PT2578229E

PT2578229E - Redução de riscos iatrogénicos potenciais associados aos antigénios das vacinas

Info

Publication number: PT2578229E
Application number: PT121930960T
Authority: PT
Inventors: Jens Peter Gregersen
Original assignee: Novartis Vaccines & Diagnostic
Priority date: 2004-09-09
Filing date: 2005-09-09
Publication date: 2013-09-27
Also published as: US20130129782A1; CA2890962A1; CY1111180T1; US20160251631A1; PT2236155E; JP2019210292A; HRP20110007T1; CY1113225T1; EP2179744A1; RS51721B; JP2017057209A; ATE488248T1; EP2236155A1; EP2179744B1; PL1789084T3; EP2578229B1; ES2386272T3; US10155932B2; PL2578229T3; CY1111208T1

Description

DESCRIÇÃO

REDUÇÃO DE RISCOS IATROGÉNICOS POTENCIAIS ASSOCIADOS AOS

ANTIGÉNIOS DAS VACINAS

CAMPO TÉCNICO

Esta invenção diz respeito à produção e controle de qualidade de vacinas de antigénios.

ANTECEDENTES DA TÉCNICA

Os virus da gripe para utilização na preparação de vacinas humanas foram desenvolvidos tradicionalmente em ovos de galinha embrionados, embora as técnicas mais modernas desenvolvam o virus em cultura celulares de mamifero, por exemplo, em células Vero, células MDCK ou células PER.C6. A mudança no substrato de crescimento do virus, proporcionou uma oportunidade para uma nova avaliação pela entidade reguladora da segurança da vacina antigripal. Por exemplo, a contaminação com o ADN da célula hospedeira tem sido uma objecção da entidade reguladora nas vacinas obtidas a partir de células [1], mas não tem sido uma preocupação no passado para as vacinas desenvolvidas em ovos.

Os problemas de segurança em torno de vacinas da gripe derivadas de ovo são assim diferentes daquelas em torno de vacinas produzidas em cultura celular, estando as vacinas derivadas de células sob exame minucioso. É um objecto da invenção resolver estas questões de segurança diferentes, e, nomeadamente, proporcionar métodos para aumentar a segurança de vacinas da gripe cultivados numa cultura de células Vero. 1

Kweon et al. (Vaccine. 1999 04 de junho, 17 (20-21):2546-53) menciona ensaios para a presença de agentes adventícios, num processo para o crescimento de vírus da epidemia de diarreia porcina (PEDV) em células Vero. Merten (Cytotechnology. 2002 julho; 39 (2):91-116) discute a contaminação por vírus de culturas de células.

DIVULGAÇÃO DA INVENÇÃO

Por definição, a utilização de substratos de células de mamíferos para a produção de vacina antigripal implica a cultura celular em condições que sejam perfeitamente adequadas para o desenvolvimento e a replicação virai. O inventor compreendeu que estas condições aumentam o risco de desenvolvimento de agentes patogénicos diferentes do vírus da gripe na cultura celular, ocorrendo, com isso, a possível contaminação do produto de vacina final. Os ensaios de contaminação não são, em geral, difíceis de realizar, mas um fabricante deve saber primeiro que tipo de ensaio tem que realizar. O inventor identificou riscos de contaminação específicos, e o seu trabalho indica que podem ser levados a cabo ensaios adequados durante o fabrico com a finalidade de garantir a segurança e qualidade das vacinas antigripais desenvolvidas em culturas celulares. Alguns dos contaminantes podem ser inócuos num produto de vacina final, mas a sua presença pode interferir com a propagação e purificação posterior do vírus da gripe, assim a sua eliminação é assunto primordial para a qualidade e reprodutibilidade; outros contaminantes seriam prejudiciais numa vacina final, assim a sua eliminação é um assunto de segurança primordial. O risco de contaminação que surge da co-cultura virai não é sem precedentes (por exemplo, certos lotes das primeiras 2 vacinas do vírus da pólio contaminaram-se com vírus de símio 40 ("SV40"), um vírus de polioma) , mas não existia nenhuma divulgação prévia sobre a identificação de riscos específicos associados à cultura celular para a produção da vacina antigripal. Os vírus da gripe desenvolvidos em culturas celulares têm um risco particular de contaminação uma vez que as estirpes usadas para a produção da vacina mudam a cada ano. Esta mudança anual nos materiais de produção significa que a cada novo ano existe um novo risco de contaminação, particularmente porque durante a preparação de vírus semeados pelos fabricantes são realizadas múltiplas passagens, aumentando assim o risco de desenvolvimento paralelo de agentes patogênicos acidentais. A invenção proporciona um processo para a preparação de um antigénio de vacina numa cultura de uma linha celular Vero, compreendendo um passo de teste para um agente patogénico selecionado do grupo consistindo em parvovírus canino, vírus de palioma JC, e circovírus. 0 inventor identificou agentes infecciosos que podem ser desenvolvidos nas condições usadas para o desenvolvimento do vírus da gripe em culturas celulares, mas que não se desenvolvem em ovos de galinha. Estes agentes infecciosos representam um novo risco de contaminação para as vacinas antigripais que nunca foram um problema para as vacinas antigripais tradicionais. Portanto, a invenção proporciona um processo para a preparação de uma vacina antigripal a partir do vírus da gripe que se desenvolve numa cultura de uma linha celular de mamífero, que compreende uma etapa na qual se ensaia a vacina e/ou a cultura para determinar a presença de um agente infeccioso que pode ser desenvolvido 3 na dita linha de células, mas não se desenvolve em ovos de galinha embrionados. 0 inventor identificou igualmente agentes infecciosos que se desenvolvem em alguns substratos de células usados para a produção de vacina antigripal, mas que não se desenvolvem em outros. De acordo com isso, estes agentes infecciosos são um risco de contaminação unicamente para certas vacinas antigripais. Assim, a descrição também proporciona um processo para a preparação de uma vacina antigripal a partir do virus da gripe, que foi cultivado em cultura de uma primeira linha de célula de mamifero, compreendendo um passo em que a vacina e/ou a cultura é testada para a presença de um agente infeccioso que pode crescer na referida primeira linha de células, mas que não cresce numa segunda linha de células de mamifero. A divulgação também fornece um processo para a preparação de uma vacina antigripal a partir do virus da gripe, que foi cultivado numa cultura de uma linha celular de mamifero, compreendendo um passo em que a vacina e/ou a cultura é tratada para remover e/ou inativar um agente infeccioso que pode crescer na linha celular, mas não cresce em ovos de galinha embrionados. De igual modo, a revelação providencia um processo para a preparação de uma vacina antigripal a partir do virus da gripe, que foi cultivado em cultura de uma primeira linha de células de mamifero, compreendendo um passo em que a vacina e/ou a cultura é tratada para remover e/ou inativar um agente infeccioso que pode crescer na referida primeira linha de células, mas não cresce numa segunda linha de células de mamifero. Após a remoção e/ou inativação, a vacina/cultura 4 pode ser testada para a presença do agente infeccioso, por exemplo, para verificar se foi removido/inativado. A divulgação também fornece uma vacina antigripal, que foi obtida por um processo da invenção. A invenção proporciona também uma vacina antigripal que é obtenivel por um processo da invenção. A divulgação também fornece uma vacina antigripal, que foi cultivada em cultura de uma linha celular de mamifero, em que a vacina foi confirmada como estando livre da presença de um agente infeccioso que pode crescer na referida linha celular mas que não cresce em ovos de galinha embrionados. Do mesmo modo, a invenção proporciona uma vacina antigripal, que foi cultivada em cultura de uma primeira linha de célula de mamifero, em que a vacina foi confirmada como estando livre da presença de um agente infeccioso que pode crescer na referida primeira linha de células, mas que não cresce numa segunda linha de células de mamifero. A divulgação também fornece uma vacina antigripal em que o reovirus de mamifero não é detectável por RT-PCR (por exemplo, utilizando a técnica de RT-PCR à base de Ll descrita na referência 16, utilizando iniciadores Ll.rv5, Ll.rvô, Ll.rv7 e LV1. RV8 como ensinado) . Não tendo sido cultivada em ovos, a vacina será isenta de ovalbumina e a partir de ADN de frango. A linha de células de mamífero

As vacinas antigripais da invenção são cultivadas numa linha celular Vero, em vez de serem cultivados em ovos embrionados. 5

Estas linhas celulares estão amplamente disponíveis, por exemplo, na coleção da American Type Cell Culture (ATCC) [10], ou no Coriell Cell Repositories [11]. Por exemplo, a ATCC fornece várias células Vero sob diferentes números de catálogo CCL-81, CCL-81,2, CRL-1586 e CRL-1587.

Agentes infecciosos que não se desenvolvem em ovos de galinha embrionados O inventor identificou uma variedade de agentes patogénicos que podem ser desenvolvidos em linhas celulares de mamíferos (em particular, tanto em células MDCK como em células Vero) usadas para a preparação de vírus da gripe para a produção de vacina, mas que não se desenvolvem em ovos de galinha. O ensaio de contaminação para estes agentes patogénicos não era necessário para vacinas preparadas sobre o substrato de ovo tradicional, mas o inventor comprovou que o controlo de qualidade das vacinas deveria incluir ensaios para um ou mais destes agentes patogénicos com a finalidade de garantir o cumprimento das normas de segurança mais exigentes. Os agentes patogénicos são os seguintes:

Pneumovirinae, tais como o género Pneumovlrus, incluindo o vírus sincicial respiratório (RSV).

Morbilliviruses da família Paramyxoviridae, tal como o vírus do sarampo.

Enterovlrus da família Picornaviridae, tal como o vírus Coxsackie, vírus ECHO e enterovírus, embora alguns vírus Coxsackie (por ex. B3, B4) tenha sido visto que não se desenvolvem em células MDCK.

Reoviridae de mamífero, em particular ortoreovírus (por exemplo, reovirus de mamífero) e rotavírus. Os reovírus 6 podem mostrar desenvolvimento não limitado em células Vero e MDCK, e em consequência, o ensaio dos mesmos é de particular importância. Os rotavirus partilham os requisitos de protease dos virus da gripe com a finalidade de ser desenvolvido em culturas celulares e esse paralelismo poderia ocorrer de maneira inconsciente à ativação de rotavirus contaminantes.

Quando estes agentes patogénicos têm diferentes estirpes que possuem diferentes hospedeiros (por exemplo, RSV humano e RSV bovino), o ensaio incluirá tipicamente a estirpe ou as estirpes de interesse que possam infectar a humanos. 0 ensaio para estes agentes é particularmente importante para estirpes virais obtidas a partir técnicas genéticas inversas, já que os virus semeados para o fabrico de virus passarão por múltiplas passagens nas culturas de células de mamífero durante os processos de genética inversa, aumentando, com isso, o risco de contaminação por agentes infecciosos acidentais.

Agentes infecciosos que não se desenvolvem em ovos, mas que se desenvolvem em diferentes linhas celulares de mamífero 0 inventor identificou uma variedade de agentes patogénicos que não se desenvolvem em ovos de galinha, que não se desenvolvem em células MDCK, mas que se desenvolvem em células Vero. 0 ensaio de contaminação por estes agentes patogénicos não era necessário para as vacinas preparadas no substrato de ovo tradicional e não é necessário para as vacinas preparadas em células MDCK, mas o inventor comprovou que o controlo de qualidade das vacinas desenvolvidas em células Vero deveria incluir ensaios para 7 um ou mais destes agentes patogénicos com a finalidade de garantir as normas de segurança mais exigentes. Os agentes patogénicos são os seguintes:

Metapneumovírus da familia Paramyxoviridae, tal como metaneumovírus humano (HMPV).

Rubulavírus da familia Paramyxoviridae, tal como o virus da papeira, o qual se desenvolve em células Vero.

Togaviridae, tal como Rubellavírus.

Coronaviridae, tal como o coronavirus SARS e outros coronavirus humanos. Estes vírus mostram altas taxas de desenvolvimento em células Vero, mostrando o virus SARS desenvolvimento não limitado, e em consequência, o ensaio para estes é de particular importância.

Rhinovírus da familia Picornaviridae, tais como as estirpes M de Rhinovírus. Vírus da varicela zoster (VZV), também conhecido como vírus 2 de herpes humano (HHV3). 0 VZV pode mostrar desenvolvimento não limitado em células Vero, e em consequência, o ensaio para estes é de particular importância.

Polyomaviridae, tais como o vírus de polioma SV-40, o vírus de polioma BK e o vírus do polioma JC. Estes vírus de polioma podem mostrar desenvolvimento não limitado em células Vero (em particular, em células BK) e, em consequência o seu ensaio é de particular importância.

Circovírus porcino.

Picornavírus porcino, tais como o vírus da doença vesicular porcina (SVDV) e o vírus Teschen-Talfan. 8

Bactérias Chlamydia, incluindo C. trachomatis, C. pneumoniae e C. psittaci. Estas bactérias podem ser desenvolvidas em células Vero e, em consequência, o seu ensaio é de particular importância.

Parvovírus, tais como parvovírus canino (CPV) ou parvovirus porcino.

Quando estes agentes patogénicos têm estirpes diferentes com hospedeiros diferentes (por exemplo, RSV humano e RSV bovino), o ensaio incluirá tipicamente a estirpe ou as estirpes, que podem infectar a humanos. 0 ensaio para virus não-humanos (por exemplo, vírus aviários e porcinos) é particularmente importante unicamente quando os materiais aviários ou porcinos de interesse foram usados na preparação virai, por exemplo, se as estirpes foram inicialmente isoladas a partir de porcos ou aves, ou se foram usadas passagens de ovos durante o desenvolvimento inicial, ou se foi usada tripsina de porcino nas culturas celulares, etc.

Agentes infecciosos que se desenvolvem em ovos e linhas celulares de mamífero 0 inventor identificou também agentes patogénicos que, em contraste com os descritos acima, se desenvolvem tanto em linhas de células de mamíferos como em ovos de galinhas. Um processo da invenção pode envolver um passo de teste para tais agentes patogénicos, mas este passo poderia também parte de um maior controlo de qualidade em vírus cultivados em ovos de galinhas. Estes agentes patogénicos incluem: 9 Vírus Parainfluenza (PIV), membros de Paramyxoviridae Paramyxovirinae, incluindo PIV-1, PIV-2 e PIV-3. 0 Herpesviridae, tais como vírus do herpes simplex 1 e 2. 0 Adenoviridae, tais como os adenovírus, incluindo adenovírus humano e de símio.

Micoplasma.

Circovírus aviário.

Reoviridae aviária, nomeadamente ortoreovírus, tais como reovírus avícolase pode desenvolver em linhas celulares de mamíferos. 0 inventor identificou também agentes patogénicos que se desenvolvem em ovos de galinha e em células Vero, mas que não são susceptíveis de crescer em células MDCK. Um processo da invençãoo pode envolver um passo de teste para tais agentes patogénicos, mas este passo poderia também ser parte de um maior controlo de qualidade dos vírus cultivados em ovos de galinhas, e a passo não é necessário se for usado o substrato MDCK. Estes agentes patogénicos incluem:

Birnaviridae, tal como o vírus da doença de Gumboro (também conhecido como vírus de Gumboro). 0 ensaio para agentes que se desenvolvem em ovos e linhas de células é importante para estirpes virais derivadas após múltiplas passaqens em ovos por exemplo, vírus de sementes para a produção de vírus. 10

Como estes agentes patogénicos se desenvolvem em ovos, em seguida, para testar a sua presença pode também ser utilizado para os virus preparados a partir de virus desenvolvidos em ovos. Assim, a invenção não está limitada a vacinas produzidas em cultura de células, mas também pode ser utilizada para vacinas "tradicionais", à base de ovo. Métodos de ensaio

Os métodos para a detecção da presença de agentes patogénicos em culturas celulares e em produtos biofarmacêuticos estão rotineiramente disponíveis. Geralmente, os métodos baseiam-se na detecção imunoquimica (imunoensaio, western blot, ELISA, etc.) e/ou na detecção de ácido nucleico (métodos de hibridização, tais como Southern blot ou slot blots, PCR, etc.). Como uma alternativa, é possivel ensaiar a presença de um agente patogénico, por meio de inoculação convencional de culturas celulares (isto é, se o material de teste conduz à produção do agente patogénico contaminante quando se cultiva em condições adequadas).

Os métodos podem detectar um único agente patogénico (por exemplo, virus) ou podem detectar múltiplos agentes patogénicos (por exemplo, vários virus). Quando um ensaio detecta múltiplos agentes patogénicos (por exemplo, "X", "Y" ou "Z"), nessa caso, pode dar um resultado especifico (por exemplo, o virus "Y" está presente) ou pode dar um resultado geral (por exemplo, está presente um de "X", "Y" ou "Z") . Os métodos podem ser quantitativos, semiquantitativos ou qualitativos. Podem ser usados métodos de detecção em tempo real. 11

As diretrizes gerais para a detecção de um agente patogénico (por exemplo, virus) de interesse podem ser encontradas na referência 14. No parágrafo seguinte, são mostrados vários ensaios mais específicos, e o perito na especialidade poderá encontrar ou preparar facilmente um ensaio para a detecção da presença de qualquer agente patogénico escolhido. A Referência 15 divulga um ensaio de PCR de transcrição inversa múltipla (RT-PCR), referido como "m-RT-PCR-ELISA", para a detecção de nove agentes patogénicos das vias respiratórias num único ensaio, especificamente: enterovírus, virus da gripe tipo A e tipo B, vírus sincicial respiratório, vírus de parainfluenza tipo 1 e tipo 3, adenovírus, Mycoplasma pneumoniae e Chlamydia pneumoniae. Na referência 16 divulga-se um método de RT-PCR para a detecção de reovírus de mamífero. A referência 17 divulga um ensaio RT-PCR em tempo real para a detecção do metapneumovírus humano procedente de todas as linhagens genéticas conhecidas. A referência 18 divulga um único ensaio RT-PCR para a detecção do vírus sincicial respiratório humano (HRSV), vírus de parainfluenza humano 1, 2, e 3 e da gripe A e B. A referência 19 divulga um ensaio RT-PCR múltiplo para detectar e diferenciar o vírus do sarampo, o vírus da rubéola e o parvovírus B19. Na referência 20 divulga-se um ensaio RT-PCR em tempo real para detectar o rinovírus humano com a discriminação exata de outros vírus procedentes da família Picornaviridae. A referência 21 divulga um ensaio RT-PCR múltiplo com conjuntos de iniciadores aninhados dirigidos a regiões conservadas da hemaglutinina do vírus parainfluenza humano, a proteína inoculada do coronavírus humano e os genes da poliproteína de enterovírus e rinovírus humano, que permite 12 a detecção e determinação do tipo de maneira rápida, sensível e simultânea dos quatro tipos de vírus parainfluenza (1, 2, 3, 4AB), o coronavírus humano 229E e OC43, e a detecção genérica de enterovírus e rinovírus. Na referência 22 divulga-se a detecção de SVDV por meio de RT-PCR. Na referência 23 divulga-se um ensaio RT-PCR quantitativo de uma única etapa para o coronavírus SARS. A referência 24 divulga um ensaio de PCR em tempo real de discriminação alélica TaqMan para o VZV. Na referência 25 divulga-se um ensaio de PCR múltipla para a detecção simultânea e rápida do vírus da pseudorrabia, o parvovírus e o circovírus. Na referência 26 divulga-se um ensaio de PCR de sonda FRET em tempo real para a detecção do vírus de polioma SV-40. Na referência 27 divulga-se um ensaio para a detecção e diferenciação simultânea do vírus do polioma humano JC e BK por meio de um método de PCR-Elaha rápido e sensível. Na referência 28 divulga-se a detecção de circovírus porcinos em linhas celulares humanas por meio de PCR e ensaios de imunofluorescência indireta. Nas referências 29 e 30 divulgam-se métodos de PCR para a detecção de birnavírus. 0 método de detecção da invenção pode ser levado a cabo em qualquer fase ou fases durante o fabrico da vacina, a partir do vírus semeado e/ou o substrato de células e/ou o meio de cultura, por meio das fases de infecção virai e de desenvolvimento, por meio da recolecção de vírus, por meio de qualquer processamento virai (por exemplo, corte e/ou extração da proteína de superfície), por meio da formulação da vacina e, finalmente, a embalagem da vacina. Portanto, o ensaio usado de acordo com a invenção pode ser levado a cabo nos materiais usados para criar a cultura virai, na própria cultura virai e no material extraído e obtido a 13 partir da cultura virai. 0 ensaio não necessita ser levado a cabo em todas e cada uma das vacinas ou culturas, mas pode ser usado a intervalos apropriados como parte do controlo de qualidade normal. É particularmente útil quando se muda a produção de vacinas para as novas estirpes recomendadas a cada ano pelas autoridades sanitárias, em cuja fase se estabelecem novas culturas que devem ser submetidas a novo controlo de qualidade. Os ensaios da invenção são levados a cabo de maneira vantajosa em virus semeados usados para o fabrico de vacinas.

Nos métodos da invenção, as linhas celulares Vero usadas para desenvolver virus da gripe podem ser cultivadas em qualquer meio adequado, por exemplo, em meios sem soro, em meios sem proteina, etc. Na referência 2 divulgam-se métodos para a cultura sem soro do virus da gripe, na referência 31 divulgam-se métodos para a cultura sem proteínas. Não obstante, um meio "sem proteína" pode incluir uma ou mais proteases (por exemplo, tripsina) que podem ser necessárias para a propagação do virus da gripe. Um meio sem soro pode incluir suplementos de soro.

Também se prefere que a vacina tenha sido desenvolvida numa cultura sem a adição de material bovino, garantindo, desta forma, que a cultura esteja livre de qualquer contaminação possível de BSE e de vírus bovinos. Os meios que não incluem componentes associados a nenhuma encefalopatia espongiforme transmissível são os preferidos. A vacina antigripal

A invenção diz respeito a controle de qualidade de antigénios de vacinas, por exemplo, vacinas antigripais. A 14 vacina pode estar na forma de um vírus vivo ou, de preferência, um vírus inativado. Tipicamente, os vírus inativados implicam o tratamento com um produto químico tal como formalina ou β-propiolactona. Quando se usa um vírus inativado, a vacina pode ser um vírus completo, um vírus fraccionado ou subunidades virais. Os vírus faccionados são obtidos por meio do tratamento de viriões com detergentes (por exemplo, éter etílico, polissorbato 80, desoxicolato, fosfato de tri-N-butilo, Triton X-100, Triton N101, brometo de cetiltrimetilamónio, etc.) para produzir preparações de subviriões. As vacinas de subunidades compreendem os antigénios de superfície da hemaglutinina e neuraminidase do vírus da gripe. Os antigénios do vírus da gripe podem estar presentes igualmente na forma de virossomas [32].

As vacinas antigripais da invenção podem estar baseadas em qualquer estirpe ou estirpes adequadas. Tipicamente, as vacinas incluem antigénios de pelo menos uma estirpe de vírus da gripe A e/ou, pelo menos, uma estirpe de vírus da gripe B. As estirpes recomendadas para vacinas mudam de uma temporada a outra. No período interpandémico atual, tipicamente, as vacinas incluem duas estirpes do vírus da gripe A (H1N1 e H3N2) e uma estirpe do vírus da gripe B, e preferem-se as vacinas trivalentes. A invenção é também adequada para a preparação de vírus a partir de estirpes pandémicas, tais como as estirpes H5 ou H7, isto é estirpes às quais a população humana não foi imunologicamente exposta. As vacinas em situações pandémicas podem ser monovalentes, ou podem estar baseadas numa vacina trivalente normal, suplementada com uma estirpe pandémica. O vírus ou tipos de vírus da gripe usados nos métodos da invenção podem ser estirpes recombinantes, e/ou podem ter 15 sido obtidos por meio de técnicas genéticas inversas. 0 virus ou tipos de virus podem estar atenuados. 0 virus ou tipos de virus podem ser sensíveis à temperatura. 0 vírus ou tipos de vírus podem estar adaptados ao frio.

Quando uma vacina inclui mais de uma estirpe do vírus da gripe, tipicamente, as diferentes estirpes desenvolvem-se em separado e misturam-se após os vírus terem sido colhidos e os antigénios preparados. Portanto, os métodos da invenção podem incluir a etapa de mistura de antigénios procedentes de mais de uma estirpe do vírus da gripe. 0 ensaio para agentes patogénicos pode ser levado a cabo antes ou depois da dita mistura.

Tipicamente, a vacina será preparada para administração a um paciente por meio de injeção (por exemplo, injeção subcutânea ou injeção intramuscular), embora sejam conhecidas outras vias de administração para vacinais antigripais, por exemplo, intranasal [33-35], oral [36], intradérmica [37, 38], transcutânea, transdérmica [39], etc.

As vacinas preparadas de acordo com a invenção podem ser usadas para tratar tanto a crianças como a adultos. As vacinas antigripais são recomendadas atualmente para utilização em imunização pediátrica e de adultos, a partir de 6 meses. As exigências de segurança são mais elevadas para as vacinas pediátricas, particularmente devido a que os indivíduos imunologicamente não expostos recebem, tipicamente, duas doses de vacina num curto período de tempo (por exemplo, com 1 a 2 meses de intervalo). 16

As vacinas da invenção podem incluir um adjuvante. Os adjuvantes que foram usados em vacinas antigripais incluem sais de aluminio [40,41], quitosano [42], oligodesoxinucleótidos CpG, tais como CpG 7909 [43], emulsões de óleo em água, taus como MF59 [44], emulsões de água em óleo [45], toxina termolábil de E. coli [34, 36] e os seus mutantes destoxifiçados [47, 48], lipido monofosforilo A [49] e o seu derivado 3-o-desacetilado [50], mutantes de toxina pertussis [51], dipéptidos muramilo [52], etc. A hemaglutinina (HA) é o imunogénio principal nas vacinas antigripais inativadas e as doses de vacina estão normalizadas com referência às concentrações de HA, tipicamente medidas por meio de um ensaio de imunodifusão radial único (SRID). Tipicamente, as vacinas contêm aproximadamente 15 yg de HA por estirpe, embora também sejam usadas doses mais baixas, por exemplo, para crianças, ou em situações pandémicas. Foram usadas doses fraccionadas tais como is (isto é, 7,5 yg de HA por estirpe), ¼ e 1/8 [40, 53] . Portanto, as vacinas podem incluir entre 1 e 20 yg de HA por estirpe do virus da gripe, preferivelmente, por exemplo, aproximadamente 15, aproximadamente 10, aproximadamente 7,5, aproximadamente 5, aproximadamente 3,8, aproximadamente 1,9, etc. tiomersal a vacina mercurial tiomersal são mais

As vacinas podem incluir conservantes, tais como ou 2-fenoxietanol. No entanto, prefere-se que esteja substancialmente livre de especialidade (isto é, menos de 5 yg/ml), por exemplo, livre de [54, 55] . As vacinas que não contêm mercúrio preferidas. 17

Preferivelmente, as vacinas da invenção contêm menos de 10 ng (preferivelmente menos de 1 ng e mais preferivelmente menos de 100 pg) de ADN da célula hospedeira residual por dose, embora possam estar presentes quantidades residuais de ADN da célula hospedeira. O ADN contaminante pode ser eliminado durante a preparação da vacina usando métodos de purificação convencionais, por exemplo, cromatografia, etc. A eliminação do ADN residual da célula hospedeira pode ser aumentada por meio de tratamento com nuclease, por exemplo, por meio da utilização de Benzonase® DNase [1]. As vacinas que contêm <10 ng (por exemplo, <1 ng, <100 pg) de ADN da célula hospedeira por 15 yg de hemaglutinina são as preferidas, como as vacinas que contêm <10 ng (por exemplo, <1 ng, <100 pg) de ADN da célula hospedeira por 0,25 mj de volume. As vacinas que contêm <10 ng (por exemplo, <1 ng, <100 pg) de ADN da célula hospedeira por 50 yg de hemaglutinina são mais preferidas, como as vacinas que contêm <10 ng (por exemplo, <1 ng, <100 pg) de ADN da célula hospedeira por 0,5 ml de volume.

Estas diferentes caracteristicas das vacinas podem ser obtidas incluindo etapas adequadas nos métodos da invenção. Assim, as etapas especificas incluem: uma etapa de inativação; uma etapa de mistura de três estirpes de virus de vacina para obter uma vacina trivalente; uma etapa de formulação da vacina para injeção; uma etapa de administração da vacina a um paciente; uma etapa de combinação da vacina com o adjuvante; uma etapa de medição do conteúdo de HA; uma etapa de ajuste do conteúdo de HA, por exemplo, por diluição; uma etapa de adição de um conservante; uma etapa de eliminação dos ácidos nucleicos residuais da célula hospedeira; etc. 18

Agentes acidentais preferidos para ensaio

Formas de realização preferidas da divulgação implicam agentes acidentais, e em particular de virus, que são encontrados em amostras respiratórias, uma vez que estas têm maior probabilidade de estar presentes em isolados clinicos iniciais de virus da gripe. Os agentes patogénicos respiratórios incluem: RSV, PIV-3, coronavirus SARS, adenovirus, rinovirus, reovirus ("virus órfão entérico respiratório"), etc. 0 virus do herpes simples pode ser encontrado também em amostras respiratórias.

Nos casos em que uma vacina tenha sido tratada com detergente (por exemplo, uma vacina fraccionada ou uma subunidade de vacina), então esta etapa de tratamento oferece um grau de segurança extra, uma vez que pode também podem destruir os virus contaminantes. No entanto, se o contaminante não tiver envelope, então, o tratamento com detergente habitualmente não terá efeito sobre a vacina, e, portanto, não melhora por si mesmo a segurança. Portanto, o o ensaio para os agentes patogénicos seguintes é particularmente importante, já que não têm envelope: Picornaviridae, Reoviridae, Birnaviridae, Parvoviridae, Circoviridiae, Adenoviridae, Polyomaviridae. A resistência a detergentes destes virus combinada com o seu alto desenvolvimento em células Vero indica que é particularmente importante ensaiar os enterovirus humanos, os Reoviridae de mamíferos, os Adenoviridae e os Polyomaviridae quando se usa um substrato de células Vero. Igualmente, os Reoviridae de mamifero desenvolvem-se em altas taxas em células MDCK. Esses virus estão igualmente entre os mais resistência à inativação. 19

Outros produtos biológicos

Para além de ser útil para testar vacinas antigripais, a invenção também pode ser usada para outros biológicos, tais como proteinas recombinantes, por exemplo, anticorpos [56], fatores de crescimento, citoquinas, linfocinas, receptores, hormonas, antigenos vacinais, antigenos de diagnóstico, etc.

Generalidades 0 termo "compreende" engloba "incluindo" bem como "consistindo" por exemplo, uma composiçãoo "que compreende" X pode consistir exclusivamente em X ou pode incluir algo adicional, por exemplo, X + Y. 0 termo "cerca" em relação a um valor numéricos de x significa, por exemplo, x ± 10%. A palavra "substancialmente" não exclui "completamente" por exemplo, uma composição que é "substancialmente livre" de Y pode ser completamente livre de Y. Sempre que necessário, a palavra "substancialmente" pode ser omitida da definição da invenção.

Para informações gerais sobre vacinas antigripais, incluindo estirpes, linhas de células para crescimento, doses, combinações, formulações, etc. podem ser encontradas nos capitulos 17 e 18 da referência 57. Mais detalhes sobre o virus da gripe, incluindo detalhes do seu ciclo de vida durante o crescimento virai, podem ser encontradas no capitulo 46 da referência 14. 20 A descrição proporciona ainda as seguintes formas de realização: 1. Um processo para a preparação de uma vacina antigripal a partir do virus da gripe, que foi cultivado em cultura de uma linha celular de mamifero, compreendendo um passo em que a vacina e/ou a cultura é testada para a presença de um agente infeccioso que se pode desenvolver na referida linha celular, mas que não se desenvolve em ovos de galinha embrionados. 2. Um processo para a preparação de uma vacina antigripal a partir do virus da gripe, que foi cultivado em cultura de uma linha celular de mamifero, compreendendo um passo em que a vacina e/ou a cultura é tratada para remover e/ou inativar um agente infeccioso que pode se pode desenvolver na linha celular, mas que não se desenvolve em ovos de galinha embrionados. 3. 0 processo da forma de realização 1 ou 2, em que a linha celular de mamifero é uma linha celular MDCK, uma linha celular Vero, ou uma linha celular PER.C6. 4. 0 processo de qualquer reivindicação precedente, em que o agente infeccioso é selecionado de entre o grupo constituído por: Pneumovirinae; Morbilliviruses da família Paramyxoviridae; Enterovirus da família Picornaviridae; Reoviridae de mamíferos e Birnaviridae. 5. 0 processo de forma de realização 4, em que o agente infeccioso é selecionado de entre o grupo constituído por: vírus respiratório sincicial; vírus do sarampo; vírus Coxsackie; vírus echo; enterovirus; ortoreovirus; rotavírus; e vírus da doença de Gumboro. 21 6. 0 processo de qualquer reivindicação anterior, em que a linha celular de mamífero é uma linha celular Vero, e em que o agente infeccioso é selecionado de entre o grupo constituído por: metapneumovírus da família Paramyxoviridae; Rubulaviruses da família Paramyxoviridae; Togaviridae; Coronaviridae; rinovírus da família Picornaviridae; vírus da varicela zoster; Polyomaviridae·, circovírus porcinos; picornavirus porcino; bactérias de clamidia; e parvovírus. 7. 0 processo de forma de realização 6, em que o agente infeccioso é selecionado de entre o grupo constituído por: metapneumovírus humano; vírus da papeira; Rubellavirus; coronavírus SARS; estirpes M de rinovírus; vírus de polioma SV-40; vírus de polioma BK; vírus de polioma JC; vírus da doença vesicular suína; vírus Teschen-Talfan; C. trachomatis; C.pneumoniae; C.psittaci; parvovírus canino; e parvovírus porcino. 8. 0 processo de qualquer reivindicação anterior, que compreende ainda um passo em que a vacina e/ou a cultura é testada para a presença de um agente patogénico selecionado do grupo consistindo em: vírus da parainfluenza; Herpesviridae; Adenoviridae; Micoplasma; circovírus aviário; e Reoviridae aviária. 9. Um processo para a preparação de uma vacina antigripal a partir do vírus da gripe, que foi cultivado em cultura de uma primeira linha de célula de mamífero, compreendendo um passo em que a vacina e/ou a cultura é testada para a presença de um agente infeccioso que se pode desenvolver na referida primeira linha celular, mas que não se desenvolve numa segunda linha celular de mamífero. 22 10. Um processo para a preparação de uma vacina antigripal a partir do virus da gripe, que foi cultivado em cultura de uma primeira linha de célula de mamifero, compreendendo um passo em que a vacina e/ou a cultura é tratada para remover e/ou inativar um agente infeccioso que se desenvolver na referida primeira linha de células, mas não se desenvolve numa segunda linha de célula de mamifero. 11. 0 processo da forma de realização 9 ou da forma de realização 10, em que (a) a primeira linha de células de mamifero é selecionada a partir do grupo que consiste em: uma linha celular MDCK, uma linha celular Vero, ou uma linha celular PER.C6; (b) a segunda linha de células de mamifero é selecionada de entre o grupo que consiste em: uma linha celular MDCK, uma celular Vero, ou uma linha celular PER.C6; e (c) a primeira e segunda linhas celulares de mamifero são diferentes. 12. 0 processo de qualquer uma das formas de realização 9-11, em que a primeira linha de células é uma linha celular Vero, e em que o agente infeccioso é selecionado de entre o grupo constituido por: metapneumovírus da familia Paramyxoviridae; Rubulaviruses da familia Paramyxoviridae; Togaviridae; Coronaviridae; rinovirus da familia Picornaviridae; virus da varicela zoster; Polyomaviridae; circovirus porcino; picornavirus porcino; bactérias de clamídia; Parvovírus; e Birnaviridae. 13. O processo da forma de realização 12, em que o agente infeccioso é selecionado de entre o grupo constituido por: metapneumovirus humano; virus da papeira; Rubellavírus; coronavirus SARS; estirpes M de rinovirus; virus do polioma SV-40; virus do polioma BK; virus do polioma JC; virus da doença vesicular suina; virus Teschen-Talfan; 23 C.trachomatis; C.pneumoniae; C.psittaci; parvovírus canino; parvovírus porcino; e virus da doença de Gumboro. 14. 0 processo de qualquer uma das formas de realização 9-13, compreendendo ainda uma etapa em que a vacina e/ou a cultura é testada para a presença de um agente patogénico selecionado do grupo consistindo em: virus da parainfluenza; Herpesviridae; Adenoviridae; circovirus aviário; Micoplasma; e Reoviridae aviária. 15. 0 processo da forma de realização 2 ou da forma de realização 10, que compreende um passo adicional, em que, após a referida remoção e/ou inativação, a vacina e/ou a cultura é testada para a presença do referido agente infeccioso. 16. Um processo para a preparação de uma vacina antigripal a partir do virus da gripe, que foi cultivado em cultura de uma linha celular de mamífero ou de ovos de galinhas, que compreende um passo em que a vacina e/ou a cultura é testada para a presença de um agente patogénico escolhido do grupo que consiste em: vírus da parainfluenza; Herpesviridae; Adenoviridae; Micoplasma; circovirus aviário; Reoviridae aviária; e Birnaviridae. 17. O processo da forma de realização 16, em que o agente patogénico é selecionado entre o grupo constituído por: PIV-1, PIV-2; PIV-3; vírus do herpes simples 1; vírus do herpes simples 2; adenovírus humano; adenovirus de símios; ortoreovírus; e vírus da doença de Gumboro. 18. O processo de qualquer reivindicação precedente, em que a cultura é testada através da detecção imunoquímica e/ou a detecção de ácido nucleico. 24 19. 0 processo da forma de realização 18, em que a detecção é através de ELISA e/ou PCR (incluindo RT-PCR). 20. Uma vacina antigripal, que foi cultivada em cultura de uma linha celular de mamifero, em que a vacina tenha sido confirmada como livre da presença de um agente infeccioso que se pode desenvolver na referida linha celular mas que não se desenvolve em ovos de galinha embrionados. 21. Uma vacina antigripal, que foi cultivada em cultura de uma primeira linha de célula de mamifero, em que a vacina tenha sido confirmada como livre da presença de um agente infeccioso que se pode desenvolver na referida primeira linha de células, mas que não se desenvolve numa segunda linha de células de mamifero. 22. A vacina da forma de realização 18 ou da forma de realização 19, em que a vacina foi cultivada numa cultura de uma linha celular MDCK, de uma linha celular Vero, ou de uma linha celular PER.C6. 23. Uma vacina antigripale, em que o reovirus de mamifero não é detectável por RT-PCR. 24. A vacina da forma de realização 23, a qual está livre de ovalbumina e a partir do ADN de frango. 25. Uma vacina antigripal obtida ou obtenivel pelo processo de qualquer uma das formas de realização 1 a 17. 26. A vacina de qualquer uma das formas de realização 20 a 25, que é uma vacina de virus vivo. 27. A vacina de qualquer uma das formas de realização 20 a 25, que é uma vacina de virus inativado. 25 28. A vacina da forma de realização 27, que é uma vacina de virus completo, uma vacina de virus fraccionado, ou uma vacina de subunidade virai. 29. A vacina de qualquer uma das formas de realização 20 a 28, que é uma vacina antigripal trivalente. 30. A vacina de qualquer uma das formas de realização 20 a 29, que inclui uma estirpe do virus da gripe pandémica. 31. A vacina da forma de realização 30, que inclui uma estirpe do virus da gripe H5 ou H7. 32. A vacina de qualquer uma das formas de realização 20 a 31, que é para administração a um paciente por injeção, por via intranasal, por via oral, através de uma via intradérmica, por via transcutânea, ou por via transdérmica. 33. A vacina de qualquer uma das formas de realização 20- 32, o que é para imunização pediátrica. 34. A vacina de qualquer uma das formas de realização 20 a 33, que inclui 1-20 pg de hemaglutinina do virus da gripe por estirpe. 35. A vacina de qualquer uma das formas de realização 20 a 34, que inclui um adjuvante. MODOS DE REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO As células MDCK (exemplo de referência) O inventor tem uma vasta experiência no desenvolvimento do virus da gripe em células MDCK em cultura sem soro para a preparação de vacinas. 0 autor comprovou que as células são também hospedeiros adequados para outros agentes patogénicos, e portanto, ensaiou-se a capacidade de outros 26 agentes patogénicos para serem desenvolvidos nas mesmas condições (especificamente, cultura de MDCK 33016, depositada como DSM ACC2219, em meio sem soro, como descrito na referência 2).

Quando se ensaia para determinar a replicação do virus ativo ou crescimento em células MDCK, os ensaios para os virus sinciciais respiratórios RSV-A2 e RSV-B foram negativos. Detectaram-se estirpes de virus parainfluenza PI-3 e SV-5. Os ensaios para coronavirus humano 229E e SARS foram negativos, assim como os ensaios para o virus da polio I, virus ECHO 6, virus coxsackie A16 e virus coxsackie B3. Os ensaios de rinovirus Tipo Ib, 37 e NL.9501841 foram negativos. Os ensaios para reovirus Reo3 foram positivos, assim como os ensaios para o virus do herpes simples HSV-1. Os ensaios para adenovirus humano 1, 5 e 6 foram negativos. Os ensaios para SV-40 foram negativos, e os titulos de inoculo mantiveram-se estáveis durante 14 dias. Os ensaios de parvovirus canino e do virus diminuto do ratinho foram negativos, assim como o do virus do sarcoma de Rous. O ensaio de Mycoplasma Hyorhinis foi negativo. O ensaio de Chlamydia trachomatis foi negativo, embora não possa ser excluído um nível muito baixo de desenvolvimento durante 3-5 dias após a infecção. A investigação adicional revelou que as células MDCK podem suportar o desenvolvimento do vírus da estomatite vesicular (Indiana), vírus vaccinia, vírus coxsackie B5; reovirus 2, adenovirus humano tipos 4 e 5, exantema vesicular de vírus porcino e vírus da hepatite canina infecciosa [58]. 27

De entre os vírus que poderiam ser desenvolvidos em células MDCK, vírus de parainfluenza, o vírus do herpes simples e os adenovírus, podem ser desenvolvidos também em ovos de galinha embrionados. Pelo contrário, os reovírus humanos (e reovírus de outros mamíferos) não se desenvolvem facilmente em ovos. Se for usado MDCK como um sistema de cultura celular para a produção de vírus da gripe, então, o ensaio de controlo de qualidade deveria comprovar a contaminação por reovírus humano. 0 inventor estima que as concentrações de reovírus poderiam ser incrementadas em 5 log ou mais durante passagens repetidas em culturas de suspensão MDCK, enquanto as concentrações de um vírus, tal como o adenovírus diminuiriam em 6 a 10 log. As concentrações do vírus herpes simples deveriam igualmente ser comprovadas, já que é possível o desenvolvimento de HSV em pelo menos oito log. Similarmente, observou-se que o desenvolvimento de PIV-3 em 8 log depois de 1 semana de cultura. Células Vero

Após os trabalhos de ensaio em células MDCK, investigou-se a replicação de agentes patogénicos em células Vero. As células Vero servem de suporte para o desenvolvimento de agentes patogénicos, tais como: neumovírus, tais como RSV-A e RSV-B; metaneumovírus humano (HMPV); morbillivírus, tal como o vírus do sarampo; paramixovírus, tais como o vírus da papeira e vírus parainfluenza; vírus da rubéola; coronavírus humano e aviário; picornavírus, tais como enterovírus, vírus ECHO e vírus coxsackie e vírus SVDV e Teschen-Talfan porcinos; reovírus de mamífero e aviário: vírus do herpes, tais como o HSV-1 e HSV-2; adenovírus do símio e humano; vírus zoster da varicela (VZV); vírus de polioma, tais como JC, BK e SV-40; birnavírus, tal como 28 gumborovírus ; Chlamydia. circovírus porcino; parvovírus canino e

De entre estes agentes patogénicos, os seguintes não se desenvolvem em ovos de galinha e, portanto, existem novos riscos de contaminação das vacinas antigripais quando se usam células Vero como substrato: RSV; HMPV; virus do sarampo; virus da rubéola; coronavirus humanos, enterovírus; reovírus; VZV; virus de polioma; picornavírus porcinos; parvovirus e circovirus. Muitos destes agentes patogénicos não se desenvolvem em células MDCK, o que mostra que MDCK é um substrato mais seguro para a produção de vacina antigripal. Os virus emergentes, tais como o coronavirus SARS desenvolvem-se em células Vero, mas não em células MDCK. De maneira similar, VZV desenvolve-se em células Vero, mas não em ovos de galinha ou em células MDCK. A vacinação com uma vacina antigripal obtida a partir de células Vero que tenham sido contaminadas inadvertidamente com este coronavirus ou com VZV poderia levar a um surto iatrogénico de SARS e/ou varicela, o que seria desastroso, tanto para a população como para a reputação das vacinas. No entanto, uma vez identificados estes riscos podem ser estabelecidos os mecanismos de controlo de qualidade apropriados.

Além das células Vero, as células PER.C6 suportam o desenvolvimento de adenovirus [59,60]. Com base nas caracteristicas virais conhecidas, pode ser esperado também que as células PER.C6 suportem o desenvolvimento de, pelo menos, virus parainfluenza e de reovirus. 29

Será entendido que a invenção é descrita acima a titulo de exemplo apenas e modificações podem ser feitas mantendo-se dentro do âmbito da invenção.

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Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a preparação de uma vacina de antigénio numa cultura de uma linha celular Vero, que compreende um passo de teste para um agente patogénico selecionado do grupo consistindo em parvovirus canino, virus de polioma JC e circovirus.
2. Processo da reivindicação 1, em que o agente patogénico é circovirus porcino.
3. Processo de qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, em que é testada a vacina e/ou semente de virus e/ou substrato da célula e/ou meio de cultura.
4. Processo de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o processo é realizado no material usado para criar a cultura virai; na cultura virai; ou em material extraido e derivado da cultura virai.
5. Processo de qualquer reivindicação anterior, que compreende um passo no qual a semente de virus e/ou a vacina do antigénio e/ou a cultura é testada para a presença de um agente patogénico selecionado do grupo consistindo em: virus parainfluenza; Herpesviridae; Adenoviridae; Micoplasma; circovirus aviário; e Reoviridae aviária.
6. Processo de qualquer reivindicação precedente, em que a cultura é testada através da detecção imunoquimica e/ou a detecção de ácido nucleico.
7. Processo da reivindicação 6, em que a detecção é através de ELISA e/ou PCR (incluindo RT-PCR). 1
8. Processo de qualquer reivindicação anterior, em que o teste é realizado numa das seguintes fases: infecção virai, fases de crescimento, colheita virai, processamento virai, separação, extração da proteína de superfície, formulação da vacina, embalagem da vacina.
9. Processo de qualquer reivindicação anterior, em que o teste é realizado como uma parte do controlo de qualidade normal.
10. Processo de qualquer reivindicação precedente, em que o antigénio da vacina é o vírus da gripe.
11. Processo da reivindicação 10, em que o antigénio da vacina é o vírus da gripe atenuado, um vírus da gripe sensível à temperatura ou um vírus da gripe adaptado ao f rio.
12. Processo da reivindicação 10 ou reivindicação 11, que compreende ainda um passo de mistura de antigénios a partir de mais do que uma estirpe de gripe. 2