DE69838383T2

DE69838383T2 - Kulturmedium mit sojabohnenextrakt als aminosäuren-quelle und ohne proteinkomplexe tierischen ursprungs

Info

Publication number: DE69838383T2
Application number: DE69838383T
Authority: DE
Inventors: Roberto Olivieri; Fabio Sabbatini; Maria Kontakou; Lucia Tagliaferri; Antonella Giglioli; Rino Rappuoli
Original assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics SRL
Current assignee: GSK Vaccines SRL
Priority date: 1997-05-28
Filing date: 1998-05-28
Publication date: 2008-06-05
Anticipated expiration: 2018-05-29
Also published as: DE69838383D1; PT1849860E; ATE488574T1; EP0983342A1; EP1849860A2; JP4173560B2; CY1111178T1; DE69842010D1; PT983342E; EP2267113A1; ES2293681T3; EP2199382A3; JP2012005495A; ATE372376T1; EP0983342B1; EP2199382A2; CY1107812T1; JP2008200047A; AU7545298A; EP1849860A3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Mediums zur Kultivierung von pathogenen Bakterien, die Gewinnung von immunogenen Faktoren aus den kultivierten Bakterien und die Herstellung von Impfstoffen unter Verwendung der immunogenen Faktoren.
Bakterielle Impfstoffe werden hergestellt, indem pathogene Bakterien in einem Medium kultiviert werden, immunogene Faktoren isoliert werden und, basierend auf den isolierten immunogenen Faktoren, Impfstoffe hergestellt werden. Solche Verfahren werden in Bacterial Vaccines, 1984, Hrsg. Rene Germanier Academic Press und Bacterial Vaccines in Advances in Biotechnology Processes, Bd. 13, 1990, Hrsg. A. Mizrahi, Wiley-Liss beschrieben. In herkömmlichen Verfahren werden die pathogenen Bakterien in Medien kultiviert, die proteinartiges Material tierischen Ursprungs enthalten. Diese Bestandteile werden in dem Glauben verwendet, dass einige Wachstumsfaktoren, die für das Wachstum von pathogenen Bakterien essentiell sind, nur in den Bestandteilen tierischen Ursprungs wie etwa Blut, Hirn-Herz-Infusion, Fleisch usw. vorkommen. Zum Beispiel wird C. tetani in Medien gezüchtet, die eine Herz-Infusion und ein enzymatisches Spaltprodukt von Kasein enthalten; C. diphtheriae erfordert eine Rindfleisch-Infusion; H. pylori wird in Medien gezüchtet, die Peptamin und Trypton enthalten; und Haemophilus influenzae wird in Medien gezüchtet, die Proteose-Peptone enthalten. Die Berichte der Weltgesundheitsorganisation Seriennummer 800 (1990) und 814 (1991) geben an, dass zum Züchten von Haemophilus influenza, Corynebacterium diphtheriae, Clostridium tetani und Bordetella Pertussis Medien erforderlich sind, die Bestandteile tierischen Ursprungs umfassen.
Das Erfordernis von proteinartigem Material tierischen Ursprungs in den Medien gibt Anlass, sich über eine mögliche Verunreinigung der Medien Gedanken zu machen. Besonders der Gedanke, dass die Medien mit dem Erreger der spongiformen Enzephalopathie des Rindes (BSE) oder anderen infektiösen oder Schaden zufügenden Agenzien verunreinigt sein können, beschränkt den Nutzen aller beliebigen Faktoren, die aus solchen Kulturen stammen, besonders bei therapeutischen Anwendungen.
Überraschend wurde herausgefunden, dass proteinartige Materialien nicht-tierischen Ursprungs in der Lage sind, das Wachstum pathogener Bakterien zu unterstützen und die Produktion von immunogenen Faktoren durch die Bakterien zu ermöglichen.
WO 94/09115 offenbart ein Kulturmedium, das keine komplexen tierischen Bestandteile enthält, für die Produktion von Streptococcus pneumoniae und die Isolierung von pneumococcalem Polysaccharid der Kapsel, das zur Herstellung von Impfstoffen verwendet werden kann. Statt des proteinartigen Materials tierischer Herkunft werden Hefeextrakt und Soja-Pepton verwendet.
EP-A-0540897 offenbart ein Verfahren zur Kultivierung von Heliobacter pylori in einem Medium, in dem Blut oder seine Derivate durch Cyclodextrine, Methylcellulose oder Gemische davon ersetzt sind. Von Tieren stammende proteinartige Materialien wie etwa Trypton und Peptamin sind jedoch ebenfalls enthalten.
In US-A-5,494,808 wird von einem synthetischen Medium zur Fermentierung von Neisseria meningitidis berichtet.
Kulturmedien für Haemophilus influenzae werden von Pienta, P. et al. (ATCC "Bacteria and Bacteriophages" 19. Auflage, 1996, Rockville, US ISBN: 0-930009-59-2) und Herriott, R.M. et al. ("Defined medium for growth of Haemophilus-influenze", J. Bacteriol., Bd. 101, Nr. 2, Feb. 1970, 513–516, US) beschrieben.
In der Patentanmeldung DD 294 502-A wird ein Verfahren zur Herstellung von Soja-Hydrolysaten und die Verwendung der Soja-Hydrolysate bei der Kultivierung von Mikroorganismen für Fimbriae offenbart. Das Soja-Hydrolysat wird hergestellt, indem ein Sojamehl enthaltendes Kulturmedium mit Streptomyces-Stämmen kultiviert wird. Das Soja-Hydrolysat wird auf Grund seines hohen Prozentsatzes an vorkommenden Polysacchariden als eine Kohlenstoffquelle verwendet und enthält im Trockengewicht weniger als 20% Protein.
Die Verwendung von proteinartigem Material aus nicht-tierischer Herkunft wie etwa Proteinen aus Sojabohnen, Baumwollsamen, Kartoffeln usw., als ein Bestandteil des Mediums für die Kultivierung von pathogenen Bakterien beseitigt vollständig das Risiko, dass eine Verunreinigung tierischen Ursprungs wie etwa BSE bei beliebigen anschließenden therapeutischen oder prophylaktischen Anwendungen auf Menschen übertragen wird.
Ein weiterer Vorteil, der mit der Verwendung von proteinartigem Material pflanzlicher Herkunft verbunden ist, ist die Senkung der Herstellungskosten für die Materialien und die erhöhte Konsistenz der Materialien (proteinartiges Material nicht tierischer Herkunft ist in seiner Zusammensetzung einheitlicher als Materialien tierischer Herkunft).
Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren, wie in Anspruch 1 beschrieben.
Jedes beliebige Standardmedium zur Kultivierung von Bakterien kann als Basis für das Medium verwendet werden, vorausgesetzt dass das Medium kein proteinartiges Material tierischer Herkunft beinhaltet.
Bevorzugt umfasst das Medium eine Kohlenstoff- und eine Energiequelle, eine Stickstoffquelle, essentielle Salze und optional ein selektierendes Agens wie etwa ein Antibiotikum zur Selektion der zu kultivierenden Mikroorganismen.
Das Medium kann ein festes oder ein flüssiges Medium sein. Beispiele für flüssige Standardmedien, die die Basis des Mediums bilden können, umschließen Brucella-Brühe (ohne Trypton und Peptamin), Watson-Medium (ohne Kasaminosäuren), Mueller-Miller-Medium (ohne Herz-Infusion und Kasein-Hydrolysat), CL-Medium (ohne Kasaminosäuren) und Franz A-Medium. Feste Standard-Medien können aus jedem beliebigen der flüssigen Medien durch die Zugabe eines festigenden Agens wie etwa Agar hergestellt werden.
Der hierin verwendete Ausdruck „Kultivieren" betrifft die Haltung und bevorzugt das Züchten von Bakterien. Bakterielles Wachstum ist hierin als ein Anwachsen der bakteriellen Biomasse definiert.
Der hierin verwendete Ausdruck „pathogene Bakterien" betrifft alle beliebigen Bakterien, die an der Pathogenese einer Krankheit beteiligt sind. Bevorzugte pathogene Bakterien schließen Helicobacter pylori, Haemophilus influenzae, Corynebacterium diphtheriae und Neisseria meningitidis, Bordetella Pertussis und Clostridium tetani ein.
Der hierin verwendete Ausdruck "immunogener Faktor" betrifft jeden beliebigen Faktor, der in der Lage ist, das Immunsystem eines Menschen oder eines Tieres zu stimulieren. Solche immunogenen Faktoren umschließen antigene Proteine und besonders Virulenz-Faktoren und Fragmente hiervon. Virulenz-Faktoren sind als mit der Virulenz eines Bakteriums verbunden definiert und umschließen solche Faktoren wie das von Helicobacter pylori produzierte Vakuolen bildende Cytotoxin VacA. Andere virulente Faktoren werden von Rappuoli, R. et al., European Journal of Gastroenterology and Hepatology of Helicobacter pylori infection. Proceedings of an interdisciplinary meeting (Genf, 18.–19. Jun., 1993) J.J. Misiewicz, Hrsg. (CS Current Science), S. S76–S78, beschrieben. Der immunogene Faktor kann genetisch detoxifiziert oder mit einem toxoidierenden Verfahren behandelt worden sein. Verfahren zur genetischen Detoxifizierung und Toxoidierung immunogener Faktoren sind Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt und umschließen jene, die von Rappuoli, R., Vaccine, 12, 579–581, (1994) beschrieben werden.
Der hierin verwendete Ausdruck "proteinartiges Material" betrifft Proteine und Abbauprodukte von Proteinen einschließlich freier Aminosäuren. Bevorzugt ist das proteinartige Material ein Protein-Hydrolysat.
Hierin verwendete proteinartige Materialien nicht tierischen Ursprungs betreffen proteinartige Materialien, die aus nicht-Säuger-Quellen stammen, wie etwa aus Pflanzen, Vögeln, Fisch, Hefen, Pilzen, Algen und Mikroorganismen. Das hierin verwendete proteinartige Material nicht tierischen Ursprungs ist eine aus Sojabohnen stammende Proteinzusammensetzung.
Beispiele für aus Sojabohnen stammende Proteinzusammensetzungen sind Hysoy (Quest), Amisoy (Quest), N-Z-Soy (Quest) und Soytone (Difco).
Aus Sojabohnen stammende Proteinzusammensetzungen können durch enzymatische Spaltung von Sojabohnenmehl oder Soja-Isolat unter Verwendung von Standard-Enzymen wie Papain hergestellt werden. N-Z-Soy ist zum Beispiel eine lösliche Proteinzusammensetzung, die durch die enzymatische Spaltung eines Soja-Isolates hergestellt wurde, und Hysoy ist ein Papain-Abbauprodukt von Sojabohnenmehl. Aus Sojabohnen stammende Proteinzusammensetzungen können auch durch saure Hydrolyse eines Soja-Isolates gewonnen werden. Zum Beispiel ist Amysoy eine Quelle von Aminosäuren und Peptiden, die durch saure Hydrolyse eines Soja-Isolates hergestellt worden ist.
Proteinartiges Material nicht tierischen Ursprungs in dem Medium der vorliegenden Erfindung kann zwei oder mehrere verschiedene proteinartige Materialien nicht tierischen Ursprungs umfassen, ein Gemisch aus Proteinzusammensetzungen, die von Sojabohnen stammen, wie etwa Hysoy, Amisoy, N-Z-Soy und Soytone.
Proteinartige Materialien tierischen Ursprungs umschließen Proteinzusammensetzungen wie etwa fötales Kälberserum (FKS), Rinderserumalbumin (BSA), Proteose-Peptone, Kasaminosäuren, Trypton, Peptamin und Kasein-Hydrolysate.
Das Medium umfasst ein proteinartiges Material nicht tierischen Ursprungs zu mindestens 20% vom Trockengewicht, mehr bevorzugt ein proteinartiges Material nicht tierischen Ursprungs zu mindestens 30% vom Trockengewicht und am meisten bevorzugt ein proteinartiges Material nicht tierischen Ursprungs zu mindestens 50% vom Trockengewicht.
Überraschend ist herausgefunden worden, dass die Kultivierung von pathogenen Bakterien unter Verwendung des hierin beschriebenen Mediums im Vergleich zur Kultivierung der pathogenen Bakterien in einem Medium, das proteinartiges Material tierischen Ursprungs enthält, zu gesteigertem Wachstum der Bakterien und einem gesteigerten Ertrag immunogener Faktoren führt.
Ein Medium für die Kultivierung von pathogenen Bakterien zur Gewinnung eines immunogenen Faktors kann hergestellt werden, indem einem Standardmedium zur Kultivierung von Bakterien, das kein proteinartiges Material tierischen Ursprungs enthält, ausreichend proteinartiges Material nicht tierischen Ursprungs zugegeben wird, so dass das Medium zur Kultivierung von pathogenen Bakterien mindestens 20% vom Trockengewicht proteinartiges Material nicht tierischen Ursprungs umfasst und kein proteinartiges Material tierischen Ursprungs enthält.
Beispiele für flüssige Standardmedien umschließen Brucella-Brühe (ohne Trypton und Peptamin), Watson-Medium (ohne Kasaminosäuren), Mueller-Miller-Medium (ohne Herz-Infusion und Kasein-Hydrolysat), CL-Medium (ohne Kasaminosäuren) und Franz-A-Medium. Feste Standard-Kulturmedien können aus einem beliebigen der flüssigen Kulturmedien durch die Zugabe eines festigenden Agens wie etwa Agar hergestellt werden.
Die pathogene Bakterienart ist Haemophilus influenzae.
Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren zur Herstellung eines immunogenen Faktors einer pathogenen Bakterienart und umfasst die Schritte der Kultivierung der Bakterien in dem Medium und optional die Reinigung des immunogenen Faktors aus dem Medium.
Bevorzugt werden die pathogenen Bakterien in dem Medium der vorliegenden Erfindung über mindestens 6 Stunden, mehr bevorzugt über mindestens 36 Stunden und am meisten bevorzugt über mindestens 72 Stunden unter geeigneten Bedingungen für die Herstellung des immunogenen Faktors kultiviert.
Geeignete Kulturbedingungen für die Herstellung des immunogenen Faktors, einschließlich der Dauer der Kultur, werden in Abhängigkeit von den zu kultivierenden Bakterien variieren. Fachleute auf dem Gebiet können die Kulturbedingungen, die für die Herstellung des immunogenen Faktors erforderlich sind, leicht anhand der nachstehenden Standard-Protokolle wie etwa jener, die in der Reihe Methodes in Microbiology, Academic Press Inc., beschrieben werden, und, falls notwendig, durch Durchführung einer Reihe von Standard-Experimenten zur Bestimmung geeigneter Kulturbedingungen bestimmen.
Der immunogene Faktor kann unter Verwendung einer Reihe von Standard-Techniken, einschließlich jener, die von Manetti, R. et al., Infect. Immun., 63, 4476–4480, (1995) beschrieben wird, isoliert werden.
Die vorliegende Erfindung liefert auch ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes, das die Herstellung eines immunogenen Faktors eines pathogenen Bakteriums durch das Verfahren nach Anspruch 1 und das Verbinden dieses optional toxoidierten Faktors mit einem pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff umfasst. Geeignete Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes werden von Rappuoli, R., New and improved vaccines against Diphtheria and Tetanus. (1990), 251–268, New Generation of Vaccines, Hrsg. G.C. Woodrow, M.M Levine, Marcel Dekker Inc. New York, beschrieben.
Bei ihrer Verwendung werden die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellten Impfstoffe die Zugabe von Adjuvantien erforderlich machen. Geeignete Adjuvantien werden von Gupta, R. K. et al., Vaccine, 13, 1263–1276, (1995) beschrieben.
Die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellten Impfstoffe können verwendet werden, um ein Individuum gegen eine bakterielle Infektion zu impfen. Bevorzugte bakterielle Infektionen, gegen die geimpft werden kann, schließen Typ-B-Gastritis, bakterielle Meningitiden, Diphtherie, Tetanus und Keuchhusten ein.
Die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellten Impfstoffe können als ein Arzneimittel bereitgestellt werden, die den Impfstoff der vorliegenden Erfindung als Gemisch mit einem pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff und Adjuvantien, wie vorstehend genannt, umfasst.
Die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellten Impfstoffe können über den oralen oder parenteralen Weg verabreicht werden, einschließlich intravenöser, intramuskulärer, intraperitonealer, subkuaner, transdermaler Verabreichung, Verabreichung über die Atemwege (Aerosol), rektaler und lokaler Verabreichung.
Zur oralen Verabreichung werden die Verbindungen der Erfindung allgemein in Form von Tabletten oder Kapseln oder als eine wässrige Lösung oder Suspension geliefert.
Tabletten für die orale Verwendung können aktive Inhaltstoffe (den Impfstoff-Bestandteil) gemischt mit pharmazeutisch verträglichen Excipienten wie etwa inerten Verdünnungsmitteln, disintegrierenden Agenzien, bindenden Agenzien, Gleitmitteln, Süßstoffen, Geruchstoffen, Farbstoffen und Konservierungsmitteln einschließen. Geeignete Verdünnungsmittel umschließen Natrium- und Calciumkarbonat, Natrium- und Calciumphosphat und Lactose, während Maisstärke und Algininsäure geeignete disintegrierende Agenzien sind. Bindungsagenzien können Stärke und andere gut bekannte Agenzien einschließen, während das Gleitmittel, falls vorhanden, allgemein Magnesiumstearat, Stearinsäure oder Talk sein wird. Falls gewünscht, können die Tabletten mit einem Material wie etwa Glycerylmonostearat oder Glyceryldistearat überzogen werden, um die Absorption im Verdauungstrakt zu verzögern.
Kapseln zur oralen Verwendung umschließen harte Kapseln, bei denen der aktive Inhaltstoff mit einem festen Verdünnungsmittel vermischt ist, und weiche Kapseln, in denen der aktive Inhaltstoff mit Wasser oder einem Öl wie etwa Erdnussöl, flüssigem Paraffin oder Olivenöl vermischt ist.
Zur intramuskulären, intraperitonealen, subkutanen und intravenösen Verwendung werden die Verbindungen allgemein in sterilen wässrigen Lösungen oder Suspensionen, die auf einen geeigneten pH-Wert und Isotonie gepuffert sind, bereitgestellt. Geeignete wässrige Trägerstoffe umschließen Ringerlösung und isotonische Natriumchloridlösung. Wässrige Suspensionen im Einklang mit der Erfindung können suspendierende Agenzien wie etwa Cellulose-Derivate, Natrium-Alginat, Polyvinylpyrrolidon und Tragantgummi und ein benetzendes Agens wie etwa Lecithin umfassen. Geeignete Konservierungsmittel für wässrige Lösungen umschließen Ethyl- und n-Propyl-p-hydroxybenzoat.
Die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellten Impfstoffe können auch als Liposomen-Formulierungen dargestellt werden.
Die vorliegende Erfindung wird nun unter Bezug auf die nachstehenden Beispiele und Abbildungen beschrieben, wobei –
1 die Wachstumskinetik von H. pylori CCUG 17874 in BB, die Trypton und Peptamin enthält, darstellt.
2 die Wachstumskinetik von H. pylori CCUG 17874 in vereinfachter BB, die Soytone enthält, darstellt.
3 die Wachstumskinetik von H. pylori CCUG 17874 in vereinfachter BB, die Hysoy enthält, darstellt.
4 eine VacA-Immunblot-Analyse darstellt, worin Linie 1 die Molekulargewichtsmarkierung, Linie 2 VacA-Standard 750 ng, Linie 3 VacA-Standard 500 ng, Linie 4 VacA-Standard 400 ng, Linie 5 VacA-Standard 150 ng, Linie 6 VacA-Standard 20 ng, Linie 7 VacA, das am Schluss der Fermentierung produziert worden ist, Linie 8 VacA, das nach 48 Stunden Kultivierung produziert worden ist, Linie 9 VacA, das nach 30 Stunden Kultivierung produziert worden ist, Linie 10 VacA, das nach 23 Stunden Kultivierung produziert worden ist, darstellt.
5 einen VacA-Immunblot darstellt, in dem Linie 1 die Molekulargewichtsmarkierung, Linie 2 VacA-Standard 750 ng, Linie 3 VacA-Standard 500 ng, Linie 4 VacA-Standard 400 ng, Linie 5 VacA-Standard 150 ng, Linie 6 VacA-Standard 20 ng, Linie 7 VacA, das zum Schluss der Fermentierung produziert worden ist, Linie 8 VacA, das nach 31,5 Stunden Kultivierung produziert worden ist, Linie 9 VacA, das nach 30 Stunden Kultivierung produziert worden ist, Linie 10 VacA, das nach 24 Stunden Kultivierung produziert worden ist, darstellt.
6 einen VacA-Immunblot darstellt, in dem Linie 1 die Molekulargewichtsmarkierung, Linie 2 VacA-Standard 750 ng, Linie 3 VacA-Standard 500 ng, Linie 4 VacA-Standard 400 ng, Linie 5 VacA-Standard 20 ng, Linie 6 VacA, das zum Schluss der Fermentierung produziert worden ist, Linie 7 VacA, das nach 48 Stunden Kultivierung produziert worden ist, Linie 8 VacA, das nach 31 Stunden Kultivierung produziert worden ist, Linie 9 VacA, das nach 24,5 Stunden Kultivierung produziert worden ist, Linie 10 VacA-Standard 150 ng darstellt.
7 die Wachstumskinetik von H. influenzae b in vereinfachtem Franz-Medium, das Soytone oder Proteose-Pepton enthält, darstellt.
8 die Wachstumskinetik von N. meningitidis C in Watson-Medium, das Kasaminosäuren oder Amisoy enthält, darstellt.
Beispiele
Beispiel I
Beispiel I befindet sich nicht innerhalb des Rahmens der Erfindung und wird nur zu Vergleichszwecken eingeschlossen.
Helicobacter pylori ist ein gekrümmtes Gram-negatives mikroaerobisches Bakterium, das vor etwa 10 Jahren isoliert wurde und mit Typ B-Gastritis bei Menschen in Verbindung steht. Dieses Bakterium besiedelt die menschliche Magenschleimhaut und etabliert eine chronische Infektion, die zu Magen- und Duodenum-Geschwüren führen (Glaser, M.J., (1990), J. Infect. Dis., 161, 629–633) und ein Risikofaktor für die Entwicklung von Magenkrebs sein kann (Parsonnet, J. et al., (1991), New Engl. J. Med., 325, 1127–1131).
Auf lange Sicht können die Infektion und die Erkrankungen durch Impfung verhindert und behandelt werden. Zur Zeit sind mehrere Faktoren, die bei bakterieller Adhäsion, Besiedelung und Virulenz eine Rolle spielen, identifiziert worden. Einer der interessantesten Faktoren, der bei der Krankheit eine Rolle spielt, ist das Vakuolen bildende Zytotoxin (VacA), das in mehreren Zelllinien von Säugern massive Vakuolen-Bildung verursacht (Leunk, R.D., (1991), Rev. Infect. Dis., 13 (Erg. 8), S683–S689). Vakuolen sind auch im Magenepithel von Patienten mit chronischer Gastritis beobachtet worden (Tricottet, V. et al., (1986), Ultrastruct. Pathol., 10, 113–117). Für dieses Protein ist gezeigt worden, dass es Geschwürbildung bei Mäusen verursacht (Telford, J.L. et al., (1994), J. Exp. Med., 179, 1653–1658), und es ist ein Kandidat für einen Impfstoff. Das gereinigte Zytotoxin ist ein Protein mit 87–94 kD, das in sehr kleinen Mengen aus bakteriellem Kulturüberstand gereinigt werden kann.
Material und Verfahren
Bakterienstamm.
Es wurde Helicobacter pylori CCUG 17874 (Typ-Stamm, Culture Collection, Universität Göteborg) verwendet.
Medien und Ergänzungen.
Brucella-Brühe (Trypton 10 g l^–1, Peptamin 10 g l^–1, Dextrose 1 g l^–1, Hefeextrakt 2 g l^–1, Natriumchlorid 5 g l^–1 und Natriumbisulfit 0,1 g l^–1). (BB)(Difco), ergänzt mit 2 g l^–1 (2,6 Di-O-methyl)-b-cyclodextrin (CD) (Teijin Lim. Tokyo, Japan) und 20 mg/l Streptomycin, wurde als flüssiges Medium zu Vergleichszwecken verwendet. Hysoy oder Soytone wurden in einer Konzentration von 10 g/l an Stelle von Trypton und Peptamin, die in BB vorliegen, verwendet.
Konservierung
Tiefgefrorene Aliquots zur Impfung wurden aus Flaschenkulturen mit 2 × 10⁸ KbE ml^–1, 1:2 mit einer Lösung verdünnt, die aus 40% Glycerin, 20% fötalem Kälberserum (FKS) (HyClone, Logan, Utah) und 0,4% CD zusammengesetzt war, hergestellt. Die erhaltene Suspension wurde auf 3 ml-Ampullen aufgeteilt und bei –80°C gelagert und als gefrorene Start-Ampullen zum Vergleich mit neu eingefrorenen Ampullen, die durch das Ersetzen von FKS durch 20% Soytone hergestellt worden waren, verwendet.
Wachstum in flüssigem Kulturmedium
Anfängliche Kulturen wurden in Erlenmeyerkolben mit 500 ml Volumen angesetzt, die 100 ml flüssiges Medium enthielten. Die Kulturen wurden mit 3 ml aus den tiefgefrorenen Beständen beimpft und bei 36°C über 36 Stunden unter Schütteln (100 UpM, 2,5 cm Ausschwenkung („throw")) in einer mikroaeroben Umgebung inkubiert. Die Kolben wurden in ein anaerobes Gefäß gestellt, wobei BBL-Campy-Pak-Hüllen (Becton Dickinson) verwendet wurden, um die richtigen Bedingungen zu erzeugen. Diese Kulturen wurden dann verwendet, um Kolben mit 1000 ml Volumen, die 250 ml Medium enthielten, zu beimpfen, und unter den gleichen Bedingungen, wie vorstehend genannt, inkubiert, und sie wurden verwendet, um die Bioreaktoren zu beimpfen.
Kulturbehälter und Wachstumsbedingungen
Batch-Fermentierung wurde in Bioreaktoren mit 7 Litern Fassungsvermögen (MBR Bioreactors AG, 8620 Wetzikon, CH), die 5 l Kulturmedium enthielten, durchgeführt. Alle Kulturen wurden bei 36°C gezüchtet. Die pH-Werte wurden nicht kontrolliert. Die Spannung für gelösten Sauerstoff (DOT) wurde durch ein Zwei-Stufen-Verfahren automatisch auf dem voreingestellten Wert (3%) gehalten. Zunächst wurde die Fließrate für Luft von 0,1 bis zu 0,5 l l^–1 min^–1 erhöht, um dem steigenden O₂-Bedarf der Kultur zu genügen. Wenn weitere Erhöhungen notwendig waren, wurden sie durch die Gabe von reinem O₂ bis zu einem Maximum von 0,4 l l^–1 min¹ erreicht. Während der ersten 12 Wachstumsstunden wurde ein konstanter Durchfluss von N₂ und CO₂ beibehalten, entsprechend 0,2 l l^–1 min^–1 beziehungsweise 0,02 l l^–1 min^–1. Die Bewegungsgeschwindigkeit wurde bei 130 UpM gehalten. Die Rührwerkschwelle war mit zwei Rhuston-Turbinen mit einem Durchmesser von 7 cm ausgestattet, und der Durchmesser des Bioreaktors betrug 17 cm.
Glucose-Futter
Eine 50%ige Glucoselösung wurde zum Zeitpunkt 0 zugegeben, um eine Endkonzentration von 5 g/l zu ergeben. Eine weitere Zugabe von 5 g/l wurde vorgenommen, wenn die OD in einem Bereich von 2–3 lag.
Bestimmung der Biomasse
Das Wachstum wurde durch die optische Dichte bei 590 nm gegen eine Wasser-Leerprobe (Perkin Elmer 35-Spektrophotometer), Lichtweg 1 cm, überwacht. Überprüfungen der Reinheit der Proben wurden durch Gram-Färbung vorgenommen.
Analyse des VacA-Proteins
Zu bestimmten Zeitpunkten während der Fermentation wurden Kulturproben mit 8.300 × g über 10 min zentrifugiert (Biofuge A, Heareus). Die Überstände wurden mit Trichloressigsäure ausgefällt und unter Verwendung eines BioRad Mini Protean II-Apparates einer 9% SDS-Page-Analyse unterzogen. Die Proteine wurden auf Nitrocellulosefilter (Schleicher & Schuell) übertragen und dann über Nacht mit polyclonalen Antiseren, die gegen das VacA-Protein hergestellt worden waren, inkubiert (Telford, J.L. et al., (1994), J. Exp. Med., 179, 1653–1658). Nach der Inkubation mit einem an Meerrettich-Peroxidase konjugierten sekundären Antikörper (Sigma) über 2 Stunden wurden die immunreaktiven Banden durch Anfärbung mit 4-Chlornaphthol sichtbar gemacht.
Ergebnisse
Brucella-Brühe ist ein komplexes Medium, das aus 10 g l^–1 Trypton, 10 g l^–1 Peptamin, 1 g l^–1 Dextrose, 2 g l^–1 Hefeextrakt, 5 g l^–1 Natriumchlorid und 0,1 g l^–1 Natriumbisulfit zusammengesetzt ist. In vielen Artikeln ist beschrieben worden, dass dieses Medium in der Lage ist, das Wachstum von H. pylori nur zu unterstützen, wenn es mit Blut-Derivaten ergänzt wird (Cover, T.L. und Glaser, M.J. (1992), J. Biol. Chem., 267, 10570–10575; Shahamat, M. et al., (1991), J. Clin. Microbiol., 29, 2835–2837; Buck, G.E. und Smith, J.S. (1987), J. Clin. Microbiol., 25, 597–599; und Morgan, D.R. et al., (1987), J. Clin. Microbiol., 25, 2123–2125). Eine wesentliche Vereinfachung für Wachstumsmedien für H. pylori wurde kürzlich erreicht, als entdeckt wurde, dass Cyclodextrine anstatt von Blutderivaten verwendet werden können (Olivieri, R. et al., (1993), J. Clin. Microbiol., 31, 160–162). Das Wachstum von H. pylori unter Verwendung dieses vereinfachten Kulturmediums und Glucose-Futters wird in 1 dargestellt. Glucose-Futter wurden verwendet, um sicherzustellen, dass die Kohlenstoff- und Energiequelle in dem Medium jederzeit vorhanden war.
Wenn H. pylori unter diesen Bedingungen kultiviert wurde, wurde die Produktion von VacA in dem Medium gemessen, wie vorstehend beschrieben. Die Ergebnisse werden in 5 und 6 dargestellt.
Mit Verwendung von Soytone und Hysoy in dem Wachstumsmedium wurden die Ergebnisse erhalten, die in 2 beziehungsweise 3 dargestellt werden. Produktion von VacA wird in 5, mit Verwendung von Soytone, und in 6, mit Verwendung von Hysoy, dargestellt.
Die Ergebnisse zeigen Verbesserungen von Wachstumsmedien und Fermentationsbedingungen für das Wachstum von Helicobacter pylori und bei der Produktion des Vakuolen bildenden Zytotoxins (VacA).
Beispiel II
Haemophilus influenzae sind kleine, nicht frei bewegliche Gram-negative Bakterien, die die Hauptursache für bakterielle Meningitis bei Kindern sind. Diese Mikroorganismen sind in erster Linie invasiv anstatt toxigen. Sie sind Bewohner des Atmungsapparates (sowohl kommensalisch als auch pathogen), und sie besitzen antiphagocytotische Kapseln aus Polysacchariden.
Materialien und Verfahren
Bakterienstamm

Haemophilus influenzae B ATCC 10211

Medien und Ergänzungen

Die Herstellung der Medien beinhaltet die Verwendung von verschiedenen Lösungen wie folgt: Herstellung von "Franz-A-Medium"

Bestandteil	Menge pro Liter
gereinigtes Wasser	800 ml
Glutaminsäure	1,6 g +/– 0,01 g
Na₂HPO₄12 H₂O	5,03 g +/– 0,05 g
KCl	0,892 g +/– 0,008 g
NaCl	6,005 g +/– 0,06 g
NH₄Cl	1,25 g +/– 0,01 g
gereinigtes Wasser	QS zu 1,0 Liter
3 N NaOH	soweit für pH-Wert = 8,2 benötigt

Die vorstehenden Bestandteile werden unter Rühren gelöst. 3 N NaOH wird verwendet, um den pH-Wert der Lösung auf pH = 8,2 einzustellen. Herstellung von ultrafiltriertem Soytone

Bestandteil Menge pro Liter

Soytone 33,3 g +/– 0,03 g

gereinigtes Wasser QS zu 1,0 Liter
Diese Lösung wurde durch einen 30 kD-TFF-Apparat ultrafiltriert. Ultrafiltriertes Proteose-Pepton

Bestandteil Menge pro Liter

Proteose-Pepton 33,3 g +/– 0,03 g

gereinigtes Wasser QS zu 1,0 Liter
Diese Lösung wurde durch einen 30 kD-TFF-Apparat ultrafiltriert. Herstellung von ultrafiltriertem YE

Bestandteil Menge pro Liter

Hefeextrakt 100 g +/– 0,02 g

gereinigtes Wasser QS zu 1,0 Liter
Der verwendete Hefeextrakt war HY YEST, erhältlich bei Quest. Die Lösung wurde durch einen 10 kD-TFF-Apparat ultrafiltriert. 50%ige Glucose-Lösung

Bestandteil Menge pro Liter

Glucose (wasserfrei) 500 g +/– 5 g

gereinigtes Wasser QS zu 1,0 Liter

0,1%ige NAD-Lösung

Bestandteil Menge pro Liter

NAD 1,0 g +/– 0,005 g

Tris 1,21 g +/– 0,01 g

gereinigtes Wasser QS zu 1,0 Liter

HCl 37% soweit für pH-Wert 7,4 +/– 0,2 benötigt

0,4%ige Hemin-Lösung

Bestandteil Menge pro Liter

Hemin 4 g +/– 0,02 g

0,2 N NaOH QS zu 1,0 Liter
Das verwendete Hemin ist bevorzugt chemisch synthetisiert. Chemisch synthetisiertes Hemin kann von Fluka käuflich erworben werden.
550 ml Franz-A-Medium wurden mit 450 ml ultrafiltriertem Soytone oder Proteose-Pepton vermischt, um einen Liter Hib-Basal-Medium zu erhalten, das im Autoklaven bei 121°C über 30 Minuten sterilisiert wurde.
Nach Abkühlung wurden 10 ml/l Glucoselösung, 20 ml/l YE, 2 ml/l NAD-Lösung, sterilisiert durch Filtration, zugegeben (mit den zuvor genannten Zugaben), und das Medium wurde „vollständiges Hib-Medium" genannt.
Wachstum in flüssigen Kulturmedien
Vorgewärmte Schüttelkolben ohne Prallflächen (500/150) wurden jeweils mit 1,0 ml einer Arbeitsstammlösung beimpft. Die Schüttelkolben wurden über 6 Stunden bei 35 +/– 1°C in einen Schüttel-Inkubator (1 Inch Ausschwenken) bei 150 UpM platziert.
Nach 6 Stunden wurde die geeignete Menge aus dem Schüttelkolben in einen Schüttelkolben ohne Prallflächen mit einem Volumen von 2 l, der 0,5 l vorgewärmtes "vollständiges Hib-Medium" enthielt, übertragen. Der Schüttelkolben wurde über 9 Stunden bei 35 +/– 1°C in einen Schüttel-Inkubator (1 Inch Ausschwenken) bei 200 UpM platziert, der Inhalt wurde dann in ein steriles Impfgefäß übertragen, und die Impfflüssigkeit wurde dann in den Fermenter übertragen.
Kulturbehälter und Wachstumsbedingungen
Batch-Fermentationen wurden in Bioreaktoren mit 30 l Fassungsvermögen (MBR Bioreactors AG, 8620 Wetzikon, CH), die 20 l Medium enthielten, durchgeführt.
Die Kulturen wurden bei 35°C und 2 psi Gegendruck gezüchtet. Der pH-Wert wurde mit 3 N NaOH auf 7,3 gehalten. Die anfängliche Bewegungsgeschwindigkeit wurde auf ein Minimum von 150 UpM gesetzt und die Bodenbelüftung auf 10 l/Minute. Der DOT wurde durch Kontrolle der UpM in einem Bereich von 150–400 bei 35% gehalten, dann mit Sauerstoff ergänzt, falls notwendig. Ein Mittel zur Verhinderung von Schaumbildung wurde manuell zugegeben, um das Schäumen zu steuern.
Restkonzentration an Glucose wurde nachgewiesen, und, wenn sie etwa 2 g/l betrug, wurden 0,2 Liter Glucoselösung zugegeben.
Bestimmung der Biomasse
Das Wachstum wurde durch die optische Dichte bei 590 nm gegen eine Wasser-Leerprobe (Perkin Elmer 35-Spektrophotometer), Lichtweg 1 cm, überwacht. Überprüfungen der Reinheit der Proben wurden durch Gram-Färbung vorgenommen.
Analyse von Hib-PS.
Diese Analyse wurde durch Rocket-Immunelektrophorese durchgeführt, wie von Weeke, B., Scand. J. Immunol. 2, 37–46, (1973) beschrieben.
Ergebnisse
Die mit Soytone und mit Proteose-Pepton erhaltenen Wachstumskurven werden in 7 verglichen. Der Erhalt an Hib-PS betrug 600 mg/l und 150 mg/l in dem Kulturmedien, die Soytone beziehungsweise Proteose-Pepton enthielten. Obgleich die Wachstumskurven unter Verwendung der beiden Medien recht ähnlich verlaufen, gibt es bei Verwendung von Soytone einen vierfach höheren Erhalt an Hib-PS. Die Verwendung der Kulturmedien, die proteinartiges Material pflanzlichen Ursprungs enthalten, führt im Vergleich zur Verwendung eines Kulturmediums, das proteinartiges Material tierischen Ursprungs enthält, zu einem erhöhten Erhalt an Polysacchariden wie etwa Hib-PS.
Beispiel III
Beispiel III befindet sich nicht innerhalb des Rahmens der Erfindung und wird nur zu Vergleichszwecken eingeschlossen.
C. diphtheriae sind Gram-positive, stäbchenförmige Mikroorganismen, die sich in Palisaden anordnen. Die Lyse von C. diphtheriae durch einen Bakteriophagen verursacht die Synthese eines wirksamen Toxins, dessen Expression durch die Konzentration an Eisen reguliert wird.
Materialen und Verfahren
Bakterienstamm

C. diphtheriae CN 2000

Kulturmedien und Ergänzungen
Die Herstellung der Medien umfasst die Verwendung verschiedener Lösungen wie folgt: A. Hefeextrakt (YE) und Kasaminosäuren (CAA) ultrafiltriert

Bestandteil Menge g/l

gereinigtes Wasser 800 ml

Hefeextrakt 20 g/l

Kasaminosäuren 10 g/l

gereinigtes Wasser QS zu 1 Liter
Diese Lösung wurde durch einen 10 kD-TFF-Apparat ultrafiltriert und das Permeat dem Enteisenungsbehälter („deferration") zugegeben. A.A Hefeextrakt (YE) und Soytone ultrafiltriert

Bestandteil Menge g/l

gereinigtes Wasser 800 ml

Hefeextrakt 20 g/l

Soytone 10 g/l

gereinigtes Wasser QS zu 1 Liter
Diese Lösung wurde durch einen 10 kD-TFF-Apparat ultrafiltriert und das Permeat dem Enteisenungsbehälter zugegeben. A.B Hefeextrakt ultrafiltriert

Bestandteil Menge g/l

gereinigtes Wasser 800 ml

Hefeextrakt 30 g/l

gereinigtes Wasser QS zu 1 Liter
Diese Lösung wurde durch einen 10 kD-TFF-Apparat ultrafiltriert und das Permeat dem Enteisenungsbehälter zugegeben.
A.1 Enteisenung

Die nachstehenden Bestandteile wurden unter Bewegung in einen Behälter gegeben

Bestandteil	Menge
UF (YE + CAA)-Lösung	1 l
KH₂PO₄	5 g/l
CaCl₂-2H₂O, 50% (Gew./Vol.)	2 ml/l
L-Tryptophan, 1% (Gew./Vol.)	5 ml/l (0,05 g/l)
3 N NaOH	(ausreichend zur Korrektur des pH-Wertes auf 7,4)

UF bedeutet, dass die Lösung ultrafiltriert worden ist.

Unter Bewegung wird die Lösung auf 100°C erhitzt. Die Temperatur von 100°C wird über 1 Minute gehalten, dann wird das Medium auf 37°C abgekühlt. Die Filtration kann beginnen, sobald die Temperatur unter 37°C liegt. Nach der Filtration wird das Medium als "CY-Basismedium mit CAA" bezeichnet.
A.1.A Enteisenung

Die nachstehenden Bestandteile werden unter Bewegung in einen Behälter eingeführt

Bestandteil	Menge
UF (YE + Soytone)-Lösung	1 l
KH₂PO₄	5 g/l
CaCl₂-2H₂O, 50% (Gew./Vol.)	2 ml/l
L-Tryptophan, 1% (Gew./Vol.)	5 ml/l (0,05 g/l)
3 N NaOH	(ausreichend zur Korrektur des pH-Wertes auf 7,4)

Unter Bewegung wird die Lösung auf 100°C erhitzt. Die Temperatur von 100°C wird über 1 Minute gehalten, dann wird das Medium auf 37°C abgekühlt. Die Filtration kann beginnen, sobald die Temperatur unter 37°C liegt. Nach der Filtration wird das Medium als "CY-Basismedium mit Soytone" bezeichnet.
A.1.B Enteisenung

Bestandteil	Menge
UF YE-Lösung	1 l
KH₂PO₄	5 g/l
CaCl₂-2H₂O, 50% (Gew./Vol.)	2 ml/l
L-Tryptophan, 1% (Gew./Vol.)	5 ml/l (0,05 g/l)
3N NaOH	(ausreichend zur Korrektur des pH-Wertes auf 7,4)

Unter Bewegung wird die Lösung auf 100°C erhitzt. Die Temperatur von 100°C wird über 1 Minute gehalten, dann wird das Medium auf 37°C abgekühlt. Die Filtration kann beginnen, sobald die Temperatur unter 37°C liegt. Nach der Filtration wird das Medium als "CY-Basismedium nur mit YE" bezeichnet.
B. Lösung mit "Ergänzungen"

B1) Lösung A

Bestandteil	Menge pro Liter
MgSO₄-7H₂O	225 g
Beta-Alanin	1,15 g
Nikotinsäure	1,15 g
Pimelinsäure	0,075 g
CuSO₄	0,50 g
ZnSO₄-7H₂O	0,40 g
MnCl₂-4H₂O	0,15g
HCl, 37%	30 ml
gereinigtes Wasser	QS zu 1,0 Liter

B2) Lösung B

Bestandteil	Menge pro Liter
gereinigtes Wasser	800 ml
L-Cystin	200 g
HCl, 37%	200 ml

Die Lösungen werden einzeln jeweils über 10 Minuten vermischt. Nach der Auflösung werden 20 ml von Lösung A und 10 ml von Lösung B gemischt und durch einen 0,2-Mikrometer-Filter filtriert. Die Lösung wird bei 4°C unter Lichtausschluss gelagert.
Sterilisation der Kolben
Sobald die filtrierten Kulturmedien einer Enteisenung unterzogen sind, (A.1 oder A.1.A oder A.1.B) werden sie in die Kolben gegeben. Die Kolben werden über 25 Minuten bei 121°C sterilisiert. Einstellungen nach der Sterilisation

1. Zugabe von "50% Maltose" 30 ml/l

2. Zugabe von "Ergänzungen" 3,0 ml/l

Medien mit vorstehenden Zugaben 1 + 2: "Vollständiges CV-Medium mit CAA oder mit Soytone oder nur mit YE"

Wachstum in flüssigen Medien
Schüttelkolben ohne Prallfläche mit einem Volumen von 500 ml mit jeweils 100 ml Kulturmedium wurden mit 1,0 ml einer Arbeitsstammlösung beimpft.
Die Schüttelkolben wurden über 5 Stunden bei 35 +/– 1°C in einem Schüttel-Inkubator (1 Inch Ausschwenken) bei 100 UpM platziert. Nach 5 Stunden wurde die Bewegung über 43 Stunden auf 250 UpM erhöht.
Der Prozess weist zwei unterscheidbare Phasen auf: 1) Exponentielles Wachstum und 2) Produktionsphase. Der Übergang zwischen den beiden Phasen erfolgt graduell und ist durch Reduktionen von Zellwachstumsrate und Sauerstoffbedarf gekennzeichnet.
Bestimmung der Biomasse
Das Wachstum wurde durch die optische Dichte bei 590 nm gegen eine Wasser-Leerprobe (Perkin Elmer 35-Spektrophotometer), Lichtweg 1 cm, überwacht. Überprüfungen der Reinheit der Proben wurden durch Gram-Färbung vorgenommen.
Ergebnisse
Nach Inkubation über 48 Stunden betrugen die OD und die Lf/ml in den Kolben:

Medium mit CAA. OD = 7,5 Lf/ml = 50

Medium mit Soytone, OD = 7,87 Lf/ml = 60

Medium nur mit YE OD = 8,07 Lf/ml = 60
Beispiel IV
Beispiel IV befindet sich nicht innerhalb des Rahmens der Erfindung und wird nur zu Vergleichszwecken eingeschlossen.
Neisseria meningitidis sind nicht bewegliche Gram-negative Cocci, die in den meisten Fällen in Paaren, gelegentlich aber auch in Tetraden oder Haufen wachsen.
Sie besitzen antiphagocytotische Polysaccharid-Kapseln, worauf die Serogruppen beruhen.
Materialien und Verfahren
Bakterienstamm

Neisseria meningitidis, C11

Medien und Ergänzungen

Die Herstellung der Medien beinhaltet die Verwendung von verschiedenen Lösungen wie folgt: Herstellung von "Franz-Medium" Herstellung von Schwenkkolben-Medium zur Impfung

Bestandteil	Menge pro Liter
gereinigtes Wasser	800 ml
Glutaminsäure	1,6 g
Na₂HPO₄-2H₂O	15,5 g
KCl	0,09 g
NH₄Cl	1,25 g
gereinigtes Wasser	QS zu 1,0 Liter
3 N NaOH	soweit für pH-Wert = 7,6 benötigt

Die vorstehenden Bestandteile werden unter Vermischung gelöst und im Autoklaven bei 121°C 30 Minuten sterilisiert. Nach Abkühlung werden die "50% Glucose" und "Men-C-Ergänzungen" wie nachstehend zugegeben.

"50% Glucose" 10 ml/l +/– 0,3 ml

"Men-C-Fermentationsergänzungen" 20 ml/l +/– 0,3 ml
Mit der Zugabe der Glucose- und Ergänzungs-Lösungen kann das Kulturmedium "vollständiges Franz-Medium" genannt werden.
Herstellung des Fermenters mit 20 l Fassungsvermögen

A. Die nachstehenden Bestandteile müssen in einen Mischbehälter eingeführt und gelöst werden, um 20 l Watson-Basis-Medium mit CAA zu erzeugen:

Bestandteil	Menge pro Liter
gereinigtes Wasser	800 ml
Glutaminsäure	1 g +/– 0,01 g
Na₂HPO₄-2H₂O	3,25 g +/– 0,03 g
KCl	0,09 g +/– 0,001 g
Kasaminosäure	10 g +/– 0,1 g
gereinigtes Wasser	QS zu 1,0 Liter
3 N NaOH	soweit für pH-Wert = 7,6 benötigt

A.A Die nachstehenden Bestandteile müssen in einen Mischbehälter eingeführt und gelöst werden, um 20 l Watson-Basismedium mit Amisoy zu erzeugen:

Bestandteil	Menge pro Liter
gereinigtes Wasser	800 ml
Glutaminsäure	1 g +/– 0,01 g
Na₂HPO₄-2H₂O	3,25 g +/– 0,03 g
KCl	0,09 g +/– 0,001 g
Amisoy	10 g +/– 0,1 g
gereinigtes Wasser	QS zu 1,0 Liter
3 N NaOH	soweit für pH-Wert = 7,6 benötigt

B. Sterilisation des Fermenters
Der Fermenter wird über 25 Minuten bei 121°C sterilisiert. Nach der Sterilisation, werden die folgenden Bedingungen eingestellt: Temperatur 35°C; Belüftung 10 l/Minute; Bewegungsgeschwindigkeit 150 UpM, und Gegendruck 0,2 bar. Nach Abkühlen des Fermenters auf 35°C und Entnahme einer Probe zum Messen des pH-Wertes wird die Kalibrierung der Fermenter-pH-Wert-Sonde vorgenommen und dann der pH-Wert des Mediums auf 7,6 eingestellt. C. Einstellungen nach der Sterilisation

1. Zugabe von "50% Glucose" 10 ml/l

2. Zugabe von "Men-C-Ergänzung" 20 ml/l

Medium mit Zugaben der vorstehenden Punkte 1 + 2: "Vollständiges Watson-Medium"

Bestandteil	Menge pro Liter
Glucose (wasserfrei)	500 g +/– 5 g
gereinigtes Wasser	QS zu 1,0 Liter

Diese Lösung wird im Autoklaven bei 121°C über 30 Minuten sterilisiert.
B. "Men-C-Ergänzungs"-Lösung
B.1 Ultrafiltrierter YE

Bestandteil Menge pro Liter

gereinigtes Wasser QS zu 1,0 Liter

Hefeextrakt 125 g/l
Diese Lösung wird durch einen 10 kD-TFF-Apparat ultrafiltriert. Das Retentat wird verworfen, nachdem das verbliebene Permeat gesammelt worden ist, und das Permeat wird in den Behälter zugegeben, der die Ergänzung enthält. B.2

Bestandteil Menge pro Liter UF YE

MgSO₄-7H₂O 30g +/– 0,5g

L-Cystein-HCl 1,5 g +/– 0,2 g
Die Chemikalien werden zu 1 l UF YE zugegeben, über 10 Minuten vermischt, durch einen 0,2-Mikrometer-Filter filtersterilisiert und in den Fermenter übertragen.
C. 3 N NaOH

3 N NaOH = 12% (Gew./Vol.) NaOH = 120 g/l NaOH

D. Schaumminderer
Der verwendete Schaumminderer ist Dow Corning 1510. Er wird im Autoklaven bei 121°C über 30 Minuten sterilisiert.
Wachstum in flüssigen Kulturmedien
Ein Kolben mit einem Volumen von 500 Millilitern wird mit 1,0 ml einer Arbeitsstammlösung beimpft. Der Schüttelkolben enthält 150 ml vollständiges "Franz-Medium".
Der beimpfte Schüttelkolben wird bei 35 +/– 1°C in einen Schüttel-Inkubator (1 Inch Ausschwenken) bei 150 UpM platziert. Nach 10 Stunden werden dem Kolben unter aseptischen Bedingungen Proben entnommen. Die optische Dichte sollte zwischen 1,3–3,3 (bei 590 nm) liegen; falls dem so ist, werden die vier Schüttelkolben mit einem Volumen von 2 l jeweils mit dem geeigneten Volumen aus dem Schüttelkolben mit 150 ml Volumen beimpft.
Jeder der Schüttelkolben mit dem Volumen von 2 l enthält 0,2 l vorgewärmtes „vollständiges Franz-Medium".
Die Schüttelkolben werden bei 35 +/– 1°C in einen Schüttel-Inkubator (1 Inch Ausschwenken) bei 200 UpM platziert. Nach 10 Stunden wird der Inhalt jedes Schüttelkolbens in das sterile Impfgefäß übertragen und der Fermenter beimpft.
Kulturbehälter und Wachstumsbedingungen
Batch-Fermentationen wurden in Bioreaktoren mit 30 Litern Fassungsvermögen (MBR Bioreactors AG, 8620 Wetzikon, CH), die 20 l Medium enthielten, durchgeführt.
Die Kulturen wurden bei 35°C und 14 × 10³ N/m² (2 psi) Unterdruck gezüchtet. Der pH-Wert wurde mit 3 N NaOH auf 7,3 gehalten. Die anfängliche Bewegungsgeschwindigkeit wurde auf ein Minimum von 150 UpM und die Bodenbelüftung auf 10 l/Minute festgesetzt. Der DOT wurde durch Kontrolle der UpM in einem Bereich von 150–400 bei 35% gehalten, dann bei Bedarf mit Sauerstoff ergänzt. Ein Schaumminderer wurde manuell zugesetzt, um die Schaumbildung zu steuern. Restkonzentration an Glucose wurde nachgewiesen, und wenn sie etwa 2 g/l betrug, wurden 0,2 Liter Glucoselösung zugegeben.
Bestimmung der Biomasse
Das Wachstum wurde durch die optische Dichte bei 590 nm gegen eine Wasser-Leerprobe (Perkin Elmer 35-Spektrophotometer), Lichtweg 1 cm, überwacht. Überprüfungen der Reinheit der Proben wurden durch Gram-Färbung vorgenommen,
Analyse von MenC-PS
Quantitative Messung der Polysaccharide wurde durchgeführt, indem der Gehalt an Sialinsäure im Einklang mit dem in Biochimica and Biophysica Acta (1957), 21, 610, von Lars Svennerholm beschriebenen Verfahren analysiert wurde.
Ergebnisse
Die mit Amisoy und mit Kasaminosäuren erhaltenen Wachstumskurven werden in. 8 verglichen. Der Erhalt an MenC-PS betrug 307 mg/l und 345 mg/l in den Kulturmedien, die Amisoy beziehungsweise Kasaminosäuren enthielten. Wachstumskurven und PS-Produktion sind bei Verwendung dieser beiden Kulturmedien recht ähnlich.
Beispiel V
Beispiel V befindet sich nicht innerhalb des Rahmens der Erfindung und wird nur zu Vergleichszwecken eingeschlossen.
Clostridium tetani ist ein schlanker Bacillus mit einer Länge von 2 μm und 0,3–0,5 μm Breite. Er liegt oft in Form einer ziemlich langen, filamentartigen Zelle vor. Wenn die Sporen gebildet werden, nimmt der Bacillus die charakteristische Trommelschlägel-Form an. Er ist ein beweglicher Organismus, Gram-positiv, aber seine Gram-Färbung kann variabel oder sogar negativ in älteren Kulturen werden. Clostridium tetani ist streng anaerob und produziert zwei Exotoxine. Eines davon, das Tetanospasmin, ist ein Neurotoxin, das für das gesamte klinische Erscheinungsbild der Krankheit verantwortlich ist.
Materialien und Verfahren
Bakterienstamm

Clostridium tetani Harvary Y – VI-3.

Medien
Die Saatkulturen wurden unter Verwendung des nachstehend beschriebenen Mediums, Angaben in g/l, hergestellt:

Bestandteil Menge g/l

N-Z Soy 15.0

Glucose 5,5

Hefeextrakt 5,0

NaCl 2,5

L-Cystein 0,5

Natrium-Thioglycollat 0,5

Agar 0,75

pH-Wert = 7,1

Die Medien für die Produktion wurden als Modifikation des Mueller-Miller-Mediums hergestellt, das in WHO/VSQ/GEN/94 (1990) beschrieben wird. In diesem Medium werden Rinderherz-Infusion und Kaseinlösung verwendet, in dem nachstehend angegebenen modifizierten Medien werden Hysoy und Soytone an Stelle von Rinderherz-Infusion und Kaseinlösung, angegeben in g/l, verwendet:

Bestandteil	Menge g/l
Glucose-H₂O	12,1
NaCl	2,5
Na₂HPO₄-12H₂O	2,5
KH₂PO₄	0,15
MgSO₄-7H₂O	0,15
Aminosäurenlösung	17,5 ml
Vitaminlösung	4,2 ml
NaOH 5M	4,0 ml
FeSO₄-7H₂O (1% Lös.)	4,0 ml
Soja-Derivate	20,0
pH-Wert = 7,3

Im Autoklaven bei 120°C über 20 min sterilisiert. Aminosäuren-Lösung:

Bestandteil

L-Tyrosin 28,51 g/l

Uracil 0,142 g/l

L-Cystein 14,25 g/l

HCl 37% 131,6 ml/l

Vitaminlösung:

Bestandteil

Ca-Pantothenat 238,1 mg/l

Thiamin 59,7 mg/l

Pyridoxin 59,7 mg/l

Riboflavin 59,7 mg/l

Biotin 0,73 mg/l

Ethanol 256,4 ml/
Wachstum in flüssigem Medium
Zwei 25 ml-Röhrchen, die 15 ml Saatmedium enthielten, wurden jeweils mit 0,5 ml Arbeitssaatlösung beimpft und bei 35°C über 29 Stunden in einem Gefäß unter anaeroben Bedingungen inkubiert, wobei ein Gas erzeugender Kit (OXOID) verwendet wurde. Eine zweite Reihe an Röhrchen wurde mit 1,5 ml aus den ersten Röhrchen beimpft und unter den gleichen, vorstehend genannten Bedingungen über 24 Stunden inkubiert.
7 ml aus diesen Kulturen wurden verwendet, um 100 ml-Röhrchen, die 75 ml des gleichen Mediums enthielten, zu beimpfen. Diese Röhrchen wurden unter den gleichen, vorstehend genannten Bedingungen über 24 Stunden inkubiert.
Der gesamte Inhalt dieser Röhrchen wurde verwendet, um 5000 ml-Becher, die 2500 ml des Mediums für die Produktion enthielten, zu beimpfen.
Bestimmung der Biomasse
Das Wachstum wurde durch die optische Dichte bei 590 nm gegen eine Wasser-Leerprobe (Pharmacia-Spektrophotometer), Lichtweg 1 cm, überwacht. Überprüfungen der Reinheit der Proben wurden durch Gram-Färbung vorgenommen.
Ergebnisse
Nach Inkubation über 186 Stunden betrugen die OD und die Lf/ml in den Bechern:

Medium mit Hysoy OD = 1,08 Lf/ml = 60

Medium mit Soytone OD = 0,74 Lf/ml = 60

Medium mit Rinderherz-Infusion OD = 1,236 Lf/ml = 60

und Kaseinlösung
Beispiel VI
Beispiel III befindet sich nicht innerhalb des Rahmens der Erfindung und wird nur zu Vergleichszwecken eingeschlossen.
Bordetella Pertussis ist ein Gram-negativer Coccobacillus mit etwa 0,5 μm Durchmesser und 0,5 bis 2 μm Länge. Seine Nahrungsbedürfnisse sind einfach, und er verwendet keine Zucker. Er ist extrem empfindlich gegenüber Fettsäuren und überlebt ohne Schutzfaktoren kaum.
Materialien und Verfahren
Bakterienstamm

Bordetella Pertussis 9K/129G (Pizza, M., et al. (1989) Science, 246, 497–500).

Medien

Die Kulturen für Aussaat und Produktion wurden unter Verwendung des nachstehend angegebenen CL-Kulturmedium (Imaizumi, A., et al., (1983) Infection and Immunity, 41 (3), 1138–1143), angegeben in g/l, hergestellt:

Bestandteil	Menge g/l
Natrium-L-Glutamat	10,7
L-Prolin	0,24
NaCl	2,5
KH₂PO₄	0,5
KCl	0,2
MgCl₂-6H₂O	0,1
CaCl₂	0,02
Tris	6,1
L-Cystein*	0,04
FeSO₄-7H₂O*	0,01
Niacin*	0,004
Glutathion reduziert*	0,15
Ascorbinsäure*	0,4
Kasaminosäure	10,0
Dimethyl-B-cyclodextrin	1,0

pH-Wert mit HCl auf 7,6 eingestellt.

* sterilisiert durch Filtration und dann unter aseptischen Bedingungen zum autoklavierten Medium zugegeben. Das modifizierte Medium enthielt 10 g/l N-Z-Soy an Stelle von Kasaminosäure.

Wachstum in flüssigen Medien
Schüttelkolben ohne Prallläche mit einem Volumen von 500 ml mit jeweils 100 ml CL-Medium oder dem modifizierten Medium wurden mit 3,0 ml einer Arbeitsstammlösung beimpft.
Die Schüttelkolben wurden bei 35 +/– 1°C über 12 Stunden in einem Schüttel-Inkubator (1-Inch Ausschwenken) bei 100 UpM platziert. Nach 12 Stunden wurde die Bewegungsgeschwindigkeit über weitere 16 Stunden auf 250 UpM erhöht.
Bestimmung der Biomasse
Das Wachstum wurde durch die optische Dichte bei 590 nm gegen eine Wasser-Leerprobe (Pharmacia Spektrophotometer), Lichtweg 1 cm, überwacht. Überprüfungen der Reinheit der Proben wurden durch Gram-Färbung vorgenommen.
Analyse von PT
Diese Analyse wurde unter Verwendung des ELISA-Verfahrens durchgeführt (Nencioni, L., et al. (1990) Infect. Immun., 58, 1306–1315).
Ergebnisse
Nach Inkubation über 28 Stunden betrugen OD und PT (mg/l) in den Kolben:

Medium mit CAA. OD = 2,31 PT = 2,4 mg/l

Medium mit NZ-Soy. OD = 1,99 PT = 2,25 mg/l

Claims

Verfahren zur Herstellung eines immunogenen Faktors eines pathogenen Bakteriums umfassend die Schritte: (a) Züchten von Haemophilus influenzae in einem Medium, das mindestens 20% als Trockengewicht eines proteinartigen Materials nicht-tierischen Ursprungs umfasst, welches kein proteinartiges Material tierischen Ursprungs umfasst, wobei das proteinartige Material nicht-tierischen Ursprungs eine aus Sojabohnen stammende Proteinzusammensetzung ist; (b) gegebenenfalls Reinigung des immunogenen Faktors aus dem Medium.
Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs, umfassend das Gewinnen eines immunogenen Faktors eines pathogenen Bakteriums mit dem Verfahren nach Anspruch 1 und Inkontaktbringen des Faktors, der gegebenenfalls toxoidiert ist, mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.