CN110231275B - 一种基于流式细胞术检测nk细胞杀伤活性的方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于流式细胞术检测NK细胞杀伤活性的方法，包括以下步骤：步骤1，接种并培养细胞；步骤2，收集细胞并染色：采用CD2‑APC荧光染料对NK细胞和肿瘤细胞进行分群，随后采用Annexin V‑FITC/SYTOX Green对凋亡和坏死的靶细胞进行染色；步骤3，流式上机检测。本发明使用Annexin V‑FITC/SYTOX Green双染，采用相同检测通道将凋亡细胞和坏死细胞全部标记出来，显著降低了对NK杀伤后肿瘤细胞各种不同状态(早期凋亡、中晚期凋亡或坏死细胞)的漏检。
Description
技术领域
本发明属于细胞杀伤活性检测技术领域，特别涉及一种基于流式细胞术检测NK细胞杀伤活性的方法。
背景技术
自然杀伤细胞(Natural killer cell，NK cell)是机体天然免疫系统的重要组成部分。在多种细胞因子(如IL-2、IL-15等)、饲养细胞(Feeder cells)的作用下，NK细胞可发生增殖和活化，随后释放穿孔素及颗粒酶杀死肿瘤细胞、病毒和清除非己细胞。NK细胞与肿瘤免疫、抗病毒免疫、移植免疫及自身免疫疾病密切相关。例如在多数肿瘤(特别是中晚期及伴有转移的肿瘤)、免疫缺陷等患者中，NK细胞活性降低；而在某些病毒感染性疾病早期、长期使用干扰素及其诱导物、宿主抗移植物反应等患者中，NK细胞活性增高。因此，准确评价外周血或体外培养NK细胞的杀伤活性，是了解NK细胞功能及评估过继性免疫治疗效果的一种重要手段。
目前检测NK细胞杀伤活性的方法较多，可分为同位素标记法、酶反应比色法和流式细胞术三大类。同位素标记51Cr释放法被认为是“金标准”，该方法准确性较高，但因设备昂贵且存在放射污染，现已不常使用。酶反应比色法有乳酸脱氢酶(LDH)释放法和四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法，两者易受外界因素(温度、pH值、试剂)影响，以及细胞自发释放底物等因素，造成准确性及重复性较差。流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)是一种在液流系统中快速测定单个细胞或细胞器的生物学性质，并把特定的细胞或细胞器从群体中加以分类收集的技术。鉴于其在单细胞水平上高效准确的定量分析优势，目前涌现出多种以流式细胞术为基础的NK细胞杀伤活性的测定方法，但各自仍然存在缺陷。以下对现有流式细胞术检测方法的不足进行分类说明。
首先，由于效应细胞(NK细胞)和靶细胞(肿瘤细胞)在共培养过程中，靶细胞对效应细胞可能会产生一定抑制和破坏作用，则共培养体系的死亡率可能是包括靶细胞和效应细胞的共同死亡率。为更加准确地反映NK细胞的杀伤功能，现有流式细胞术检测方法多采用以下方案区分靶细胞和效应细胞，然后分析靶细胞的死亡率：(1)如果效应细胞和靶细胞的体积相差比较大，可通过FSC/SSC设门的方式将两种细胞区分开。(2)如果效应细胞和靶细胞的体积相同或相差不大，通过设门难以分开，则需标记细胞进行区分。多使用荧光染料标记靶细胞，如钙荧光素乙酰氧基甲酯(CAM)、羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)、VybrantDiO(DiO)和MitoTracker Green(MTG)。但是这种标记方法存在荧光染料自发释放后被邻近效应细胞吸收，且荧光染料对细胞功能造成潜在影响，持续时间短，稳定性差等问题。
其次，经效应细胞(NK细胞)杀伤作用后，靶细胞将处于各种不同状态(活细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡及坏死细胞)。目前流式细胞术检测方法主要采用7-氨基放线菌素(7-AAD)、碘化丙啶(PI)、SYTOX Green单染法来鉴定靶细胞的死亡率。三者均为核酸染料，可与凋亡细胞浆内的DNA结合。虽然它们能够特异性地检测靶细胞的凋亡率，但仅能标记晚期凋亡及坏死细胞，漏检早期凋亡细胞，从而无法全面反映NK细胞的杀伤活性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于流式细胞术检测NK细胞杀伤活性的方法，以解决上述问题。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种基于流式细胞术检测NK细胞杀伤活性的方法，包括以下步骤：
步骤1，接种并培养细胞；
步骤2，收集细胞并染色：采用CD2-APC荧光染料对NK细胞和肿瘤细胞进行分群，随后采用Annexin V-FITC/SYTOX Green对凋亡和坏死的靶细胞进行染色；
步骤3，流式上机检测。
进一步的，步骤1具体包括：接种KHYG-1、K562细胞并培养，实验前1-2天给细胞换液，调整细胞至对数生长期的最佳状态；KHYG-1细胞培养于含IL-2的细胞培养基中。
进一步的，步骤2包括以下步骤：
1)1500rpm离心NK细胞以及靶细胞细胞5分钟，重悬并分别计数，调整细胞密度为0.5х106/ml；
2)接种细胞至24孔板；NK细胞为效应细胞，肿瘤细胞为靶细胞，设置不同效应细胞与靶细胞比例，E:T ratio；取1ml K562细胞加入对照孔，取1ml KHYG-1细胞和1ml K562细胞混合后加入实验孔；
3)继续培养4小时；
4)收集孵育后细胞至流式管，于1500rpm离心细胞5分钟，弃掉上清，用4℃的PBS缓冲液洗涤1-2次；
5)每管加入冰冷的100μl FACS staining buffer，再加入5μl CD2-APC荧光染料，冰浴避光静置30分钟；
6)用4℃的PBS缓冲剂离心洗涤细胞1-2次；每管加入4℃的100μl Annexin V-FITCbinding buffer，再加入5μl Annexin V-FITC荧光染料和1μl SYTOX Green荧光染料，冰浴避光静置15分钟；
7)流式上机检测前，每管补加300μl Annexin V-FITC binding buffer。
进一步的，PBS缓冲液含0.5％BSA和0.1％叠氮化钠；SYTOX Green荧光染料的浓度为1mg/ml。
进一步的，步骤3包括以下步骤：
1)在FSC/SSC散点图中，设门圈定包括效应细胞和靶细胞的全部细胞；
2)在APC/SSC散点图中，将Step 1圈定的细胞分为APC+和APC-细胞，APC+为表达CD2的KHYG-1细胞，APC-为CD2表达阴性的K562细胞；
3)在FITC/Count直方图中，分析Step 2中APC-细胞的FITC通道荧光强度，计算出早期凋亡、中晚期凋亡及坏死的K562细胞总比例。
FSC/SSC散点图、APC/SSC散点图和FITC/Count直方图均由任意一款国家标准流式分析软件生成。
与现有技术相比，本发明有以下技术效果：
本发明无需提前标记效应细胞(NK细胞)和靶细胞(肿瘤细胞)，对细胞的干涉或影响小，不存在标记物泄露的问题。
本发明准确鉴定效应细胞与靶细胞比例(E:T ratio)，可进一步用于计算毒力单位(lytic unit)。
本发明的CD2在多数肿瘤细胞中呈阴性表达，见图1，故本发明检测范围广泛。
本发明使用Annexin V-FITC/SYTOX Green双染，采用相同检测通道将凋亡细胞和坏死细胞全部标记出来，显著降低了对NK杀伤后肿瘤细胞各种不同状态(早期凋亡、中晚期凋亡和坏死细胞)的漏检。
本发明所使用的三种荧光分子仅占用两个荧光通道，空余荧光通道可用于结合其他检测指标(通道)监测细胞其他表型。
附图说明
图1效应细胞(KHYG-1，NK92-MI)和靶细胞(U266，Jurkat，K562，MM.1S，RPMI8226，MOLM13，KMS11，HL60，NCI-H929，Raji)中CD2表达情况。
图2采用CD2分群联合Annexin V-FITC/SYTOX Green双染的流式细胞术检测NK细胞杀伤活性的操作流程。
图3比较不同效应细胞与靶细胞比例(E:T ratio)下，NK细胞的杀伤活性。(A，B)在E:T＝1:1与E:T＝5:1的比例下，KHYG-1细胞对K562细胞的杀伤活性。(C，D)在E:T＝1:1与E:T＝5:1的比例下，KHYG-1细胞对MM.1S细胞的杀伤活性。
图4比较Annexin V-FITC单染，SYTOX Green单染与Annexin V-FITC/SYTOX Green双染处理条件下，NK细胞杀伤活性的检测效率。
具体实施方式
以下结合附图对本发明进一步说明：
请参阅图1至图4，一种基于流式细胞术检测NK细胞杀伤活性的方法，包括以下步骤：
步骤1，接种并培养细胞；
步骤2，收集细胞并染色：采用CD2-APC荧光染料对NK细胞和肿瘤细胞进行分群，随后采用Annexin V-FITC/SYTOX Green对凋亡和坏死的靶细胞进行染色；
步骤3，流式上机检测。
步骤1具体包括：接种KHYG-1、K562细胞并培养，实验前1-2天给细胞换液，调整细胞至对数生长期的最佳状态；KHYG-1细胞培养于含IL-2的细胞培养基中。
步骤2包括以下步骤：
1)1500rpm离心NK细胞及靶细胞5分钟，重悬并分别计数，调整细胞密度为0.5х106/ml；
2)接种细胞至24孔板；NK细胞位效应细胞，肿瘤细胞为靶细胞，设置不同效应细胞与靶细胞比例，E:T ratio；取1ml K562细胞加入对照孔，取1ml KHYG-1细胞和1mlK562细胞混合后加入实验孔；
3)继续培养4小时；
4)收集2孔细胞至流式管，于1500rpm离心细胞5分钟，弃掉上清，用4℃的PBS缓冲液洗涤1-2次；
5)每管加入冰冷的100μl FACS staining buffer，再加入5μl CD2-APC荧光染料，冰浴避光静置30分钟；
6)用4℃的PBS缓冲剂洗涤细胞1-2次；每管加入4℃的100μl Annexin V-FITCbinding buffer，再加入5μl Annexin V-FITC荧光染料和1μl SYTOX Green荧光染料，冰浴避光静置15分钟；
7)流式上机检测前，每管补加300μl Annexin V-FITC binding buffer。
PBS缓冲液含0.5％BSA和0.1％叠氮化钠；SYTOX Green荧光染料的浓度为1mg/ml。
步骤3包括以下步骤：
1)在FSC/SSC散点图中，设门圈定包括效应细胞和靶细胞的全部细胞(见图2流式检测步骤中Step 1)。
2)在APC/SSC散点图中，将Step 1圈定的细胞分为APC+和APC-细胞，APC+为表达CD2的KHYG-1细胞，APC-为CD2表达阴性的K562细胞(见图2流式检测步骤中Step 2)。
3)在FITC/Count直方图中，分析Step 2中APC-细胞的FITC通道荧光强度，计算出早期凋亡、中晚期凋亡及坏死的K562细胞总比例(见图2流式检测步骤中Step 3)。
FSC/SSC散点图、APC/SSC散点图和FITC/Count直方图均由任意一款国家标准流式分析软件生成。
本发明利用流式细胞术在单细胞水平上分选监测细胞信号的优势，采用CD2-APC荧光染料对效应细胞(NK细胞)和靶细胞(肿瘤细胞)进行分群，随后采用Annexin V-FITC/SYTOX Green对凋亡和坏死的靶细胞进行染色，在FITC通道检测出NK细胞的杀伤活性。
所述流式细胞术能够在单细胞水平上检测NK细胞引发的肿瘤细胞死亡率。
所述CD2细胞表面抗原可以区分NK细胞和肿瘤细胞。CD2是NK细胞特有的表面抗原分子，相反CD2在除T细胞相关淋巴瘤之外的众多肿瘤细胞中几乎均为阴性表达。
所述APC荧光染料在合适波长激发光的激发下发出明亮的红色荧光。
所述Annexin V-FITC荧光染料可以标记NK杀伤后肿瘤细胞的早期凋亡细胞群。在正常细胞中，膜磷脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧。在细胞发生凋亡的早期，PS由脂膜内侧翻向外侧，此时Annexin-V与PS高亲和力特异性的结合。因此Annexin-V是检测细胞早期凋亡的灵敏指标。
所述SYTOX Green荧光染料可以标记NK杀伤后肿瘤细胞的中晚期凋亡及坏死细胞群。SYTOX Green是一种核酸染料，不能通过正常完整的细胞膜。随着细胞凋亡、死亡，细胞膜对SYTOX Green的通透性逐渐增加，SYTOX Green将会进入细胞并与凋亡细胞浆内的DNA结合。因此SYTOX Green是检测细胞中晚期凋亡及坏死的常用指标。
所述Annexin V-FITC与SYTOX Green双染，可将凋亡细胞和坏死细胞全部标记出来，杜绝了漏检。此外，两者在合适波长激发光的激发下均发出明亮的绿色荧光，可在相同通道进行检测，利于数据分析。
本发明方法应用于NK细胞杀伤活性的检测。
所述的方法为区分效应细胞和靶细胞，并鉴定效应细胞与靶细胞比例(E:Tratio)。
所述的方法为通过检测靶细胞的凋亡和坏死细胞群，全面反映NK细胞的杀伤活性。
本发明的实验试剂：CD2-APC荧光染料、Annexin V-FITC荧光染料、SYTOX Green荧光染料、FACS staining buffer、Annexin V-FITC binding buffer、PBS缓冲液(含0.5％BSA，0.1％叠氮化钠)、细胞培养基、血清、IL-2生长因子等。
每组细胞均设置3个或以上复孔。实验结果以3个或以上独立实验的均值±标准差(Standard Deviation，SD)表示。采用GraphPad Prism 5进行统计分析，组间比较采用双尾不配对t检验，P<0.05为显著性差异标准。
结果举例：
(1)比较不同效应细胞与靶细胞比例(E:T ratio)下NK细胞的杀伤活性。
分别按照E:T＝1:1与E:T＝5:1的比例混合KHYG-1细胞和K562细胞，培养4小时后收集细胞，荧光染色并上机检测。实验结果表明，本发明提供的CD2-APC荧光染色法可以很好地区分效应细胞KHYG-1和靶细胞K562，准确鉴定E:T比例，且高比例的效应细胞对靶细胞的杀伤作用更加强烈(见图3A，3B)。同理，分别按照E:T＝1:1与E:T＝5:1的比例混合KHYG-1细胞和MM.1S细胞，培养4小时后收集细胞，荧光染色并上机检测。获得同样实验结论，CD2-APC荧光染色可以很好地区分效应细胞KHYG-1和靶细胞MM.1S，准确鉴定E:T比例，且高比例的效应细胞对靶细胞的杀伤作用更加强烈(见图3C，3D)。
(2)比较Annexin V-FITC单染，SYTOX Green单染与Annexin V-FITC/SYTOX Green双染处理条件下NK细胞的杀伤活性
按照E:T＝1:1的比例混合KHYG-1细胞和K562细胞，培养4小时后收集细胞，分别进行Annexin V-FITC单染，SYTOX Green单染，Annexin V-FITC/SYTOX Green双染，并上机检测。实验结果表明，本发明提供的Annexin V-FITC/SYTOX Green双染法可以检测出效应细胞杀伤后靶细胞的凋亡和坏死细胞比例，全面反映NK细胞的杀伤活性，显著降低了对于靶细胞死亡率的漏检(见图4)。
综合以上结果，本发明提供的采用CD2分群联合Annexin V-FITC/SYTOX Green双染的流式细胞术检测NK细胞杀伤活性的新方法，具有①快速高效；②无需事先标记效应细胞(NK细胞)和靶细胞(肿瘤细胞)，对细胞干涉或影响小；③准确鉴定效应细胞与靶细胞比例(E:T ratio)，用于计算毒力单位(lytic unit)；④显著降低对于效应细胞杀伤后靶细胞死亡率的漏检；⑤节约检测通道，可结合其他检测指标等优势。因此，本发明是一种操作简单、稳定可靠、灵敏度高，适用范围广的NK细胞杀伤活性的检测方法。
Claims (2)
1.一种基于流式细胞术检测NK细胞杀伤活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，按比例混合效应细胞即NK细胞为KHYG-1细胞和靶细胞即肿瘤细胞为K562细胞，培养后收集细胞，无需提前标记效应细胞即NK细胞和靶细胞即肿瘤细胞，接种并培养细胞；
步骤2，收集细胞并染色：采用CD2-APC荧光染料对NK细胞和肿瘤细胞进行分群，随后采用Annexin V-FITC/SYTOX Green对凋亡和坏死的靶细胞进行染色；
步骤3，流式上机检测；
步骤1具体包括：接种效应细胞即NK细胞为KHYG-1细胞、靶细胞即肿瘤细胞为K562细胞，并培养，实验前1-2天给细胞换液，调整细胞至对数生长期的最佳状态；KHYG-1细胞培养于含IL-2的细胞培养基中；
具体包括：
1)NK细胞为效应细胞，肿瘤细胞为靶细胞，1500rpm离心NK细胞和肿瘤细胞5分钟，重悬并分别计数，调整细胞密度为0.5х106/ml；
2)接种细胞至24孔板；设置不同效应细胞与靶细胞比例，E:T ratio；取1ml K562细胞加入对照孔，取1ml KHYG-1细胞和1ml K562细胞混合后加入实验孔；
3)继续培养4小时；
步骤2包括以下步骤：
1)收集2孔细胞至流式管，于1500rpm离心细胞5分钟，弃掉上清，用4℃的PBS缓冲液洗涤1-2次；
2)每管加入4℃的100μl FACS staining buffer，再加入5μl CD2-APC荧光染料，冰浴避光静置30分钟；
3)用4℃的PBS缓冲剂离心洗涤细胞1-2次后，每管加入4℃的100μl Annexin V-FITCbinding buffer，再加入5μl Annexin V-FITC荧光染料和1μl SYTOX Green荧光染料，冰浴避光静置15分钟；
4)流式上机检测前，每管补加300μl Annexin V-FITC binding buffer；
步骤3包括以下步骤：
1)在FSC/SSC散点图中，设门圈定包括效应细胞和靶细胞的全部细胞；
2)在APC/SSC散点图中，将Step 1圈定的细胞分为APC+和APC-细胞，APC+为表达CD2的KHYG-1NK细胞，APC-为CD2表达阴性的K562肿瘤靶细胞；
3)在FITC/Count直方图中，分析Step 2中APC-细胞的FITC通道荧光强度，计算出早期凋亡、中晚期凋亡和坏死的K562细胞总比例。
2.根据权利要求1所述的一种基于流式细胞术检测NK细胞杀伤活性的方法，其特征在于，PBS缓冲液含0.5％BSA和0.1％叠氮化钠；SYTOX Green荧光染料的浓度为1mg/ml。
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