CN106177937A - 鸡减蛋综合征和禽脑脊髓炎二联灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents

鸡减蛋综合征和禽脑脊髓炎二联灭活疫苗及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供鸡减蛋综合征和禽脑脊髓炎二联灭活疫苗及其制备方法，涉及生物工程领域。所述二联灭活疫苗，含有灭活的鸡减蛋综合征病毒AV127株和禽脑脊髓炎病毒HM08株，HM08株的保藏号为CGMCC NO.7759。制备所述疫苗的方法：将两病毒株分别接种易感鸭胚和SPF鸡胚，得到减蛋综合征病毒液和禽脑脊髓炎病毒液；将灭活病毒液混合，然后与吐温‑80混合均匀，制得水相；将水相和油相混合均匀，得二联灭活疫苗。HM08株在SPF鸡胚中增殖，0.2ml病毒液的含量≥107.0EID50，免疫原性好，产生的抗体水平高，交叉保护性好，该二联灭活疫苗能够产生高水平的抗体，持续期长。

Description

鸡减蛋综合征和禽脑脊髓炎二联灭活疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种鸡减蛋综合征和禽脑脊髓炎二联灭活疫苗及其制备方法。
背景技术
鸡减蛋综合征(Egg Drop Syndrome，EDS)是由腺病毒引起的以产蛋高峰期产蛋量下降，产畸形蛋软壳蛋和无壳蛋为特征，其临床特征为鸡群产蛋突然下降，大量出现软壳蛋和畸形蛋，蛋壳颜色变浅，给生产带来很大的经济损失。1976年荷兰科学家van Eck等首次报道此病以来，许多国家及地区都报道了此病的流行。我国于20世纪80年代末在肉用种鸡群中发现减蛋综合征以来，许多地区均有该病的流行。
禽脑脊髓炎(Avian Encephalomy eli t is,AE)又名流行性震颤,，是由禽脑脊髓炎病毒(AEV)引起的一种主要危害4周龄以下雏鸡，以侵害雏鸡中枢神经系统，引起雏鸡非化脓性脑炎为主要病理特征的病毒性传染病，病雏主要表现为运动失调、头颈震颤和后趾麻痹等神经症状。具有突然出现和难以预测持续期等特点，能造成雏鸡的损失和母鸡产蛋率的下降，成为当前世界上危害养禽业发展的主要疫病之一。我国自80年代中期有此病发生的报道以来，在全国各地均有发生和流行，给养鸡业造成了较大的损失。
目前减蛋综合征、禽脑脊髓炎严重危害家禽养殖业的发展，在各种防控措施中，疫苗的免疫仍为最重要的措施，研制出抗原滴度高、免疫剂量小、免疫效果好的减蛋综合征、禽脑脊髓炎二联苗是一项具有重要意义的工作。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鸡减蛋综合征和禽脑脊髓炎二联灭活疫苗，该二联灭活疫苗中含有的禽脑脊髓炎病毒HM08株，保藏号为：CGMCCNO.7759，该毒株在SPF鸡胚中增殖，0.2ml病毒液的含量≥107.0EID50，免疫原性好，产生的抗体水平高，交叉保护性好，该二联灭活疫苗能够产生高水平的抗体，持续期长。
本发明的另一目的在于提供鸡减蛋综合征和禽脑脊髓炎二联灭活疫苗的制备方法，该方法简单，安全。
本发明的目的采用如下技术方案实现。
鸡减蛋综合征和禽脑脊髓炎二联灭活疫苗，含有灭活的鸡减蛋综合征病毒AV127株和禽脑脊髓炎病毒HM08株，所述禽脑脊髓炎病毒HM08株的保藏号为CGMCC NO.7759。
2.根据权利要求1所述鸡减蛋综合征和禽脑脊髓炎二联灭活疫苗，其特征在于0.3ml所述二联灭活疫苗中鸡减蛋综合征病毒AV127株的含量≥2000HAU，禽脑脊髓炎病毒HM08株含量≥105.0EID50。
一种制备所述鸡减蛋综合征和禽脑脊髓炎二联灭活疫苗的方法，包括如下步骤：
(1)病毒液的制备：将鸡减蛋综合征病毒AV127株和禽脑脊髓炎病毒HM08株分别接种易感鸭胚和SPF鸡胚，得到减蛋综合征病毒液和禽脑脊髓炎病毒液；
(2)病毒液的灭活：将减蛋综合征病毒液和禽脑脊髓炎病毒液分别灭活，得到灭活的减蛋综合征病毒液和禽脑脊髓炎病毒液。
(3)水相制备：将灭活的禽脑脊髓炎病毒液与鸡减蛋综合征病毒液混合，然后与吐温-80混合均匀，制得水相；
(4)油相制备：将白油和司本－80混合均匀，作为油相。
(5)乳化：将水相和油相混合均匀，即得鸡减蛋综合征和禽脑脊髓炎二联灭活疫苗。
在本发明中，0.3ml所述二联灭活疫苗中鸡减蛋综合征病毒AV127株的含量≥2000HAU，禽脑脊髓炎病毒HM08株含量≥105.0EID50。
优选的技术方案中，步骤(1)中减蛋综合征病毒液的血凝价≥1:10240，0.2ml禽脑脊髓炎病毒液的病毒含量≥107.0EID50。
优选的技术方案中，步骤(2)中灭活的减蛋综合征病毒液和禽脑脊髓炎病毒液中甲醛的体积百分浓度为0.15％-0.25％
优选的技术方案中，步骤(3)中混合病毒液与吐温-80按照体积比为96∶4进行混合。
优选的技术方案中，步骤(4)中所述白油和司本－80混合的体积比为94∶6。
优选的技术方案中，步骤(5)所述水相和油相混合的体积比为1:2-4。
有益效果：
本发明鸡减蛋综合征和禽脑脊髓炎二联灭活疫苗中含有的禽脑脊髓炎病毒HM08株，是申请人自行分离、筛选、鉴定的，该毒株在鸡胚上培养的毒价高，0.2ml病毒液病毒含量≥107.0EID50，毒价为已报道毒株细胞培养的100倍以上，免疫原性好，交叉保护性好，对鸡和环境均安全。本发明二联灭活疫苗，免疫后抗体水平高、持续时间长，保护率高，能较好地控制禽脑脊髓炎与鸡减蛋综合征的发生与流行。
本发明制备鸡减蛋综合征和禽脑脊髓炎二联灭活疫苗的方法，简单，安全。因为制备方法中对病毒液进行了浓缩，所以提高单位体积疫苗中的抗原含量，有效降低了使用剂量，达到 同样的免疫效果。
附图说明
图1 RT-PCR扩增电泳结果，其中1是Marker DL 2000，2是VP1，3是VP2。
具体实施方式
实施例1 禽脑脊髓炎HM08株的筛选与鉴定
1.病毒的分离
将具有禽脑脊髓炎病理特征的病雏处死，无菌采集病、死雏鸡脑组织后混合，反复冻融3次后在无菌容器中研磨，用PBS缓冲液制成1∶3的悬液，按1000IU/ml加入青霉素、链霉素，经3000r/min离心20分钟后，取上清液，经卵黄囊接种6日龄的SPF鸡胚10枚，每胚0.2ml，封口后置于37.0℃孵育。孵化至18日龄，观察鸡胚病变，如接种后12日内未出现明显病变，将胚脑取出，匀浆，用同批尿囊液或PBS缓冲液按1∶3制成悬液，置灭菌的容器中冻融3次，3000r/min离心20分钟，取上清液，进行下一代传代培养。若出现鸡胚病变后，收获典型病变鸡胚的脑组织混合，匀浆，用同批尿囊液或PBS缓冲液按1∶3(体积比)制成悬液，置灭菌的容器中冻融3次，3000r/min离心20分钟，取上清液，-20℃保存备用。
2.禽脑脊髓炎病毒有限稀释法纯化
将本实施例标题1中病变鸡胚脑组织处理后得到的上清液，按1∶10、1∶100、1∶1000倍稀释，分别经卵黄囊接种6日龄的SPF鸡胚10枚，每胚0.2ml，封口后置于37.0℃孵育。孵化至18日龄，观察鸡胚病变。弃去72小时以内的死亡鸡胚。收获72小时以后的、具有发育迟缓、矮小、脑部水肿、肌肉进行性萎缩、脚趾变形和槟榔肝等AE特征性病变的鸡胚。选取接种最高稀释倍数的上清液、且在12日内出现典型禽脑脊髓炎病变的鸡胚脑组织，混合、匀浆，用同批尿囊液按体积比为1∶3混合制成悬液，置灭菌的容器中反复冻融3次，3000r/min离心20分钟，取上清液，再次同上法处理，卵黄囊接种6日龄的SPF鸡胚10枚，每胚0.2ml，封口后置于37.0℃孵育，孵化至18日龄，观察鸡胚病变。收获典型病变鸡胚的脑组织混合，匀浆，与2倍体积的同批尿囊液混合，制成悬液，置灭菌的容器中冻融3次，3000r/min离心20分钟，取上清液，用于病毒进一步纯化，直至同批脑组织悬液不同稀释度接种鸡胚后发病率均达到100％，得到E1代种毒。
3.E1代种毒对鸡胚的毒力
将E1代种毒作1∶100倍稀释，经卵黄囊途径接种6日龄的SPF鸡胚20枚，每胚0.2ml，封口后置于37.0℃继续孵育。定时照蛋，及时取出死亡胚。观察接种12天后出现鸡胚活性减弱、发育不良、矮小、肌肉萎缩、脚趾变形和槟榔肝等AE特征性病变。结果如表1。20枚胚 中24小时死亡胚有3枚；至接种12天后，有8枚死亡，9枚活胚，且均出现发育不良、矮小、肌肉萎缩、脚趾变形、槟榔肝等AE特征性病变，病变率达100％。
表1 E1代种毒对鸡胚的毒力测定结果
4.种毒对雏鸡的毒力
用不同含量的E1代种毒病毒液，脑内分别接种1日龄、7周龄的SPF鸡，每只鸡接种后观察21天统计AE典型症状的发病率，结果表明：攻毒剂量为200EID50、500EID50、1000EID50/0.03ml/只，对1日龄的SPF鸡，接种后7～14天出现精神沉郁、站立不稳、喜卧、瘫痪和共济失调等AE典型的神经症状，AE典型症状的发病率分别可以达到10/10、10/10、10/10；对7周龄的SPF鸡，攻毒剂量为200EID50、500EID50、1000EID50/0.03ml/只，接种后7～19天出现精神沉郁、站立不稳、喜卧、瘫痪和共济失调等AE典型的神经症状，AE典型症状的发病率分别达到8/10、10/10、10/10。
5.毒种的传代
将E1代种毒病毒液进行1∶100倍稀释后，经卵黄囊途径接种6日龄SPF鸡胚10枚，每胚接种0.2ml。接种后，置37℃继续孵化，每8小时照蛋一次，及时取出死亡胚，弃去72小时以内的死亡鸡胚，收获72小时以后的死亡鸡胚或具有AE特征性病变的鸡胚：鸡胚发育迟缓、矮小、脑部水肿、肌肉进行性萎缩、脚趾变形和槟榔肝。从72小时以后的死亡鸡胚和具有AE特征性病变的鸡胚中收集脑组织混合，用同批尿囊液按体积比为1∶3混合制成悬液，匀浆，置灭菌的容器中反复冻融3次，3000r/min离心20分钟，取上清液，分装，标记为E2代种毒。病毒如此反复传到E15代。
6.种毒病毒含量测定
测量各代次种毒的病毒含量。用灭菌生理盐水将种毒作10倍稀释，取10-3、10-4、10-5、10-6这4个稀释度，每个稀释度经卵黄囊途径接种6日龄SPF鸡胚5枚，每胚接种0.2ml。接种后，置37℃继续孵化，每8小时照蛋一次，及时取出死亡胚，弃去72小时以内的死亡鸡胚，视72小时以后的死亡鸡胚或具有下列症状之一：鸡胚发育迟缓、矮小、脑部水肿、肌肉进行性萎缩、脚趾变形和槟榔肝为AE病变。根据鸡胚死亡及病变个数，按Reed—Muench法计算病毒含量。各代次种毒的病毒含量见表2。
表2 各代次种毒病毒含量测定结果
种毒代次 病毒含量：EID50/0.2ml
E1 105.56
E2 107
E3 107
E4 107
E5 107
E6 107.5
E7 107.4
E8 107.36
E9 107.2
E10 107.3
E11 107.2
E12 107.3
E13 107.4
E14 107.3
E15 107.36
7.E15代种毒特异性试验
用生理盐水将E15代种毒稀释为104EID50/0.2ml，与等量抗AE特异性血清和阴性血清分别混合，37℃作用60分钟，经卵黄囊途径接种6日龄SPF鸡胚各5枚，同时设病毒对照组、阳性血清对照组、阴性血清对照组和生理盐水对照组，同条件观察12天，判定结果。
特异性试验分组及结果如表3所示，接种后连续观察12天，病毒中和组、阴、阳性血清对照组、空白对照组一致，鸡胚均活，未出现鸡胚病变；病毒对照组和阴性血清中和组鸡胚AE典型症状的病变率均达100％。特异性试验结果说明E15代种毒是禽脑脊髓炎病毒。
表3 E15种毒代特异性检测
8.无菌检验按照现行《中国兽药典》附录进行检验。E15代种毒分别接种TG小瓶，37℃培养3天，无菌生长。转种的TG小管、GP小管、GA斜面培养5天后均无菌生长。接种支原体液体培养基、再转接固体培养基，观察结果均阴性。鸡胚外源性病毒检测，特异性血清中和后接种鸡胚无一死亡，尿囊腔、尿囊膜HA价均为零。细胞外源性病毒检测，禽网状内皮组织增生症病毒、禽白血病病毒、红细胞吸附试验均为阴性。
9.E15代种毒的PCR检测
根据GenBank上公布的AEV病毒基因序列，针对保守基因VP1和VP2分别设计了1组引物。针对基因VP1的上游引物：GGACAAGGAACCACAGGGAC，下游引物：TCCAGTGGCGTGTAGAAAGG。针对基因VP2的上游引物：ACGGTAGACCAGAGTTCAGTTAG，下游引物：ATGGCACCTTCATCCTTACA。
将E15代种毒用0.1mol/LPBS(pH 7.2)缓冲液按1：3稀释,反复冻融3次,5000r/min离心20分钟,取上清。用Trizol试剂(Gibco公司产品)从上清液中抽提RNA。提取出的RNA用经DEPC(焦碳酸二乙酯)处理的水溶解,用于合成第一条cDNA链。
用5μl RNA作为模板,使用延长反转录试剂盒合成cDNA第一条链。分别用基因VP1或VP2引物进行PCR扩增。PCR产物在1.2％琼脂糖凝胶上电泳,用DNA分子质量标准确定产物的大小。
扩增的片段送上海英骏生物技术有限公司进行序列测定。采用DNAStar软件对测得的VP1基因的核苷酸序列和VP2基因序列进行分析,并分别与GenBank中AEV毒株的相应序列进行比较。图1可见，VP1扩增片段约510bp，VP2扩增片段约420bp，与目的片段大小吻合。VP1扩增片段与GenBank中AY275539.1、AY466473.1、AY517471.1、JN986828.1的同源性分别为94.2％、99.8％、99.8％、94％。VP2扩增片段与GenBank中EU327593.1、AY275539.1、AY517471.1的同源性分别为81％、98.6％、100％。因此，PCR检测结果也证明E15代种毒是禽脑脊髓炎病毒。
10.红细胞凝集价测定：用灭菌生理盐水将E15代种毒作2倍梯度稀释，进行红细胞凝集价测定。结果均为阴性。
11.免疫原性：以E15代种毒制备疫苗，将疫苗以不同免疫剂量颈部皮下注射21日龄SPF鸡10只，设同日龄SPF鸡5只对照，免疫3周后用AEV同源毒株脑内接种攻毒(每只鸡剂量为1000个EID50)，观察14～21天，结果免疫鸡全部保护，对照鸡全部发病。结果说明此病毒的免疫原性好。
将E15代种毒命名为禽脑脊髓炎病毒HM08株。
保藏信息如下：
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所。
分类命名：禽脑脊髓炎病毒。
参椐的生物材料：HM08株。
保藏号：CGMCC NO.7759。
保藏日期：2013年6月20日。
实施例2 鸡减蛋综合征和禽脑脊髓炎二联灭活疫苗的制备
1.制苗用毒种来源：
鸡减蛋综合征病毒AV127株，购自中国兽医药品监察所。
禽脑脊髓炎病毒HM08株，保藏号：CGMCC NO.7759。
2.病毒液的制备：
(1)鸡减蛋综合征病毒AV127株病毒液的制备：将鸡减蛋综合征病毒AV127株接种易感鸭胚，收获鸭胚液作为鸡减蛋综合征病毒AV127株病毒液。
具体方法如下：
接种：取鸡减蛋综合征病毒AV127株，用灭菌生理盐水作适当稀释(如10-1或10-2)，尿囊腔内接种8～10日龄易感鸭胚，每胚0.1ml，接种后密封针孔，置36～37℃继续孵育，不必翻蛋。
孵育和观察：鸭胚接种后，每日照蛋1次，将72小时以前死亡的鸭胚弃去。此后，每4～8小时照蛋1次，死亡的鸭胚随时取出置于2～8℃冷却；直至120小时，不论死亡与否，全部收回，气室向上，置于2～8℃冷却。
收获：将冷却的鸭胚取出，用碘酊消毒气室部位，然后以无菌手术剥除气室部位卵壳，揭去卵壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜(勿使卵黄破裂)，吸取鸭胚液作为鸡减蛋综合征病毒AV127株病毒液。
在鸡减蛋综合征病毒AV127株病毒液中，加入抗生素(每毫升抗原中青霉素终浓度800单位，链霉素终浓度800单位)，测定红细胞凝集价，红细胞凝集价应≥1∶10240(按现行《中国兽药典》附录微量法测定)。同时按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验。
注意：在吸取胚液前，对每个鸭胚均应注意检查，凡出现腐败、胚液混浊及有任何污染可疑者，弃去不用。
(2)禽脑脊髓炎病毒HM08株病毒液的制备：
具体方法如下：
接种取禽脑脊髓炎病毒HM08株，用灭菌PBS缓冲液稀释，卵黄囊接种5～6日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml(1000EID50)，置37℃孵育，不必翻蛋。
孵育和观察前3日内，每天照蛋一次，弃去死亡胚；3日后，每8个小时照蛋一次，及时取出死亡胚，置2-8℃冷却。
收获孵化致16日龄，将鸡胚全部取出，置2-8℃冷却过夜。取2-8℃冷却的鸡胚，用强力碘消毒蛋壳气室部位经75％酒精二次消毒后，以无菌方法去除蛋壳，分别收集具有AE特征性病变鸡胚的尿囊液、绒毛尿囊膜(CAM)和胚体。将绒毛尿囊膜(CAM)和胚体用组织捣碎机匀浆，用收获的鸡胚尿囊液与无菌PBS或生理盐水作为稀释液，按体积比1:2(组织1份，稀释液2份)制成悬液，冻融3次后，置灭菌容器中，3000转离心20分钟，取上清作为禽脑脊髓炎病毒HM08株病毒液，置-20℃备用。
其中，AE特征性病变鸡胚是指：72小时以后的死亡鸡胚或具有下列症状之一的鸡胚：鸡胚发育迟缓、矮小、脑部水肿、肌肉进行性萎缩、脚趾变形和槟榔肝。
经检测，0.2ml禽脑脊髓炎HM08株病毒液的病毒含量应≥107.0EID50。同时按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验。
注意：在吸取胚液前对每个鸡胚均应注意检查，凡胎儿腐败、胚液浑浊及有任何污染可疑者，弃去不用。
3.病毒液的灭活：采用甲醛分别灭活鸡减蛋综合征病毒AV127株病毒液和禽脑脊髓炎病毒HM08株病毒液。鸡减蛋综合征病毒AV127株病毒液在灭活前需要浓缩，才能保证每羽份二联灭活疫苗中鸡减蛋综合征病毒的含量≥2000HAU。禽脑脊髓炎病毒HM08株病毒液需要进行适当的稀释，然后灭活，才能保证每羽份二联灭活疫苗中禽脑脊髓炎病毒的含量≥105.0EID50。灭活病毒液中甲醛的体积百分数为0.15％-0.25％。
(1)病毒液的浓缩或稀释：
将鸡减蛋综合征病毒AV127株病毒液和禽脑脊髓炎病毒HM08株病毒液分别进行连续离心澄清(连续离心转速：10000rpm/min)，除去病毒液中的大颗粒，使其成为透明或半透明溶液。
用病毒超滤浓缩系统(购自美国Millipore公司，超滤膜孔径：300KD)将鸡减蛋综合征病毒AV127株病毒液进行适当浓缩，获得浓缩病毒液。用超滤浓缩过程中产生的滤出废液接种鸡胚，均应无血凝性。
用生理盐水对澄清后的禽脑脊髓炎病毒HM08株病毒液进行适当倍数的稀释。
(2)病毒液的灭活：
将上述浓缩或稀释后的病毒液分别置无菌灭活罐内，加入甲醛溶液，随加随搅拌，使其充分混合。加完甲醛溶液后用无菌压缩空气将其压入另一无菌灭活罐内，置37℃下灭活，鸡减蛋综合征病毒AV127株灭活病毒液中甲醛的体积百分数为0.15％-0.25％，灭活36小时；禽脑脊髓炎病毒HM08株灭活病毒液中甲醛的体积百分数为0.15％-0.25％，灭活48小时。从灭活病毒液中取样进行灭活检验。灭活病毒液置2～8℃保存。
4.半成品检验：
(1)无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。
(2)病毒含量测定：分别检测浓缩或稀释后病毒液中病毒含量，换算至原病毒液，应该达到：鸡减蛋综合征病毒AV127株病毒液的红细胞凝集价应≥1∶10240，0.2ml禽脑脊髓炎HM08株病毒液的病毒含量应≥107.0EID50。
(3)灭活检验：
鸡减蛋综合征病毒AV127株灭活病毒液灭活检验：取灭活病毒液，经尿囊腔接种10日龄易感鸭胚10枚，每胚0.1ml，置36～37℃孵育，观察120小时，鸡胚非特异性死亡应不超过1枚，对所有胚液分别测定红细胞凝集价，均应不出现血凝，并盲传1代，测定红细胞凝集价，均应不出现血凝。
禽脑脊髓炎病毒HM08株灭活病毒液灭活检验：取灭活病毒液，经卵黄囊接种5～6日龄SPF鸡胚10枚，每胚0.2ml，置36～37℃孵育，弃去72小时内死亡鸡胚，观察12天，鸡胚非特异性死亡应不超过1枚。所有鸡胚均健活均无AE病变，取上述鸡胚的脑，按1:3(体积比)制成悬液，再接种5-6日龄SPF鸡胚10个，每胚0.2ml，孵化至18日龄，剖检，应无AE病变。
5.鸡减蛋综合征和禽脑脊髓炎二联灭活疫苗的制备：
(1)油相制备：将注射用白油和司本－80按照体积比为94：6混匀，作为油相。
(2)水相制备：将鸡减蛋综合征病毒AV127株灭活病毒液和禽脑脊髓炎病毒HM08株灭活病毒液混合，得到混合病毒液；将混合病毒液与吐温-80按照体积比96∶4混合，充分搅拌直至吐温-80完全溶解，即得水相溶液。
(3)乳化：将油相和水相按照体积比3∶1混合，搅拌均匀获得鸡减蛋综合征和禽脑脊髓炎二联灭活疫苗。具体操作步骤如下：将3份油相放入乳化罐内，启动乳化罐搅拌机搅拌，同时徐徐加入水相一份，加完后继续搅拌10～15min，打开均质机进出口开关，启动均质机，使乳化液经均质机进入另一罐，如此反复乳化数次(一般6～8次)，乳化后取10ml疫苗，以3000r/min离心15分钟，应不出现分层现象。
制苗过程中，可以根据两种病毒液具体的病毒含量，对病毒液的浓缩或稀释倍数及混合的体积比进行调整，只要保证每羽份(0.3ml)鸡减蛋综合征和禽脑脊髓炎二联灭活疫苗中，鸡减蛋综合征病毒AV127株含量≥2000HAU，禽脑脊髓炎病毒HM08株含量≥105.0EID50即可。
6.作用与用途禽脑脊髓炎灭活疫苗用于预防禽脑脊髓炎。7日龄以上鸡均可免疫接种，接种后14日产生免疫力，免疫期为10个月。
7.用法与用量每只鸡颈部皮下注射0.3ml。
实施例3 鸡减蛋综合征和禽脑脊髓炎二联灭活疫苗双倍剂量接种安全试验
按实施例2制备3批次鸡减蛋综合征和禽脑脊髓炎二联灭活疫苗(批号：20130328、20130427、20130909，0.3ml二联灭活疫苗中AV127株含量为2000HAU，HM08株含量为105.0EID50)。
考察对象为7日龄SPF鸡(购自北京梅里亚维通实验动物有限公司)和7日龄三黄肉鸡(购自南京石佛寺养鸡场)。各批鸡购回后，适应数天，核实鸡的全身状况和临床疾病情况，剔除弱鸡，选择健康鸡进入试验。对SPF鸡分别双倍剂量(0.6ml/只)颈部皮下注射三批鸡减蛋综合征和禽脑脊髓炎二联灭活疫苗，每次设1组不接种，作为对照；对三黄肉鸡分别双倍剂量(0.6ml/只)颈部皮下注射三批鸡减蛋综合征和禽脑脊髓炎二联灭活疫苗，每次设1组不接种，作为对照。接种后观察14天内是否出现由疫苗引起的任何局部和全身反应，接种后14天、28天各随机抽取试验鸡5～10只，剖检注射部位，检查疫苗的吸收情况。
结果：用双倍剂量鸡减蛋综合征和禽脑脊髓炎二联灭活疫苗对7日龄SPF鸡和7日龄三黄肉鸡进行接种。接种后14日内，未观察到临床异常，采食、饮水正常，健康情况良好，未发现由疫苗引起的任何局部和全身反应，具体见表4。接种后14天，各组取5～10只鸡剖检注射部位，80％以上肉眼可见少量粟粒样大小颗粒未吸收完全；注射后28天剖检，70％以上疫苗已基本吸收，注射部位未见由疫苗接种引起的异常反应，具体见表5。因此，鸡减蛋综合征和禽脑脊髓炎二联灭活疫苗双倍剂量接种是安全的。
表4 双倍剂量接种鸡减蛋综合征和禽脑脊髓炎二联灭活疫苗后14天内临床观察结果
表5 双倍剂量接种鸡减蛋综合征和禽脑脊髓炎二联灭活疫苗的吸收检验结果
实施例4 鸡减蛋综合征和禽脑脊髓炎二联灭活疫苗免疫效力试验
按实施例2方法制备鸡减蛋综合征和禽脑脊髓炎二联灭活疫苗(批号：20130328、20130427、20130909，抗原含量见实施例3)，并按下列方法进行成品的效力检验。
1.血清学效力检验：每批苗取1月龄SPF鸡15只，其中10只作为免疫组，每只SPF鸡颈部皮下注射0.3ml所述二联灭活疫苗；另5只作为对照组，不免疫。免疫后21天采血，分离血清，测定AE抗体中和指数，参照现行《中国兽药典》方法进行；免疫后28天采血，分离血清，测定鸡减蛋综合征抗体水平，参照现行《中国兽药典》方法进行血凝抑制试验。三批次二联灭活疫苗组免疫后21天，AE抗体中和指数分别为101.50、102.17、102.85，均不低于101.1的标准，达到合格标准具体，见表6；免疫后28天，鸡减蛋综合征平均血凝抑制抗体效价分别为8.4log2、8.8log2、9.1log2，均不低于7log2的标准，对照组均不高于2log2，达到合格标准，具体见表7。
表6 三批次二联苗AE抗体中和指数测定结果
批号 AE抗体中和指数
20130328 101.50
20130427 102.17
20130909 102.85
表7 三批次二联苗鸡减蛋综合征血凝抑制检验结果
2.禽脑脊髓炎免疫攻毒保护效力检验：取本实施例标题2中免疫21天后的免疫组SPF鸡和对照SPF鸡用禽脑脊髓炎病毒HM08株的病毒液进行脑部接种，攻毒剂量为1000EID50/0.03ml/只，观察至21天，对照组全部发病，具有脑脊髓炎的典型症状，免疫组全部正常。结果表明：免疫组攻毒后保护率达到100％，对照组发病率为100％，具体见表8。
表8三批次二联苗禽脑脊髓炎攻毒保护效力试验结果
实施例5 鸡减蛋综合征和脑脊髓炎二联灭活疫苗与同类产品比较试验
为了对比本发明鸡减蛋综合征和禽脑脊髓炎二联灭活疫苗与目前市场销售的其他同类产品的免疫效果，按实施例2方法制备鸡减蛋综合征和禽脑脊髓炎二联灭活疫苗，批号为20130909，抗原含量见实施例3。
购买北京兽医生物药品厂的鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、传染性脑脊髓炎四联灭活疫苗产品(生产批号：127304；产品批准文号：兽药生字(2008)010322042；)作为同类制品对照疫苗，该产品中减蛋综合征病毒HSH23株病毒液血凝价≥1:10240，禽脑脊髓炎病毒Van Roekel株含量≥105.0EID50/0.2ml，颈部皮下或肌肉注射。
为了与同类制品相区分，下述实验中，将本发明鸡减蛋综合征和禽脑脊髓炎二联灭活疫苗简称为自制疫苗。
将SPF鸡设为自制疫苗组、同类制品组和对照组，自制疫苗组和同类制品组分别有20只鸡，对照组10只鸡。接种方法：自制疫苗组与同类制品组均采用颈部皮下注射与其组名对应的疫苗，自制疫苗组按照剂量0.3ml/只接种，同类制品组按照剂量0.5ml/只接种，对照组不接种。接种后7日、14日、21日，自制疫苗组、同类制品组分别随机抽取10只鸡采血，测定减蛋综合征抗体和AE抗体中和指数。接种后21日，用禽脑脊髓炎病毒HM08株病毒液0.03ml(含1000EID50)和禽脑脊髓炎病毒强毒株LC-95株(购于山东省农业科学院家禽研究所)病毒液0.03ml(含1000EID50)分别脑内接种免疫组(自制疫苗组与同类制品组)10鸡，对照组各5只鸡，观察21日，统计各组发病情况。接种28日后，自制疫苗组、同类制品组分别抽取10只鸡采血，测定减蛋综合征抗体水平。通过测定免疫后抗体产生期、血清学效力检验、交叉攻毒保护试验对比两种疫苗的免疫效果。
1.鸡减蛋综合征病毒抗体产生期测定结果：两种疫苗按照1羽份(0.3ml)免疫3周龄SPF 鸡后，鸡减蛋综合征病毒抗体在免疫后7天产生，抗体产生期比较试验的结果表明：采用自制苗免疫SPF鸡后7天、14天、21天，产生的抗鸡减蛋综合征病毒抗体效价分别为3.6log2、7.7log2、8.8log2，均高于同类苗免疫相同时间后产生的抗体水平。结果见表9。鸡减蛋综合征病毒抗体大于7log2为合格。
表9 SPF鸡鸡减蛋综合征抗体产生期比较结果
2.禽脑脊髓炎病毒抗体产生期中和指数测定结果：两种疫苗按照1羽份(0.3ml)免疫3周龄SPF鸡后，禽脑脊髓炎病毒抗体在免疫后7～14天产生，抗体产生期比较试验的结果表明：采用自制苗免疫SPF鸡后7天、14天、21天，AE抗体中和指数分别为100.35、101.27和101.87，均高于同类苗免疫相同时间后产生的抗体水平，自制苗免疫SPF鸡后第14天，AE抗体中和指数达到合格；同类制品免疫后第21天，AE抗体中和指数才达到合格。上述结果说明，自制苗显著缩短了免疫窗口期。结果见表10。
表10 SPF鸡禽脑脊髓炎抗体产生期比较结果
3.鸡减蛋综合征效力检验：自制疫苗按0.3ml/只免疫SPF鸡后28天，鸡减蛋综合征病毒抗体水平为9.1log2；同类制品免疫组鸡减蛋综合征病毒抗体水平为7.6log2，对照组抗体水平为0log2。说明自制二联苗中鸡减蛋综合征的抗体效价较同类产品高1.5个滴度，结果见表11。
表11 鸡减蛋综合征血清学效力检验结果(log2)
4.禽脑脊髓炎血清学效力检验结果：各批苗免疫后21天AE抗体中和指数如下，自制疫 苗免疫组为101.87，同类制品免疫组抗体水平为101.35，说明自制二联苗中禽脑脊髓炎的抗体效价高于同类产品，结果见表12。
表12 AE抗体中和指数测定结果
组别 AE抗体中和指数
自制疫苗 101.87
同类制品 101.35
5.禽脑脊髓炎交叉攻毒试验结果：各组用禽脑脊髓炎病毒HM08株和LC-95株分别攻毒。自制苗免疫后21天，分别用HM08株和LC-95株攻毒均获得100％保护；而同类制品用HM08株攻毒的保护率仅为70％，LC-95株攻毒的保护率为90％，结果见表13。
表13 禽脑脊髓炎交叉攻毒保护结果
实施例6 鸡减蛋综合征和禽脑脊髓炎二联灭活疫苗对蛋鸡及其子代的免疫效力
检测实施例2制备的鸡减蛋综合征和禽脑脊髓炎二联灭活疫苗(自制灭活疫苗，批号为20130909，抗原含量见实施例3)对蛋鸡及其子代的免疫效力。
将自制灭活疫苗与同类制品：鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、传染性脑脊髓炎四联灭活疫苗(购自北京兽医生物药品厂，该产品含有禽脑脊髓炎病毒Van Roekel株)分别免疫18周龄海兰蛋种鸡20只，自制疫苗按照剂量0.3ml/只接种，同类制品按照剂量0.5ml/只接种，另20只不免疫作对照。免疫后7天、14天、21天、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月采血，测定减蛋综合征抗体水平和AE抗体中和指数。并收集免疫后1个月、2个月、3个月、4个月、5个月前后3天的鸡蛋各30枚；孵化至5-6日龄时，各取10个鸡胚，按照现行《中国兽药典》进行禽脑脊髓炎鸡胚敏感性试验，以检测自制灭活疫苗免疫蛋鸡后对子代的保护率及保护时间。
1.鸡减蛋综合征病毒抗体测定结果：自制苗0.3ml免疫18周龄海兰蛋鸡后，7天开始产生抗体，28天效检抗体水平达到8.5log2，免疫持续期测定到10个月，抗体水平仍有3.7log2，且抗体水平远高于同类制品。结果见表14。
表14：蛋鸡减蛋综合征抗体水平结果
2.AE抗体中和指数测定：自制苗0.3ml免疫18周龄海兰蛋鸡后，7天开始产生抗体，免疫持续期可达10个月，且抗体水平远高于同类制品。自制苗免疫蛋鸡后可以对子代提供3个月的保护，保护率高于同类制品，结果见表15、表16。
表15 禽脑脊髓炎病毒对蛋鸡抗体持续期比较结果
表16 各灭活疫苗对鸡胚的敏感性试验

Claims (9)

1.鸡减蛋综合征和禽脑脊髓炎二联灭活疫苗，其特征在于：含有灭活的鸡减蛋综合征病毒AV127株和禽脑脊髓炎病毒HM08株，所述禽脑脊髓炎病毒HM08株的保藏号为CGMCCNO.7759。
2.根据权利要求1所述鸡减蛋综合征和禽脑脊髓炎二联灭活疫苗，其特征在于0.3ml所述二联灭活疫苗中鸡减蛋综合征病毒AV127株的含量≥2000HAU，禽脑脊髓炎病毒HM08株含量≥105.0EID50。
3.一种制备权利要求1所述鸡减蛋综合征和禽脑脊髓炎二联灭活疫苗的方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1） 病毒液的制备：将鸡减蛋综合征病毒AV127株和禽脑脊髓炎病毒HM08株分别接种易感鸭胚和SPF鸡胚，得到减蛋综合征病毒液和禽脑脊髓炎病毒液；
（2）病毒液的灭活：将减蛋综合征病毒液和禽脑脊髓炎病毒液分别灭活，得到灭活的减蛋综合征病毒液和禽脑脊髓炎病毒液；
（3）水相制备：将灭活的禽脑脊髓炎病毒液与鸡减蛋综合征病毒液混合，然后与吐温-80混合均匀，制得水相；
（4）油相制备：将白油和司本－80混合均匀，作为油相。
（5）乳化：将水相和油相混合均匀，即得鸡减蛋综合征和禽脑脊髓炎二联灭活疫苗。
4.根据权利要求3所述制备鸡减蛋综合征和禽脑脊髓炎二联灭活疫苗的方法，其特征在于0.3ml所述二联灭活疫苗中鸡减蛋综合征病毒AV127株的含量≥2000HAU，禽脑脊髓炎病毒HM08株含量≥105.0EID50。
5.根据权利要求3或4所述制备鸡减蛋综合征和禽脑脊髓炎二联灭活疫苗的方法，其特征在于：步骤（1）中减蛋综合征病毒液的血凝价≥1:10240，0.2ml禽脑脊髓炎病毒液的病毒含量≥107.0 EID50。
6.根据权利要求5所述制备鸡减蛋综合征和禽脑脊髓炎二联灭活疫苗的方法，其特征在于：步骤（2）中灭活的减蛋综合征病毒液和禽脑脊髓炎病毒液中甲醛的体积百分浓度为0.15%-0.25%。
7.根据权利要求6所述制备鸡减蛋综合征和禽脑脊髓炎二联灭活疫苗的方法，其特征在于步骤（3）中混合病毒液与吐温-80按照体积比为96∶4进行混合。
8.根据权利要求7所述制备鸡减蛋综合征和禽脑脊髓炎二联灭活疫苗的方法，其特征在于步骤（4）中所述白油和司本－80混合的体积比为94∶6。
9.根据权利要求8所述鸡减蛋综合征和禽脑脊髓炎二联灭活疫苗，其特征在于步骤（5）所述水相和油相混合的体积比为1:2-4。
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