JPS6092220A - カリクレインの精製法 - Google Patents
カリクレインの精製法Info
- Publication number
- JPS6092220A JPS6092220A JP58200426A JP20042683A JPS6092220A JP S6092220 A JPS6092220 A JP S6092220A JP 58200426 A JP58200426 A JP 58200426A JP 20042683 A JP20042683 A JP 20042683A JP S6092220 A JPS6092220 A JP S6092220A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- kallikrein
- organic solvent
- insoluble
- adsorbed
- eluent
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- Pending
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- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はカリクレインの精製法に関し、更に評しくは不
溶性カリクレイン抗体を用いる′ことによりカリクレイ
ンを簡単な操作で、しかも高収率、高純度に精製する方
法に関する。
溶性カリクレイン抗体を用いる′ことによりカリクレイ
ンを簡単な操作で、しかも高収率、高純度に精製する方
法に関する。
カリクレインは哺乳動物の各種組織で生産される蛋白分
解酵素の一種であ抄、またキニン遊離酵素の一種として
知られている。遊離キニンには末梢血管拡張作用があり
、従ってカリクレインは循猿器系疾患の治療用に使用さ
れている。カリクレインは通常咄乳動物臓器から抽出さ
れるので、その粗抽出物中には多くの異種蛋白質が含ま
れており、この抽出物を医薬品として使用するＫは更に
十分な精製を行う必要がある。
解酵素の一種であ抄、またキニン遊離酵素の一種として
知られている。遊離キニンには末梢血管拡張作用があり
、従ってカリクレインは循猿器系疾患の治療用に使用さ
れている。カリクレインは通常咄乳動物臓器から抽出さ
れるので、その粗抽出物中には多くの異種蛋白質が含ま
れており、この抽出物を医薬品として使用するＫは更に
十分な精製を行う必要がある。
カリクレインの精製法としては、従来硫安塩析法、溶媒
沈澱法（特開昭５２−１０２４９５号）、イオン交換ク
ロマトグラフィー（特開１１８５３−６２８９３号、昭
５４−２２７０号、昭５４−１４６４７号）、電気泳動
法（％開昭４９−４１５８３号）、阻害剤や吸着剤等を
オロ用したアフィニティークロマトグラフィー（％Ｈｚ
５４−６２３１２号、昭５６−１１７７９１号、昭５７
−５０９２４号、昭５７−１４６５８１号、餡５８−５
５０４３号）勢が知られている。しかし、これらの方法
はカリクレインに％異的な精製法でないために交雑蛋白
との分離が不十分であり、高純度のカリクレインを高収
率で得る方法としては未だ満足のゆくものではなかった
。
沈澱法（特開昭５２−１０２４９５号）、イオン交換ク
ロマトグラフィー（特開１１８５３−６２８９３号、昭
５４−２２７０号、昭５４−１４６４７号）、電気泳動
法（％開昭４９−４１５８３号）、阻害剤や吸着剤等を
オロ用したアフィニティークロマトグラフィー（％Ｈｚ
５４−６２３１２号、昭５６−１１７７９１号、昭５７
−５０９２４号、昭５７−１４６５８１号、餡５８−５
５０４３号）勢が知られている。しかし、これらの方法
はカリクレインに％異的な精製法でないために交雑蛋白
との分離が不十分であり、高純度のカリクレインを高収
率で得る方法としては未だ満足のゆくものではなかった
。
最近では、このような方法に代って不溶性カリクレイン
抗体を利用する方法、すなわち、カリクレイン含有液を
−Ｈ不溶性カリクレイン抗体に吸着せしめた後、尿素又
は塩基性の溶離剤を用いてカリクレインを溶離せしめる
ことよりなるカリクレインの精製法が提案された（特開
昭５６−５０９５号、昭５８−５１９１号）。しかしな
がら、期かる方法では、カリクレインとカリクレイン抗
体との強固な結合体からカリクレインを溶離せしめる溶
離剤として、尿素、又は炭酸ナトリウム若しくはｐＨ１
１，５のグリシン−ＮａＯＫ緩衝液緩衝液基性のものを
使用しているため、溶離剤によるカリクレインの失活が
避けられず、収率の低下を免れ得なかった。
抗体を利用する方法、すなわち、カリクレイン含有液を
−Ｈ不溶性カリクレイン抗体に吸着せしめた後、尿素又
は塩基性の溶離剤を用いてカリクレインを溶離せしめる
ことよりなるカリクレインの精製法が提案された（特開
昭５６−５０９５号、昭５８−５１９１号）。しかしな
がら、期かる方法では、カリクレインとカリクレイン抗
体との強固な結合体からカリクレインを溶離せしめる溶
離剤として、尿素、又は炭酸ナトリウム若しくはｐＨ１
１，５のグリシン−ＮａＯＫ緩衝液緩衝液基性のものを
使用しているため、溶離剤によるカリクレインの失活が
避けられず、収率の低下を免れ得なかった。
本発明者は、斯かる実情において、カリク ３−
レインをより安定な条件で溶離する方法について鋭意検
討した結果、溶離剤として無機塩及び水と混和しうる有
機溶剤を含有する緩衝液を用いれは、カリクレインが安
定なｐＨ域において、高収率で高純度のカリクレインを
得ることができることを見出し、本発明を完成した。
討した結果、溶離剤として無機塩及び水と混和しうる有
機溶剤を含有する緩衝液を用いれは、カリクレインが安
定なｐＨ域において、高収率で高純度のカリクレインを
得ることができることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明はカリクレイン含有液を不溶性カリク
レイン抗体に吸着せしめ、吸着物を洗浄した後、無機塩
および水と混和しうる有機溶剤を含有する緩ｇｆＪ液か
らなる溶離剤でカリクレインを溶離することを特徴とす
るカリクレインのｎ製法を提供するものである。
レイン抗体に吸着せしめ、吸着物を洗浄した後、無機塩
および水と混和しうる有機溶剤を含有する緩ｇｆＪ液か
らなる溶離剤でカリクレインを溶離することを特徴とす
るカリクレインのｎ製法を提供するものである。
本発明方法で使用される不溶性カリクレイン抗体は、公
知の方法によって高純度にｙｎ！製 ４− したカリクレインを動物に免疫して得た抗体を、自体公
知の方法によって不溶性担体に化学的に結合させること
により調製される。不溶性担体としては、例えはアガロ
ース、デキストラン、セルロース、ポリアクリルアミド
等を挙けることができ、これらは例えｉｌ’ｃＮＢｒ法
によって活性化してカリクレイン抗体と化学結合させる
。例えは活性化不溶性担体としテｄ、ｃＮｎｒｅ＆化セ
ルローヌ４Ｂ（ファルマシア・ファイン・ケミカル社製
）として市販されている。
知の方法によって高純度にｙｎ！製 ４− したカリクレインを動物に免疫して得た抗体を、自体公
知の方法によって不溶性担体に化学的に結合させること
により調製される。不溶性担体としては、例えはアガロ
ース、デキストラン、セルロース、ポリアクリルアミド
等を挙けることができ、これらは例えｉｌ’ｃＮＢｒ法
によって活性化してカリクレイン抗体と化学結合させる
。例えは活性化不溶性担体としテｄ、ｃＮｎｒｅ＆化セ
ルローヌ４Ｂ（ファルマシア・ファイン・ケミカル社製
）として市販されている。
本発明方法を実施するには、この不溶性カリクレインを
吸着させる。次いでこの吸着物を洗浄して夾雑蛋白を除
去する。この洗浄に使用する洗浄液は０．１〜０．２Ｍ
の塩化す） ＩＪラムを含む緩＠液（ｐａｅ〜９）が好
ましい。
吸着させる。次いでこの吸着物を洗浄して夾雑蛋白を除
去する。この洗浄に使用する洗浄液は０．１〜０．２Ｍ
の塩化す） ＩＪラムを含む緩＠液（ｐａｅ〜９）が好
ましい。
次いで、かくして吸着されたカリクレインを無機塩およ
び水と混和しうる有機溶剤を含有する緩衝液を溶離剤と
して用いて溶離する。
び水と混和しうる有機溶剤を含有する緩衝液を溶離剤と
して用いて溶離する。
無機塩としては塩化ナトリウム、酢酸アンモニウム尋を
挙けることができる。水と混和しうる有機溶剤としては
、メタノール、エタノール、アセトン、イソプロピルア
ルコール、ジオキサン、テトラヒドロフラン、アセトニ
トリル、グリセリン、エチレングリコール、プロピレン
グリコール等が挙けられる。また緩ｇｆｌ液としては、
ｐＨ４＝１１、好ましくはｐＨ４〜５．０又はｐＨ９，
５〜１０，５のものが使用され、斯かる緩衝液としては
、例えはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン・塩
酸緩衝液、酢酸緩衝液、グリシン−ＮａＯＨ緩衝液等が
好適に使用される。本発明方法に使用する俗離剤は、上
記無機塩を０．５〜３Ｍ、特に１〜２Ｍ、水と混和しう
る有機溶剤を１０〜６０％、特に２０〜５０％を含む上
記緩衝液が好ましい。
挙けることができる。水と混和しうる有機溶剤としては
、メタノール、エタノール、アセトン、イソプロピルア
ルコール、ジオキサン、テトラヒドロフラン、アセトニ
トリル、グリセリン、エチレングリコール、プロピレン
グリコール等が挙けられる。また緩ｇｆｌ液としては、
ｐＨ４＝１１、好ましくはｐＨ４〜５．０又はｐＨ９，
５〜１０，５のものが使用され、斯かる緩衝液としては
、例えはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン・塩
酸緩衝液、酢酸緩衝液、グリシン−ＮａＯＨ緩衝液等が
好適に使用される。本発明方法に使用する俗離剤は、上
記無機塩を０．５〜３Ｍ、特に１〜２Ｍ、水と混和しう
る有機溶剤を１０〜６０％、特に２０〜５０％を含む上
記緩衝液が好ましい。
本発明方法のカリクレインの吸着、洗浄及び溶離の各操
作はバッチ法によってもがし得るが、工業的には不溶性
カリクレイン抗体を充填したカラムを用いて行うのが好
ましい。
作はバッチ法によってもがし得るが、工業的には不溶性
カリクレイン抗体を充填したカラムを用いて行うのが好
ましい。
叙上の如き本発明方法によれは、カリクレインを失活さ
せることなく、高純度にしかも高収率で精製することが
できる。また、本発明の溶離剤は不溶性カリクレイン抗
体に例の悪影譬を与えないので、中性付近の緩衝液で−
７＝ 洗浄することにより何回でも繰り返して使用できる利点
を有する。
せることなく、高純度にしかも高収率で精製することが
できる。また、本発明の溶離剤は不溶性カリクレイン抗
体に例の悪影譬を与えないので、中性付近の緩衝液で−
７＝ 洗浄することにより何回でも繰り返して使用できる利点
を有する。
次に試験例及び実施例を牟けて本発明を説明する。
試験例１
下記方法により、カリクレインの溶出液中における安定
性について調べた。
性について調べた。
（試験方法）
布製カリクレイン（ｔｓｓｏｘｔｙ／ｑ）を２００ＫＵ
／ｌｄＫなるように下記第１表に示す溶出液に溶解し、
室温に３．８．２４時間放置後、カリクレイン活性を測
定し、残存活性■をめた。その結果を第１表に示す。な
お、カリクレイン活性の測定は９屋等の方法〔ザゾヤー
ナル オプ バイオケミヌトリー ８− （Ｊ、旧ｏｅｈｅｍ、 ） ５８巻、２０１負。
／ｌｄＫなるように下記第１表に示す溶出液に溶解し、
室温に３．８．２４時間放置後、カリクレイン活性を測
定し、残存活性■をめた。その結果を第１表に示す。な
お、カリクレイン活性の測定は９屋等の方法〔ザゾヤー
ナル オプ バイオケミヌトリー ８− （Ｊ、旧ｏｅｈｅｍ、 ） ５８巻、２０１負。
１９５６年〕に従って行なった（以下に示す実施例にお
いて同じ）。
いて同じ）。
第１表：残存活性
第１表より明らかなように、カリクレインは従来の俗離
剤に比較し本発明の俗離剤中で最も安定であった。
剤に比較し本発明の俗離剤中で最も安定であった。
実施例１
部分精製カリクレイン１ｖを０．０５ Ｍ ）すス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタン・塩酸緩衝液（ｐＨ８，
０）５０−に溶かし、同緩衝液で平衡化したカリクレイ
ン抗体結合セファロース４Ｂカラム５０−に通液する（
流速；１−７分）。次いで０．１５Ｍの塩化ナトリウム
を含む同緩衝液でカラムを洗浄後、２Ｍ塩化ナトリウム
および４０％プロピレングリコールを含む０．２ Ｍ
）リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン・塩酸緩衝液
（ｐｎｉｏ、ｏ）でカリクレインを溶出する。この溶出
液をセファデックスＧ２５により脱塩後、アセトンを加
えてカリクレインを沈澱させ、アセトン、ついでエーテ
ルで洗浄し、吸引乾固してｎ製カリクレイン１６ ”Ｉ
Ｆ （総括性２６２７０ＫＵ）を得た。
ドロキシメチル）アミノメタン・塩酸緩衝液（ｐＨ８，
０）５０−に溶かし、同緩衝液で平衡化したカリクレイ
ン抗体結合セファロース４Ｂカラム５０−に通液する（
流速；１−７分）。次いで０．１５Ｍの塩化ナトリウム
を含む同緩衝液でカラムを洗浄後、２Ｍ塩化ナトリウム
および４０％プロピレングリコールを含む０．２ Ｍ
）リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン・塩酸緩衝液
（ｐｎｉｏ、ｏ）でカリクレインを溶出する。この溶出
液をセファデックスＧ２５により脱塩後、アセトンを加
えてカリクレインを沈澱させ、アセトン、ついでエーテ
ルで洗浄し、吸引乾固してｎ製カリクレイン１６ ”Ｉ
Ｆ （総括性２６２７０ＫＵ）を得た。
実施例２
部分ｎ＃！カリクレインｌｆを１，５Ｍ塩化ナトリウム
および４０％エチレングリコールを含む０．２Ｍ）リス
（ヒドロキシメチル）アミツメクン・塩酸緩衝液（ＰＨ
１０，０）で溶出する以外は実施例１と全く同様に操作
して精製カリクレイン１６■（総括性２８０３０ＫＵ）
を得た。
および４０％エチレングリコールを含む０．２Ｍ）リス
（ヒドロキシメチル）アミツメクン・塩酸緩衝液（ＰＨ
１０，０）で溶出する以外は実施例１と全く同様に操作
して精製カリクレイン１６■（総括性２８０３０ＫＵ）
を得た。
実施例３
部分精製カリクレイン１ｇを２Ｍ塩化ナトリウムおよび
５０％エチレングリコールを含む０．２ Ｍ酢Ｉｌ緩衝
液（ｐＨ４，５）で溶出する以外は実施例１と全く同様
に操作して精製カリクレイン２０■（総括性２６２８０
ＫＵ）を得た。
５０％エチレングリコールを含む０．２ Ｍ酢Ｉｌ緩衝
液（ｐＨ４，５）で溶出する以外は実施例１と全く同様
に操作して精製カリクレイン２０■（総括性２６２８０
ＫＵ）を得た。
実施例４
ブタ膵臓原末５０ｆを０，２％塩化ナトリウ １１−
ム水溶液５００−に懸濁してアンモニア水でｐＨ８，０
としアセトン４０〜６０％にて分画沈降を行なった。得
られた沈澱を０．０５Ｍ）ＩＪス（ヒドロキシメチル）
アミノメタン壷塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）に溶かして５
０ｇ１とし、同緩衝液で平衡化したカリクレイン抗体結
合セファロース４Ｂカラム５θ−に通液する（流速；ｌ
−７分）。次いで０．２Ｍ塩化す） ＩＪウムを含む同
緩衝液でカラムを洗浄後、１．５Ｍ塩化ナトリウムおよ
び４０％エチレングリコールを含む０．２ Ｍ ）リス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン・塩［ｌＩ！衝液（
ＰＨ１０，０）でカリクレインを溶出する。以下実施例
１と同様に操作してｈａカリクレイン１４■（総括性２
２６７０ＫＵ）を得た。
としアセトン４０〜６０％にて分画沈降を行なった。得
られた沈澱を０．０５Ｍ）ＩＪス（ヒドロキシメチル）
アミノメタン壷塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）に溶かして５
０ｇ１とし、同緩衝液で平衡化したカリクレイン抗体結
合セファロース４Ｂカラム５θ−に通液する（流速；ｌ
−７分）。次いで０．２Ｍ塩化す） ＩＪウムを含む同
緩衝液でカラムを洗浄後、１．５Ｍ塩化ナトリウムおよ
び４０％エチレングリコールを含む０．２ Ｍ ）リス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン・塩［ｌＩ！衝液（
ＰＨ１０，０）でカリクレインを溶出する。以下実施例
１と同様に操作してｈａカリクレイン１４■（総括性２
２６７０ＫＵ）を得た。
１２−
実施例５
ブタ膵臓原末５０Ｆを、２Ｍ塩化ナトリウムおよび２０
％エタノールを含む０．２ Ｍ ）リス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタン・塩酸緩衝液（ＰＨ１０，０）で溶
出する以外は実施例４と全く同様に操作してｎ製カリク
レイン 、１９１９（総括性２３３１０ＫＵ）を得た。
％エタノールを含む０．２ Ｍ ）リス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタン・塩酸緩衝液（ＰＨ１０，０）で溶
出する以外は実施例４と全く同様に操作してｎ製カリク
レイン 、１９１９（総括性２３３１０ＫＵ）を得た。
実施例１〜５で得た結果を第２表に示す。
以下余白
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、 カリクレイン含有液を不溶性カリクレイン抗体に
吸着せしめ・、吸着物を洗浄した後、無機塩および水と
混和しうる有機溶剤を含有する緩衝液からなる溶離剤で
カリクレインを溶離することを特徴とするカリクレイン
の精製法。 ２、＠離開が無機塩０．５〜３Ｍおよび水と混和しうる
有機溶剤ｌＯ〜６０％を含有するｐＨ４〜１１の緩衝液
である特許請求の範囲第１項記載のカリクレインの精製
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58200426A JPS6092220A (ja) | 1983-10-26 | 1983-10-26 | カリクレインの精製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58200426A JPS6092220A (ja) | 1983-10-26 | 1983-10-26 | カリクレインの精製法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6092220A true JPS6092220A (ja) | 1985-05-23 |
Family
ID=16424098
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58200426A Pending JPS6092220A (ja) | 1983-10-26 | 1983-10-26 | カリクレインの精製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6092220A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01503679A (ja) * | 1987-06-30 | 1989-12-14 | アムジエン・インコーポレーテツド | カリクレインの生産 |
-
1983
- 1983-10-26 JP JP58200426A patent/JPS6092220A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01503679A (ja) * | 1987-06-30 | 1989-12-14 | アムジエン・インコーポレーテツド | カリクレインの生産 |
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