗视野强度组成。该信息使用统计方法分析以将每个物体分类为淋巴细胞、单核细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞或微珠。基于不同类型的细胞的计数、对应的微珠计数和在样品处理过程中使用的稀释比例，计算出每微升原始全血中细胞的绝对浓度。这对所有白细胞和每个亚型进行计算，并报告为绝对浓度(每微升的细胞数)和比例(％)。
这类测量结果的图像和图形的示例呈现在图9、10和11中。
图9显示来自全血样品的血细胞的代表性图像；这些图像是使用不同的成像技术和染色拍摄的。图9A所示的图像是使用暗视野照射拍摄的全血中的细胞的图像。图9B所示的图像拍摄自来自全血的细胞，显示了来自用PacificBlue染料标记的抗-CD14抗体的荧光；发荧光的细胞为单核细胞。图9C所示的图像拍摄自来自全血的细胞，显示了用PECy5染料标记的抗-CD123抗体的荧光；发荧光的细胞为嗜碱性粒细胞。图9D所示的图像拍摄自来自全血的细胞，显示了用PE染料标记的抗-CD16抗体的荧光；发荧光的细胞为嗜中性粒细胞。图9E所示的图像拍摄自来自全血的细胞，显示了用AF647染料标记的抗-CD45抗体的荧光；所有白细胞均在这些条件下发荧光。图9F所示的图像拍摄自来自全血的、用对细胞核进行染色的细胞。因此，白细胞和血小板在这些条件下被染色并且发荧光，但红细胞(缺乏细胞核)没有被染色并且不发荧光。
图10显示了全血细胞中的细胞类型的代表性合成图像，它来自由根据本文公开的方法获得的图像。图中显示了单核细胞(在图的左上象限内标记并可见，具有被蓝紫色环围绕的微红色中心)、淋巴细胞(在图的中央标记并可见，具有被暗红色环围绕的亮红色中心)、嗜酸性粒细胞(在图的左下象限内标记并可见，具有被红色边界围绕的绿色中心)和嗜中性粒细胞(在图的右下象限内标记并可见，具有被黄绿色边界围绕的绿色中心)的图像。
对这类血液样品中发现的各种细胞类型进行鉴定和量化是有意义的。可能有多种方法来进行这样的分类过程，在一些实施方式中，该分类过程可以被认为是多维分类的一个统计学问题。应当理解，在本领域中有众多的方法可用于解决这些类型的分类问题。以下提供了这类分析的一个特定实施方式。
图11显示了通过该实施例中描述的细胞计数测定而鉴定并量化的各种细胞类型的图形。图11A显示了按照标记物FL-17(用PacificBlue染料标记的抗CD14抗体)强度对FL-9强度(暗视野散射信号)的斑点(细胞)图形，用来鉴定单核细胞。图11B显示了按照标记物FL-19(用PE-CY5染料标记的抗CD123抗体)强度对标记物FL-15(用PE染料标记的抗CD16抗体)强度的斑点(细胞)图形，用来鉴定嗜碱性粒细胞。图11C显示了按照标记物FL-15(用PE染料标记的抗CD16抗体)强度对标记物FL-11(用AF647染料标记的抗CD45抗体)强度的斑点(细胞)图形，用来鉴定淋巴细胞。图11D显示了按照标记物FL-15(用PE染料标记的抗CD16抗体)强度对FL-9强度(暗视野散射信号)的斑点(细胞)图形，用来鉴定嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。
对单核细胞的初始鉴定(9.6％，如图11A所示)用来指导后续对嗜碱性粒细胞的鉴定(0.68％，如图11B所示)。如图11A和11B所示对单核细胞和嗜碱性粒细胞的鉴定用来指导后续对嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的鉴定(WBC中68％为嗜中性粒细胞，3.2％为嗜酸性粒细胞，如图11D所示)。最后，如图11C所示鉴定淋巴细胞(图11C中绘出93％的WBC，对应于原始样品中18％的细胞)。
本发明的方法与其他方法有良好的相关性。使用EDTA抗凝的全血获得白细胞、红细胞和血小板的计数。进一步对白细胞进行计数，以确定样品中嗜中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞的数目。在图12中所示的测量中，EDTA抗凝的全血样品被分成2份，一份样品使用本文公开的方法在本文公开的系统上运行。另一份样品在AbbottCELL-DYNRubySystem(AbbottDiagnostics，LakeForest，IL，USA)上运行，这是一种商品化的多参数自动血液分析仪。用两种方法获得的结果的比较显示于图12中。
如图12A-12C所示，通过本发明方法所测得的白细胞(“WBC”，图12A)、红细胞(“RBC”，图12B)和血小板(图12C)数目与通过其他方法对本发明方法所分析的相同样品的相应等分试样所测得的WBC、RBC和血小板数目有良好的相关性。如图12D-12F所示，通过任一方法所测得的嗜中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞数目非常近似，并且彼此之间有良好的相关性。在本文公开的方法的实施方式中，可以对血液样品进行稀释以减少或消除红细胞重叠。例如，从中获得红细胞计数的样品通常被稀释约400倍到约1000倍，以便红细胞会充分分离以用于准确的计数。如果是有利的或需要的，此类稀释通过连续稀释进行(例如，其中样品或其部分被第一次稀释以提供第一稀释样品，并且该第一稀释样品(或其部分)按需要被进一步稀释一次、两次或更多次，以提供所需的稀释液)。如上所述，可以将微珠引入到这样的稀释样品中，以提供对稀释液的独立测量：由于添加的微珠的数目已知，所以最终(稀释的)样品中微珠的数目的计数或浓度可用于计算获得的稀释液的真实量。通常，每个微珠约5-7个RBC的比例提供理想的RBC与微珠的比例。可选地，溶液也可以具有防止微珠相互粘附的组分。在一个非限制性示例中，当在稀释步骤之前，特别是在用来产生200倍或更高稀释度的连续稀释步骤中，将已知数目或浓度的参照体如微珠或其他结构加至未稀释的样品中时，其使用可能是特别有用的。只要样品和微珠在每一抽吸步骤之前良好混合，这就会降低稀释步骤中不准确性的影响并使该方法对这些多重稀释步骤中的分配误差不敏感。可选地，一些实施方式可以在多步骤稀释过程的第一稀释步骤之后加入参照体。可选地，一些实施方式可以在多步骤稀释过程的第二稀释步骤之后加入参照体。
在本文所使用的术语的方面中，术语“细胞计数法”是指与生物样品的细胞相关的观察、分析、方法和结果，其中细胞基本上静止在流体中或基底上。通过细胞计数法检测并分析的细胞可由任何光学检测器、电检测器或声学检测器检测和分析。细胞计数法可包括制备和分析生物样品中或者来自生物样品的细胞的图像(例如，二维图像)。可以对细胞进行标记(例如，利用荧光标记、化学发光标记、酶标记或其他标记)、板涂(例如，使之沉降于基底上)并通常由相机进行成像。显微镜可以用于细胞计数法中的细胞成像；例如，细胞可由相机和显微镜进行成像，例如，由使用显微镜来形成图像的相机进行成像。由细胞计数法形成并且用于细胞计数法的图像通常包括不止一个细胞。
实施例7
该实施例呈现了对来自血液样品的白细胞图像进行连续分割的方法和结果。其他合适的方法包括对图像进行求和，包括提供多幅图像的加权平均值，以提供用于确定细胞边界的图像。可以一起或单独地使用细胞核染色染料和其他染料，包括用于与特定细胞标记物结合的标记的抗体，以获得用于分析的图像。例如，可使用分别用每种染料或标记物获得的图像来获取细胞大小和细胞边界估计，或者可以组合一些或所有图像以用于分析。本方法提供了用于估计细胞大小以及用于确定由本文公开的设备和系统成像的细胞边界的相关和改良方法。应当理解，这些方法对于通过其他设备和系统成像的细胞的分析也是有用的。
分割对于确定图像的轮廓是有用的，例如，对于在包含一个或多个物体和(通常)背景或其他特征的更大图像内，确定物体的图像的轮廓(例如，边界，诸如最佳轮廓)是有用的。连续分割是迭代过程，当其被应用于生物样品中的细胞的图像时，通过利用导致最终、最优的(或足够准确的)结果的连续规程，可用来提供逐渐变好的细胞轮廓。本实施例中呈现的结果展示了对单独的白细胞的荧光图像应用连续分割，其中使用细胞核染色剂来显示细胞内的感兴趣区域(例如，提供细胞核的图像)，该感兴趣区域用作种子，连续分割方法以该种子为基础用于确定包含这些细胞核的细胞的外边界。
可用于此类图像及其分析的染料和染色剂包括本文公开的染料和标记物，诸如，例如，DAPI、碘化丙啶，或其他DNA染色染料；PE、PacificBlueTM、别藻蓝蛋白(APC)、Alexza和其他染料。
对使用荧光显微图像获得的WBC图像应用分割，以寻找每个细胞的将其与图像背景分开的轮廓(例如，最佳细胞轮廓)。细胞的感兴趣区域(ROI)被定义为轮廓内部的区域，并用于计算形状和大小度量如面积、体积和圆度，以及强度测量值如强度平均值、中值、最小值和最大值。在图15B中，示出了细胞(亮)、背景(暗)和轮廓(红色)的示例。图15B所示的轮廓通过如本实施例所述的连续分割来确定。
对于每个视野(FoV)，用不同的滤光器获得了多幅荧光图像，每一个滤光器突出显示不同的WBC类型。不同荧光图像类型的示例可见于图13A-E中；图13A是暗视野图像，图13B来自标记的抗-CD45抗体，图13C用细胞核染色剂成像，图13D来自标记的抗-CD16抗体，而图13E来自标记的抗-CD123抗体。
图13示出了使用显微术获得的白细胞(WBC)图像，其用于进行连续分割分析以确定每个细胞的轮廓并由此将细胞图像与背景图像区分开来。图13A是暗视野图像；图13B是示出了用抗-CD45抗体标记细胞的荧光图像，图13C是示出了用标记细胞的荧光图像，图13D是示出了用抗-CD16抗体标记细胞的荧光图像，而图13E是示出了用抗-CD123抗体标记细胞的荧光图像。
分割方法的假设是，给定细胞核的所需细胞轮廓可以在细胞面积最大的图像中找到。该方法由以下步骤组成：
1)使用以染色的图像对细胞核进行分割。
2)对于每个获得的图像：使用分水岭分割使细胞区域增长，用分割的细胞核初始化。
3)对于每个细胞核：找到在所有图像中具有最大面积的细胞ROI，并将其记录为该细胞的最终分割。
使用以染色的图像检测细胞核。使用适应性取阈法找到ROI，其中如果像素强度比邻近像素中的平均强度高出一定的量，则将该像素的强度设置为前景。像素强度在图像之间是变化的；例如，像素强度随其距局部最大强度值的距离而降低。这种像素强度(随其距局部最大值的距离增加而)降低的变化率用于确定成像的物体的边界或边缘。然后用该边界计算成像的物体(例如，当使用或其他细胞核染色剂时的细胞核)的大小。如果ROI在容许的大小范围内，则将其分类为细胞核。图14C示出了用染色的图像，其中以蓝色显示了以这种方式鉴定的细胞核轮廓。
每个细胞核ROI均假定为在细胞ROI的内部。通过使已经分割的细胞核ROI周围的区域增长来进行图像中的细胞分割。停止标准可以基于梯度幅值、强度信息或其他因素或因素的组合。可以使用的分割技术的示例为活动轮廓法、测地线活动轮廓法和分水岭法。使用了分水岭算法，并且当其达到强度梯度幅值的最大值时，强度显著降低时，或当其遇到邻近的ROI时，ROI增长停止。
对每幅针对FoV获得的图像进行分水岭分割，并且存储细胞ROI。对于图像中的每个细胞核，在所有图像中此较细胞ROI面积，并且将具有最大面积的ROI记录为该细胞核的最终细胞ROI。然后将所有具有最大面积的细胞ROI组合成最终WBC分割。最终连续WBC分割的示例在图15B中示出。该方法比其他方法更准确地确定细胞区域，例如，比荧光图像的加权平均值的一过性分割更准确地找到细胞区域。图15A中所示的轮廓通过对合成细胞图像进行一次分水岭分割来确定，而图15B中所示的轮廓通过本文所述的连续WBC分割来确定。
图14示出了具有分割结果的图13中的图像。细胞核ROI用蓝色轮廓标绘，而细胞ROI具有红色轮廓。图14A是暗视野图像，其细胞核ROI以蓝色覆盖，而生成的细胞分割为红色，图14B来自标记的抗-CD45抗体，其细胞核ROI以蓝色覆盖，而产生的细胞分割为红色，图14C用细胞核染色剂成像，其分割的细胞核ROI为蓝色，图14D来自标记的抗-CD16抗体，其细胞核ROI为蓝色，而产生的细胞分割为红色，图14E来自标记的抗-CD123抗体，其细胞核ROI以蓝色覆盖，而产生的细胞分割为红色。
图14示出了使用显微术获得的白细胞(WBC)图像，与图13一样，用于进行连续分割分析以确定每个细胞的外(例如，细胞膜)和内(例如，细胞核)轮廓，并由此鉴定细胞核以及将细胞ROI从背景区域中区分出来。如通过连续分割分析所确定的，细胞图像内的线确定每个细胞的WBC核的边界。图14A是暗视野图像；图14B是示出了用抗-CD45抗体标记细胞的荧光图像；图14C是示出了用细胞核染色剂标记细胞的荧光图像；图14D是示出了用抗-CD16抗体标记细胞的荧光图像；图14E是示出了用抗-CD123抗体标记细胞的荧光图像。
WBC分割的另一种方法是对所有荧光和暗视野图像进行加权平均并且对合成图像进行一次分水岭分割。此方法可以产生对在图像中具有更多染色的细胞的偏倚。图15A示出了合成图像。来自对合成图像进行一次分水岭分割的ROI在红色轮廓中示出。图15B示出了具有用红色轮廓标绘的所述连续WBC分割的合成图像。在此情况下，对最终分割的主要贡献者来自图14B和图14D。
图15示出了图13和14所示的白细胞(WBC)的合成图像。图15A是图13和14所示的细胞的合成图像，其具有通过进行一次分水岭分割而获得的细胞轮廓。图15B是对图13和14所示的细胞的合成图像应用本文所述的连续分割的结果，示出了通过该分析获得的细胞轮廓。图15B中显示的连续分割分析相比于如图15A所示进行一次的分水岭分割似乎更好地鉴定细胞轮廓。
光学系统
现在参考图6A和6B，现在将描述适于本文使用的光学系统的实施方式。尽管在能够执行细胞计数法的情境下描述了该系统的这些实施方式，但是应当理解该系统的这些实施方式还可以具有超出细胞计数法的用途和能力。例如但非限制性地，本文公开的该系统的成像以及图像处理能力可以有多方面的应用，包括细胞计数法以外的应用。由于捕捉了被分析的样品的图像，并且在该系统中通常将图像信息链接或关联到定量测量值，人们可以进一步分析与定量测量值相关联的图像以收集图像中以其他方式不会得到报告的临床信息。
可以将例如要通过细胞计数法或其他光学或成像手段分析的样品保持在样品架中以供分析。例如，容槽可以充当这样的样品架。图6A中的实施方式示出了容槽600的透视图，容槽600包括多个开口602用来接收样品或样品的一部分以供分析。例如，可将开口602用作入口端口以将诸如流体样品之类的样品提供至通道、导管或腔室(例如，样品室)以供分析。图6A的实施方式中的水平横截面形状为矩形的水平横截面形状。尽管在容槽的情境下描述了该系统，但是应当理解其他样品保持设备也可用来替代容槽600，或与容槽600结合使用。
正如图6A实施方式中所见，开口602可以允许样品处理系统(未示出)或其他递送系统将样品放置到开口602中，开口602可以连接于或可以通向容槽中的分析区域608，可以在分析区域608对样品进行分析。在非限制性示例中，分析区域608可以是腔室。在另一非限制性示例中，分析区域608可以是通道。在实施方式中，被配置为通道的分析区域608可以连接两个入口端口602。在又一非限制性示例中，分析区域608可以是通道，其中，将样品以非流动方式予以保持。在本文的任何实施方式中，在分析期间，该系统可以以非流动方式保持样品。可选地，一些替代实施方式可以被配置用于使得样品能够在分析之前、分析期间或分析之后流经该分析区域。在一些实施方式中，在分析之后，将样品从容槽600提取出来，然后递送至另一站(在具有多个站的系统中)用于进一步处理或进一步处理或分析。一些实施方式可以在系统中使用闸门来控制样品流动。
图6A显示，在容槽600的一些实施方式中，容槽600可以具有多个开口602。样品可以经由入口端口602添加至样品架中。开口602可以与分析区域608可操作地连接(例如，流体连通)。分析区域608可以与多个开口602可操作地连接(例如，流体连通)。应当理解，一些实施方式在600中可以具有更多，或者可以具有更少的开口602。一些实施方式可以链接一定的开口602，使得所选择的成对或其他成组开口602可以接近相同通道(例如，被配置为通道的分析区域608)。作为非限制性示例，在分析区域608的每个末端可以存在开口602。可选地，在分析区域608的末端可以有不止一个开口602。
容槽600的实施方式可以具有允许样品处理系统接合和传送容槽600的结构610。图6A和6B所图示的容槽600可以经由元件610被样品处理系统接合，有效地将容槽600可以从一个位置传送至另一位置。元件610还可用来确保容槽600处于所需位置，例如传送至位置(诸如用于光学成像和分析的检测仪)之前或之后，容槽600可以由元件610保持就位，或者由使用元件610的工具或设备将容槽600保持就位。在一个非限制性示例中，结构610可以是容槽600中的开口，其允许移液管或其他细长构件接合容槽600并将其传送至所需位置。可选地，取代所述开口或与之结合，结构610可以是或可包括突起、钩、磁体、可磁化元件、金属元件或可用来接合容槽传送设备的其他特征。在实施方式中，可以向容槽600施加力(例如压缩力或其他力)；例如，可以向容槽600施加压缩力以便将容槽600压到基底或表面上(例如底座支架620的表面)，有效地将容槽600放置成与该表面有效地光学接触。在实施方式中，这样的力(例如压缩力)可以有助于提供所需要的光学性质，诸如在容槽600与底座支架620之间提供良好的接触，有效地允许光通过而在界面处没有明显的畸变或反射或在界面处没有明显的反射，或者可以提供其他所需要的光学性质。在实施方式中，可以经由结构610或经由多个结构610至少部分地施加这样的力(例如压缩力)。
如图6B所示(透视图)，容槽600可以具有圆形的水平横截面形状。开口602(或者在类似的实施方式中可以存在的多个开口602，图中未示出)可以允许样品处理系统或其他递送系统将样品储放到开口602中，该开口602继而可以通向容槽中的分析区域608，样品可以在此进行分析。合适的分析区域608的非限制性示例包括包含腔室的分析区域608，和包含通道的分析区域。在实施方式中，这样的分析区域608可以位于环形结构内，诸如图6B中所示的环形结构604内。在实施方式中，开口602可以与分析区域608连接。在实施方式中，结构604内的分析区域608可以形成连续的环状腔室，其与开口608连接，有效地允许在该腔室内在远离开口602的两个方向的任一方向上流动。在实施方式中，结构604内的分析区域608可以形成环状通道或腔室，其中一个末端与开口608连接，另一末端与开口602分离或阻断，有效地允许在该腔室内仅在远离开口602的一个方向上流动。在实施方式中，这样的单向环状通道或腔室在远离开口602的位置处可以具有通气孔或其他孔口。在又一非限制性示例中，该分析区域可以是或可包括以非流动方式保持样品的通道；样品可以以非流动方式保持在包括环状通道的分析区域608中，或者该环状通道从两个方向连接至开口602，或者该环状通道仅从单个方向连接至开口602。在本文的任何实施方式中，在分析期间，该系统可以以非流动方式保持样品。可选地，一些替代实施方式可以被配置成使得样品在分析之前、期间或之后能够流经该分析区域。在一些实施方式中，在分析之后，从容槽600提取出样品，然后递送至另一站(在具有多个站的系统中)以供进一步处理或分析。一些实施方式可以在系统中使用闸门来控制样品流动。
图6B只示出了单个环形结构604；然而，应当理解，在如图6B所示地成形的容槽600的另外实施方式中，容槽600可以具有多个环形结构604。例如，具有多个环形结构604的容槽600可以具有不同大小的同心的环形结构604，其中外部的环形结构604围绕一个或更多个内部的环形结构604。这样的环形结构604可以在每个环形结构604内包括分析区域608。图6B只示出了单个开口602；然而应当理解，在如图6B所示地成形的容槽600的另外实施方式中，容槽600可以具有多个开口602。例如，具有多个环形结构604的容槽600(例如，包含多个同心的环形结构604)可以具有多个开口602(例如，每个环形结构604可以具有至少一个开口602)。应当理解，一些实施方式在容槽600中可以具有更多，或可以具有更少的开口602。一些实施方式可以链接一定的开口602，使得所选择的成对或其他成组开口602可以接近相同的通道或腔室。作为非限制性示例，在分析区域的每个末端可以存在开口602。可选地，在分析区域608的一个末端可以存在不止一个开口602。
图6A和6B中所示的容槽的一些实施方式可以在容槽600的选定区域上提供结构604。在一个实施方式中，该结构604为肋，其为容槽的被选择以具有受控厚度的区域(例如区域613)提供结构支撑。例如，该厚度可以被选择成提供所需的光学性质，其包括光在容槽600内反射之前和之后要遵循的所需路径。这样的反射可以是部分内反射(PIR)或全内反射(TIR)。这样的反射是否发生取决于许多因素，其包括光波长；光到达表面的入射角度；(区域613和区域613边界外部的环境或材料的)材料的组成；以及其他因素。在图6A所示的实施方式中，结构604的形状是矩形的，并且有矩形的横截面。在图6B所示的实施方式中，结构604的形状是环形的，并且可以有矩形的横截面或者梯形的横截面或者其他形状的横截面。这样的结构可以具有任何合适的横截面形状。如图8B所示，这样的结构604可以具有三角形的横截面(例如，当存在多个肋时形成了锯齿形的横截面)。应当理解，这样的结构604也可以具有其他形状和横截面(例如，半圆形、椭圆形、不规则形或其他形状)，并且在实施方式中，在相同系统中可以存在不止一个形状(例如，容槽可包括矩形、三角形或其他形状的结构)。当受控厚度区域613相对于容槽的一定区域厚度减小时，可以使用结构604，并且因而可以从受益于结构604所提供的机械支撑。
除了提供结构支撑以外，结构604对于为容槽600内光的内反射提供材料和路径也是有用的。如图8A-8D所示，在容槽600内反射的光可包括在结构604内反射的光的路径(例如，肋或具有三角形横截面的结构，如图所示，或任何其他形状，诸如圆形或半圆形横截面或其他横截面形状)。结构604可以因而提供从容槽600的表面614向外延伸的凸特征；或者可以提供从容槽600的表面614向内延伸的凹特征；或者可以在容槽600的表面614上提供凸特征和凹特征这二者。因此，结构604因而可以向容槽600提供机械支撑，可以向容槽600提供包括光学路径在内的所需光学性质；并且也可以向容槽600提供其他需要的和有用的特征和能力，如本文所公开的。
支撑结构604因而可以用来向容槽600提供结构支撑，例如包括硬度支撑。容槽600的光学性质对于其在分析区域608中的样品的光学成像和其他光学测量中的用途，以及这样的样品的单元、颗粒或其他组分的光学成像和其他光学测量中的用途可能是重要的。对于使用容槽600获得的光学测量值和图像的完整性而言可能重要的是：容槽600表面的恰当平坦度的维持，包括基底部分606或表面614或618的平坦度的维持；容槽600的恰当定向和配置的维持(例如没有扭曲、弯曲或其他畸变)；以及容槽600的恰当定位的维持(例如，在底座支架620上或光学设置内)。因而，例如在提供和维持容槽600的恰当光学性质过程中，支撑结构604和基底部分606的设计和配置可能是重要因素。分析区域608的恰当维度的维持，其包括分析区域608上表面与下表面(或侧壁)的恰当距离和相对角度的维持，对于在分析区域608内的提供对样品的正确和一致的照射可能是重要的。分析区域608的恰当维度的维持对于确保分析区域608的体积并且因此样品在分析区域608内的体积是正确的也可能是重要的。如本文所讨论的，可以向容槽600施加力(例如压缩力)以便在使用期间进一步确保恰当的平坦度，或者减少扭曲或畸变，或者以其他方式确保容槽的恰当的形状、大小和定向。应当理解可以不需要压缩力来确保在使用期间这样的恰当的平坦度以及在容槽的恰当的形状、大小和定向。例如，在实施方式中，结构604可以单独地足够帮助或确保容槽600在使用期间具有恰当的平坦度以及恰当的形状、大小和定向。另外，应当理解，在实施方式中，压缩力可以单独地足够帮助或确保在使用期间这样恰当的平坦度和容槽600的恰当的形状、大小和定向。应当理解，在实施方式中，结构604与压缩力的组合可以帮助或确保在使用期间恰当的平坦度以及容槽的恰当的形状、大小和定向的维持。
包括支撑结构606和封盖部612的容槽600可以由具有适合的光学性质的任何材料制成。在实施方式中，包括支撑结构606和封盖部612的容槽600可以由玻璃(例如，石英或硼硅酸盐玻璃或铝硅酸盐玻璃或硅酸钠玻璃或其他玻璃)制成。在实施方式中，封盖部612或底座支架620可以由丙烯酸树脂或清透聚合物(例如，环烯烃、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚氨酯、聚氯乙烯或其他聚合物或共聚物)或其他透明材料制成。除了这样的材料的光学性质之外，物理性质(例如坚度、硬度、熔点、被机械加工的能力以及其他性质)、与其他材料的兼容性、费用以及其他因素可能影响用来制造容槽600的材料的选择。如以上所讨论的，结构604的存在、压缩力的可用性(如可以经由结构610或直接施加到支撑结构606和封盖部612的至少一部分)，以及其他因素可以允许使用可以比例如石英刚度低但仍可以提供用在本文所公开的系统和方法中的必备的光学和机械性质的材料。另外，结构604的存在、压缩力的可用性以及其他因素可以允许使用否则在不存在这样的结构、压缩力和其因素的情况下可能是行不通的(例如由于变形的可能性或其他因素)制造技术和容差。另外，结构604的存在、压缩力的可用性以及其他因素可以允许使用包括比否则在不存在这样的结构、压缩力和其他因素的情况下可能使用的材料成本小的材料在内的材料。
因而，对于容槽606及其用途而言，支撑结构64和基底部分606的恰当的设计、构造和材料是重要的。
在一些实施方式中，将这些受控的厚度区域613(例如，见图8A、8B和8D)选择成定位在分析区域608之上。在一些实施方式中，这些受控厚度区域613可以在分析区域之上或附近给予一定的光学性质。一些实施方式可以将该结构604配置成还对穿过容槽600的光给予光学性质。可选地，在一些实施方式中，结构604可以被配置成不对容槽600的光学性能产生影响。在这样的实施方式中，结构604可以被配置成具有一个或更多个光学吸收表面。例如但非限制性地，一定的表面可以是黑色的。可选地，一些实施方式可以具有由吸光材料形成的结构604。可选地，结构604可以被定位成提供机械支撑但是不与该分析区域附近的容槽600的光学性质相互作用。
例如，一定的表面，其包括受控的厚度区域613的表面614和结构604的表面618，可以涂覆有黑色或其他颜色的涂层。这样的涂层可包括一层，也可包括多个层。例如表面614或618的适合的涂层可包括2、3、4、5、6、7层或更多层。在实施方式中，例如结构604的表面(如表面618)或表面614可以被覆盖3个或5个涂层。这样的涂层可包括染料、墨水、涂料、表面处理部、带颜色的胶带或其他涂层或表面处理部。在实施方式中，黑色或其他颜色的标记物(例如PapeMate或Sharpie，或MagicMarker，或其他标记物)可用来对受控厚度区域613的表面614，或结构604的表面618进行涂覆。例如，超大的黑色标记物可用来向表面614或结构604的外表面618涂敷多层黑色墨水以提供光学吸收表面，并且因此改善了容槽600的光学性能。在实施方式中，可以涂覆或处理表面614或618以便影响或减少在该表面的反射率(PIR或TIR)。在该表面的反射率的减少可以影响(例如减少)来自表面的背景照射。
在实施方式中，可以将一定的表面，其包括受控厚度区域613的表面614以及结构604的表面618，涂覆或覆盖增强在该表面的反射率的材料。可以通过下列各项来增大在表面的反射率：例如通过对表面进行涂覆或将材料附着至表面；用于增大反射率的适合的材料，其包括铝、银、金和介电材料(例如氟化镁、氟化钙或其他盐或金属氧化物，或其他反射或介电材料)。这样的涂层或覆盖物可包括一层，或可以包括多个层。例如，表面614或618的适合的涂层和覆盖物可包括2、3、4、5、6、7层或更多层。在表面的反射率的增大可以影响(例如增大)来自表面的透射照射。在表面的反射率的增大可以帮助或增强样品在分析区域608内的成像；或者可以帮助或增强分析区域608内对样品的光学分析。
应当理解，容槽600一般是由光学透明材料或光学透射材料制成的。可选地，仅容槽600的选定部分(例如，分析区域或与分析区域相关联的区域)是光学透明或光学透射的。可选地，容槽600中的选定层或区域也可以被配置成是非光透射的。可以对容槽的一部分或区域进行覆盖或涂覆以成为吸收光的；例如表面(或其一部分)可以涂覆有深色或吸光的染料或墨水。在再一个示例中，可以对表面(或其一部分)涂覆深色或吸光性的涂层，诸如深色或吸光的材料，诸如胶带或布料或纸张或橡胶或塑料。
图6A、6B和8A-8D图示了容槽600安置在底座支架620上的一些实施方式，其中，底座支架620的一些或全部由光学透明或透射材料制成。在一些实施方式中，光学透明或透射的部分被配置成与容槽600的分析区域对准，以允许对该分析区域内的样品的光学拾取。在一个非限制性示例中，底座支架620可以在X、Y和Z轴上移动，以将容槽600移动到所需位置进行成像。在一些实施方式中，底座支架620包含可以仅在两个轴上移动的平台或载物台。可选地，一些支撑结构可以仅在单个轴上移动。容槽600可以被配置成通过摩擦、机械耦合，或通过安装于其中一个部件或全部两个部件的挡定件与支撑结构600可操作地耦合。在实施方式中，可以将压缩力或其他力施加至容槽600或底座支架620，或此二者，以便在容槽600和底座支架620之间确保充分的接触和恰当的配合。在实施方式中，这样的压缩力可以有助于确保容槽600或底座支架620或这二者的光学透射表面是光学平坦的且基本上无畸变。例如，在实施方式中，容槽600可以被压抵底座支架620以便减少或避免可能由容槽600光学表面的缺陷或异常引起的任何光学畸变。在实施方式中，这样的力(例如压缩力)可以有助于提供所需的光学性质，有效地允许光在界面处无畸变地通过，而以其他方式可能产生畸变。在实施方式中，经由结构610或经由多个结构610至少部分地施加这样的力(例如压缩力)。
图6A、6B、8A、8B、8C还示出了这样的实施方式，其中对暗视场或明视场的照射可以由置于底座支架620下面以将照射设备定位在容槽600的水平面之下的照射源650(诸如但不限于所示的环形灯)提供。该配置将容槽600的上区域留给移液管、样品处理设备或其他设备，以无障碍地接近容槽上表面上的开口或其他特征。可选地，一些实施方式可以将照射源660(阴影所示)定位在容槽600之上，以取代下方照射源(例如所示的下方照射源650)而使用、与其单个或多个组合地使用。物镜670可以如所示地进行定位，或在其他配置中，被定位成观察到被照射的样品。应当理解，容槽600与光学部分650和670之间的相对运动可以用来允许该系统使容槽600中的不同的分析区域可视化。可选地，这样的部件中的仅一个放置成处于运动中以便拾取容槽600的不同区域。
现在参照图7A，现在将更详细地描述适合的成像系统的一个实施方式。图7A示出了位于底座支架620下方的不同部件的横截面示意图。该横截面沿着由图6A中弯箭头7所指示的区域。
图7A示出这样的实施方式，其中容槽600包含基底部分606和由封盖部612限定的分析区域608。可选地，分析区域608可以被限定在单个部件内。可选地，分析区域608可以通过使用两个以上的部件进行限定，诸如但不限于针对每个分析区域608的分立的覆盖件。在一个实施方式中，层606包含光学晶透塑料，诸如但不限于递送优质光学部件和应用的环烯烃聚合物保温塑料。在一些实施方式中，一个或多个层或部件可以由玻璃、丙烯酸类、清透聚合物或其他透明材料形成。图7A所示的容槽600包括五个分离的分析区域608；这些区域的横截面显示在图中；具有这样的横截面的分析区域608可以是矩形或方形或其他形状。例如，分析区域608可以包含细长通道，其提供具有相对大的表面面积的表浅腔室，通过所述腔室可以观察到样品。在实施方式中，分析区域608可以具有弯曲的形状，或多边的形状，或不规则的形状，并且可是分离的，或者可以通过连接通道连接。应当理解，容槽600可包括单个分析区域608；或可包括两个分析区域608；或可包括三个分析区域608；或可包括四个分析区域608；或可包括五个(如图7A所示)或更多个分析区域608。
在实施方式中，容槽600中的通道，诸如分析区域608，可以具有不规则的形状，使得横截面尺寸沿该通道的长度而不同；例如，容槽600中的通道可以具有窄的末端部分和较宽的中间部分。在实施方式中，容槽600中的通道，诸如分析区域608，可以具有U形或其他形状，其中单个分析区域的第一细长部分设置在该相同分析区域608的第二细长部分的附近或旁边。例如，在这样的实施方式中，图7A中由标号为“608”的引线指示的矩形可以是相同分析区域的由该矩形所图示的部分，其紧靠由标号为“608”的引线指示的矩形的左边。
在实施方式中，可以将要拾取的样品全部或部分地保持在分析区域608中。在实施方式中，可以将样品的不止一个部分，或不止一个样品，或不止一个样品的部分，保持在分析区域608中。在实施方式中，也在容槽的通道内，例如，在分析区域608内，可以通过气泡，或通过油滴，或通过另一材料或多种材料将样品的各部分，或不同样品的各部分分离。
在实施方式中，对保持在分析区域608中的样品的分析可以包含对分析区域608的至少一部分的光学观察、测量或成像。在实施方式中，对分析区域608的至少一部分的光学观察、测量或成像可以包含对整个分析区域608的光学观察、测量或成像。在实施方式中，对保持在分析区域608中的样品的分析可以包含仅对分析区域608的一部分的光学观察、测量或成像。在实施方式中，对保持在分析区域608中的样品的分析可以包括对分析区域608的至少一部分内的感兴趣区(ROI)的光学观察、测量或成像。在实施方式中，对保持在分析区域608中的样品的分析可以包含对分析区域608内的多个ROI的光学观察、测量或成像。例如，在容槽600中的通道具有窄的末端部分和较宽的中间部分的情况下，可以在该较宽的中间部分中观察、测量或成像多个ROI，而在较窄的末端部分例如仅观察、测量或成像单个ROI(或无ROI)。
举非限制性示例而言，底座支架620下方的光学器件可包括包含环面反射器652和光源654的环形灯650。可以使用适合于暗场照射的其他照射部件；因而所述光学器件可包括单独的或与这样的环形灯组合的其他照射源。一些实施方式可以使用反光镜。一些实施方式可以使用涂覆的反射表面。一些实施方式可以使用与该图中所示的反射器不同的反射器(例如，在照射样品时可以不使用环面反射)。一些实施方式可以使用抛物面反射器。一些实施方式可以使用椭圆抛物面形状的抛物面反射器。一些实施方式可以使用多个单独的反射片。一些实施方式可以不使用任何反射器。一些实施方式可以在具有或不具有来自一个或更多个外部反射器的情况下，通过使用被定位成引导光的成角度的光源获得倾斜的照射。
多个波长的光可由一个或多个光源同时或顺序地发射。图7A所示的实施方式示出了激发能量源680、682和684，诸如但不限于被安装成将光引导到分析区域608中的样品中的指定波长的激光二极管。在便于紧凑封装的非限制性示例中，能量源680、682和684可以将光引导至二向色元件690(例如二色分光反光镜或分束器)，其继而将激发波长引导到分析区域608中。激发波长造成样品中的标记物、染料或其他材料中的荧光团发射荧光波长。所发射的荧光波长通过物镜670、通过二向色元件690、通过可选的滤光轮692漏到检测器700中，诸如但不限于相机系统。举非限制性示例而言，二向色元件690被配置用于反射激发波长而使荧光波长和光学观察所需的任何波长通过。
可同时或顺序地获取多个波长的光。在一个实施方式中，所有的荧光激发波长同时照射分析区域608中的样品。例如，检测器700可以耦合至可编程处理器710，可编程处理器710可以取得所捕捉的信号或图像，并且对与发荧光的荧光团相关联的那些波长进行解构。在一些实施方式中，激发源可以顺序地对样品进行照射，或采用整个激发源数目中的子集进行照射。当然，应当理解该系统不限于对样品中的荧光团的基于荧光的激发，而其他检测技术或激发技术可用来取代荧光，或与荧光单个组合或与其多个组合地使用。例如，一些实施方式还可以与荧光检测器组合地，同时或顺序地收集暗场照射散射信息。
在另外的实施方式中，对样品的照射通过一个或多个光斑点在样品上(例如，在分析区域608内或在分析区域608内的ROI内，或包含分析区域608的ROI内)扫描一段时间来完成。这样的一个斑点或多个斑点可以包含光点，或可以包含光线，或可以包含其他形状，或可以包含其组合。这样的扫描例如可以是光栅扫描(例如，其中被照射的区域形成了一系列相邻的(点或点划的)线)、矩形扫描(例如，其中被照射的区域形成了由(点或点划的)线界定的嵌套的正方形或矩形)、螺旋扫描(例如，其中被照射的区域形成了(点或点划的)螺旋线图案)、或其他形状或图案的扫描。
相似地，样品的检查可以一次完成，或可以在一段时间内通过测量样品上(例如，在分析区域608内或在分析区域608内的ROI内，或包含分析区域608的ROI内)来自光的一个斑点或多个斑点的光来完成。可以记录这样的测量。这样的一个斑点或多个斑点可以包含光点，或可以包含光线，或可以包含其他形状，或可以包含其组合。这样的扫描例如可以是光栅扫描(例如，其中被照射的区域形成了一系列相邻的(点或点划的)线)、矩形扫描(例如，其中被照射的区域形成了由(点或点划)线界定的嵌套的正方形或矩形)、螺旋扫描(例如，其中被照射的区域形成了(点或点划的)螺旋线图案)、或其他形状或图案的扫描。
这样的扫描(用于照射、测量或这二者)例如可以，通过使用在工作中例如连接到光学元件690、一个反光镜或多个反光镜(例如，与激发能量源680、682或684相关联的反光镜)或其他反射体、光栅、棱镜或其他光学元件的压电、机电、液压或其他元件来完成。
由样品架内样品中的物体(例如，细胞或微珠或晶体)所散射的光将以多个散射角进行散射，其中可以相对于从光源穿到物体的入射光线来测量散射角。这样的多个散射角包含一系列的散射角。这样的样品架可以包含如本文所公开的特征，并且可以被配置成提供光内反射的路径。被配置用于对物体成像的物镜将收集并聚焦所散射的光，在那里可以将该光传至检测器。由物镜聚焦并聚焦到检测器上的光可以在该检测器上形成光斑点。在实施方式中，从物镜传至检测器的光可以被另外的透镜聚集；这样的聚集可以减小在该检测器上形成的光斑点的大小。聚集在检测器上的光，无论是否经过另外的透镜，将包含从样品架内的物体以多个散射角散射的光。
本申请人在此公开了方法、系统和设备(例如样品架)，其允许检测到比其他情况下可能的散射角范围更小的范围的散射角，从而对样品内的样品和物体提供了更大的分辨率和较佳的成像。本申请人在此公开了针对容槽的设计特征，其可用来控制例如经由PIR和TIR入射在样品上的光学的角度和强度，有效地控制测量散射光的角度。
由于由许多系统的非成像光学器件所强加的约束(例如集光率，或经过该系统的光传播的程度)，到达检测器的光的散射角可以比所需的宽。例如，在一些将LED作为光源的环形灯-容槽组合中，撞击样品的光可以传播出围绕主角度的至少20度。换句话说，如果主射线以60撞击样品，光射线束中的其他射线可以以约50度到约70度的散射角撞击样品。应当理解，由物镜收集的光的散射角的锥体传播取决于透镜的数值光圈。在这种情况下，物镜(例如具有40度的数值光圈)所收集的光应该是在约30-70度的锥体中。因此，大范围的散射角上散射的光将到达该检测器上；例如，这样的系统将测量在以约60度+/-40度为中心的大锥体中由样品散射的所有光。然而，如本文所公开的，一些应用需要检测较窄的散射角范围内的光，例如，非常窄的角度范围(如60+/-5度)。为了提供来自该较窄范围内的测量，申请人在本文公开了，可以将光圈放置在物镜(或与该平面结合的任何平面)的傅里叶(或后焦平面)内。在傅里叶平面内，该角度信息是空间编码的。因此，根据该光圈的形状和大小，可以防止(例如阻断或过滤掉)来自样品的具体角度的光到达该检测器。环形光圈将阻断或过滤掉内角(如60+/-30度)。所得的测量值可以被调整到所需的角度。
在实施方式中，可以提供这样的光圈，使来自物镜的光在接触检测器之前，经过该光圈。在实施方式中可以提供这样的光圈，使来自另外透镜的光(在通过物镜之后)，在接触检测器之前，通过该光圈。在将这样光圈配置成限制通过至该检测器的光的情况下，与在不存在这样的光圈的情况下通过的光相比，经过的光将被减少至来自较少的散射角的光，以及至来自较小范围的散射角的光。在实施方式中，这样光圈可以诸如圆形孔之类的单个孔。在实施方式中，这样的光圈可以包含单个环形体，诸如光可以通过且具有光不能通过的中央区域(例如圆形区域的圆形环。在实施方式中，这样的光圈可以包含两个或三个或更多个光可以通过的同心环形体，以及可包括光不能通过的中央区域(例如圆形区域)。在实施方式中，这样的光圈可以包含不同于圆形或环形形状的形状。
设置于物镜和检测器之间的这样的光圈，例如设置于另外的透镜和检测器之间(其中光在通过过该另外的透镜之前通过物镜)，提供了对从样品散射的光更锐利的分辨的优势，这提高了从样品获得的光散射图像(例如暗场图像)的分辨率。在光强度可以是一因素的实施方式中，与没有本文所公开的光圈的配置相比较，在具有本文所公开的光圈的配置中，所施加的光强度(例如，来自光源，或来自多个光源)可以增加。
系统可包括具有如本文所讨论和描述的特征的样品架，以及光源、二向色镜和其他图7A中所示的元件。如图7B中所示，具有类似特征(例如与图7A或本文其他附图中所示的特征相似)的系统可包括样品架600、光源650(例如光源654或激发源680，或这二者)、物镜670、光圈694、另外的透镜696和傅里叶透镜698。光圈694可以具有用于允许光通过至检测器700的单个通路。检测器700可以可操作地连接至处理器(例如可编程处理器)710。在实施方式中，光圈694可以包含用于允许光通过至检测器700的两个通路。在实施方式中，光圈694可以包含用于允许光通过至检测器700的三个通路。在实施方式中，光圈694可以包含用于允许光通过至检测器700的四个或更多个通路。在实施方式中，光圈694中的通路可以包含允许光通过至检测器700的圆形孔。在实施方式中，光圈694中的通路可以包含允许光通过至检测器700的两个或三个或四个或更多个圆形孔。在实施方式中，光圈694中的通路可以包含被配置成允许光通过至检测器700的环形体；并且可包括不允许光通过至检测器700的中央部分。在实施方式中，光圈694中的通路可以包含两个或更多个环形体(例如实施方式中的同心环形体)，其中的每一个被配置成允许光通过至检测器700；并且这样的光圈694可包括不允许光通过至检测器700的中央部分。这样的一个环体形或多个环形体可以具有圆形或椭圆形或其他环形的形状。
因此，本申请人公开了用于对样品进行成像的系统，其包括：样品架；光源，其用来对所述样品架内保持的物体进行照射；物镜，其被配置用来收集和聚集从保持在所述样品架内的物体散射的光，其中所述散射的光包含以多个散射角散射的光；光学光圈，其用于通过来自所述物镜的光；以及另外的透镜，其被配置用于将来自所述物镜的光聚焦到所述光学光圈上，其中所述光学光圈被配置成只允许由所述物镜聚焦的一部分光通过所述光圈，藉此允许通过所述光圈的所述部分光包括以所述多个散射角中的仅一部分散射角散射的光。
如本文所使用的，术语“落射”和“落射照射”是指样品被在通常远离用来对样品进行观察和成像的物镜或其他光学元件的方向上行进的光照射。因此，在不存在荧光的情况下，通过落射照射所照射的样品的图像利用从样品反射或散射的光(光从该光源行进到样品，并且被样品反射或散射回到所述光学元件以便观察、成像或测量)形成。如本文所使用的，术语“透射”和“透射照射”是指样品被在通常朝着用来对物体进行观察或成像的物镜或其他光学元件的方向上行进的光照射(光从该光源行进至并通过该样品，并继续至所述光学元件以便观察、成像或测量)。因此，在不存在荧光的情况下，通过透射照射所照射的样品的图像利用通过样品的光或由样品散射的光形成。
在光源与物镜或者用来对样品进行观察和成像的其他光学元件被安置在样品的同一侧时，来自该光源的光直接行进到样品，因此一般通过落射照射来对样品进行观察和成像。然而，即使在将唯一的光源与物镜或光学元件置于样品的同一侧时，除了落射照射，本文公开的样品架还能够向样品提供透射照射。因此，允许进行两个方向的照射，而无需将光源置于样品的两侧。这样的配置紧凑，节约资源，并且由于光源和其他光学元件被安置在样品架的仅一侧上，所以该配置允许无阻碍地进入样品架的一侧而不受光学元件的干扰。因此，这样的配置提供了一个优势：能够在不干扰光学成像或测量或者用于光学成像和测量的装置和元件的情况下，对样品架内的样品和试剂进行加载、混合和移除。
如图4A和图4B中示出的图像所示，向暗视野图像添加透射照射大大增强了图像并且很大程度地增加了可从图像中获得的信息。通过使用从单一方向进行的照射(以及在实施方式中使用仅从单一光源进行的照射)来结合落射照射和透射照射，本文公开的方法和系统提供大大增强的图像。
如本文所公开的，诸如容槽600等样品架(例如，如图8A-图8D中所示)被配置用于允许光从光源进行内反射(PIR或TIR)，以使得保持在容槽600的分析区域608中的样品被直射光照射(落射照射；例如，沿通路830行进的光)并且还被间接的反射光照射(透射照射；例如，沿通路820或通路825行进的光)。如本文所公开的，来自与光学元件670、860、700等安置在容槽600的同一侧的光源的光可以既向样品提供落射照射又向样品提供透射照射。
现在参考图8A-图8D，现将描述更进一步的实施方式。图8A-图8D显示了图6A和图6B中示出的容槽600和暗视野散射照射源(诸如但不限于环形灯650)的一部分的横截面的示意图。图8A-图8D中也示出底座支架620。图8A-8D包括括号和箭头，以指示出结构或结构的一部分；例如，括号标记的600表示图中所示的整个容槽600；括号标记的612表示容槽600的封盖部612。图8A中的箭头621至626表示封盖部612的指示部分的尺寸。应当理解，这些尺寸可以在容槽600的不同实施方式中有所变化，并且这样的变化可以取决于大小、应用、材料、光波长、样品以及与容槽600的结构和使用相关的其他元素和因素。例如，在实施方式中，支撑结构604之间的距离621可以在约0.1毫米(mm)到约1厘米(cm)之间，并且在实施方式中可以在约1mm到约100mm之间或者在约1.5mm到约50mm之间或者在约2mm到约20mm之间。在进一步的实施方式中，支撑结构604之间的距离621可以在约0.5mm到约10mm之间，或者在约1mm到约5mm之间。在实施方式中，支撑结构604的高度622可以在约0.1mm到约100mm之间，或者在约0.5mm到约500mm之间，或者在约1mm到约25mm之间。在进一步的实施方式中，支撑结构604的高度622可以在约0.1mm到约10mm之间，或者在约1mm到约5mm之间。类似地，在实施方式中，厚度受控区域613的高度623可以在约0.1mm到约100mm之间，或者在约0.5mm到约50mm之间，或者在约1mm到约25mm之间。在进一步的实施方式中，厚度受控区域613的高度623可以在约0.1mm到约10mm之间或者在约1mm到约5mm之间。在实施方式中，层800的厚度624可以在约0.01mm到约10mm之间，或者在约0.05mm到约1mm之间，或者在约0.1mm到约0.5mm之间。在实施方式中，分析区域608的宽度625可以在约0.05mm到约100mm之间，或者在约0.5mm到约50mm之间，或者在约1mm到约25mm之间。在进一步的实施方式中，分析区域608的宽度625可以在约0.1mm到约10mm之间或者在约1mm到约5mm之间。在实施方式中，支撑结构604的宽度626可以在约0.1mm到约100mm之间，或者在约0.5mm到约50mm之间，或者在约1mm到约25mm之间。在进一步的实施方式中，支撑结构604的宽度626可以在约0.05mm到约10mm之间或者在约0.5mm到约5mm之间。
应当理解，如在本文的任何一个图中所示，用于照射、激发、发射观察的光学组件和布置可以表明可应用于其他图的实施方式中的组件和布置，即使此类特定组件或布置并没有在每个图中明确显示。例如，虽然图8D中不包括环形灯650或其他照射源650，但是在所示的任何实施方式中以及在其他实施方式中，环形灯650或其他照射源650(参见，例如，图8A、图8B和图8C)可用于照射分析区域608(分析区域608在图8A和8B中示出)。作为适于容槽600使用的光学组件的示例，环形灯组件652和654在图8A、8B和8D中示出；在实施方式中，可以使用其他照射成分或其他数目的照射组件。例如，光源654可以是白光或者诸如但不限于具有特定波长输出或输出范围的发光二极管(LED)或激光二极管等光源。可选地，光源654的环可以是被配置用于提供光环的光纤电缆(例如，具有许多接头)。可选地，光源654可以是具有特定的、由反射器控制的狭窄发散角的LED。可能需要通过选择光源或者通过设计反射器来控制环形灯的发散角。
举非限制性示例而言，光源654可以使用激光照射来提供狭窄的光图案，从而在当前的落射型照明配置中导致较低的透射照射背景(其中照射组件都位于样品的一侧)，因为该光源：提供狭窄的光斑点(射入样品分析区域608内)；提供具有狭窄的光谱宽度的光(例如，波长在以特定的主波长为中心的狭窄范围内的光)；并且它是相干光源。可选地，使用LED作为照射源654还可以提供小斑点尺寸(例如，在分析区域608内提供小斑点尺寸)并因此提供由激光光源实现的一些有益性质。出于这些原因和其他原因，相比于其他照射配置，激光光源(或提供小斑点尺寸的LED)有效地降低背景信号水平。相比于通常与更多个漫散光源一起发生的照射，激光照射可以减少散射光，并因此可以通过以下方式而减少一个通道中的背景(例如，在第一分析区域608内的背景)：减少从相邻通道(例如从相邻的第二分析区域608)散射到该通道中的光。因此，相比于由更多个漫散光源进行照射所预期的，激光照射可以导致较少的透射照射背景。当然，期望透射照射的减少小于背景的减少，其中背景中更显著的下降导致更可分辨的信号。可选地，使用LED作为照射源654提供漫射光图案，其具有增加的背景照射和增加的透射照射。当然，期望透射照射的增加大于背景中的增加。
一些容槽实施方式可包括由多个粘附在一起的单层形成的容槽，其具有由一种或多种材料模塑而成的容槽或者具有被添加至容槽的不同表面上的反射层，以增强单个或多个内反射(例如，增强TIR或PIR)。
在实施方式中，本文公开的系统、容槽和光学元件可以与荧光相结合地工作，可能期望与这样的系统和容槽一起使用的暗视野照射不是白光照射。然而，一些实施方式可能仅使用白光，例如，当荧光检测不与暗视野显微镜或亮视野显微镜结合使用时。
图8A和8B示出，在一些实施方式中，设备可以在容槽600中具有光学非透射层，诸如层800。这在光源654是漫射的并且光不射入特定位置的实施方式中可以是有用的。层800可以阻断未以期望的角度或位置进入容槽600中的光。层800可被配置成置于适当位置以防止照射，通过分析区域608以下的区域的照射除外。一些实施方式可仅在最靠近分析区域608处具有变暗的特定区域。一些实施方式可在一个以上的层中具有变暗的或非透射的材料。一些实施方式可在不同方向上具有变暗的或非透射的材料，所述不同方向诸如但不限于为一个水平方向以及一个垂直方向或非水平方向。
应当理解，在实施方式中，层800可以是光学透射的。例如，图8D呈现了一个实施方式，其中层800是光学透射的。在一些实施方式中，层800可以包含光学透射材料，其具有与厚度受控区域613的折射率或底座支架620的折射率或全部两者的折射率不同的折射率。在一些实施方式中，层800可以包含光学透射材料，其具有与厚度受控区域613的折射率或底座支架620的折射率或全部两者的折射率相同的折射率。
在图8A、8B和8C中，所示光源位于容槽600的下方(靠近光学器件652和654)并且提供从下方基部606射入的光。这样的光源也可被理解位于图8D所示的示例中的适当位置处。如这些图中所示，光源650可包括环形灯654和环面反射器652。还可包括其他元件，包括但不限于镜头、滤光器、光栅、反光镜和其他反射表面、光纤、棱镜以及其他元件。在实施方式中，光源可包括激光或LED或其他光源；并且可包括将光从此类光源传输至另一位置或者使光直接射向光学元件的光纤。光学系统的一个设计标准是从光源发出的光的散度或发散角；在距光源给定距离处，宽度为D、具有较低散度的光束比宽度为D、具有较高散度的光束提供更小的斑点。一般而言，提供具有较低散度的光源650是优选的。这样的光学元件和结构可被设计用于提供基本准直的光，例如，大部分或全部光沿着基本平行的通路射向样品(例如，射向分析区域608)。然而，在优选漫射光或散射光的实施方式中，可以使用具有高散度的光源650。
如图8C所示，适合作为本文公开的设备或系统的一部分的光学系统的实施方式可包括光学器件(例如，光源650(例如，如图8C中所示的环形灯654)以及物镜670)、容槽600以及被配置用于保持并定位容槽以供成像的底座支架620。在如图8C所示的实施方式中，底座支架620可包括对来自光源650的光进行折射(或衍射或以其他方式改变光路)的光学特征802。如图8C所示，光学特征802可包含小透镜阵列。应当理解，光学特征802可以包含任何合适的光学特征。在实施方式中，光学特征802可以包含小透镜或衍射光栅或Fresnel透镜或凸透镜或凹透镜或其他可以使光发生折射、衍射或以其他方式发生改变的形状和特征或者它们的组合。在实施方式中，这样的光学特征802可以包含不同于底座支架620的材料并且可以具有不同于底座支架620的折射率。例如，受光学特征802影响的光可以直接地或间接地经由适于本文公开的方法使用的反射(例如，内反射)而射向分析区域608，例如，以便向分析区域608中的样品既提供落射照射又提供透射照射。如图8C所示的实施方式中示出，这样的实施方式还可包括绕过光学特征802的光路。相比于需要通过光学特征802进行成像的通路，这样的光路可以更好地适用于分析区域608内的样品的成像。在实施方式中，可以同时提供两种类型的光路(即，绕过光学特征802和穿过光学特征802)，因此提供适用于对样品进行图像分析的光学器件，所述样品由来自与光源650位于容槽600的同一侧上的光源的落射照射和透射照射进行照射。
容槽600包括影响照射该容槽以及该容槽内的样品的光路的特征。这样的透射照射可以受到容槽600内反射的光的影响(例如，受到内反射，包括或者主要受到例如来自表面612、表面604或其他表面或者表面的组合的部分内反射(PIR)或全内反射(TIR)的光的影响)。例如，图8A、图8B和图8D中示出经历TIR的光的通路的其他示例。
如图8D所示，在实施方式中，如本文公开的以及适于本文公开的方法所使用的设备或系统中的光学系统的容槽600可以包括影响照射该容槽600的内部部分的光路的特征，所述光诸如为照射分析区域608以及容槽600的分析区域608内的样品的光。如图8D所示，层800可以包括使进入分析区域608的光的光路发生折射、衍射或以其他方式发生改变的特征。这样的光路改变可以影响并且可以增加对分析区域608内的样品的照射。在图8D所示的示例中，光从横向进入层800；光路被层800的形状(以及材料性质)所改变，并且在需要时射入分析区域608中。例如，层800的外表面可以是平坦的(例如，外表面674)，或者可以是曲面(例如，外表面676)。例如，层800的内表面可以是平坦的(图8D中未示出；然而，参见图8A和图8B中这样的表面，尽管图8A和图8B中的层800不是光学透射的，但这些表面显示为平坦的)或者可以是曲面的(例如，图8D中所示的内表面678)。在实施方式中，这样的光路改变有效地向分析区域608中的样品提供落射照射和透射照射。
图8A、图8B、图8C和图8D图示了样品架内的光路，其在上表面614或者在支撑结构604中的表面618处的封盖部612内提供TIR和PIR的示例。诸如容槽600等样品架可以具有光可穿过的光学透射表面；在实施方式中，这样的光学透射表面可以允许光穿过而没有显著的畸变或光强度的降低。诸如容槽600等样品架可以由光学透射材料制成，有效地使光可以穿入到样品架内。在样品架至少部分地由光学透射材料制成的实施方式中，光可以穿过样品架的一个光学透射表面，并且可以在样品架内行进。在实施方式中，在样品架内行进的光可以在一个或多个表面上发生反射，并且沿样品架内的反射路径行进。当光从置于样品架外部的光源通过样品架的光学透射表面进入样品架内时，这样的光可以在样品架内远离光源而行进并且在样品架的表面上发生反射，以使得反射光可以在被反射之后朝着光源的方向行进。这样的反射可以是PIR或TIR。
即，穿过容槽600内的光可以从表面(例如，如图8A和8B中所示的表面614或表面618)反射。这样的内部反射可以有效地用间接光对分析区域608内的样品进行照射；与直接照射相结合(其中在照射在样品上之前，光不发生反射)，样品可以以这种方式接收落射照射(从与光学检测元件的同一侧进行照射)和透射照射(从该光学检测元件的相对侧进行照射)。当表面614，或表面618，或两者均被配置于吸收光(例如，被涂上或覆盖黑色)时，可使用单独的落射照射源提供暗视野图像。当表面614，或表面618，或两者均被配置于散射光(例如，没有被擦亮或具有粗糙表面)时，可使用单独的落射照射源提供适合于获得亮视野图像的这种散射光。
应当理解，光波长、材料、表面以及促进或增强PIR的配置可能不适于或者不能有效地促进或增强TIR。应当理解，光波长、材料、表面以及促进或增强TIR的设计可能不适于或者不能有效地促进或增强PIR。因此，有一些设计和构造可以对PIR和TIR其中之一有促进作用，对另外一个则无促进作用。在实施方式中，有一些设计和构造可以对PIR和TIR都有促进作用。在实施方式中，有一些设计和构造可以对PIR和TIR均无促进作用。
如图8A所示，支撑结构604可以具有矩形或正方形横截面。应当理解，支撑结构604可以具有除了正方形或矩形以外的其他横截面形状；例如，如图8B所示，支撑结构604可以具有三角形横截面形状；其他横截面形状(例如，圆形或半圆形或锯齿状或不规则形状)也可适用于本文公开的系统和容槽。PIR和TIR是可调的特征，其可以根据容槽600的使用材料、应用的任何涂层、覆层或覆盖物以及容槽600厚度受控区域613的几何形状或厚度进行选择。在实施方式中，PIR可以是优选的，而光、材料以及配置可被选择用来增强PIR。
在实施方式中，TIR可以是优选的。在实施方式中，来自光源650的光的一个波长或多个波长可被选择用来增强TIR。在实施方式中，容槽600的材料、厚度、表面配置以及其他特征可以被选择用来增强TIR。例如，厚度受控区域613的高度(从与层800相接触的封盖部612的底座处测量的高度)将影响到达分析区域608的光通过TIR反射后的角度和强度。能够使光在容槽内发生TIR从而允许对样品进行倾斜角度照射(从样品上方进行照射)的容槽600配置是理想的，特别是对于暗视野显微术。在一些实施方式中，期望使从样品上方进行的TIR最大化。可选地，在一些实施方式中，容槽600可以被配置用于仅从分析区域608之上的表面提供TIR。可选地，一些实施方式可被配置用于仅从厚度受控区域613之上的表面(例如，在图8A和8B中所示的实施方式中，一般在分析区域608上方)提供TIR。可选地，在一些实施方式中，容槽600可以被配置用于从容槽600中的其他表面提供光的TIR；例如，可以提供来自容槽600其他表面的光的TIR以便以倾斜角度来散射光，有效地使光射回至分析区域608。
可以选择并且配置用于构造容槽600的设计和材料，以便提供光的TIR。例如，在一些实施方式中，提供TIR或者提供增加的或增强的TIR量的配置包括但不限于：在其中厚度受控区域613的尺寸可以与TIR相兼容或者促进TIR的配置；在其中表面614或表面618(例如，相对于入射光)的一个角度或多个角度可以与TIR相兼容或者促进TIR的配置；在其中表面614或表面618的形状、质地或涂层可以与TIR相兼容或者促进TIR的配置；在其中制成厚度受控区域613的材料的折射率与接触表面614(形成支撑结构604的边界)的材料或空间的折射率之间的差可以与TIR相兼容或者促进TIR的配置；在其中制成支撑结构604的材料的折射率与接触表面618(形成支撑结构604的边界)的材料或空间的折射率之间的差可以与TIR相兼容或者促进TIR的配置；以及其他配置和设计。为了增强TIR，相比于如果未被内反射则光可以穿过其中的第二材料而言，要在其内对光进行(内)反射的第一材料应当具有较高的折射率；由于这种第二材料通常为空气(其折射率接近1)，所以确保第一材料具有较高的折射率通常并不困难。入射角必须大于临界角，以便提供TIR。例如，参照图8所示的实施方式，制成厚度受控区域613和结构604(例如，表面614和618以外的区域)的材料应该比空气具有更大的折射率。在期望于层800内发生TIR的实施方式中，层800的材料应该比厚度受控区域613的材料具有更低的折射率，以确保在图8A、图8B和图8D所示的壁上发生TIR。在备选实施方式中，层800的材料可以比厚度受控区域613的材料具有更高的折射率，这将会在所述边界(层800与厚度受控区域613之间)处造成TIR，有效地使角度和材料可被调整以便优化射在分析区域608中的样品上的光的透射照射组件。
在实施方式中，表面614或618可以被涂覆或处理以便影响或减小表面处的反射率(PIR或TIR)。在实施方式中，表面614或618可以被涂覆或处理以便减少光从表面漏出。例如，即使在表面614或618与TIR相兼容或增加TIR的量的情况下，一些光还是可以从表面614或618透射或折射。吸光涂层或材料可以置于或者施加在这样的表面614或618或其一个部分或多个部分上，以便减少从容槽600漏出的杂散光的量。这样吸光涂层例如可以是染料、墨水、涂料、表面处理剂、黑色或彩色带，或者其他涂层或表面处理剂。在实施方式中，黑色的或其他的吸光固体材料可以放置在紧靠或临近表面614或618处，以提供光学吸收表面。
可选地，在一些实施方式中，可以配置容槽600，以便不从该容槽的一个部分或几个部分提供光的TIR(或者仅提供不显著的TIR)或者光的PIR(或者仅提供不显著的PIR)。例如，在一些实施方式中，可以配置容槽600，以便不从支撑结构604处提供光的TIR或PIR(或者仅提供不显著的量的TIR或PIR)。可选地，在一些实施方式中，可以配置容槽600，以便不从表面618处提供光的TIR或PIR(或者仅提供不显著的量的TIR或PIR)。不提供TIR或PIR或者仅提供不显著的量的TIR或PIR的配置包括但不限于：在其中厚度受控区域613的尺寸不与TIR或PIR相兼容或者不促进TIR或PIR的配置；在其中表面614或表面618(例如，相对于入射光)的一个角度或多个角度不与TIR或PIR相兼容或者不促进TIR或PIR的配置；在其中表面614或表面618的形状、质地或涂层不与TIR或PIR相兼容或者不促进TIR或PIR的配置；在其中制成厚度受控区域613的材料的折射率与接触表面614(形成支撑结构的边界)的材料或空间的折射率之间的差不与TIR或PIR相兼容或者不促进TIR或PIR的配置；在其中制成支撑结构604的材料的折射率与接触表面618(形成支撑结构604边界)的材料或空间的折射率之间的差不与TIR或PIR相兼容或者不促进TIR或PIR的配置；以及其他配置和设计。
可选地，在一些实施方式中，反射材料可以放置在或者附接至表面614或表面618。这样的反射材料例如可以是金属，诸如银或金或铝；可以是电介质，诸如氟化镁或氟化钙或其他盐或金属氧化物；或其他反射材料。通常，这样的反射涂层可以非常薄(例如，可以小于0.1微米，或者可以最大为100微米厚)。可选地，反射材料(例如反射涂层)可以仅放置在或附接至表面614。可选地，反射材料可以仅仅放置在或附接至表面618。可选地，表面618可被处理成黑色以便具有吸光性。在其他实施方式中，表面614可被处理成黑色以便具有吸光性。一些实施方式可以选择厚度受控区域613的宽度，以使其宽于分析区域608。对于使用激光照射的一些实施方式，层800可被移除或者可以是光透射的，因为激光照射已充分聚焦以便在分析区域618之间不需要暗区域。
例如但非限制性地，使用PIR、TIR或两者还可以使光能够沿着通路820行进从附近区域射入分析区域608内。如图8A、图8B和图8D所示，沿通路820进行的光被反射至分析区域608，而沿通路820行进的光被反射至分析区域608，而沿通路825行进的光随着其行进在容槽600内并最终到达分析区域608会经历多个反射。如图所示，沿图8B中的通路820行进的光随着其在容槽600内行进并最终达到分析区域608会经历多个反射。如图8B所示，这样的反射可以是PIR，或者可以是TIR。按照传统术语学，图8A中示出的、由沿着通路820和825行进的光进行的照射，以及图8B中示出的、由沿着通路820行进的光进行的照射是透射照射。图8A和8B中示出的、由沿着通路830行进的光进行的照射示出光直接来自环形灯而不是通过TIR的方式：这是落射照射。相比于仅可提供那些光成分之一的光源，来自位于样品下方(或者仅位于样品一侧)的光源的两种类型的光成分的组合允许提高的性能。这对于暗视野显微术尤其有用。
图8A-8D所示实施方式的使用的一个非限制性示例是暗视野照射，以测量样品中细胞的散射性质。暗视野显微术是一种已确立的方法，其主要用作对反差增强技术。在暗视野显微术中，由于只对样品散射或反射的光进行成像，所以图像背景是完全黑暗的。定量暗视野显微术尚未用于以与使用流式细胞术中传统的“侧向散射”参数相当的方式来测量细胞的散射性质。
从硬件角度来看，用于暗视野显微术的照射需要是倾斜的，即，来自照射光源的所有光线都不能在不首先接触样品的情况下进入物镜。例如但非限制性地，照射应当发生在不激发已经存在于样品中的任何其他荧光素的波长处。可选地，这种照射允许使用高数值孔径(NA)的镜头进行成像。例如但非限制性地，对于与光学显微镜相关的传统镜头的尺寸，NA可以至少约为0.3。可选地，NA至少为0.4。可选地，NA至少为0.5。可选地，一些实施方式可以使用油浸物镜来获得期望的NA，特别是当镜头尺寸被限制在某个水平以下时。
用于暗视野照射的传统方法已使用透射照射，其中样品位于成像镜头和暗视野光源之间。因此，在这种传统的布置中，检测组件和照射组件不在样品的同一侧。传统的落射照射方法(其中成像镜头/物镜和光源在样品的同一侧)需要使用特别制造的物镜并且通常不允许使用高NA的物镜，因此限制了整个系统的能力。
相反，本文描述的暗视野照射系统的至少一些实施方式具有以下属性。在硬件方面，图8A-8D中实施方式的方案是“落射”，因为用于暗视野照射的环形灯与物镜位于样品的同一侧。尽管光源在其他侧的备选实施方式可以被单独地使用或者与本文描述的实施方式相结合地使用，但从系统角度来看，这种方案可以是满足需要的。在一个非限制性示例中，设计环形灯以使得光源654的LED或激光都处于同一平面中并且具有相同的方向(光源位于同一个水平平面中并且向上发射光)。一些实施方式中可具有位于样品平面中的光，但以非平行的方式(诸如但不限于锥形方式)发射光。一些实施方式可具有位于不同平面中的光，但以相同的方向发射光。一些实施方式可具有位于不同平面中的光，但以非平行的方式(诸如但不限于锥形方式)发射光。在一些实施方式中，光由环面反射镜652反射以实现对样品的倾斜照射。
除了环形灯以及环面反射器的光学性质之外，图8A-8D的实施方式中所示的容槽600的光学性质也显著地影响暗视野照射。在该实施方式中，细胞计数容槽600被设计成使得来自环形灯650的光直接落在样品上；但除此以外，光也会从容槽的特征“反射”到样品上，以便模仿“透射”照射。这种反射可以通过TIR或者真反射的方式。
注意到，任何透射照射方案都允许测量从样品向前散射的光；而落射方案仅允许测量从样品向后散射的光。前向散射光在强度上通常比后向散射光高出两个数量级。因此，透射照射的使用允许使用非常低的照射强度并且减少对样品有害的副作用。
如图8A中的实施方式所示，环形灯650(或其他照射源)和容槽600提供了可被调节的系统，使得透射和落射照射的强度可被调整以在传统的落射照射基础上提高性能。类似地，环形灯650(或其他照射源)和容槽600提供了图8B的实施方式中的系统，该系统可被调节，使得透射和落射照射的强度可被调整以在传统的落射照射基础上提高性能。这种调节可以借助于所选的材料(例如，因为其光学特性)以及容槽几何形状的设计来实现，以控制全内反射的角度和程度。
如图8C所示，特征802可以改变入射光的通路，并因此用于增强透射照射和落射照射。如图8D所示，表面674、676和678的形状和配置可以改变入射光的通路(例如，横向照射)，并因此用于提供或增强透射照射、落射照射或两者。
图8E提供了容槽600从样品制备位置向接近光学检测器D的样品观察位置传送的示意图。如图中所示，样品架600可以从一个位置移动至临近检测器D或者位于检测器D上的位置。检测器D可包括被配置用于接收、保持和定位容槽600的载物台。样品可经由入口端口602(例如，在图8E所示的示例中示出六个入口端口602)而被添加至样品架中，并且可继而置于分析区域608(未示出，在图8E中所示容槽600的表面内部(例如，支撑结构604的表面内部))内，以供光学观察和测量。保持在分析区域608内的样品可被照射，并且可由检测器D检测。在实施方式中，检测器D可被配置用于进行定性观察或成像，并且在实施方式中，检测器D可被配置用于进行定量观察和成像。
如图8E中所示的检测器D可以包含细胞计数单元或细胞计数模块或者可以是其一部分。这样的细胞计数单元或细胞计数模块可以包含用于样品分析的独立单元或模块。在实施方式中，其他分析功能和设备可以包括在检测器D中，或者可以与检测器D封装在一起，或者可以被配置用于与检测器D相结合地使用。在实施方式中，如本文公开的、用于样品分析的系统可以包含这种细胞计数单元或细胞计数模块，例如，包含用于分析容槽600中的样品的检测器D。在实施方式中，如本文公开的、用于样品分析的系统可以包含这种细胞计数单元或细胞计数模块以及其他单元或模块，除了用于分析容槽600中的样品的检测器D的分析能力和装置以外，所述其他单元或模块还提供其他分析能力和装置。在这种系统中，这种其他单元或模块可以与检测器D封装在一起，或者可被配置用于与检测器D相结合地使用。这种其他的分析能力和装置可以应用于样品上；例如，这种分析能力和装置可用于分析存在于容槽600中的样品或样品的一部分。在实施方式中，这种分析能力和装置可用于分析存在于容槽600中的样品的不同部分(例如，样品可以分成两个或三个等分试样，其中一个等分试样放置在容槽600中以供细胞计数分析，并且一个或多个等分试样由封装在细胞计数单元或细胞计数模块中或者与之靠近或者与之相结合地工作的其他设备进行分析)。因此，例如，独立于由这样的细胞计数模块执行的分析，可以在化学分析单元或核酸分析单元或蛋白质分析单元(例如，使用抗体或其他特异性结合的分子来分析样品的单元)或其他这样的单元或者单元与能力的组合中测量或分析样品(或其一部分)。这种分析可包括对存在于样品中的小分子和元素的分析(例如，通过一般化学单元)；对存在于样品中的核酸分子的分析(例如，通过核酸单元)；对存在于样品中的蛋白质或抗体-反应性抗原的分析(例如，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)单元)；或者这些分析的组合。另外，如图8E所示以及本文所讨论的系统可包括控制器，以控制和调度安排一个或多个单元或模块中的操作。
图8F提供了系统的进一步的、详细的示意图，该系统包括用于将容槽从样品制备位置传送到接近光学检测器D的样品观察位置的传送机构。系统，诸如图8F所示实施方式的系统，可包括多个样品分析模块，所述分析模块可被配置用于独立工作，或者在一些实施方式中可被配置用于一起工作。图8F所示的系统包括具有检测器D的单个细胞计数单元707；在实施方式中，在分析模块701、702、703、704、705和706中的任何一个或全部分析单元中分析的样品(或其一部分)可被传送至细胞计数模块707，以供检测器D观察和测量。独立于由细胞计数模块707执行的分析，可以在化学分析单元715中测量或分析样品(或其部分)。这种在化学分析单元715中的分析可包括对存在于样品中的小分子和元素的分析(例如，通过普通化学单元)；对存在于样品中的核酸分子的分析(例如，通过核酸单元)；对存在于样品中的蛋白质或抗体反应性抗原的分析(例如，通过ELISA测定单元)；或者这些分析的组合。
如图8F中所示的系统可包括控制器，用以控制和调度模块701-707中的一个或多个模块中的操作。可以将样品加载至样品架或其他元件上，以供在如图8E中所示的示例中图示的系统中进行分析。这样的系统或者这样的系统的模块例如包括：样品处理系统708；用于获取、移动和等分样品的移液管，包括抽吸式移液管711和容积式移液管712；离心机713；分光光度计714；化学分析单元715；光电倍增管(PMT)716；用于容纳一次性用品和工具(例如，移液管尖端和其他尖端)的筒匣717；以及其他元件。模块和其他元件可以由机架709或其他支撑结构所支撑。样品、一次性用品、工具和其他元件可以在模块内传送，并且可以在模块之间(例如，在模块701-706与细胞计数模块707之间)传送。
图8E和图8F示出，样品架诸如容槽600可以从一个位置(例如在可以进行样品处理之处)传送，并继而传送至另一位置(例如图8E和图8F中所示的检测器D)。容槽600并不向检测器D中或检测器D上释放流体，而是将所有的样品保持于其中的自包含单元。在检测器D上或其附近可以存在一个或多个、两个或更多个、三个或更多个这样的位置：在其上存在容槽600或其他样品架可以与之接合的透明表面，以便为进行样品信号检测提供透明界面。图8F的元件以及关于这样的元件及其使用的进一步公开内容可在美国专利申请序列号13/769,779中找到，该文献通过引用而整体并入本文。
暗视野
本文的至少一些实施方式包括暗视野照射源和容槽。容槽600的相关特征与该容槽尺寸以及容槽的光学材料和几何形状的设计有关。该容槽通过反射(例如，通过TIR或PIR或全部两者)来增加暗视野照射的程度。在一个实施方式中，该系统可以同时使用对样品的透射暗视野照射和落射暗视野照射。
在本文所示的一些实施方式中，容槽600与光源650相结合以支持使用落射配置(例如，光源和物镜位于样品的同侧)下的物理系统的透射照射和落射照射。基本的容槽被设计用于容纳生物样品和呈现该生物样品以供可视化。在实施方式中，封盖部612可以具有特定的设计。已知不同的材料可具有不同的折射率；可以选择具有期望的折射率的材料用于制造容槽600的封盖部612或底座支架620或其他元件和组件以及关联的元件和组件。例如，在一些实施方式中，封盖部612或底座支架620可由玻璃制成。例如，在一些实施方式中，封盖部612或底座支架620可由石英制成。例如，在一些实施方式中，封盖部612或基底支持部分620可由丙烯酸类或清透聚合物(例如，环烯烃、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚氨酯、聚氯乙烯或其他聚合物或共聚物)或其他透明材料制成。
可以设计顶部封盖部612的材料以促进照射和图像采集。在实施方式中，为了照射样品，光源650可以是环形灯650(例如，可以是环形)，可以具有不连续或连续图案中的光源位置654，并且可以使用曲面反射器652将光指向样品。
在暗视野显微术中，通过倾斜光线来照射样品。在暗视野显微术中，进入显微镜光学器件的光是由样品散射的光，从而允许对样品中的细胞、颗粒以及其他物体和结构的散射性质进行测量。如果样品中不存在细胞、颗粒、结构或其他物体，则暗视野图像是黑色的。
在该非限制性示例中，反射器652和环形灯650的LED654被设计用于反射光，以使得光的最小部分直接返回到物镜中作为非特异性背景。该系统被设计用于通过在容槽表面处的TIR将光引导回到分析区域608中。从表面反射的光——无论是通过TIR还是其他反射——因而被引导以照射分析区域608中的样品。分析区域608内的样品中的细胞、颗粒和结构从细胞下方直接接收来自环形灯的光(即，通过落射照射)。此外，如本文所公开的，来自上表面(反射的)的光也被引向分析区域608(即，通过透射照射)。
因此，根据本文所公开的系统和方法，在环形灯650处于同一位置的情况下，可以引导来自单一环形光源的光以从两个方向照射(落射照射和透射照射)分析区域608。在实施方式中，这样的照射全都是倾斜照射。可以通过对容槽和用于容槽的材料的设计来控制这两个光成分的相对强度。
这样的暗视野照射不同于常规的暗视野。例如，在本文所公开的实施方式中，由在容槽表面通过TIR反射的光提供暗视野照射。举非限制性示例而言，在实施方式中，本文公开的系统可以在封盖部612的某些表面的背侧使用反射层来反射所有的光。举非限制性示例而言，在实施方式中，本文公开的系统可以在容槽600的某些表面的背侧使用反射层来反射所有的光。一些实施方式可以使用全反射背景或选择性反射背景。
例如，在实施方式中，期望以倾斜角度来引导光，这样会保持照射暗视野。在一些实施方式中，光源654可以按一定角度来引导光，并且因此可以不需要或者可以不使用反射器652。反射器652可以提高光源654的可制造性，这是因为所有的光都处于同一平面内，在同一个方向上得到引导。可选地，成角度的光源654还可以替代反射器使用，或者与反射器结合使用。
应当理解，即使照射中的透射照射成分的光强度可能此对应的落射照射成分弱例如10倍，但由于透射照射而从样品中的细胞或其他物体散射的光的强度可能会强200倍。也就是说，当将来自一定量的落射照射的散射与来自相同量的透射照射的散射相比较时，样品中的细胞或其他物体因透射照射而散射的光的强度可以比因落射照射而散射的光强200倍。因此，少量的透射照射即可显著增强从细胞的光散射。
在单独采用落射照射时，由物镜采集的光仅仅是由样品反射的光。然而，衍射是散射的重要成分，并且透射照射的使用可以提供一定量的衍射(例如，由样品衍射的光)。然而，从落射照射采集的光不包括由样品衍射的光(没有光在衍射后朝向光源反射回去)。因此，当使用透射照射和落射照射时，对于物镜所采集的光存在反射、折射和衍射成分。传统的方法使用全透射暗视野照射，其由于光学组件在样品的全部两侧的放置而占用大量空间用于配置。与之相反，本文所公开的系统和方法单独使用配置用于落射照射的光学元件来同时提供落射照射和透射照射。本文所公开的实施方式可以在获得落射照射配置的空间节省的同时，提供对样品的同时的落射照射和透射照射的益处。
对样品架和光源一起进行设计可以使落射照射配置能够增大样品的透射照射的量，特别是可以提供均匀的透射照射。一些实施方式可以使用镜面。一些实施方式使用TIR，可以对此进行调节以产生期望的透射照射，包括均匀的并以一定倾斜角度进入分析区域608中的透射照射，用于样品的暗视野照射。容槽600可被配置成仅从落射照射配置下的光源通过使用反射(例如，使用TIR或PIR或全部两者)来提供分析区域608的透射照射。在一个非限制性示例中，较厚的封盖部612允许光经受TIR(或者PIR，或全部两者)以反射回目标区域608中。此外，本文所公开的系统和方法不仅提供由于TIR(或者PIR，或全部两者)而回到分析区域608中的光，而且回到分析区域608中的光是均匀的。图8A、图8B和图8D的实施方式具有成一定角度的特定表面，具有一个或多个特定的黑色表面以及一个或多个特定的反射表面，以使得光均匀地回到分析区域608从而有效地提供对分析区域608内的样品的均匀的透射照射。可选地，可以将全反射表面置于顶部(例如但不限于图7A和图7B中所示的平坦封盖部612，并且可选地在图8A、图8B和图8C的区域613顶部的选定区域之上)。与之相反，在传统硬件内传播的光可能会经受一些反射，包括有可能的一些TIR(或者PIR，或全部两者)，但是该光可能不会回到区域608中。
举非限制性示例而言，本文所公开的实施方式采用基于成像的平台，并且取代于使用可能例如具有16个激光光源的高复杂度、高成本的系统，本实施方式利用集成度更高的检测系统以便能够对样品进行成像并鉴定该样品中的细胞的差异和类型。
在一个非限制性示例中，将所有这些不同类型的信息相结合对于实现期望的分析目标是有用和有效的。这可以包括定量测量或与定量测量相关联的定性测量，或者与定量测量相关联的图像。本文公开的方法和系统提供了不同的荧光通道，其中每一通道可以具有靶向的一种或多种特异性分子标记物(即，定量信息)。本文公开的方法和系统可包括显微术，或者可以与显微术一起使用，本文的实施方式可以提供观察和测量在细胞内形成染色的背景的能力(例如，其是否位于细胞质内、是聚集在表面上、细胞核内还是其他位置)，这可以将所生成的图像或定性信息与所生成的定量测量关联起来。以这种方式，如果事实证明该定量测量触发了警报或者满足了表明期望进行进一步分析的阈值，则与产生定量结果的原始图像的关联可用于进一步的分析。本文的实施方式可以探询在分析区域608内的样品中的细胞内产生染色的背景图像和信息。这样的图像和信息允许确定染色是否在细胞内，例如，在细胞质内、在细胞核内、在细胞膜，或者其他细胞器或细胞位置内。
在本文公开的方法和系统的一些实施方式中，可以观察和测量细胞定量散射性质、细胞形状或细胞大小组合，并且可将其用于鉴定或表征样品。在本文公开的方法和系统的一些实施方式中，样品或或其一部分的物理性质、光学性质以及生物/生化性质全都可以同时在同一设备中观察和测量。所有这些测量和观察都可以在可编程处理器或其他处理系统中结合起来以将各种类型的信息相关联，从而实现测定的目标(例如，实现测定的临床目标)。
尽管传统设备可能适合于一种或另一种类型的观察或测量，但是其不适合于全都来自同一光源的落射照射和透射照射；并且在这样的不同类型信息之间也没有关联。例如，在本文公开的一些实施方式中，生成定量测量值的图像信息是可检索的，所述系统和方法可以用于组织形态学测量。可选地，该系统可适用于巴氏涂片(papsmear)，这更类似于传统的细胞学检查。可以将此扩展至任何使用传统显微术完成的检查。对于尿液，所述实施方式中的至少有一些实施方式可以查看和分析晶体，而不仅仅是细胞。可以查看已在曲线图的一部分上产生某些定量读数的、来自尿液样品的无机盐和化学物质晶体。此外，可以查看和分析存在于血液中的细胞和颗粒，包括分析血细胞的不同类型和群体，诸如但不限于图1A中可见之物，在图中圈划出了不同的数据区域。可以检索某些数据区域的图像信息，以便进一步分析产生出标绘于曲线图或图表上的测量的、作为基础的细胞图像。
本文的一些实施方式可以将成像特征与病理特征相结合。例如，可以在被配置成包括本文所公开的光学元件的设备或系统内进行组织制备(系统例如可以是或者包括被配置用于对样品进行光学分析和其他分析的一个或多个模块)，并且可以在该平台中对如此制备的材料进行成像。继而可以将图像或分析发送至服务器以进行图像分析、进行诊断，或者执行有效地帮助或使病理医生能够对样品进行分析的数字病理学。
本文所公开的方法、系统和设备的实施方式，包括例如图8C和图8D中所示的系统和设备，提供了范围广泛的细胞计数能力，其可以一起应用于对样品的分析。这样的细胞计数能力包括细胞计数成像，例如通常局限于限制显微术的细胞计数成像；这样的对生物样品的显微成像和图像分析是由本文所公开的设备、系统和方法所提供的。此外，本文所公开的设备和系统被配置用于提供对生物样品的分光光度分析。这样的图像分析包括暗视野、亮视野和其他图像分析。本文公开了用于从单一光源同时施加落射照射和透射照射的新型和改进的方法，其允许血液样品的更灵敏和准确的图像和分析。与本文所公开的方法相协同，可以获得关于RBC、WBC和它们的子类别的单独的测量值。本文所公开的图像和分光光度分析可用于鉴定和量化WBC的不同群体，有助于血液样品的表征和许多临床状况的诊断。本文公开的设备和系统可以用于提供临床报告，该临床报告包括普通化学分析信息、基于核酸的分析信息、基于抗体(或蛋白质或表位)的分析信息、分光光度分析信息，并且此外还提供所分析的细胞和样品的图像。产生这样的信息和提供这样的报告(包括图像和其他临床信息)的能力据信会提供新颖而出人意料的功能和结果。
此外，该信息和这些报告可以在很短的时间量内产生(例如，在不到一小时、或不到50分钟、或不到40分钟、或不到30分钟或者其他更短的时间量内产生)。此外，该信息和这些报告可以从很小的样品产生，例如，从很小的血液或尿液样品产生。这样的很小的样品的大小可以不超过约500μL、或小于约250μL、或小于约150μL、或小于约100μL、或小于约75μL、或小于约50μL、或小于约40μL、或小于约20μL、或小于约10μL，或者其他小体积。在样品为血液样品的实施方式中，这样的很小的样品可以从手指针刺来采集。通常，仅从手指针刺采集少量的血液样品(例如，血液量可以是约250μL或更少、或者约200μL或更少、或者约150μL或更少、或者约100μL或更少、或者约50μL或更少、或者约25μL或更少，或者其他很少的量)。
本文所公开的包括细胞计数信息和图像(包括图像、散布图以及其他光学和成像信息)并且还包括普通化学分析信息、基于核酸的分析信息、基于抗体(或蛋白质或表位)的分析信息以及分光光度分析信息的临床报告据信会提供广泛的且在临床上丰富的信息，有助于许多临床状况的诊断和表征，并提供相比于现有技术的优势。这样的报告可以在服务点(或照护点)位置迅速准备，并且可以迅速传送(例如，通过无线、陆线、光纤或其他通信链路来电子传送)至病理医生或其他临床专业人员以供分析和解释。这样的专业人员分析和解释可以转而迅速传送(例如，通过无线、陆线、光纤或其他通信链路来电子传送)至照护受试者的临床医生，或者传送回服务点(或照护点)位置或者全部两者，以供快速反馈。这样的快速反馈通过提供可在服务点或照护点位置获取、分析或者既获取又分析的基于样品的信息和分析，来支持在必要情况下及时治疗或者防止不必要的治疗。这样的快速分析、报告和反馈提供了相比于耗时方法的优势，并且通过允许及时的治疗以及通过防止不必要的治疗，还可以提供更有效、更高效和更便宜的临床服务和治疗。可由本文所公开的设备、系统和方法所避免的此类更耗时的方法包括但不限于：由于要求受试者前往远离受试者的家并且远离受委托照护受试者的临床医生的实验室或诊所而造成的延迟和不便；由于从采集地点到可对样品进行分析的地点的样品传送而造成的延迟和有可能的样品降解；由于这样的分析的结果向病理医生或其他专业人员的传输而造成的延迟；由于专业人员意见向受试者的临床医生的传输而造成的延迟；在将专业人员意见向临床医生传输之后的临床医生对受试者的诊断和治疗中的延迟。通过使用本文所公开的方法、设备和系统，可以减少或消除这些延迟、不便以及可能的样品降解。
图6A、图6B、图7、图8A、图8B、图8C、图8D和其他附图中所示以及本文所公开的系统和设备的实施方式提供细胞计数能力，包括以紧凑形制与一种或多种其他样品分析能力一起使用。申请人在此公开了包括在设备和系统中的如本文所公开的新颖细胞计数能力连同其他样品分析能力的新颖设备和系统。例如，申请人在此公开了这样的新颖设备和系统：其提供了与用于通过普通化学单元进行样品分析的设备和系统相协同的、与用于通过核酸分析单元进行样品分析的设备和系统相协同的、与用于通过使用抗体测定(例如，ELISA)单元进行样品分析的设备和系统相协同的或者与它们的组合相协同的、如本文所公开的新颖细胞计数能力。因此，本文所公开的样品处理设备可被配置用于对样品执行多种测定。这样的样品可以是很小的样品。
在一些实施方式中，所有样品测定行动和步骤都对单一样品执行。在一些实施方式中，所有样品测定行动和步骤都由单一设备或系统来执行，并且可以在单一设备的壳体内执行。这样的包括细胞计数法、特别是包括在单一单元内提供图像分析以及分光光度分析或其他光学分析的细胞计数法的系统和设备据信是新颖的和出人意料的。提供包括细胞计数法、特别是包括在单一单元内提供图像分析以及分光光度分析或其他光学分析的细胞计数法的系统和设备据信会提供现有技术中前所未有的优势。
图6A、图6B、图7、图8A、图8B、图8C、图8D和其他附图中所示以及本文所公开的系统和设备实施方式以便携式的形制提供细胞计数功能，其中这样的设备和系统可以封装在足够小的外壳内以方便从一个位置传送到另一位置。例如，这样的设备和系统可以易于运输以供在照护点位置(例如，医生办公室、诊所、医院、临床实验室或其他地点)使用。例如，这样的设备和系统可以易于运输以供在服务点(除了上述的此类照护点以外，还例如有药店、超市或者其他零售或服务地点)使用。服务点位置可例如包括受试者可在其中接受服务(例如，测试、监测、治疗、诊断、指导、样品收集、ID验证、医疗服务、非医疗服务等)的任何位置。服务点位置包括但不限于受试者的住所、受试者的工作场所、医疗保健提供者(例如，医生)的位置、医院、急诊室、手术室、诊所、医疗保健专业人员的办公室、实验室、零售商[例如药房(例如，零售药房、临床药房、医院药房)、药店、超市、杂货店等]、交通工具(例如，轿车、舟船、卡车、公共汽车、飞机、摩托车、救护车、移动单元、消防车/救火车、应急车辆、执法车辆、警车或者被配置用于将受试者从一个点传送到另一点的其他运载工具等)、巡回医护单元、移动单元、学校、日托中心、安检地点、作战地点、医疗辅助生活住所、政府机关、办公建筑、帐篷、体液样品采集地点(例如，血液采集中心)、受试者可能希望进入的地点的入口处或其附近的场所、受试者可能希望访问的装置处或其附近的场所(例如，计算机的位置——如果受试者希望访问该计算机)、样品处理设备接收样品的位置，或者本文其他地方描述的任何其他服务点位置。
专业的细胞计数法和专用细胞计数标记物
许多传统的先进或专业的细胞计数测定需要传统的系统来测量细胞上的大量标记物；通常，同时测量这些标记物。本领域中的一般方法已经与高能力的仪器联系在一起，所述高能力的仪器例如包括6个或更多个激光光源以及18个不同的PMT管来同时测量所有这些标记物。然而，在许多临床环境下，并不需要同时测量多种标记物。例如，在许多临床需求中，感兴趣的是查看有多少细胞对一种标记物呈阳性，或者有多少细胞对两种或三种标记物的组合呈阳性，或者对几种标记物的其他此类组合呈阳性。本文的一些实施方式提供了染色方案的多重组合，其中一个染色方案可以例如具有一组10种标记物，其中一个染色方案可以将它们组合于3-4种或5-6种标记物的组中，其中甚至可以将同一颜色的两种标记物组合起来，本系统的一些实施方式可以对图像和信息进行解卷积，以确定哪个信号来自哪种标记物。这允许本系统的一些实施方式减少在光源数目、用于样品分析的通道数目以及其他简化和效率方面的硬件需求。因此，使用一定数目的标记物的子集，或者以非同时的方式按预定配对使用和测量标记物对于支持专业的细胞计数法可能是有用的。例如，一些标记物可被认为是“门控”标记物；此类标记物被首先测量，并且如果这样的初步测量的结果呈阴性(例如，样品中不存在或者仅少量存在该标记物)，则可以不需要使用其他的后续标记物的测量。在实施方式中，这样的非同时的方法和系统可减少分析所需的样品体积，并且可减少分析所需的标记物的量(例如，如果通常仅在所分析的样品的一小部分中使用后续标记物)。
应当理解，对用于样品(诸如血液样品或尿液样品)的细胞计数分析的成像的使用支持获得实际的细胞计数，并且因此可以比不包括此类测量的传统细胞计数方法更准确。样品的成像，包括样品中的细胞(以及颗粒或结构)的成像实际上可以比其他方法(例如传统的流式细胞术)更准确。例如，传统的流式细胞术门控不允许实际计数。流式细胞术中的门控是主观的，并且因此这在系统之间可以有所不同。此外，传统的流式细胞术不提供样品中的细胞的图像。
本文的一些实施方式也可以进行门控，但是该门控在算法上基于不同因素，包括但不限于患者的健康。在患者群体上训练分类方法，从而知晓他们是健康的还是患病的。本文的一些实施方式可以标记异常的患者，并对其作出标记以供审验。自学习式门控可以根据所传递的关于患者健康的信息来确定是否期望不同的门控。因此，对于本文所公开的一些实施方式，样品的门控是算数地进行的(可能是利用可编程处理器)，并且门控基于患者的健康而改变。
在用于成像的方法和系统的实施方式中，可能希望使所需硬件的数量和复杂度最小化，并且可能希望在有可能的情况下重复使用一些或所有样品，以便使所需的样品体积最小化。因此，能够从样品的成像中获取的能力越多，在从样品(并且当有可能时，从更少量的样品)最大程度地获取信息的方面就越好。因此，可以从最少数目的图像获得用以区分不同细胞类型的信息越多，就越可以减少所需的样品体积。
可选地，在一个非限制性示例中，用于在该显微镜载物台中使用的容槽可被配置如下(参考图7、图8A和图8B中所示的实施方式和元件)。中间通道层包含很薄塑料膜芯800，且在两侧具有压敏粘结剂(psa)。一侧粘附到窗口层606，而另一侧粘附到模塑成型顶层封盖部612。所述芯是挤制膜，其颜色为黑色，这主要是出于防止光散射以及不同液体通道之间的光学串扰等光学原因。该芯膜的厚度优选地治着其长度和宽度是均匀的，并且可以例如由黑色PET或黑色HDPE(聚乙烯)挤制膜所形成。位于两侧的psa子层优选地尽可能薄以保持整体液体通道(例如，分析区域608)的精确而均匀的尺寸，而又优选地足够厚以在该液体通道周围提供良好的流体密封。在实施方式中，有助于这样的样品架的psa粘合剂在性质上是丙烯酸类，并且对于低表面能塑料具有高粘附强度。位于中间层面上的液体通道、端口和其他对准特征可以使用激光切割或模切工艺制成。在实施方式中，将材料加热到接近但不高于该材料的熔点可以用于容槽以及容槽腔的制造。在实施方式中，扩散结合可以用于容槽和容槽腔的制造(例如，可以将容槽组件加热至其材料的玻璃化转变温度，从而允许或增强材料在容槽的先前分离的组件之间的扩散)；例如，可以使用扩散结合来形成丙烯酸与丙烯酸的结合。在实施方式中，超声波焊接可以用于容槽和容槽腔的制造。例如，可以使用包括但不限于使用加热、使用粘合剂、使用扩散结合、使用超声波焊接在内的结合方法以及其他合适的技术和方法，来将支撑结构结合到容槽的封盖部(例如，图7A和图7B的支撑结构606到封盖部612)。声波焊接容槽，诸如但不限于对其进行超声焊接，可涉及制作该容槽的多个层并将它们放在一起，而不是模塑成型或对该多个层使用粘合剂。在实施方式中，可以将各种技术相结合以供制造容槽，诸如但不限于超声焊接某些层，而在其他层上使用粘合剂或其他结合技术。可选地，一些实施方式可以使用一种技术来结合容槽的周边部分而另一技术可用于结合当使用容槽时将会与样品或液体相接触的结构或层。
容槽中的通道可以具有用于填充的入口端口(例如，如图6A中所示的入口端口602)，并且可以具有两个或更多个用于填充的入口端口602。入口端口602可以具有适合于向通道的内部中转移样品的任何形状或配置。在实施方式中，入口端口可以具有圆形的或椭圆形的或者其他适合于允许移液管(例如，具有圆锥形或相似的锥形端部的移液管)将流体样品转移到并进入通道中的形状。例如，圆形入口端口可适合于接纳圆锥形移液管的尖端，其中该移液管定向成基本上垂直于入口端口的平面。例如，椭圆形入口端口可适合于接纳圆锥形移液管的尖端，其中该移液管定向成与垂直于入口端口的平面垂直的情况成一定角度。例如，入口端口可被配置成允许用于将移液管的端部(例如，移液管尖端)定位在入口端口之上的空间，从而有效地使得离开移液管尖端的流体落入或以其他方式流入到入口端口之中；在实施方式中，可以在入口端口的至少一个部分与移液管尖端的至少一个部分之间保持空间。在实施方式中，入口端口可被配置用于与液体分配尖端的至少一部分，诸如但不限于移液管的端部(例如，移液管尖端)相接触或以其他方式相接合，以便在移液管的端部与该入口端口的壁之间形成密封。在实施方式中，入口端口可具有内锥度(例如，入口端口的最外侧部分的直径或其他横截面长度可以不同于该入口端口的最内侧部分的直径或其他横截面长度)。在入口端口具有内锥度的实施方式中，入口端口的内径或其他横截面长度可小于该入口端口的最外侧部分的直径或其他横截面长度，从而有效地与定位在入口端口中的移液管尖端(例如，圆锥形移液管尖端)的锥度互补。在实施方式中，移液管尖端可以与入口端口相接合，从而有效地防止由移液管递送的流体(例如，样品)经由入口端口流出通道。可选地，可以设定容槽中的端口的大小或以其他方式对其予以设计，以便对移液管尖端的至少一些部分形成密封。可选地，材料可以是疏水性材料，以使得液体仅当足够的力从尖端分配液体时才进入容槽，而不是主要由于任何亲水力而进入容槽。
在实施方式中，容槽中的通道可以具有通气孔，有效地允许空气或其他气体流动(例如，离开)，从而帮助用样品(例如，流体样品，诸如血液或血浆或其他流体)填充通道。在实施方式中，入口端口可充当通气孔，或者在实施方式中，通道可以具有与入口端口分离的、并且附加于入口通道的通气孔。在实施方式中，通气孔可以包含配置于允许空气或气体通过但减少或阻止液体从通道(例如，从通道内的样品)蒸发的多孔膜。这样的通气孔可由多孔膜覆盖，或者可以在该通气孔的开口处或其附近包括多孔膜。用疏水性材料制成的多孔膜可以比用亲水性材料制成的多孔膜更有效地减轻从样品的蒸发。这样的多孔膜可例如用环烯烃聚合物诸如或(ZeonChemicals，Louisville，KY，USA)；聚乙烯(PE)；聚偏氟乙烯(PVDF)；PE和PVDF的组合诸如PorexCorporation，Fairbum，GA，USA)制成；或者用其他多孔材料和多孔材料的组合制成。
可以例如通过向容槽中的通道的入口端口提供样品来填充该通道。应当理解，“填充通道”既指通道的完全填充又指通道的部分填充；因此本文所用的“填充通道”是指填充通道或者通道的一部分，无论通道变得被完全填充或仅部分填充。可以通过重力流入通道，例如，经由开放的入口端口，来将流体样品提供至通道。可以通过毛细管作用将流体样品吸入通道中；例如，由移液管尖端提供的一滴或一部分样品经由入口端口而与通道的壁的接触可以开始并提供样品向通道中的毛细流动。当通道的壁或者至少通道的内表面包含亲水性材料或涂层时，这样的填充通道的毛细管手段更有效，并且更容易实现。在实施方式中，可以使用压力来实现填充通道，其中通过施加力(例如，通过可由活塞、泵、压缩气体、渗透压或其他手段供应的液压或气压)迫使流体进入通道之中。当通过压力填充通道时，可以使用疏水性材料来形成或涂覆通道的内壁。此类疏水性材料(例如，包括丙烯酸类、烯烃、环烯烃以及其他聚合物和塑料)可以比其他材料(例如，此亲水性材料)提供更好的光学性质。当要使用压力填充通道时，移液管(用于递送流体，例如，样品)与通道的入口端口之间的紧密密封可能是优选的。当要使用压力填充通道时，可以提供被配置成允许先前占据整个通道内部或其一些部分的气体(例如，空气)或液体离开的通气孔(或多个通气孔)。使用压力填充通道允许对所递送的流体的速率和体积的控制；这样的速率和体积控制可以大于当使用毛细或重力流动来填充通道时所实现的速率和体积控制。
在本文公开的实施方式中，可以向容槽中并入磁性元件(例如但不限于：磁性球或磁性盘，或者可由磁体保持的金属球或金属盘)。例如，这样的磁性元件可被包括在样品架或容槽的模望的顶层内，或者构成样品架或容槽的模望的顶层。可以使用磁性元件来简化用于传送容槽的硬件。例如，处理系统可以接合容槽中的磁性特征，以对其进行传送而不必增添额外的样品处理设备。
虽然已经参考本发明的特定实施方式对本发明作出了描述和说明，但是本领域技术人员将会理解，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以作出对规程和方案的各种调整、改变、修改、替代、删除或添加。例如，可以使用不同的材料来创造容槽中的不同反射表面，或者创造沿着光学系统中的光路的其他表面。可选地，选择反射表面以使得反射仅为漫反射。可选地，选择反射表面以使得反射仅为镜面反射。一些实施方式可以使用如Coumans，F.A.W.，vanderPol，E.，&Terstappen，L.W.M.M.(2012)的“Flat-topilluminationprofileinanepifluorescencemicroscopebydualmicrolensarrays”.Cytometry，81A：324-331.doi：10.1002/cyto.a.22029中所阐述的平顶照射方案，该文献出于所有目的而全文并入于此。
可选地，一些实施方式可使所有的通道具有位于一个平面中的底面，但由于不同的通道大小而具有位于不同平面中的顶面。可选地，一些实施方式可以具有位于不同垂直面中的通道。尽管本文的大多数实施方式示出了以自上而下垂直配置的成像，但应当理解，一些实施方式能够以垂直堆叠配置来布置通道并从侧面对通道进行成像。一些实施方式可以位于成像平台上的多个容槽。例如，尽管图8E在其上示出了单个容槽，但是有可能将多个容槽放置到成像平台上用于以顺序的或同时的方式进行处理。尽管本文的容槽通常被图示为是由透明材料所形成，但是一些实施方式可以由非透明材料形成容槽的至少一些部分。这可以被提供用于向容槽的各个部分提供改善的结构刚性，以及/或者可选地，提供不同的光处理性质。可选地，一些实施方式可以与非透明承载体一起使用，该承载体接合容槽的至少一部分并且与容槽一起移动至成像平台，以促进处理和/或提供期望的光学效应。
此外，浓度、量和其他数值数据可在本文中以范围格式呈现。应当理解，这样的范围格式仅仅是为了方便和简洁而使用的，并且应当被灵活地解释为不仅包括被明确表述为范围界限的数值，并且还包括被包含于该范围内的单个数值或子范围，犹如明确表述了每个数值和子范围。例如，约1nm至约200nm的大小范围应当解释为不仅包括明确表述的约1nm和约200nm的界限，并且还包括单个大小诸如2nm、3nm、4nm，以及子范围诸如10nm至50nm、20nm至100nm和其他范围。
本文所讨论或阐述的出版物只是为了它们在本申请的申请日之前的公开内容而提供的。本文中的任何事项均不应解释为承认本发明无权凭借在先发明而先于这样的出版物。此外，所提供的公开日期可能不同于实际公开日期，实际公开日期可能需要独立确认。本文提到的所有出版物均通过引用而并入于此，以便公开和描述与引用的出版物相关联的结构和/或方法。
尽管上文是对本发明的优选实施方式的完整描述，但有可能使用各种替代、修改和等同物。因此，不应当只参考以上描述而确定本发明的范围，而是应当参考所附权利要求书，连同其等同物的全部范围一起来确定本发明的范围。无论优选与否的任何特征均可与无论优选与否的任何其他特征相组合。所附权利要求书不应被解释为包括装置加功能的限定，除非这样的限定在给定的权利要求中使用短语“用于...的装置”而被明确阐述。应当理解，如本文的描述和随后的权利要求书全文中所使用，“一个”、“一种”和“该”等的含义包括复数指代对象，除非上下文另有明确规定。此外，如本文的描述和随后的权利要求书全文中所使用，“之中”的含义包括“之中”和“之上”，除非上下文另有明确规定。如本文所用的，术语“或”可以包括“和/或”；因此，“或”的含义同时包括转折的和连接的含义，除非上下文另有明确规定。
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Claims (64)

1.一种用于分析样品的系统，该系统包括：
包含被配置用于保持所述样品的样品室的样品架，所述样品架的至少一部分包含光学透射材料，所述光学透射材料包含光学透射表面和反射表面；以及
照射源，其被配置用于提供照射并穿过所述光学透射表面的光；
其中所述样品架被配置成有效地使来自所述照射源的所述光向该样品架中的样品同时提供落射照射和透射照射，其中落射照射包含从所述照射源行进到所述样品，而在该样品架的光学透射材料的表面上没有反射的光，并且其中透射照射包含在该光学透射材料内行进，且在从所述光学透射材料的至少一个表面上经至少一次反射后到达该样品的光。
2.如权利要求1所述的系统，其中所述样品架包含容槽，该容槽具有配置用于支持样品的细长通道。
3.如权利要求1或2所述的系统，其中所述样品架包含一个或多个光学非透射表面。
4.如权利要求1或2所述的系统，其中所述透射照射至少部分地由光在表面上的全内反射所提供。
5.如权利要求2所述的系统，其中所述透射照射至少部分地由光在所述容槽内的全内反射所提供。
6.如权利要求1所述的系统，其中所述样品架包含两个或更多个用于支持样品的样品室。
7.如权利要求2所述的系统，其中所述容槽具有矩形的水平横截面形状。
8.如权利要求2所述的系统，其中所述容槽具有圆形的水平横截面形状。
9.如权利要求2所述的系统，其中所述容槽具有锯齿形的垂直横截面形状。
10.如权利要求2所述的系统，其中所述容槽具有阶梯形的垂直横截面形状。
11.如权利要求1所述的系统，其中所述样品架相对于所述照射源可移动至多个位置，其中该样品架的所述光学透射表面在每个所述位置都能被所述照射源照射。
12.如权利要求1所述的系统，其中所述照射源包含环形灯。
13.如权利要求12所述的系统，其中所述环形灯选自基于发光二极管(LED)的环形灯和基于激光的环形灯。
14.如权利要求1所述的系统，其进一步包含支撑结构，该支撑结构包含其形状设置为与所述样品架的光学透射表面相接合的光学透射表面。
15.如权利要求1所述的系统，其进一步包括压迫设备，该压迫设备被配置用于将所述样品架保持在所需位置，以便被所述照射源照射。
16.如权利要求1所述的系统，其进一步包括检测器，该检测器被配置用于对所述样品架中的通道的至少一部分进行成像。
17.如权利要求16所述的系统，其中所述样品架包含被配置用于容纳所述样品的至少一部分的细长通道，并且其中所述检测器被配置用于对所述样品架中的整个细长通道进行成像。
18.如权利要求16所述的系统，其中所述样品架被配置成在成像期间以静止的、非流动方式保持所述样品。
19.如权利要求16所述的系统，其中在成像期间，所述样品架被配置成以静止的、非流动方式保持所述样品的一部分，而以流动方式保持所述样品的另一部分。
20.如权利要求16所述的系统，其中所述照射源相对于所述样品架是可移动的。
21.如前述权利要求中任一项所述的系统，其中在成像期间，所述样品架被配置成以流动方式保持所述样品。
22.如权利要求16所述的系统，其中所述样品架进一步包含完全限制在该样品架内的流体回路，并且其中所述样品位于所述流体回路内，有效地使该样品与所述检测器保持分开。
23.如权利要求22所述的系统，其中所述样品架相对于所述检测器是可移动的。
24.如权利要求22所述的系统，其中所述检测器相对于所述样品架是可移动的。
25.如权利要求1所述的系统，其中所述样品架和所述照射源包含光学分析单元的至少一部分，所述系统进一步包含被配置用于对所述样品进行临床分析的临床分析单元。
26.如权利要求25所述的系统，其中所述系统被配置用于向所述光学分析单元和所述临床分析单元中的每一个提供单一样品的等分试样，有效地使所述临床分析单元和所述光学分析单元能够同时对样品的部分进行光学分析和临床分析。
27.如权利要求25所述的系统，其中所述临床分析选自普通化学分析、核酸分析和酶联结合分析。
28.如权利要求25所述的系统，其包括多个临床分析单元，其中所述多个临床分析单元中的每个临床分析单元都被配置用于提供选自普通化学分析、核酸分析和酶联结合分析的临床分析。
29.一种容槽，其包含被配置用于保持样品的样品室，所述容槽的至少一部分包含光学透射材料，所述光学透射材料包含光学透射表面和反射表面，其中所述光学透射表面和所述反射表面被配置成有效地使穿过该光学透射表面的光向该样品室中的所述样品同时提供落射照射和透射照射，其中落射照射包含从照射源行进到该样品，而在该光学透射材料的表面上没有反射的光，并且其中透射照射包含在该光学透射材料内行进，且在从所述光学透射材料的至少一个表面上经至少一次反射后到达该样品的光。
30.如权利要求29所述的容槽，其中所述样品室包含细长通道。
31.如权利要求29所述的容槽，其进一步包含一个或多个光学非透射表面。
32.如权利要求29所述的容槽，其中所述透射照射至少部分地由光在表面上的部分内反射所提供。
33.如权利要求29所述的容槽，其中所述透射照射至少部分地由光在表面上的全内反射所提供。
34.如权利要求29所述的容槽，其中所述样品架包含两个或更多个用于保持样品的样品室。
35.如权利要求29所述的容槽，其包含选自矩形水平横截面形状和圆形水平横截面形状的横截面形状。
36.如权利要求29所述的容槽，其包含选自锯齿形垂直横截面形状和阶梯形垂直横截面形状的横截面形状。
37.一种容槽，其包含具有光学透射底部的样品室，所述容槽具有包含至少一个配置用于为该容槽提供机械支撑的凸面或凹面结构的外表面。
38.如权利要求37所述的容槽，其中所述至少一个凸面或凹面结构具有选自矩形、三角形、圆形和半圆形的横截面形状。
39.如权利要求37所述的容槽，其中所述至少一个凸面或凹面结构被配置用于为该容槽内的内反射光提供通路。
40.如权利要求37所述的容槽，其中所述至少一个凸面或凹面结构包含表面，并且其中所述表面被配置用于在该容槽内反射光。
41.一种鉴定包含多种细胞的样品中的细胞的方法，其包括：
(a)将所述样品置于包含配置用于保持该样品的样品室的样品架内，所述样品架的至少一部分包含光学透射材料，所述光学透射材料包含光学透射表面和反射表面，其中所述光学透射表面和所述反射表面被配置成有效地使穿过该光学透射表面的光向该样品室中的样品同时提供落射照射和透射照射，其中落射照射包含从所述照射源行进到该样品，而在该光学透射材料的表面上没有反射的光，并且其中透射照射包含在该光学透射材料内行进，且在从所述光学透射材料的至少一个表面上经至少一次反射后到达该样品的光；
(b)照射所述样品架以有效地向该样品同时提供落射照射和透射照射；以及
(c)鉴定该样品中的细胞。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述鉴定包括用配置用于对所述样品室的至少一部分进行成像的检测器鉴定所述细胞。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述样品室包含细长通道。
44.一种测量样品内细胞群体的细胞中的感兴趣组分的方法，其包括：
a)获得对该样品内细胞群体的细胞中存在的标记物的定量测量值；
b)借助于计算机，基于部分a)的测量值，确定该样品中存在的细胞群体内的细胞的近似量；
c)向该样品添加一定量的细胞标记物，其中添加的所述细胞标记物的量基于部分b)的结果，并且其中该细胞标记物与该细胞群体的细胞中的感兴趣组分特异性地结合，且被配置为可容易地检测；
d)针对与感兴趣组分结合的标记物对该样品中的细胞进行测定；以及
e)基于与感兴趣组分结合的标记物的量确定该样品内细胞群体的细胞中感兴趣组分的量。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述样品架包括选自如权利要求29所述的样品架和如权利要求37所述的样品架的样品架。
46.一种对显微镜进行对焦的方法，其包括：
a)将含有供显微镜分析的物体的样品与具有已知大小的参照颗粒混合，有效地生成含有该样品和参照颗粒的混合物；
b)将步骤a)的混合物置于显微镜的光路中；
c)使步骤a)的混合物暴露于配置用于对参照颗粒进行可视化的光束；以及
d)基于该混合物内参照颗粒的位置或者基于该参照颗粒的图像的清晰度，对该显微镜进行对焦。
47.如权利要求46所述的方法，其中将所述含有样品和参照颗粒的混合物保持在选自如权利要求29所述的样品架和如权利要求37所述的样品架的样品架内。
48.一种鉴定含有多种细胞的样品中的细胞的方法，其包括：
(a)测定所述多种细胞中的细胞的至少一个以下方面：(i)细胞表面抗原的存在；(ii)细胞表面抗原的量；或(iii)细胞大小；
(b)测定(a)中的细胞的至少一个以下方面：(i)细胞核大小；或(ii)细胞核形状；以及
(c)测定(a)和(b)中的细胞的定量细胞光散射，
其中使用来自步骤(a)、(b)和(c)的信息的组合来鉴定含有多种细胞的样品中的细胞。
49.如权利要求48所述的方法，其中将所述多种细胞保持在选自如权利要求29所述的样品架和如权利要求37所述的样品架的样品架内。
50.一种对样品进行成像的系统，其包括：
样品架，
光源，其用于照射保持在所述样品架内的物体，
物镜，其被配置用于收集并聚焦从保持在所述样品架内的物体所散射的光，其中所述散射光包含以多个散射角散射的光，
光学光圈，其用于使来自所述物镜的光通过，以及
另外的镜头，其被配置用于将来自所述物镜的光聚焦到所述光学光圈上，其中所述光学光圈被配置成只允许一部分由所述物镜聚焦的光通过该光圈，由此被允许通过所述光圈的所述部分光由仅以所述多个散射角中的一部分散射角散射的光组成。
51.一种用于对样品进行成像的系统，该系统包括：
包含所述样品的样品器皿，
载物台，其包含具有光学透明表面的样品器皿接收部，
光源，其用于通过该载物台照射该样品中的成形组分，
其中该样品器皿具有界面表面，该界面表面被配置成与该样品器皿接收部的光学透明表面相接合，由此该界面表面与该光学透明表面相符合，而穿过该界面表面的光没有明显的畸变。
52.如权利要求51所述的系统，其中所述样品器皿的界面表面由聚合物材料形成。
53.如权利要求51所述的系统，其中所述样品器皿的界面表面由比用来形成所述样品器皿接收部的光学透明表面的材料更软的材料形成。
54.如权利要求51所述的系统，其进一步包括压迫单元，该压迫单元用于施加压力，以使所述界面表面符合被配置成与所述样品器皿接收部的光学透明表面相符的形状。
55.如权利要求51所述的系统，其进一步包括被配置成与所述样品器皿相耦合的处理单元，以促进样品器皿向载物台上及离开载物台的传送，并提高该样品器皿的机械刚性。
56.如权利要求51所述的系统，其进一步包括被配置成与所述样品器皿相耦合的不透明处理单元。
57.如权利要求51所述的系统，其中样品的所有成像不需要使光基本呈直线地穿过一个表面并从对侧表面穿出而到达检测器。
58.如权利要求51所述的系统，其中所述光源不位于所述样品器皿的一侧来将光传输到处于该样品器皿的对侧的检测器。
59.一种确定在至少含有物体的图像中所述物体的图像轮廓的方法，其包括：
分割所述物体的图像的一部分；
使用所述物体的图像的分割的部分进行初始化；
使用分水岭分割使所述图像的区域增长；
确定在所有图像中具有最大面积的感兴趣区域(ROI)；及
将具有最大面积的ROI鉴定为所述物体的最终分割，
由此确定所述物体的图像的轮廓。
60.如权利要求59所述的方法，其中所述感兴趣区域(ROI)通过适应性取阈法来确定。
61.如权利要求60所述的方法，其中所述适应性取阈法包括，如果第一像素的强度大于比像素中邻近的其他像素的平均强度更高的阈值量，则在所述图像内设置所述第一像素为前景像素。
62.如权利要求59所述的方法，其中所述物体的图像包含细胞的图像，并且所述图像的分割的部分包含细胞核。
63.如权利要求62所述的方法，其中所述细胞已经用细胞核染色剂染色。
64.如权利要求63所述的方法，其中所述细胞核染色剂是
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