CN117969381A - 用于单细胞的流式细胞检测方法和检测装置及其应用 - Google Patents

用于单细胞的流式细胞检测方法和检测装置及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于单细胞的流式细胞检测方法和检测装置及其应用，涉及细胞检测技术领域。所述流式细胞检测方法首先对血液样本进行染色处理，得到带有金属同位素标记的染色细胞悬浮液并将细胞悬浮液中的细胞进行单细胞排列；随后将排列的单细胞依次进行流式光学检测和质谱流检测，利用流式光学检测和质谱流检测得到的细胞信息对样本细胞的特征和功能进行表征。本申请检测方法在现有质谱流式细胞检测的基础上，还对单细胞进行了流式光学检测，新增了细胞大小和颗粒度的信息维度；结合质谱流式细胞技术可同时分析细胞表型和功能的多个信息维度，进而能够更全面、准确地描述和分析细胞的特征和功能。

Description

用于单细胞的流式细胞检测方法和检测装置及其应用
技术领域
本发明涉及细胞检测技术领域，尤其是涉及一种用于单细胞的流式细胞检测方法和检测装置及其应用。
背景技术
质谱流式细胞技术是利用质谱原理对单细胞进行多参数检测的流式技术。它既具有传统流式细胞仪的高速分析的特点，又具有质谱检测的高分辨能力，是流式细胞技术一个新的发展方向，对于以后干细胞治疗等领域具有重要的指导意义。
然而，现有的质谱流式细胞技术无法给出细胞大小和颗粒度的信息维度。而细胞大小和颗粒度是细胞的两个基本物理特征，为了能够更全面、准确地描述和分析细胞的特征和功能，特提出本发明。
发明内容
需要说明的是，本发明用于单细胞的流式细胞检测方法是以非疾病诊断为目的的，应用场景包括科学研究、基础技术研究、基础医学研究等。
本发明的第一目的在于提供一种用于单细胞的流式细胞检测方法，所述方法可以更为全面、准确地描述和分析细胞的特征和功能。
本发明的第二目的在于提供一种流式细胞检测装置，所述流式细胞检测装置执行上述用于单细胞的流式细胞检测方法。
本发明的第三目的在于提供一种用于单细胞的流式细胞检测方法在非治疗目的细胞分析中的应用。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明提供的一种用于单细胞的流式细胞检测方法，所述检测方法包括：
(A)、对血液样本进行染色处理，得到带有金属同位素标记的染色细胞悬浮液；随后利用单细胞进样毛细管将细胞悬浮液中的细胞进行单细胞排列；
(B)、将排列的单细胞依次进行流式光学检测和质谱流检测；
所述流式光学检测和质谱流检测的单细胞在时序上一一对应；
(C)、利用流式光学检测和质谱流检测得到的细胞信息对样本细胞的特征和功能进行表征。
进一步的，所述血液样本包括人外周血样本、PBMC细胞悬液、骨髓、各类体液(如脑脊液、胸水、腹水等)以及人体的组织(如淋巴结、脾、肝等)研磨液中的任意一种。
进一步的，所述步骤(A)中将细胞悬浮液中的细胞进行单细胞排列的方法包括：
利用流式管对细胞悬浮液进行过滤，随后以气压为动力使过滤后的细胞悬浮液进入单细胞进样毛细管进行单细胞排列。
更进一步的，所述流式管对细胞悬浮液进行过滤的滤网孔径为35～48um，优选为35um；
所述单细胞进样毛细管的内径为25～45um，优选为25um。
进一步的，所述步骤(B)流式光学检测包括：
将排列的单细胞依次通过激光束，利用光学检测器对单细胞的前向散射光和侧向散射光进行检测；
优选地，所述步骤(C)流式光学检测得到的细胞信息包括：前向散射光信号和侧向散射光信号，其中：
前向散射光信号反映单细胞的大小；侧向散射光信号反映单细胞的内部结构。
进一步的，所述步骤(B)质谱流检测包括：
将流式光学检测后的排列单细胞通过100％传输效率雾化器后，进入质谱流式细胞分析仪进行检测。
本发明提供的一种流式细胞检测装置，所述流式细胞检测装置执行上述用于单细胞的流式细胞检测方法。
进一步的，所述流式细胞检测装置包括：质谱流式细胞分析仪和流式光学检测系统；
所述质谱流式细胞分析仪采用单细胞毛细管进行进样，所述流式光学检测系统设置于单细胞毛细管的进样通路上。
更进一步的，所述流式光学检测系统包括：
激光发射器、前向散射光检测器和侧向散射光检测器。
本发明提供的一种上述用于单细胞的流式细胞检测方法在非治疗目的细胞分析中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的用于单细胞的流式细胞检测方法，所述方法首先对血液样本进行染色处理，得到带有金属同位素标记的染色细胞悬浮液并将细胞悬浮液中的细胞进行单细胞排列；随后将排列的单细胞依次进行流式光学检测和质谱流检测，利用流式光学检测和质谱流检测得到的细胞信息对样本细胞的特征和功能进行表征。本申请检测方法在现有质谱流式细胞检测的基础上，还对单细胞进行了流式光学检测，新增了细胞大小和颗粒度的信息维度；结合质谱流式细胞技术可同时分析细胞表型和功能的多个信息维度，进而能够更全面、准确地描述和分析细胞的特征和功能。
本发明提供的流式细胞检测装置，该装置可实现质谱流式细胞仪在单细胞层面检测细胞大小和颗粒度两个基本信息量。进而在质谱流式细胞技术分析细胞表型和功能的基础上，结合新增的细胞大小和颗粒度信息维度，可用于更全面、准确地描述和分析细胞的特征和功能。
本发明提供的用于单细胞的流式细胞检测方法可广泛应用于非治疗目的细胞分析中。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1提供的流式细胞检测装置的检测流程示意图；
图2A为本发明应用例1提供的人体外周血细胞的免疫分型示意图；
图2B为本发明应用例1提供的免疫分型示意图中去除beads、死细胞和黏连细胞圈门示意图；
图2C为本发明应用例1提供的免疫分型示意图中排除T细胞和B细胞圈门示意图；
图2D为本发明应用例1提供的免疫分型示意图中单核细胞分群圈门示意图；
图2E为本发明应用例1提供的免疫分型示意图中嗜碱性粒细胞圈门示意图；
图2F为本发明应用例1提供的免疫分型示意图中粒细胞圈门示意图；
图2G为本发明应用例1提供的免疫分型示意图中γδT细胞圈门示意图；
图2H为本发明应用例1提供的免疫分型示意图中NKT细胞圈门示意图；
图2I为本发明应用例1提供的免疫分型示意图中固有淋巴细胞圈门示意图；
图2J为本发明应用例1提供的免疫分型示意图中树突状细胞圈门示意图；
图2K为本发明应用例1提供的免疫分型示意图中B细胞圈门示意图；
图2L为本发明应用例1提供的免疫分型示意图中NK细胞圈门示意图；
图2M为本发明应用例1提供的免疫分型示意图中CD4+/CD8+T细胞圈门示意图；
图2N为本发明应用例1提供的免疫分型示意图中CD8+T细胞记忆性圈门示意图；
图2O为本发明应用例1提供的免疫分型示意图中Tregs细胞圈门示意图；
图2P为本发明应用例1提供的免疫分型示意图中CD4+T细胞记忆性圈门示意图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，本发明用于单细胞的流式细胞检测方法是以非疾病诊断为目的的，应用场景包括科学研究、基础技术研究、基础医学研究等。
根据本发明的一个方面，一种用于单细胞的流式细胞检测方法，所述检测方法包括：
(A)、对血液样本进行染色处理，得到带有金属同位素标记的染色细胞悬浮液；随后利用单细胞进样毛细管将细胞悬浮液中的细胞进行单细胞排列；
(B)、将排列的单细胞依次进行流式光学检测和质谱流检测；
所述流式光学检测和质谱流检测的单细胞在时序上一一对应；
(C)、利用流式光学检测和质谱流检测得到的细胞信息对样本细胞的特征和功能进行表征。
本发明提供的用于单细胞的流式细胞检测方法，所述方法首先对血液样本进行染色处理，得到带有金属同位素标记的染色细胞悬浮液并将细胞悬浮液中的细胞进行单细胞排列；随后将排列的单细胞依次进行流式光学检测和质谱流检测，利用流式光学检测和质谱流检测得到的细胞信息对样本细胞的特征和功能进行表征。本申请检测方法在现有质谱流式细胞检测的基础上，还对单细胞进行了流式光学检测，新增了细胞大小和颗粒度的信息维度；结合质谱流式细胞技术可同时分析细胞表型和功能的多个信息维度，可用于更全面、准确地描述和分析细胞的特征和功能。
因此，本申请通过流式光学检测可以提供细胞大小和颗粒度的信息维度，进而提供了关于细胞形态和内部结构的重要线索。
例如细胞的大小变化可能与细胞增殖、凋亡或异常生长有关，颗粒度的变化可能反映细胞内部的代谢活性或细胞器的变化。而质谱可以提供关于细胞内分子的信息，例如代谢产物、蛋白质表达水平和修饰等，从而更深入地了解细胞的功能和代谢状态。因而本申请将流式光学检测技术与质谱流式细胞技术相结合，可以进一步分析细胞的表型和功能。
在本发明的一种优选实施方式中，所述血液样本包括人外周血样本、PBMC细胞悬液、骨髓、各类体液(如脑脊液、胸水、腹水等)以及人体的组织(如淋巴结、脾、肝等)研磨液中的任意一种。
在本发明的一种优选实施方式中，所述步骤(A)中将细胞悬浮液中的细胞进行单细胞排列的方法包括：
利用流式管对细胞悬浮液进行过滤，随后以气压为动力使过滤后的细胞悬浮液进入单细胞进样毛细管进行单细胞排列。
在上述优选实施方式中，所述流式管对细胞悬浮液进行过滤的滤网孔径为35～48um，优选为35um；
所述单细胞进样毛细管的内径为25～45um，优选为25um。
作为一种优选的实施方式，本申请通过气压(氩气瓶)作为动力来源，利用内径为25um的单细胞进样毛细管将细胞悬浮液中的细胞进行单个排列，保证管路中均为单个细胞排列，以建立空间上的时序性。
在本发明的一种优选实施方式中，所述步骤(B)流式光学检测包括：
将排列的单细胞依次通过激光束，利用光学检测器对单细胞的前向散射光和侧向散射光进行检测；
优选地，所述步骤(C)流式光学检测得到的细胞信息包括：流式光学检测的前向散射光信号反映单细胞的大小；流式光学检测的侧向散射光信号反映单细胞的内部结构。
需要说明的是，流式光学检测技术中前向散射光(forward scatter,FSC)是正向收集的散射光信号。FSC可以反映细胞的大小，FSC强则细胞大一些，反之则细胞小一些。侧向散射光(side scatter,SSC)是侧向收集的散射光信号。SSC对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，其强度与细胞内部的精细结构和颗粒性质有关。通常，一个细胞内部细胞器和颗粒越多，其SSC就越强。
作为一种优选的实施方式，流式光学检测过程中，单细胞依次通过激光束，借助光学系统，当细胞通过激光束时，检测器会检测到细胞或颗粒的散射光，放置在前面的检测器检测前向散射光(forward scatter,FSC)，而放置在侧面的检测器检测侧向散射光(sidescatter,SSC)。
在本发明的一种优选实施方式中，所述步骤(B)质谱流检测包括：
将流式光学检测后的排列单细胞通过100％传输效率雾化器后，进入质谱流式细胞分析仪进行检测。
作为一种优选的实施方式，流式光学检测后的带有金属同位素标签的细胞，依次通过100％传输效率雾化器，完成单细胞层面FSC/SSC的细胞大小和颗粒度信息与质谱流式细胞仪检测的细胞表型和功能信息统一，在时序上一一对应，实现质谱流式细胞技术在单细胞层面的细胞大小、颗粒度与细胞表型和功能的同时研究。
根据本发明的一个方面，一种流式细胞检测装置，所述流式细胞检测装置执行上述用于单细胞的流式细胞检测方法。
本发明提供的流式细胞检测装置，该装置可实现质谱流式细胞仪在单细胞层面检测细胞大小和颗粒度两个基本信息量。进而在质谱流式细胞技术分析细胞表型和功能的基础上，结合新增的细胞大小和颗粒度信息维度，可用于更全面、准确地描述和分析细胞的特征和功能。
在本发明的一种优选实施方式中，所述流式细胞检测装置包括：质谱流式细胞分析仪和流式光学检测系统；
所述质谱流式细胞分析仪采用单细胞毛细管进行进样，所述流式光学检测系统设置于单细胞毛细管的进样通路上。
在上述优选实施方式中，所述流式光学检测系统包括：激光发射器、前向散射光检测器和侧向散射光检测器。
根据本发明的一个方面，一种上述用于单细胞的流式细胞检测方法在非治疗目的细胞分析中的应用。
本发明提供的用于单细胞的流式细胞检测方法可广泛应用于非治疗目的细胞分析中。
需要说明的是，本发明上述用于单细胞的流式细胞检测方法、流式细胞检测装置是以非疾病诊断为目的的，应用场景包括科学研究、基础技术研究、基础医学研究等。
所述非治疗目的细胞分析包括：
研究癌细胞大小和颗粒度与治疗药物敏感性的关系。
研究免疫细胞的大小和颗粒度与免疫反应的关系。
研究细菌的大小和颗粒度与细菌生长的关系。
例如：将受不同治疗药物刺激的癌细胞样品/不同类型的免疫细胞样品/不同生长时期的细菌样品，通过单细胞进样毛细管进样，保证管路中均为单个细胞排列。
单细胞依次通过激光束，且一次仅进一个细胞。通过检测器检测到细胞或颗粒的散射光，放置在前面的检测器检测FSC，而放置在侧面的检测器检测SSC。带有金属同位素标签的细胞依次通过100％传输效率雾化器，建立单细胞层面FSC/SSC和质谱流式细胞仪检测的信息，在时序上一一对应。通过分析单个癌细胞的大小和颗粒度，以及其对不同治疗药物的敏感性，深入研究不同治疗药物刺激下的癌细胞的表型和功能影响。
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行进一步地说明。
实施例1
一种用于单细胞的流式细胞检测方法，所述检测方法包括：
(1)、提供新鲜人外周血样本，经过红细胞裂解，顺铂染色，膜蛋白抗体孵育，细胞质蛋白/分泌蛋白染色，固定细胞，细胞核嵌入剂Ir染色，至此细胞标记染色完成，上机前用带35um滤网的流式管过滤细胞悬液，获取分散良好的细胞悬液。
通过气压(氩气瓶)作为动力来源，利用内径为25um的单细胞进样毛细管将细胞悬浮液中的细胞进行单个排列，保证管路中均为单个细胞排列，以建立空间上的时序性。
(2)、将排列的单细胞依次进行流式光学检测和质谱流检测；所述流式光学检测和质谱流检测的单细胞在时序上一一对应；
图1为本实施例提供的流式细胞检测装置的检测流程示意图。
由图1可知，所述流式细胞检测装置包括质谱流式细胞分析仪和流式光学检测系统；所述质谱流式细胞分析仪采用单细胞毛细管进行进样，所述流式光学检测系统设置于单细胞毛细管的进样通路上。
本实施例流式细胞检测装置的工作过程为：
1、单个细胞排列的单细胞通过单细胞进样毛细管进行进样；首先进入流式光学检测系统，当细胞通过激光束时，前向散射光检测器、侧向散射光检测器会检测到细胞或颗粒的散射光，其中放置在前面的前向散射光检测器检测FSC，而放置在侧面的侧向散射光检测器检测SSC；
2、流式光学检测系统检测后的单细胞依次通过100％传输效率雾化器后进入质谱流式细胞仪检测。
本实施例流式细胞检测装置通过建立单细胞层面FSC/SSC的细胞大小和颗粒度信息与质谱流式细胞仪检测的细胞表型和功能信息统一，可以增加两个维度的分析角度，提供更多信息量。其中：
FSC，即前向角散射，它的值代表细胞的大小。细胞体积越大，其FSC值就越大。所以可以利用细胞的FSC值初步比较细胞的大小，利用FSC值对细胞进行分群和分类。
SSC，即侧向角散射，它的值代表细胞的颗粒度(与细胞中所含的细胞器、细胞核等的数量成正比)。细胞越不规则，细胞表面的突起越多，细胞内能够引起激光散射的细胞器或者颗粒性物质越多，其SSC值就越大。所以可以利用细胞的SSC值初步比较细胞的颗粒度，利用SSC值对细胞进行分群和分类。
应用例1人体免疫细胞分型
人体免疫系统的主要参与者，分为淋巴细胞、单核细胞、粒细胞三大类，而这三大类细胞又包含各自不同的亚群，这些不同种类不同亚型的免疫细胞共同参与了机体的免疫过程，精准识别并杀伤病毒、细菌等外来入侵者，并执行免疫监视功能，发现和清除体内出现的突变或衰老细胞，维持机体内环境的稳定，保障身体健康。因此，对外周血中免疫细胞进行分型、鉴定，是评估免疫功能和状态的重要方法。
下面本实验例利用实施例1的用于单细胞的流式细胞检测方法对人体免疫细胞进行分型分析。
本实验例涉及的带金属标签的单克隆抗体如下表所示：
(一)、提供新鲜人体外周血样本，经过红细胞裂解，顺铂染色，膜蛋白抗体孵育，细胞质蛋白/分泌蛋白染色，固定细胞，细胞核嵌入剂Ir染色，至此细胞标记染色完成，得到待测单细胞悬液。具体过程如下：
一、红细胞裂解：
1、取1mL新鲜人外周血样本加入到50mL离心管中，按1：20的比例加入稀释后的1×溶血素，振荡混匀，室温孵育10min。
2、400g离心5min弃上清，再加入10mL 1×溶血素二次裂红，振荡混匀，室温孵育5min。
3、400g离心5min弃上清，加入10mL PBS缓冲液，涡旋混匀。
4、400g离心5min弃上清。
二、顺铂染色：
1、取用不含Ca2+、Mg2+的PBS重悬并细胞计数，将密度调整至3×106个细胞(不要低于1*106个)/mL。
2、转入流式管内，加入终浓度为0.5μM的顺铂，混匀后室温放置3min(此浓度和孵育时间根据不同类型的样本最终染色强度进行调整)。
3、加入2ml Cell Staining Buffer终止反应，常温300g离心5分钟(此时进行“三、FcR-blocking中步骤1”)。
4、弃上清。
三、FcR-blocking：
1、配置block mix，每个样本对应50ul。
2、每管样本加入50ul block mix，重悬细胞，室温放置10min，孵育结束后不必去除封闭液，直接加入antibody cocktail。在孵育时间内根据步骤7进行antibody cocktail配置。
四、膜蛋白抗体孵育：
1、配置antibody cocktail。
2、向封闭结束后的每管样本中加入50ul antibody cocktail(加上之前的50ul封闭液，此时体积为100ul)。
3、轻柔吹打混匀细胞，室温放置15min。
4、轻柔vortex混匀细胞，继续室温放置15min。
5、每管样本中加入2ml Cell Staining Buffer，室温离心300g X 5min，弃上清。
6、重复步骤5。
7、轻柔vortex，在残留的上清中打散细胞。
五、细胞质蛋白/分泌蛋白染色：
1、配置Fix I溶液。将5XFix I母液用PBS稀释到1X，每份样本需要1ml 1X Fix I溶液。
2、每管加入1ml 1X Fix I溶液，vortex混匀。室温放置10-30min。
3、每管中加入2ml Perm-S buffer，离心800g X 5min，弃上清。
4、重复步骤3。(离心时间进入步骤5配置antibody cocktail)
5、Antibody cocktail配置。
6、每管细胞中加入50ul antibody cocktail。
7、轻柔涡旋震荡细胞，室温放置30min。
8、每管加入2ml Cell Staining Buffer，室温离心800g X 5min，弃上清。
9、重复步骤21，弃上清，在回流的上清中涡旋震荡，打散细胞。
六、固定细胞(新鲜固定)：
重要：在加入固定液前，请确保vortex彻底打散细胞。
1、用PBS配置终浓度为1.6％的甲醛溶液，每个样本需要1ml。
2、每个样本中加入1ml 1.6％的甲醛溶液，vortex混匀。
3、室温放置10min。
4、室温离心800g X 5min，弃上清(此离心时间请根据步骤27配置Cellintercalator Solution)。
七、细胞核嵌入剂Ir染色：
1、在fix and perm buffer里加入终浓度为125nM的Ir或者500nM的Rh，每个样品用量1ml。
2、握住流式管管口，一边Vortex，一边逐滴加入1ml cell intercalation溶液，(这样可以尽量减少细胞dimmer的出现；室温1小时或4度过夜，(在4度可以存放48h)。
八、细胞上机前准备：
1、室温离心800g X 5min，弃上清。
2、每管样本加入2ml Cell Staining Buffer重悬细胞，室温离心800gX 5min，弃上清。
3、每管样本加入1ml Cell Acquisition Solution(CAS)溶液重悬细胞，取10ul进行细胞计数。其余悬液室温离心800g X 5min，弃上清。细胞沉淀放置冰上，直到上机前进行重悬。
4、根据细胞计数结果，上机前，用CAS溶液将细胞重悬为1.1*106/ml(Helios)的悬液。
5、向向细胞悬液中加入10％EQ Beads(1份EQ beads+9份CAS)。
6、用带35um滤网的流式管过滤细胞悬液。
7、上机采集数据(WB Injector)。
(二)、将排列的单细胞依次进行流式光学检测和质谱流检测；所述流式光学检测和质谱流检测的单细胞在时序上一一对应；
其中：
通过前向散射光(forward scatter,FSC)区分单细胞得大小,细胞体积越大，其FSC值就越大,利用FSC值对可对细胞进行大小上得分群；
前向散射光信号反映单细胞的大小；侧向散射光信号反映单细胞的内部结构。
通过侧向散射光(side scatter,SSC)区分单细胞的颗粒度(与细胞中所含的细胞器、细胞核等的数量成正比)。细胞越不规则，细胞表面的突起越多，细胞内能够引起激光散射的细胞器或者颗粒性物质越多，其SSC值就越大。所以可以利用细胞的SSC值初步比较细胞的颗粒度，利用SSC值对细胞进行分群和分类；
对人外周血样本中人体免疫系统的主要参与者淋巴细胞、单核细胞、粒细胞三大类，以及三大类细胞中超过十种主要的亚群，如CD4 T和CD8T细胞亚群，调节性T细胞(Tregs)，γδT细胞，NKT细胞，B细胞，NK细胞，单核细胞，嗜碱性粒细胞，固有淋巴细胞(ILCs)以及树突细胞进行精细分析。
图2A为本应用例提供的人体外周血细胞的免疫分型示意图；
图2B为本应用例提供的免疫分型示意图中去除beads、死细胞和黏连细胞圈门示意图；
图2C为本应用例提供的免疫分型示意图中排除T细胞和B细胞圈门示意图；
图2D为本应用例提供的免疫分型示意图中单核细胞分群圈门示意图；
图2E为本应用例提供的免疫分型示意图中嗜碱性粒细胞圈门示意图；
图2F为本应用例提供的免疫分型示意图中粒细胞圈门示意图；
图2G为本应用例提供的免疫分型示意图中γδT细胞圈门示意图；
图2H为本应用例提供的免疫分型示意图中NKT细胞圈门示意图；
图2I为本应用例提供的免疫分型示意图中固有淋巴细胞圈门示意图；
图2J为本应用例提供的免疫分型示意图中树突状细胞圈门示意图；
图2K为本应用例提供的免疫分型示意图中B细胞圈门示意图；
图2L为本应用例提供的免疫分型示意图中NK细胞圈门示意图；
图2M为本应用例提供的免疫分型示意图中CD4+/CD8+T细胞圈门示意图；
图2N为本应用例提供的免疫分型示意图中CD8+T细胞记忆性圈门示意图；
图2O为本应用例提供的免疫分型示意图中Tregs细胞圈门示意图；
图2P为本应用例提供的免疫分型示意图中CD4+T细胞记忆性圈门示意图。
参见图2A～图2P，本应用例的细胞分型过程如下：
首先，区分beads和细胞后，利用Pt去除死细胞，Ir去除粘连细胞。
1、嗜碱性粒细胞(Basophils)
从CD3-HLADR-的细胞群体中圈出嗜碱性粒细胞(CD38+CD123+)。
2、粒细胞(Granulocytes)
用CD66ace圈出粒细胞。
3、单核细胞(Moncytes)
从CD3-CD19-的细胞群体中，采用CD14和CD16来区分非经典单核细胞(CD14-CD16+)，经典单核细胞(CD14+CD16-)以及中间型单核细胞(CD14+CD16+/low)。
4、淋巴细胞(Lymphocytes)
在排除粒细胞后，利用CD3和TCRγδ圈出三群细胞，其中CD3+TCRγδ+用于分析γδT细胞，CD3-TCRγδ-用于分析NK细胞，Dendritic细胞，B细胞以及固有淋巴细胞(ILCs)，CD3+TCRγδ-用于分析T细胞，NKT细胞。
5、树突状细胞(Dendritics)：
在排除粒细胞后，在CD19-CD56-CD14-HLADR+细胞中对DC细胞进行分群(CD11c+DCs和CD123+DCs)
5.1、gd T细胞(γδT cells)：
可以从CD3+TCRγδ+的细胞群体中来分析gdT细胞亚群。
5.2、NKT细胞(NKT-Like cells)：
从CD3+TCRγδ-中圈出CD56+细胞，用于分析NKT细胞(CD3+CD56+)。
5.3、CD4 T细胞/CD8 T细胞：
从CD3+TCRγδ-的细胞群中，采用CD4/CD8来圈出CD4+T细胞和CD8+T细胞。
5.4、CD4/CD8 T细胞各亚群：
使用CD45RA和CCR7，可将CD4/CD8+T细胞分为初始(CD45RA+CCR7+)，CM：中央记忆(CD45RA-CCR7+)，EM：效应记忆(CD45RA-CCR7-)以及TEMRA：末端效应记忆(CD45RA+CCR7-)亚群。加入CD27和CD28可以进一步细分：
(CD45RA+CCR7+CD28++CD27++)，CM(CD45RA-CCR7+CD28+CD27++)，EM(CD45RA-CCR7-CD28+/-CD27+/-)以及TEMRA(CD45RA+CCR7-CD28-CD27-)。
6、调节性T细胞(Regulatory T cells)：
调节性T细胞(Treg)在维持免疫稳态和免疫耐受方面都有着重要作用，是一类可以调节其它多种免疫细胞功能的T细胞亚型。从CD4+T细胞中采用CD25和CD127圈定Tregs(CD4+CD25+CD127lo/-)，再看CD27、CD38、HLA-DR和CD45RA表达的相对量。
7、NK细胞(NK cells)：
NK作为淋巴细胞群中的一员，在固有免疫系统中扮演着重要的角色。
从CD3-TCRγδ-细胞中采用CD16和CD56来区分出成熟的NK(CD16+CD56+)，早期NK(CD16-CD56+)以及终末NK(CD16+CD56-)。
8、B细胞(B cells)：
排除粒细胞后，采用CD19和CD1c圈出B细胞(CD19+CD1c+)。以IgD和CD27进一步圈出B cells(IgD+CD27-)，Marginal zone-like(IgD+CD27+)和Memory B cells(IgD-CD27+)；采用CD20和CD27圈出浆母细胞(CD27+CD20-)和IgD记忆B细胞(CD20+CD27-/low)。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种用于单细胞的流式细胞检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：
(A)、对血液样本进行染色处理，得到带有金属同位素标记的染色细胞悬浮液；随后利用单细胞进样毛细管将细胞悬浮液中的细胞进行单细胞排列；
(B)、将排列的单细胞依次进行流式光学检测和质谱流检测；
所述流式光学检测和质谱流检测的单细胞在时序上一一对应；
(C)、利用流式光学检测和质谱流检测得到的细胞信息对样本细胞的特征和功能进行表征。
2.根据权利要求1所述的用于单细胞的流式细胞检测方法，其特征在于，所述血液样本包括人外周血样本、PBMC细胞悬液、骨髓、脑脊液、胸水、腹水以及人体的组织研磨液中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的用于单细胞的流式细胞检测方法，其特征在于，所述步骤(A)将细胞悬浮液中的细胞进行单细胞排列的方法包括：
利用流式管对细胞悬浮液进行过滤，随后以气压为动力使过滤后的细胞悬浮液进入单细胞进样毛细管进行单细胞排列。
4.根据权利要求3所述的用于单细胞的流式细胞检测方法，其特征在于，所述流式管对细胞悬浮液进行过滤的滤网孔径为35～48um，优选为35um；
所述单细胞进样毛细管的内径为25～45um，优选为25um。
5.根据权利要求1所述的用于单细胞的流式细胞检测方法，其特征在于，所述步骤(B)流式光学检测包括：
将排列的单细胞依次通过激光束，利用光学检测器对单细胞的前向散射光和侧向散射光进行检测；
优选地，所述步骤(C)流式光学检测得到的细胞信息包括：前向散射光信号和侧向散射光信号，其中：
前向散射光信号反映单细胞的大小；侧向散射光信号反映单细胞的内部结构。
6.根据权利要求1所述的用于单细胞的流式细胞检测方法，其特征在于，所述步骤(B)质谱流检测包括：
将流式光学检测后的排列单细胞通过雾化器后，进入质谱流式细胞分析仪进行检测。
7.一种流式细胞检测装置，其特征在于，所述流式细胞检测装置执行权利要求1～6任一项所述的用于单细胞的流式细胞检测方法。
8.根据权利要求7所述的流式细胞检测装置，其特征在于，所述流式细胞检测装置包括：质谱流式细胞分析仪和流式光学检测系统；
所述质谱流式细胞分析仪采用单细胞毛细管进行进样，所述流式光学检测系统设置于单细胞毛细管的进样通路上。
9.根据权利要求8所述的流式细胞检测装置，其特征在于，所述流式光学检测系统包括：
激光发射器、前向散射光检测器和侧向散射光检测器。
10.一种根据权利要求1～6任一项所述的用于单细胞的流式细胞检测方法在非治疗目的细胞分析中的应用。
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