CN110231275B - 一种基于流式细胞术检测nk细胞杀伤活性的方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于流式细胞术检测NK细胞杀伤活性的方法,包括以下步骤:步骤1,接种并培养细胞;步骤2,收集细胞并染色:采用CD2‑APC荧光染料对NK细胞和肿瘤细胞进行分群,随后采用Annexin V‑FITC/SYTOX Green对凋亡和坏死的靶细胞进行染色;步骤3,流式上机检测。本发明使用Annexin V‑FITC/SYTOX Green双染,采用相同检测通道将凋亡细胞和坏死细胞全部标记出来,显著降低了对NK杀伤后肿瘤细胞各种不同状态(早期凋亡、中晚期凋亡或坏死细胞)的漏检。
Description
技术领域
本发明属于细胞杀伤活性检测技术领域,特别涉及一种基于流式细胞术检测NK细胞杀伤活性的方法。
背景技术
自然杀伤细胞(Natural killer cell,NK cell)是机体天然免疫系统的重要组成部分。在多种细胞因子(如IL-2、IL-15等)、饲养细胞(Feeder cells)的作用下,NK细胞可发生增殖和活化,随后释放穿孔素及颗粒酶杀死肿瘤细胞、病毒和清除非己细胞。NK细胞与肿瘤免疫、抗病毒免疫、移植免疫及自身免疫疾病密切相关。例如在多数肿瘤(特别是中晚期及伴有转移的肿瘤)、免疫缺陷等患者中,NK细胞活性降低;而在某些病毒感染性疾病早期、长期使用干扰素及其诱导物、宿主抗移植物反应等患者中,NK细胞活性增高。因此,准确评价外周血或体外培养NK细胞的杀伤活性,是了解NK细胞功能及评估过继性免疫治疗效果的一种重要手段。
目前检测NK细胞杀伤活性的方法较多,可分为同位素标记法、酶反应比色法和流式细胞术三大类。同位素标记51Cr释放法被认为是“金标准”,该方法准确性较高,但因设备昂贵且存在放射污染,现已不常使用。酶反应比色法有乳酸脱氢酶(LDH)释放法和四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法,两者易受外界因素(温度、pH值、试剂)影响,以及细胞自发释放底物等因素,造成准确性及重复性较差。流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)是一种在液流系统中快速测定单个细胞或细胞器的生物学性质,并把特定的细胞或细胞器从群体中加以分类收集的技术。鉴于其在单细胞水平上高效准确的定量分析优势,目前涌现出多种以流式细胞术为基础的NK细胞杀伤活性的测定方法,但各自仍然存在缺陷。以下对现有流式细胞术检测方法的不足进行分类说明。
首先,由于效应细胞(NK细胞)和靶细胞(肿瘤细胞)在共培养过程中,靶细胞对效应细胞可能会产生一定抑制和破坏作用,则共培养体系的死亡率可能是包括靶细胞和效应细胞的共同死亡率。为更加准确地反映NK细胞的杀伤功能,现有流式细胞术检测方法多采用以下方案区分靶细胞和效应细胞,然后分析靶细胞的死亡率:(1)如果效应细胞和靶细胞的体积相差比较大,可通过FSC/SSC设门的方式将两种细胞区分开。(2)如果效应细胞和靶细胞的体积相同或相差不大,通过设门难以分开,则需标记细胞进行区分。多使用荧光染料标记靶细胞,如钙荧光素乙酰氧基甲酯(CAM)、羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)、VybrantDiO(DiO)和MitoTracker Green(MTG)。但是这种标记方法存在荧光染料自发释放后被邻近效应细胞吸收,且荧光染料对细胞功能造成潜在影响,持续时间短,稳定性差等问题。
其次,经效应细胞(NK细胞)杀伤作用后,靶细胞将处于各种不同状态(活细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡及坏死细胞)。目前流式细胞术检测方法主要采用7-氨基放线菌素(7-AAD)、碘化丙啶(PI)、SYTOX Green单染法来鉴定靶细胞的死亡率。三者均为核酸染料,可与凋亡细胞浆内的DNA结合。虽然它们能够特异性地检测靶细胞的凋亡率,但仅能标记晚期凋亡及坏死细胞,漏检早期凋亡细胞,从而无法全面反映NK细胞的杀伤活性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于流式细胞术检测NK细胞杀伤活性的方法,以解决上述问题。
为实现上述目的,本发明采用以下技术方案:
一种基于流式细胞术检测NK细胞杀伤活性的方法,包括以下步骤:
步骤1,接种并培养细胞;
步骤2,收集细胞并染色:采用CD2-APC荧光染料对NK细胞和肿瘤细胞进行分群,随后采用Annexin V-FITC/SYTOX Green对凋亡和坏死的靶细胞进行染色;
步骤3,流式上机检测。
进一步的,步骤1具体包括:接种KHYG-1、K562细胞并培养,实验前1-2天给细胞换液,调整细胞至对数生长期的最佳状态;KHYG-1细胞培养于含IL-2的细胞培养基中。
进一步的,步骤2包括以下步骤:
1)1500rpm离心NK细胞以及靶细胞细胞5分钟,重悬并分别计数,调整细胞密度为0.5х106/ml;
2)接种细胞至24孔板;NK细胞为效应细胞,肿瘤细胞为靶细胞,设置不同效应细胞与靶细胞比例,E:T ratio;取1ml K562细胞加入对照孔,取1ml KHYG-1细胞和1ml K562细胞混合后加入实验孔;
3)继续培养4小时;
4)收集孵育后细胞至流式管,于1500rpm离心细胞5分钟,弃掉上清,用4℃的PBS缓冲液洗涤1-2次;
5)每管加入冰冷的100μl FACS staining buffer,再加入5μl CD2-APC荧光染料,冰浴避光静置30分钟;
6)用4℃的PBS缓冲剂离心洗涤细胞1-2次;每管加入4℃的100μl Annexin V-FITCbinding buffer,再加入5μl Annexin V-FITC荧光染料和1μl SYTOX Green荧光染料,冰浴避光静置15分钟;
7)流式上机检测前,每管补加300μl Annexin V-FITC binding buffer。
进一步的,PBS缓冲液含0.5%BSA和0.1%叠氮化钠;SYTOX Green荧光染料的浓度为1mg/ml。
进一步的,步骤3包括以下步骤:
1)在FSC/SSC散点图中,设门圈定包括效应细胞和靶细胞的全部细胞;
2)在APC/SSC散点图中,将Step 1圈定的细胞分为APC+和APC-细胞,APC+为表达CD2的KHYG-1细胞,APC-为CD2表达阴性的K562细胞;
3)在FITC/Count直方图中,分析Step 2中APC-细胞的FITC通道荧光强度,计算出早期凋亡、中晚期凋亡及坏死的K562细胞总比例。
FSC/SSC散点图、APC/SSC散点图和FITC/Count直方图均由任意一款国家标准流式分析软件生成。
与现有技术相比,本发明有以下技术效果:
本发明无需提前标记效应细胞(NK细胞)和靶细胞(肿瘤细胞),对细胞的干涉或影响小,不存在标记物泄露的问题。
本发明准确鉴定效应细胞与靶细胞比例(E:T ratio),可进一步用于计算毒力单位(lytic unit)。
本发明的CD2在多数肿瘤细胞中呈阴性表达,见图1,故本发明检测范围广泛。
本发明使用Annexin V-FITC/SYTOX Green双染,采用相同检测通道将凋亡细胞和坏死细胞全部标记出来,显著降低了对NK杀伤后肿瘤细胞各种不同状态(早期凋亡、中晚期凋亡和坏死细胞)的漏检。
本发明所使用的三种荧光分子仅占用两个荧光通道,空余荧光通道可用于结合其他检测指标(通道)监测细胞其他表型。
附图说明
图1效应细胞(KHYG-1,NK92-MI)和靶细胞(U266,Jurkat,K562,MM.1S,RPMI8226,MOLM13,KMS11,HL60,NCI-H929,Raji)中CD2表达情况。
图2采用CD2分群联合Annexin V-FITC/SYTOX Green双染的流式细胞术检测NK细胞杀伤活性的操作流程。
图3比较不同效应细胞与靶细胞比例(E:T ratio)下,NK细胞的杀伤活性。(A,B)在E:T=1:1与E:T=5:1的比例下,KHYG-1细胞对K562细胞的杀伤活性。(C,D)在E:T=1:1与E:T=5:1的比例下,KHYG-1细胞对MM.1S细胞的杀伤活性。
图4比较Annexin V-FITC单染,SYTOX Green单染与Annexin V-FITC/SYTOX Green双染处理条件下,NK细胞杀伤活性的检测效率。
具体实施方式
以下结合附图对本发明进一步说明:
请参阅图1至图4,一种基于流式细胞术检测NK细胞杀伤活性的方法,包括以下步骤:
步骤1,接种并培养细胞;
步骤2,收集细胞并染色:采用CD2-APC荧光染料对NK细胞和肿瘤细胞进行分群,随后采用Annexin V-FITC/SYTOX Green对凋亡和坏死的靶细胞进行染色;
步骤3,流式上机检测。
步骤1具体包括:接种KHYG-1、K562细胞并培养,实验前1-2天给细胞换液,调整细胞至对数生长期的最佳状态;KHYG-1细胞培养于含IL-2的细胞培养基中。
步骤2包括以下步骤:
1)1500rpm离心NK细胞及靶细胞5分钟,重悬并分别计数,调整细胞密度为0.5х106/ml;
2)接种细胞至24孔板;NK细胞位效应细胞,肿瘤细胞为靶细胞,设置不同效应细胞与靶细胞比例,E:T ratio;取1ml K562细胞加入对照孔,取1ml KHYG-1细胞和1mlK562细胞混合后加入实验孔;
3)继续培养4小时;
4)收集2孔细胞至流式管,于1500rpm离心细胞5分钟,弃掉上清,用4℃的PBS缓冲液洗涤1-2次;
5)每管加入冰冷的100μl FACS staining buffer,再加入5μl CD2-APC荧光染料,冰浴避光静置30分钟;
6)用4℃的PBS缓冲剂洗涤细胞1-2次;每管加入4℃的100μl Annexin V-FITCbinding buffer,再加入5μl Annexin V-FITC荧光染料和1μl SYTOX Green荧光染料,冰浴避光静置15分钟;
7)流式上机检测前,每管补加300μl Annexin V-FITC binding buffer。
PBS缓冲液含0.5%BSA和0.1%叠氮化钠;SYTOX Green荧光染料的浓度为1mg/ml。
步骤3包括以下步骤:
1)在FSC/SSC散点图中,设门圈定包括效应细胞和靶细胞的全部细胞(见图2流式检测步骤中Step 1)。
2)在APC/SSC散点图中,将Step 1圈定的细胞分为APC+和APC-细胞,APC+为表达CD2的KHYG-1细胞,APC-为CD2表达阴性的K562细胞(见图2流式检测步骤中Step 2)。
3)在FITC/Count直方图中,分析Step 2中APC-细胞的FITC通道荧光强度,计算出早期凋亡、中晚期凋亡及坏死的K562细胞总比例(见图2流式检测步骤中Step 3)。
FSC/SSC散点图、APC/SSC散点图和FITC/Count直方图均由任意一款国家标准流式分析软件生成。
本发明利用流式细胞术在单细胞水平上分选监测细胞信号的优势,采用CD2-APC荧光染料对效应细胞(NK细胞)和靶细胞(肿瘤细胞)进行分群,随后采用Annexin V-FITC/SYTOX Green对凋亡和坏死的靶细胞进行染色,在FITC通道检测出NK细胞的杀伤活性。
所述流式细胞术能够在单细胞水平上检测NK细胞引发的肿瘤细胞死亡率。
所述CD2细胞表面抗原可以区分NK细胞和肿瘤细胞。CD2是NK细胞特有的表面抗原分子,相反CD2在除T细胞相关淋巴瘤之外的众多肿瘤细胞中几乎均为阴性表达。
所述APC荧光染料在合适波长激发光的激发下发出明亮的红色荧光。
所述Annexin V-FITC荧光染料可以标记NK杀伤后肿瘤细胞的早期凋亡细胞群。在正常细胞中,膜磷脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧。在细胞发生凋亡的早期,PS由脂膜内侧翻向外侧,此时Annexin-V与PS高亲和力特异性的结合。因此Annexin-V是检测细胞早期凋亡的灵敏指标。
所述SYTOX Green荧光染料可以标记NK杀伤后肿瘤细胞的中晚期凋亡及坏死细胞群。SYTOX Green是一种核酸染料,不能通过正常完整的细胞膜。随着细胞凋亡、死亡,细胞膜对SYTOX Green的通透性逐渐增加,SYTOX Green将会进入细胞并与凋亡细胞浆内的DNA结合。因此SYTOX Green是检测细胞中晚期凋亡及坏死的常用指标。
所述Annexin V-FITC与SYTOX Green双染,可将凋亡细胞和坏死细胞全部标记出来,杜绝了漏检。此外,两者在合适波长激发光的激发下均发出明亮的绿色荧光,可在相同通道进行检测,利于数据分析。
本发明方法应用于NK细胞杀伤活性的检测。
所述的方法为区分效应细胞和靶细胞,并鉴定效应细胞与靶细胞比例(E:Tratio)。
所述的方法为通过检测靶细胞的凋亡和坏死细胞群,全面反映NK细胞的杀伤活性。
本发明的实验试剂:CD2-APC荧光染料、Annexin V-FITC荧光染料、SYTOX Green荧光染料、FACS staining buffer、Annexin V-FITC binding buffer、PBS缓冲液(含0.5%BSA,0.1%叠氮化钠)、细胞培养基、血清、IL-2生长因子等。
每组细胞均设置3个或以上复孔。实验结果以3个或以上独立实验的均值±标准差(Standard Deviation,SD)表示。采用GraphPad Prism 5进行统计分析,组间比较采用双尾不配对t检验,P<0.05为显著性差异标准。
结果举例:
(1)比较不同效应细胞与靶细胞比例(E:T ratio)下NK细胞的杀伤活性。
分别按照E:T=1:1与E:T=5:1的比例混合KHYG-1细胞和K562细胞,培养4小时后收集细胞,荧光染色并上机检测。实验结果表明,本发明提供的CD2-APC荧光染色法可以很好地区分效应细胞KHYG-1和靶细胞K562,准确鉴定E:T比例,且高比例的效应细胞对靶细胞的杀伤作用更加强烈(见图3A,3B)。同理,分别按照E:T=1:1与E:T=5:1的比例混合KHYG-1细胞和MM.1S细胞,培养4小时后收集细胞,荧光染色并上机检测。获得同样实验结论,CD2-APC荧光染色可以很好地区分效应细胞KHYG-1和靶细胞MM.1S,准确鉴定E:T比例,且高比例的效应细胞对靶细胞的杀伤作用更加强烈(见图3C,3D)。
(2)比较Annexin V-FITC单染,SYTOX Green单染与Annexin V-FITC/SYTOX Green双染处理条件下NK细胞的杀伤活性
按照E:T=1:1的比例混合KHYG-1细胞和K562细胞,培养4小时后收集细胞,分别进行Annexin V-FITC单染,SYTOX Green单染,Annexin V-FITC/SYTOX Green双染,并上机检测。实验结果表明,本发明提供的Annexin V-FITC/SYTOX Green双染法可以检测出效应细胞杀伤后靶细胞的凋亡和坏死细胞比例,全面反映NK细胞的杀伤活性,显著降低了对于靶细胞死亡率的漏检(见图4)。
综合以上结果,本发明提供的采用CD2分群联合Annexin V-FITC/SYTOX Green双染的流式细胞术检测NK细胞杀伤活性的新方法,具有①快速高效;②无需事先标记效应细胞(NK细胞)和靶细胞(肿瘤细胞),对细胞干涉或影响小;③准确鉴定效应细胞与靶细胞比例(E:T ratio),用于计算毒力单位(lytic unit);④显著降低对于效应细胞杀伤后靶细胞死亡率的漏检;⑤节约检测通道,可结合其他检测指标等优势。因此,本发明是一种操作简单、稳定可靠、灵敏度高,适用范围广的NK细胞杀伤活性的检测方法。
Claims (2)
1.一种基于流式细胞术检测NK细胞杀伤活性的方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤1,按比例混合效应细胞即NK细胞为KHYG-1细胞和靶细胞即肿瘤细胞为K562细胞,培养后收集细胞,无需提前标记效应细胞即NK细胞和靶细胞即肿瘤细胞,接种并培养细胞;
步骤2,收集细胞并染色:采用CD2-APC荧光染料对NK细胞和肿瘤细胞进行分群,随后采用Annexin V-FITC/SYTOX Green对凋亡和坏死的靶细胞进行染色;
步骤3,流式上机检测;
步骤1具体包括:接种效应细胞即NK细胞为KHYG-1细胞、靶细胞即肿瘤细胞为K562细胞,并培养,实验前1-2天给细胞换液,调整细胞至对数生长期的最佳状态;KHYG-1细胞培养于含IL-2的细胞培养基中;
具体包括:
1)NK细胞为效应细胞,肿瘤细胞为靶细胞,1500rpm离心NK细胞和肿瘤细胞5分钟,重悬并分别计数,调整细胞密度为0.5х106/ml;
2)接种细胞至24孔板;设置不同效应细胞与靶细胞比例,E:T ratio;取1ml K562细胞加入对照孔,取1ml KHYG-1细胞和1ml K562细胞混合后加入实验孔;
3)继续培养4小时;
步骤2包括以下步骤:
1)收集2孔细胞至流式管,于1500rpm离心细胞5分钟,弃掉上清,用4℃的PBS缓冲液洗涤1-2次;
2)每管加入4℃的100μl FACS staining buffer,再加入5μl CD2-APC荧光染料,冰浴避光静置30分钟;
3)用4℃的PBS缓冲剂离心洗涤细胞1-2次后,每管加入4℃的100μl Annexin V-FITCbinding buffer,再加入5μl Annexin V-FITC荧光染料和1μl SYTOX Green荧光染料,冰浴避光静置15分钟;
4)流式上机检测前,每管补加300μl Annexin V-FITC binding buffer;
步骤3包括以下步骤:
1)在FSC/SSC散点图中,设门圈定包括效应细胞和靶细胞的全部细胞;
2)在APC/SSC散点图中,将Step 1圈定的细胞分为APC+和APC-细胞,APC+为表达CD2的KHYG-1NK细胞,APC-为CD2表达阴性的K562肿瘤靶细胞;
3)在FITC/Count直方图中,分析Step 2中APC-细胞的FITC通道荧光强度,计算出早期凋亡、中晚期凋亡和坏死的K562细胞总比例。
2.根据权利要求1所述的一种基于流式细胞术检测NK细胞杀伤活性的方法,其特征在于,PBS缓冲液含0.5%BSA和0.1%叠氮化钠;SYTOX Green荧光染料的浓度为1mg/ml。
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