JPS5965748A - 光吸収性染料で染色されない細胞および染色される細胞を識別する方法 - Google Patents
光吸収性染料で染色されない細胞および染色される細胞を識別する方法Info
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- JPS5965748A JPS5965748A JP58162479A JP16247983A JPS5965748A JP S5965748 A JPS5965748 A JP S5965748A JP 58162479 A JP58162479 A JP 58162479A JP 16247983 A JP16247983 A JP 16247983A JP S5965748 A JPS5965748 A JP S5965748A
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- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は挟角および広角光散乱の指標に基づいて、非染
色性細胞および光吸収性表面染色色素で染1つ反細胞と
4・識別する方法に関するものである。言いかえf′1
.ば本発明に、光を基にしたフローシトメトリー(fl
ow cytornetr)’)測冗法に応用されるこ
とを目的にしている。
色性細胞および光吸収性表面染色色素で染1つ反細胞と
4・識別する方法に関するものである。言いかえf′1
.ば本発明に、光を基にしたフローシトメトリー(fl
ow cytornetr)’)測冗法に応用されるこ
とを目的にしている。
フローシトメトリー測足法は、臨床−並びに研究分野で
使用さ扛る工うになシ、同時に毒物学。
使用さ扛る工うになシ、同時に毒物学。
診断、好ましいハイグリドーマ細胞系列の確認。
および不均質細胞集団における神々の細胞型の識別に必
要なものとなってきた。歴史的Vr−に、こ几は無生育
性細胞にではなく、生育細胞に特異的な染料、即ち生体
型染料、な用いるか、又は、混合物中の全ての細胞に一
収旧に用いらnる成る果料の効果を1ヌ別する目的で、
埃扛た螢光の大きさ。
要なものとなってきた。歴史的Vr−に、こ几は無生育
性細胞にではなく、生育細胞に特異的な染料、即ち生体
型染料、な用いるか、又は、混合物中の全ての細胞に一
収旧に用いらnる成る果料の効果を1ヌ別する目的で、
埃扛た螢光の大きさ。
程度等の多数の指標を測足することKよって行わ扛てき
穴。
穴。
例えばDr、MYron R,MelamedにLる1
細胞毒性試験オートノーンヨン:生きている細胞と死ん
でいる細胞&に別するカウンター”と題する論文(5c
ience、163:285−286.1969)の中
で、細胞毒性試験において生細胞と死細胞ケ自動0ジに
識別、計数するkめに細胞スペクトロフロロメーターを
用いる方法が記載されていた。トリノくングルーが生体
指標として用いらn、π、というのは無生育細胞はトリ
ノくングルーをとシ込み、染色さnるのに反し、生きて
いる細胞はこの染料を排除し、染色さnないからである
。トリバンプルーは光を効果的に吸収するから、吸光度
測定値な。
細胞毒性試験オートノーンヨン:生きている細胞と死ん
でいる細胞&に別するカウンター”と題する論文(5c
ience、163:285−286.1969)の中
で、細胞毒性試験において生細胞と死細胞ケ自動0ジに
識別、計数するkめに細胞スペクトロフロロメーターを
用いる方法が記載されていた。トリノくングルーが生体
指標として用いらn、π、というのは無生育細胞はトリ
ノくングルーをとシ込み、染色さnるのに反し、生きて
いる細胞はこの染料を排除し、染色さnないからである
。トリバンプルーは光を効果的に吸収するから、吸光度
測定値な。
非染色性生育細胞に対する。染色された。即ち無生育の
細胞のパーセンテージと関連づけることができる。
細胞のパーセンテージと関連づけることができる。
細胞の生育性お工びそnに基づく生体型染料の摂取の差
に依らないで、非−吸光度測定値の使用に工り、生育細
胞間を識別することのできる方法を作るのが不発明の目
的である。
に依らないで、非−吸光度測定値の使用に工り、生育細
胞間を識別することのできる方法を作るのが不発明の目
的である。
異なる染料摂取量および散乱並びに吸収の測定値に基づ
く細胞の鑑別がFr i edman等により、米国特
許1租3,785.735 K記載さfL穴。その特許
には、トリバンプルーのような生体染料の摂取の差に基
う〈生細胞と死細胞の鑑別が明確に記さ扛ている1、ト
リパングルーで染1つた死細胞は大きい吸収および小さ
い散乱の特性ケ示し、生細胞、は低い吸収−お工び冒い
散乱特性を示すことがわかつ* o Fr i edm
anは、直接的(セロ角)吸収側’iでは明らかに大き
いノイズシグナルを減らそうとして1人躬商明光ビーム
に対して広角に検出器を置くことによって吸収な測足し
fco Fr1edrnanは生絹JI’[!!および
死細胞を識別するために吸収−お工び散乱測定値に籾っ
た。吸収測定値に、頼らずに生細胞の、仲々の種類を鑑
別する方法については彼は語っていない。
く細胞の鑑別がFr i edman等により、米国特
許1租3,785.735 K記載さfL穴。その特許
には、トリバンプルーのような生体染料の摂取の差に基
う〈生細胞と死細胞の鑑別が明確に記さ扛ている1、ト
リパングルーで染1つた死細胞は大きい吸収および小さ
い散乱の特性ケ示し、生細胞、は低い吸収−お工び冒い
散乱特性を示すことがわかつ* o Fr i edm
anは、直接的(セロ角)吸収側’iでは明らかに大き
いノイズシグナルを減らそうとして1人躬商明光ビーム
に対して広角に検出器を置くことによって吸収な測足し
fco Fr1edrnanは生絹JI’[!!および
死細胞を識別するために吸収−お工び散乱測定値に籾っ
た。吸収測定値に、頼らずに生細胞の、仲々の種類を鑑
別する方法については彼は語っていない。
不均質混合物中に存在するところの1元吸収性表面染料
で染色さ肛る細゛胞お工び非染色性細胞ケ。
で染色さ肛る細゛胞お工び非染色性細胞ケ。
挟角並びに広角散乱測定値を用いて、そfi以外の吸収
測定値は用いないで鑑別する方法を用意す4)のが本発
明の目的である。実際、散乱と吸収とは。
測定値は用いないで鑑別する方法を用意す4)のが本発
明の目的である。実際、散乱と吸収とは。
表面によって吸収さ扛る光が多けrしば多い程、散乱す
る党は少くなる。というように逆比例関係にある。そこ
でFr i edman ば、死細胞(トリパンクル
ーで染色され7t)は染色されない細胞ニジ多くの光を
吸収する。と主張し、染色性細胞で得らnる散乱値が、
非染色性細胞の散乱値より特徴的に小さいことを示唆し
左。実際は光吸収性染料で染色され7tC+1組胞の広
角測定では、染色さ几ない細胞が発生する散乱ニジ多い
散乱が認めらnることが発見さnRoULって染色性細
胞および非染色性細胞を識別するためにこの発見を利用
することが本発明の目的である。
る党は少くなる。というように逆比例関係にある。そこ
でFr i edman ば、死細胞(トリパンクル
ーで染色され7t)は染色されない細胞ニジ多くの光を
吸収する。と主張し、染色性細胞で得らnる散乱値が、
非染色性細胞の散乱値より特徴的に小さいことを示唆し
左。実際は光吸収性染料で染色され7tC+1組胞の広
角測定では、染色さ几ない細胞が発生する散乱ニジ多い
散乱が認めらnることが発見さnRoULって染色性細
胞および非染色性細胞を識別するためにこの発見を利用
することが本発明の目的である。
光吸収性色素をオIJ用して、ウイールス抗原の細胞形
僧門免疫酵素染色を見出す方法をLeary 等J、H
istocbem、Cytoche?n、 24,12
49(1976)が報告しに0ウイールスを含む細胞を
ホルムアルデヒド中で固定し、そ扛からそのウイールス
に対する抗体と反応させ友。過酸化酵素と結合し、第一
の抗体と反応する第二の抗体をその細胞と反応させた。
僧門免疫酵素染色を見出す方法をLeary 等J、H
istocbem、Cytoche?n、 24,12
49(1976)が報告しに0ウイールスを含む細胞を
ホルムアルデヒド中で固定し、そ扛からそのウイールス
に対する抗体と反応させ友。過酸化酵素と結合し、第一
の抗体と反応する第二の抗体をその細胞と反応させた。
基質ジアミノベンチジンー二#ARYその後その細胞と
反応させると過酸化酵素を含むこ扛らの細胞、即ちウイ
ールスに対する抗体を會むこれら細胞に褐色の反応生成
物が沈着した。褐色反応生成物の存在f−1:、”0I
(THOCYTOFLUOROGRAF’(商品名ノフ
ローシトメータを用いて、アルゴンイオンレーザ−で冊
1胞を分析することに、Cシ、演出シ1テ。CYTUF
LLIOROGRAFでハ、レーザービームに対して0
−1の範l′!itの川の胛り刀同元損失(Leary
’?、iにより「挟角散乱(low angle 5c
atter月と呼ば几る)およびレーザービームに対し
て1°二19の角110囲の前刀回元散乱(L ea
r y等に工9「広角散乱(wide angle 5
catter〕」と呼ばnる)を測定しに0ノ又応した
細胞は1反応しない細胞に比べて、J、り少い前方光散
乱、Lり多い軸力開光損失ケボした。
反応させると過酸化酵素を含むこ扛らの細胞、即ちウイ
ールスに対する抗体を會むこれら細胞に褐色の反応生成
物が沈着した。褐色反応生成物の存在f−1:、”0I
(THOCYTOFLUOROGRAF’(商品名ノフ
ローシトメータを用いて、アルゴンイオンレーザ−で冊
1胞を分析することに、Cシ、演出シ1テ。CYTUF
LLIOROGRAFでハ、レーザービームに対して0
−1の範l′!itの川の胛り刀同元損失(Leary
’?、iにより「挟角散乱(low angle 5c
atter月と呼ば几る)およびレーザービームに対し
て1°二19の角110囲の前刀回元散乱(L ea
r y等に工9「広角散乱(wide angle 5
catter〕」と呼ばnる)を測定しに0ノ又応した
細胞は1反応しない細胞に比べて、J、り少い前方光散
乱、Lり多い軸力開光損失ケボした。
0rtho Diagnostic Systems
Inc、 社によって発表さ扛、同社から入手でき
る1オルソ・プロトコール1框81に、細胞1表面の光
−吸収性染料に関してJul様な効果が得られると報告
さnている1、このプロトコール、′形質細t@膀#I
胞におけるCon−A Receptor 5iteの
測胞図的分析」には、細胞表面におけるコンカカバリン
Aの免役過酸化酵素染色に関する方法が記さn、ている
。この染色の結果、 、t、lII胞表面表面光吸収性
の赤い染色がおきる1、ヘリウム・ネオン・レーザーか
らの軸方向光植失および前方光散乱をrcYTOGRA
F6300AJ(商品名)で測定しに0染色された細胞
は前方光散乱の著しい減少ケ示し爬が軸力同党損失は大
きくは亥化しなかっに0 比較的鋭敏でない軸力同党損失測定の代シに。
Inc、 社によって発表さ扛、同社から入手でき
る1オルソ・プロトコール1框81に、細胞1表面の光
−吸収性染料に関してJul様な効果が得られると報告
さnている1、このプロトコール、′形質細t@膀#I
胞におけるCon−A Receptor 5iteの
測胞図的分析」には、細胞表面におけるコンカカバリン
Aの免役過酸化酵素染色に関する方法が記さn、ている
。この染色の結果、 、t、lII胞表面表面光吸収性
の赤い染色がおきる1、ヘリウム・ネオン・レーザーか
らの軸方向光植失および前方光散乱をrcYTOGRA
F6300AJ(商品名)で測定しに0染色された細胞
は前方光散乱の著しい減少ケ示し爬が軸力同党損失は大
きくは亥化しなかっに0 比較的鋭敏でない軸力同党損失測定の代シに。
非常に広い角で(CYTOFL、tJOROGRAFで
測定する場合約55°〜125°)光散乱を測定するこ
とが。
測定する場合約55°〜125°)光散乱を測定するこ
とが。
本発明の目的である。広角−光散乱は、細胞表面中又は
細胞表向上の光吸収性染料の存在によって者しく影響さ
几ること?我々は見出し穴。
細胞表向上の光吸収性染料の存在によって者しく影響さ
几ること?我々は見出し穴。
その他の一般的細胞先別法は、−オル類の螢光色素で一
様に染色した細胞(複数)の異なる螢光特性を7Il!
1足することに基づいている。例えばAdams等の米
国特許Na 3,684,377には1種々の組成−そ
の一部には螢光色素としてアクリジンオレンジをも含む
−を用いて生きている白血球を他の血液成分と区別して
分析する方法が記さ扛ている。
様に染色した細胞(複数)の異なる螢光特性を7Il!
1足することに基づいている。例えばAdams等の米
国特許Na 3,684,377には1種々の組成−そ
の一部には螢光色素としてアクリジンオレンジをも含む
−を用いて生きている白血球を他の血液成分と区別して
分析する方法が記さ扛ている。
細胞を宵色レーザーイルミネーションにさらす。
この時緑色螢光の検出は、白血球と他の血液成分とを区
別する特徴としてはたらく。こめ情報な。
別する特徴としてはたらく。こめ情報な。
個々の白血球からツ1)せらγLる赤色螢光の検出と絹
み合わせると、白面〕*のNMY識別することができる
。
み合わせると、白面〕*のNMY識別することができる
。
細胞型の鑑別を有効に行うために、多数の螢光特性の検
出に頼らない方法を用意することか本発明の目〔(1で
ある。 1血欣成分
の鑑別も、細胞が焦点を合わせIC平行元#馨辿過1−
る時検出さ才しる散乱シグナルの二仄元シグナル分析に
よって行うことかできる。そのような方法は、Wein
er等に工って米国特許Na(4,202,625に記
載さ几ている。こnvCは、血液成分、特に赤血球およ
び血小板を見分ける方法および装置が記さrしている。
出に頼らない方法を用意することか本発明の目〔(1で
ある。 1血欣成分
の鑑別も、細胞が焦点を合わせIC平行元#馨辿過1−
る時検出さ才しる散乱シグナルの二仄元シグナル分析に
よって行うことかできる。そのような方法は、Wein
er等に工って米国特許Na(4,202,625に記
載さ几ている。こnvCは、血液成分、特に赤血球およ
び血小板を見分ける方法および装置が記さrしている。
しかしながらWeiner −は1元吸収性染料と
関連した散乱光測定が、細胞型ヲ麺別するのに用いら扛
ることについては述べていない。そのような力汰乞用意
することが本発明の目的である。
関連した散乱光測定が、細胞型ヲ麺別するのに用いら扛
ることについては述べていない。そのような力汰乞用意
することが本発明の目的である。
本発明の目的に従って、光吸収性表面−又は細胞質染色
色素で染1らない細胞および染する細胞の混合物を含む
不均質試料において細胞型を、鑑別する方法が用意さ汎
る。個々の血球を照射し分析するための光学系を用いる
血液分析装置、即ちいわゆるflow cytomet
ryinstrumentatiorl’用い、挟角、
および広角光散乱の測定によって。
色素で染1らない細胞および染する細胞の混合物を含む
不均質試料において細胞型を、鑑別する方法が用意さ汎
る。個々の血球を照射し分析するための光学系を用いる
血液分析装置、即ちいわゆるflow cytomet
ryinstrumentatiorl’用い、挟角、
および広角光散乱の測定によって。
鑑別を行うことができる。挟角散乱は、理想的には、入
射レーザービームから1〜19の範囲内の散乱と定義さ
n、広角散乱は、理想的には入射レーザービームから6
0〜120の範囲内又はそ几以上の角度の散乱と定義さ
rしる。(上記のLearyは1°〜19の範囲を、誤
って広角散乱と記してい谷フ特殊の種類の細胞は、酵素
のようなマーカーで標識化した血清学的に特異的な抗体
を用いて染色することができる。そのような抗体は都合
の良いことに特殊の抗原とのみ反応するであろうし、又
又反応お工び非特異的結合を減らすためには、モノクロ
ーン由来のものであるのが好フしいであろう。その抗体
は、染色したいと思う櫛類の細胞にのみ存在する抗原と
反応するようなものを選ぶのが都合がよい。その後その
酵素をjj考当な基質と反応させた場合、細胞表面に不
溶性生成物の沈着がおこるのが理想的である。この不溶
性生成物が入射光を吸収するか減するようなものである
ように選ぶのが理想的である。
射レーザービームから1〜19の範囲内の散乱と定義さ
n、広角散乱は、理想的には入射レーザービームから6
0〜120の範囲内又はそ几以上の角度の散乱と定義さ
rしる。(上記のLearyは1°〜19の範囲を、誤
って広角散乱と記してい谷フ特殊の種類の細胞は、酵素
のようなマーカーで標識化した血清学的に特異的な抗体
を用いて染色することができる。そのような抗体は都合
の良いことに特殊の抗原とのみ反応するであろうし、又
又反応お工び非特異的結合を減らすためには、モノクロ
ーン由来のものであるのが好フしいであろう。その抗体
は、染色したいと思う櫛類の細胞にのみ存在する抗原と
反応するようなものを選ぶのが都合がよい。その後その
酵素をjj考当な基質と反応させた場合、細胞表面に不
溶性生成物の沈着がおこるのが理想的である。この不溶
性生成物が入射光を吸収するか減するようなものである
ように選ぶのが理想的である。
このようにして、染色性および非染色性細胞の。
特に挟角−お工び広角光散乱性の測定は、「光吸収性・
表面−および細胞細胞形質染料で染色した細胞は、染色
さ’nない細胞ニジも少い挟角散乱。
表面−および細胞細胞形質染料で染色した細胞は、染色
さ’nない細胞ニジも少い挟角散乱。
および比較E171Lシ多い広角光散乱化生じる」とい
う発見に基づく上記細胞の鑑別を可能にする、。
う発見に基づく上記細胞の鑑別を可能にする、。
本発明の原理が神々の光学Bつ血液分析装置に適用さn
ることは明らかであるとはいえ、一層好ましい適用領域
は、流体力学Fl集中を用いる糸に(男するものである
。こ\では細胞は、大体1細胞の巾の狭い液体渦を通過
し、単一の細胞を照らすために、細胞は1ケづつ非當に
高速度で、焦点乞合わせた。又はレーザーの、光源を通
過する。伝達さ几た放射は、IN、体力学四に細胞力(
集っているフローチェンバーを出た後光ビームの横断面
に合うように工夫さf′Lだ閉鎖物により物理的に遮断
さ扛る。この工夫された閉鎖物の了わりを小さい前方角
で通過1−る散乱放射も入射光/lIIから広い角度。
ることは明らかであるとはいえ、一層好ましい適用領域
は、流体力学Fl集中を用いる糸に(男するものである
。こ\では細胞は、大体1細胞の巾の狭い液体渦を通過
し、単一の細胞を照らすために、細胞は1ケづつ非當に
高速度で、焦点乞合わせた。又はレーザーの、光源を通
過する。伝達さ几た放射は、IN、体力学四に細胞力(
集っているフローチェンバーを出た後光ビームの横断面
に合うように工夫さf′Lだ閉鎖物により物理的に遮断
さ扛る。この工夫された閉鎖物の了わりを小さい前方角
で通過1−る散乱放射も入射光/lIIから広い角度。
典型的には90°、で散乱する光も検出する7、そのよ
うな装置の一つがオルシン・ディアグノスチンクシステ
ム社(Rt、202.ラリクン、ニューシャーシー)か
ら入手できる”オルソスペクトラムIrrl″である。
うな装置の一つがオルシン・ディアグノスチンクシステ
ム社(Rt、202.ラリクン、ニューシャーシー)か
ら入手できる”オルソスペクトラムIrrl″である。
不均質試料中の検出ずべき細胞は、光−吸収性又はう七
−減弱注架料を細胞表口又は細胞形質に直接適用するか
、酵素活性に工ってそのような染料を形成すること[工
り染色さrしる。染色しょうとする細胞のみの表面に存
在する抗原に%異性を■するように選は7’した。いわ
ゆるモノクローナル抗体?用いて、目的とする細胞をN
認すること力を好葦しい。こうして吸収性染料そのもの
又は酵素。
−減弱注架料を細胞表口又は細胞形質に直接適用するか
、酵素活性に工ってそのような染料を形成すること[工
り染色さrしる。染色しょうとする細胞のみの表面に存
在する抗原に%異性を■するように選は7’した。いわ
ゆるモノクローナル抗体?用いて、目的とする細胞をN
認すること力を好葦しい。こうして吸収性染料そのもの
又は酵素。
の工うな標識ケモノクローナル抗体にくつつけると、そ
のラベ/l/’Y、目的とする種類の細胞に間接B″X
IVc<つつけたことになる。−I−好ましいのは。
のラベ/l/’Y、目的とする種類の細胞に間接B″X
IVc<つつけたことになる。−I−好ましいのは。
成る酵素ケ用いて、酵素反応が促進さ7’Lる工うな条
件下で適当な基質を添加すると細胞表面又は細胞形質に
一成る生成物が沈右するというやり力である。この生J
又物か光吸収性染料に7rる。光吸収性染料で染1つた
細胞と染プらない細胞とで光散乱特性の相異ン比較する
と挟角散乱では、非染色性細胞は典型的に染色性細胞エ
リ大きい散乱を示す。
件下で適当な基質を添加すると細胞表面又は細胞形質に
一成る生成物が沈右するというやり力である。この生J
又物か光吸収性染料に7rる。光吸収性染料で染1つた
細胞と染プらない細胞とで光散乱特性の相異ン比較する
と挟角散乱では、非染色性細胞は典型的に染色性細胞エ
リ大きい散乱を示す。
反対に、広角度−入射光に対して90が好ましい−1(
おける散乱の測定からは、非染色性細胞か表面ケ1吸収
性采料で染色さt+、* r同胞に比べて特徴的によシ
少い敗乱化示ずことか明らかになる。こうして不均質細
胞集団(ておいて、透析したオオ類の細胞1馨、他の細
胞と区別することができる。
おける散乱の測定からは、非染色性細胞か表面ケ1吸収
性采料で染色さt+、* r同胞に比べて特徴的によシ
少い敗乱化示ずことか明らかになる。こうして不均質細
胞集団(ておいて、透析したオオ類の細胞1馨、他の細
胞と区別することができる。
881図はオルソスペクトラム■ 又はシトフロログラ
フ (両刀共0rtho Diagnostic Sy
stemsInc、から人手できるノで分析した全血試
料の期待さnる二仄元ヒストグラム?説明する手書きの
図である。こ\で!得妹の白血球サブ楽団は吸収j生染
料で染ぼる。残骸群は赤血球の死骸および血小板な百む
であろう。
フ (両刀共0rtho Diagnostic Sy
stemsInc、から人手できるノで分析した全血試
料の期待さnる二仄元ヒストグラム?説明する手書きの
図である。こ\で!得妹の白血球サブ楽団は吸収j生染
料で染ぼる。残骸群は赤血球の死骸および血小板な百む
であろう。
m2図は実験結果を示す。この実験では胸腺から分化し
た白血球、即ちいわゆるT−細胞が不均質全血細胞混合
物中に発見される。T−細胞に特異的なモノクローナル
抗体0KT3 (これも0rth。
た白血球、即ちいわゆるT−細胞が不均質全血細胞混合
物中に発見される。T−細胞に特異的なモノクローナル
抗体0KT3 (これも0rth。
Diagnostic Systems Inc、から
入手可能)を全血試料と反応させ瓦、すると血清学的特
異性のため、血清学旧反応はそのT −IJンパ球集団
に限らt″Lり。そnに絖いて細胞を、マウス由来のモ
ノクローナル抗体0KT3に特異的なりキー抗マウス抗
体に結合している過酸化酵素と反応させた。過酸化酵素
の基質、過酸化水素および4−クロロ−1−ナントール
、を加えると、T−リンパ球の表面に黒色の吸収性色票
が生じた。オルソスペクトラム■ によって試料を分析
すると第2図に示すような散乱特性があられnた。対照
の食塩水試料は第3図に示す散乱!+!f件をあられし
た。両図共、非染色性リンパ球1.単球3.顆粒球4お
工び残骸5に1目幽する塊を示す。第2図には、染色性
リンパ球は塊2としてあられ扛るが第3図の対照試料で
は1期待した通シ、染色性細胞による塊はない。
入手可能)を全血試料と反応させ瓦、すると血清学的特
異性のため、血清学旧反応はそのT −IJンパ球集団
に限らt″Lり。そnに絖いて細胞を、マウス由来のモ
ノクローナル抗体0KT3に特異的なりキー抗マウス抗
体に結合している過酸化酵素と反応させた。過酸化酵素
の基質、過酸化水素および4−クロロ−1−ナントール
、を加えると、T−リンパ球の表面に黒色の吸収性色票
が生じた。オルソスペクトラム■ によって試料を分析
すると第2図に示すような散乱特性があられnた。対照
の食塩水試料は第3図に示す散乱!+!f件をあられし
た。両図共、非染色性リンパ球1.単球3.顆粒球4お
工び残骸5に1目幽する塊を示す。第2図には、染色性
リンパ球は塊2としてあられ扛るが第3図の対照試料で
は1期待した通シ、染色性細胞による塊はない。
従ってこの方法は全面試料中に存在する白血球混合物か
ら、胸腺から分化した細胞を効果的に識別する。
ら、胸腺から分化した細胞を効果的に識別する。
光吸収性細胞形質染料の効果の一例として血球をニトロ
グルーテトラキソリウム(NBT)試験で以下のように
染色し女。全血を緩衝食塩水中でNBTと共に37°で
15分間培養した。活溌に食作用を行う白血球はNBT
Yとり込み、それを小石性の青色(従って赤色光を吟収
する)化合物に還元する。白血球に食作用ケおこさせる
ために。
グルーテトラキソリウム(NBT)試験で以下のように
染色し女。全血を緩衝食塩水中でNBTと共に37°で
15分間培養した。活溌に食作用を行う白血球はNBT
Yとり込み、それを小石性の青色(従って赤色光を吟収
する)化合物に還元する。白血球に食作用ケおこさせる
ために。
12−0−テトラテカノイルフオルポール−13−酢酸
(TPA)を若干の試料に加え穴。NETと共に、そし
て若干f/1jではTPAも加えて、培養した後、赤血
球を崩壊させ、試料をオルソ・シトフロログラフFC2
00で分析しに0前刀光散乱欠、CYTROF’LUO
ROGRAF で1元婢としてヘリウムネオンレーザ
−を用いて測足し穴。その結果は、NETのみと共にイ
ンキュベートした試料は、亥化しない白血球に典型的な
光散乱特性をもっていることケ示し穴。しかしTPAY
加えた場合、顆粒球の前力元散乱は非常に減少し、広角
光散乱は非常に減少し7j oこの結果は明らかに、こ
fl、ら細)@中にNBTが存在′1−るkめである。
(TPA)を若干の試料に加え穴。NETと共に、そし
て若干f/1jではTPAも加えて、培養した後、赤血
球を崩壊させ、試料をオルソ・シトフロログラフFC2
00で分析しに0前刀光散乱欠、CYTROF’LUO
ROGRAF で1元婢としてヘリウムネオンレーザ
−を用いて測足し穴。その結果は、NETのみと共にイ
ンキュベートした試料は、亥化しない白血球に典型的な
光散乱特性をもっていることケ示し穴。しかしTPAY
加えた場合、顆粒球の前力元散乱は非常に減少し、広角
光散乱は非常に減少し7j oこの結果は明らかに、こ
fl、ら細)@中にNBTが存在′1−るkめである。
上述のことは6本発明の原理および一つの好ましい実施
例の特徴を明らかにしているが、多数のこの他の実施例
も、一般の熟透しに当業者には。
例の特徴を明らかにしているが、多数のこの他の実施例
も、一般の熟透しに当業者には。
本発明の原理の鞘神又は範囲から逸脱することなく心に
浮かぶということは理解されよう。
浮かぶということは理解されよう。
第2図は、全血試料をOK T 3″′、抗−胸腺リン
特許出願人 オーツ・タイアグノステインク・シス
テムズ脅インコーボレイテソド
特許出願人 オーツ・タイアグノステインク・シス
テムズ脅インコーボレイテソド
Claims (1)
- (1)混合細胞試料中で、フローシトメトリー法にもと
づいてう′Cの中で得らnた挟角および広角光散乱測定
値を使い、光吸収性表面iceに細胞形質染料で染色さ
れた細胞と染色されていない細胞とを識別する方法であ
って、つぎの工程を備λ−た方法。 a)上記混合細胞試料中の細胞の一部を光吸収性染料で
染色する染色工程。 b)染色された細胞と染色さnていない細胞とを有する
上記混合細胞試料を、焦7屯を合わせた光7原に通ずエ
オン。 C)上記細胞が上記光#を通るときに挟角および広角光
散乱を測定する工程。お工び d)光吸収性染料で染色された細胞が、染色さnていな
い細胞と比戟して、比較的少ない挟角光散乱および比V
旧冬い広角光散乱を与えるということにもとづいて、染
色さnR細胞と染色さnていない細胞とを識別する工程
。 (21上記染色ニオjI!がつぎのニオ〒をさらに備え
ている特許請求の範囲第1項記載の方法。 a)染色ずべき細胞を、この細胞に対して特異的であシ
0元吸収件染料、 rj%累からなる群から選ばfL六
第1の標識を有する第1の抗体と反応させ、つき゛に第
1の抗体に対して特異的であり。 第1の抗体が上記の染色すべき細胞と反応したのちにこ
の第1の抗体と反応する。光吸収性染料および酵素から
なる群から選ばf′した第2の標識を有する第2の抗体
と反応させる工程。おIび b)上記第1または第2の標識のいずれかが酵素である
場合に、この酵素と反応する基質を与えることによって
、標識部位に不溶性の光吸収性生成物を生成させる工程
。 t3+上記酵素は過酸化酵系でらシ、かつ上記基質が過
酸化水素および4−クロロ−1−ナフトールである特許
請求の範囲第2項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US06/414,683 US4492752A (en) | 1982-09-03 | 1982-09-03 | Method for discriminating between unstained and absorbing dye stained cells |
US414683 | 1982-09-03 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS5965748A true JPS5965748A (ja) | 1984-04-14 |
JPH0374340B2 JPH0374340B2 (ja) | 1991-11-26 |
Family
ID=23642487
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP58162479A Granted JPS5965748A (ja) | 1982-09-03 | 1983-09-02 | 光吸収性染料で染色されない細胞および染色される細胞を識別する方法 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4492752A (ja) |
EP (1) | EP0105614B1 (ja) |
JP (1) | JPS5965748A (ja) |
AU (1) | AU557760B2 (ja) |
CA (1) | CA1202868A (ja) |
DE (1) | DE3377940D1 (ja) |
Families Citing this family (39)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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US4599304A (en) * | 1983-10-07 | 1986-07-08 | Becton, Dickinson And Company | Method for monitoring activated cell subpopulations |
US4735504A (en) * | 1983-10-31 | 1988-04-05 | Technicon Instruments Corporation | Method and apparatus for determining the volume & index of refraction of particles |
US4704354A (en) * | 1984-02-15 | 1987-11-03 | University Of Cincinnati | Virion assay method for use in in vitro screening of teratogens and carcinogens |
CA1254134A (en) * | 1984-03-28 | 1989-05-16 | Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York | Specific binding flow cytometry method |
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US4665024A (en) * | 1984-10-01 | 1987-05-12 | Becton, Dickinson And Company | Fluorescent gram stain |
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