KR102342988B1 - Ihc 항원 영상 척도 외삽 방법 - Google Patents
Ihc 항원 영상 척도 외삽 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR102342988B1 KR102342988B1 KR1020207001301A KR20207001301A KR102342988B1 KR 102342988 B1 KR102342988 B1 KR 102342988B1 KR 1020207001301 A KR1020207001301 A KR 1020207001301A KR 20207001301 A KR20207001301 A KR 20207001301A KR 102342988 B1 KR102342988 B1 KR 102342988B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- antigen
- primary
- target
- antibody
- protein
- Prior art date
Links
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 77
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 77
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 77
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 46
- 238000013213 extrapolation Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 title abstract description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 79
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 79
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 230000007547 defect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 36
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 36
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims description 21
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 19
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 17
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 17
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 claims description 14
- 238000003491 array Methods 0.000 claims description 11
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 10
- 239000012128 staining reagent Substances 0.000 claims description 7
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 3
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 claims description 3
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000004040 coloring Methods 0.000 claims description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 claims description 2
- 239000010432 diamond Substances 0.000 claims description 2
- 230000001788 irregular Effects 0.000 claims description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 claims 1
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 abstract description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 abstract description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 21
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 7
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 3
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 3
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 2
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100123569 Megathura crenulata KLH1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100123570 Megathura crenulata KLH2 gene Proteins 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 239000013077 target material Substances 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 2
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 101710098119 Chaperonin GroEL 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699667 Mus spretus Species 0.000 description 1
- 241000798077 Poelagus marjorita Species 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 239000002262 Schiff base Substances 0.000 description 1
- 101000588258 Taenia solium Paramyosin Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 238000011948 assay development Methods 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 102000034238 globular proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005896 globular proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000019612 pigmentation Effects 0.000 description 1
- 238000003498 protein array Methods 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 238000007767 slide coating Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/44—Sample treatment involving radiation, e.g. heat
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
- G01N33/54386—Analytical elements
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2496/00—Reference solutions for assays of biological material
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Rehabilitation Therapy (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
본 발명은 IHC 항원 영상 척도 외삽 방법에 관한 것이다. 본 발명 특히 이차 포유 동물 IgG 혈청과 선택적으로 항원 농도의 구배 밀도 타깃 시리즈로부터 항원 농도 척도가 전개되는 방법에 관한 것이다. 상술한 방법의 일차적인 적용은 타깃 단백질 농도 척도로 슬라이드 상의 이미지 분석을 지원하는 것이다. 이 방법은 이차 단백질 농도 척도로부터 일차 항원 농도 척도를 형성하는 데에 사용된다. 다음으로, 암과 같은 검출된 세포 결손의 조직 절편으로 접근하기 위해 일차 항원 농도 척도가 공존의 조직 절편에 적용된다.
Description
본 발명은 IHC 항원 영상 척도 외삽 방법에 관한 것이다. 본 발명 특히 이차 포유 동물 IgG 혈청과 선택적으로 항원 농도의 구배 밀도 타깃 시리즈로부터 항원 농도 척도가 전개되는 방법에 관한 것이다. 상술한 방법의 일차적인 적용은 타깃 단백질 농도 척도로 슬라이드 상의 이미지 분석을 지원하는 것이다. 이 방법은 이차 단백질 농도 척도로부터 일차 항원 농도 척도를 형성하는 데에 사용된다. 다음으로, 암과 같은 검출된 세포 결손의 조직 절편으로 접근하기 위해 일차 항원 농도 척도는 공존의 조직 절편에 적용된다.
시료 내의 분석물의 알려지지 않은 농도가 정량화될 필요가 있는 경우 면역 측정법이 사용된다. 알려지지 않은 농도의 가장 정확한 판단을 얻기 위해, 일반적인 분석 개발 기준(표준 편차 또는 최적 신호 윈도우)을 기초로 할 뿐만 아니라 면역 측정법이 알려지지 않은 시료의 값을 얼마나 잘 예측할 수 있는지를 기초로 면역 측정법이 개발되어야 한다. 첫째, 중요한 성공 요인을 분석할 필요가 있다. 그런 다음, 개념의 증명을 확립하는 면역 측정법이 개발되어야 한다. 최적화 단계에서, 실험 시료이 측정될 매트릭스 내의 정밀도 프로파일을 산출하는 것에 의해 면역 측정법의 정량화 가능한 범위가 결정된다. 그런 다음, 분석물을 매트릭스 내로 주입하고 매트릭스 내의 분석물의 회수율을 결정함으로써 주입된 회수를 수행한다. 정밀도 프로파일이 요구되는 작동 범위 내에 있다면, 수일에 걸쳐 주입된 회수 시료를 분석하여 면역 측정법의 검증을 완료한다. 정밀도 프로파일 한계가 요구되는 작동 범위 내에 있지 않다면, 검증 전에 면역 측정법의 추가적인 최적화가 요구된다.
본원에 개시된 방법의 일차적인 적용은 타깃 단백질 농도 척도로 슬라이드 상의 이미지 분석을 지원하는 것이다. 본 발명은 이차 단백질 농도 척도로부터 일차 항원 농도 척도를 형성하는 데에 사용되는 방법을 개시한다. 다음으로, 암과 같은 검출된 세포 결손의 조직 절편으로 접근하기 위해 일차 항원 농도 척도는 공존의 조직 절편에 적용된다.
일반적으로, 본 발명의 일 양태는 IHC 항원 영상 척도 외삽 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명은 항원 농도 및 이차 포유 동물 IgG 혈청의 알려진 구배 밀도 타깃 시리즈로부터 항원 농도 척도가 전개되는 방법을 개시한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 상술한 방법의 일차적인 적용은 타깃 단백질 농도 척도로 슬라이드 상의 이미지 분석을 지원하는 것이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 이 방법은 이차 단백질 농도 척도로부터 일차 항원 농도 척도를 형성하는 데에 사용된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 일차 항원 농도 척도는 그런 다음 암과 같은 검출된 세포 결손의 조직 절편으로 접근하기 위해 공존의 조직 절편에 적용된다.
본 발명의 다른 양태가 후술하는 설명에 개시된다.
도 1은 상이한 타깃을 식별하여 IHC 착색한 이후 타깃을 포집하는 일차 및 이차 착색을 포함하는 슬라이드의 일부의 도면을 도시한다.
도 2는 IHC 착색 이후의 이차 단백질 어레이 중 하나에 대한 항원 회수 처리의 효과를 도시한다.
도 3은 공존의 조직 절편을 가지며 IHC 착색의 대상이 되는 이차 단백질 농도 척도를 갖는 슬라이드를 도시한다.
도 2는 IHC 착색 이후의 이차 단백질 어레이 중 하나에 대한 항원 회수 처리의 효과를 도시한다.
도 3은 공존의 조직 절편을 가지며 IHC 착색의 대상이 되는 이차 단백질 농도 척도를 갖는 슬라이드를 도시한다.
본 발명은 본 개시의 일부를 구성하는 후술하는 본 발명의 상세한 설명을 참조하면 보다 쉽게 이해될 수 있다. 본 발명은 본원에 설명된 및/또는 도시된 구체적인 장치, 방법, 조건 또는 파라미터에 한정되지 않으며 본원에 사용된 용어는 예시적인 것일 뿐 청구된 발명을 한정하고자 하는 것이 아니라는 점이 이해될 것이다. 또한, 첨부된 청구범위를 포함하는 명세서에서 사용되는 것과 같이, 'a', 'an', 및 'the'의 단수 형식인 복수형을 포함하며, 특정 수치에 대한 참조는 그 내용이 명확하게 달리 언급하지 않는 한 적어도 그 특정 값을 포함한다. 이러한 범위가 다른 실시예에서 표현될 때, 본원에서는 '약' 또는 '대략적인' 다른 특정 값으로 범위가 표현될 수 있다. 또한, 달리 표시되지 않는 한, 본원에 명시된 치수 및 재료 특징은 한정적이기 보다는 예시적인 것이고, 적합한 실용성의 시료 실시예를 보다 잘 이해하기 위한 것이며, 명시된 값을 벗어나는 변동도 특정의 적용에 따라 본 발명의 범위 내에 있을 수 있다는 것이 이해될 것이다.
본 발명은 그 적용에 있어서 제시된 구성의 세부 사항 및 부품의 배치에 한정되지 않는다. 이하의 설명에서, 또는 이하의 설명에서 도시되거나, 또는 도면에 나타낸 바와 같이 본 발명은 다른 실시예들이 가능하고, 다양한 방식으로 실시되거나 실시될 수 있다. 또한, 설명을 목적으로 본원에 사용되는 어구와 용어는 한정적인 것으로 간주되면 안된다. "포함하는", "구성하는", "갖는", "함유하는", "관련하는" 및 이들의 변형 및 추가 항목의 사용.
일반적으로, 면역 조직 화학적(IHC) 착색은 환자 조직 절편 내의 특정 항원 부위의 존재를 평가하는 데에 사용된다. 비정상 또는 암 상태의 진단 레벨을 할당하기 위해 조직 절편 상의 착색 밀도에 대하여 주관적인 해석이 적용된다. 일반적으로, IHC 처리는 항상 정확하게 기능하며 비정상 또는 암 상태이 존재할 때 비정상 또는 암 질환을 식별하는 가시적인 크로모겐 마커로 조직 절편이 마킹될 것으로 가정한다. 그러나, 항원 회수 또는 착색 시약의 실패는 인공물을 식별하는 특징(signature)을 남기지 않는다. 그러므로, 실험실 기술이나 병리학자의 입장에서 유효한 진단 판단을 내릴 수 없는 상당한 가능성이 있다. 다시 말하면, 물리적 형태가 비정상 상태를 표시하기에 충분하지 않을 수 있지만, 항원 부위가 마킹되지 않으면, 슬라이드는 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 슬라이드에서 발견되는 것 이상의 것을 제공하지 않는다.
산출을 완료하기 위해 필요한 요건 면에서 일부가 통과되었다. 알아야 할 파라미터는 아래와 같다.
1. 항체 A: 희석 비율, ID, 및 숙주종(예로서, 25, ER, 마우스)
2. 항체 B: 희석 비율 및 ID(예로서, 20, Ki-67) 숙주종이 필요하지 않은 이유는 항체 A가 항체 B를 사용하는 것이 정반대의 마우스/토끼일 것이기 때문이다.
일차 항체는 요구되는 항원 분율로 접종된 숙주 동물(마우스 또는 토끼)로부터 얻은 처리된 숙주 혈청으로 구성되는 것으로 알려져 있다. 그런 다음, 숙주는 항원 부위가 이제 항원 길항제에 대한 항체 반응물을 포함하는 혈청 단백질을 생성한다. 후속하여, 타깃 항원을 포함하는 단백질과 항체가 접촉하면, 항원 및 항체가 함께 결합한다. 그 결과, 항체의 숙주종(마우스 또는 토끼)이 이차 착색 키트와 자유롭게 반응한다.
공존의 조직 절편에 대하여 항원 밀도 눈금자(ruler)를 전개하는 데에 IHC 타깃이 사용될 수 있는 기반은 후술하는 절차를 따른다.
슬라이드의 접착제 결합 부위 밀도는 단일 단백질의 면적 변위를 적어도 두 자릿수만큼 초과한다.
일차 항체 및 이차 단백질은 나노그램의 중량으로 변환될 수 있는 알려진 원자 질량 kDa을 갖는다.
일차 및 이차 타깃은 알려진 분배 체적의 타깃 재료가 적용되는 잘 정의되고 둥근 침착(deposition) 영역을 갖는다. 단백질 침착물은 교차 링크 커플러를 포함하므로, 단백질 깊이 이상의 슬라이드 코팅의 공극률로 내려갈 수 없다. 그러므로, 단백질의 원자 질량, 침착물 내의 각 단백질 유형의 단백질의 수, 타깃의 면적을 알면, 타깃의 활성 표면 단백질 밀도가 산출될 수 있다.
적용된 농도, 분배된 체적, 일차 항체의 시약에 노출되는 슬라이드 상의 표면적이 알려져 있다. 시약의 노출 시간 동안 대부분의 부유 항체가 낙하하여 수용 항원 부위에 의해 포집될 것으로 합리적으로 가정할 수 있다. 항원 부위의 바로 위에 낙하한 것만이 포집될 것이고 버퍼 세척 단계에서 잔액이 세척된다. 그러므로, 농도가 컷오프의 25% 이상, 포화로부터 25% 미만이라면, 침착된 항체 농도가 설정될 수 있다.
a. 컷오프는 적용된 단백질 농도를 포집하기에 불충분한 타깃 부위 밀도로서 정의된다.
b. 포화는 적용된 모든 단백질 농도를 포집할 수 없는 것으로 정의된다.
일차 희석 배율을 알면, 정확한 일차 타깃 밀도 타깃이 선택될 수 있고 일차 농도가 검증될 수 있다.
이차 및 일차 타깃은 각각 [(마우스 또는 토끼) +(당나귀 + 가교제 + 균류 억제제)] 또는 [(항원 A가 있는 KLH 또는 항원 B가 있는 KLH) +(비결합성(unconjugated) KLH + 가교제 + 균류 억제제)]의 혼합물이다. 각 도트는 총 단백질의 체적은 동일하지만, 특정 타깃을 구성하는 단백질 간에 원자 질량이 상이할 수 있으므로, 혼합비가 약간 조절되어야 한다. 예를 들면,
A. 마우스 IgG = 155kDa
B. 토끼 IgG = 150kDa
C. 당나귀 IgG = 160kDa
D. 항원 펩타이드 가닥과 결합된 KLH 서브 유닛(여기에서, 서브 유닛은 KLH1 및 KLH2) = 350 & 390kDa
2D 이차 타깃 시리즈는 20log(희석) 프로파일을 따르는 10 내지 100% 사이의 범위이며, 여기에서, 희석은 1:1 및 1,000:1 사이의 범위이다. 단일 2D/3D 타깃이 2D 베이스 및 3D 입자 사이의 착색 밀도 증분(delta)을 측정하는 데에 사용된다. 증분은 2D 어레이의 밸런스에 적용되어 조직 절편 내에서 또는 조직 절편 상에서 보이는 3D 거동과 양호하게 일치하는 색 밀도 척도를 생성할 수 있다.
이차 100% 2D/3D 및 2D 타깃은 2개의 침착물이 2D 착색 밀도와 관련하여 일치하는지를 검증한다. 이는 2D 성분의 이동을 초래하도록 입자 성분이 100% 단백질 물질을 충분히 소비하지 않았음을 검증하는 것이다.
이차 착색은 착색 시약의 구성인1 내지 20배의 효소 이득 기능을 포함한다. 따라서, 이득이 증가함에 따라, 저농도 이차 타깃이 포화 상태로 전환되는 한편, 이득이 1로 떨어지면, 고농도 이차 타깃만이 가시적으로 착색된다.
이차 타깃 어레이가 공칭적으로 고정되지 않으면, IHC 슬라이드가 경험하는 항원 회수 과정에서 침착물이 손상될 것이다. 이는 영향의 척도를 제공하지만, 조직에 대한 AR 영향이 무엇이 될지는 항상 알 수 없기 때문에, 조직에 적용될 수 있는 항원 밀도 척도를 생성하는 데에는 유용하지 않다. 따라서, 항원 밀도 척도는 조직 절편 상에 또는 조직 절편 내에 남아 있는 것 만을 반영할 수 있다. 따라서, AR 과정을 평가하는 QC 사용에 대해 2개의 항원 회수 타깃이 제공된다.
이차 및 일차 타깃 단백질 간의 상당한 크기 차이로 인해, 단백질 농도 밀도가 일차 단백질에 의해 설정될 것이다. KLH 서브 유닛 KLH1 & KLH2이 50:50 분포를 갖는다는 전제를 인정한다면, 일차 타깃 희석을 설정하는 데에 이들의 평균 값인 370kDa가 사용될 수 있다.
평균 일차 항체 원자 질량이 150kDa이면, 단일 항체의 중량은 249×10-12ηg의 중량과 동일한 150kDa (1.6605×10-12). 노출된 부분만으로서 슬라이드의 단일 면적을 선택한다면, 적용된 일차 시약의 양을 전개할 수 있다. 따라서, 내부 치수가 20.3mm2×0.14mm 높이인 폐쇄된 모세관 간극에서, 체적은 57.2μl이다. 적용된 일차 항체 시약의 0.1μl를 생성하는 타깃 도트 중 하나의 면적을 나타내는 1mm 직경 직경의 타깃 구역에 대한 비율.
일차 항체 시약은 그 농축물로부터 1 to 100μg/ml 사이의 범위로 희석된다. 따라서, 1 내지 100μg/ml의 적용된 일차 희석에 대하여, 타깃이 0.1 to 1μg의 항체에 노출된다. 항체의 중량이 공칭적으로 249×10-12ηg이면, 1mm 타깃 최대 단백질 노출 범위는 41.06 내지 4106 항체가 될 것이다.
100% 포집 능력을 확보하기 위해, 일차 타깃은 안전 계수 of 100 내지 1000배의 안전 계수를 가져야 한다. 1000배(1000x) 옵션을 선택하면, 일차 타깃은 4×106 항원 부위를 포함하여야 한다. KHL 서브 유닛은 적용된 항체보다 크지만, 이러한 증가는 포집된 항체의 수를 1:1을 초과하여 바꾸는 데에는 충분하지 않다. 각 KLH 서브 유닛은 614.4×10-12ηg의 중량과 동일한 370kDa의 평균 원자 질량을 갖는다.
단백질 분자의 체적은 매우 단순하고 신뢰할 수 있게 단백질의 분자량 및 평균 단백질 부분 비체적과 근사할 수 있다. (부분 비체적 = 체적/분자량) 가용성 구상성(globular) 단백질의 실험으로 결정된 부분 비체적의 평균은 0.73cm3/g이다. 이러한 값은 단백질마다 다르지만, 그 범위는 오히려 좁다. 이 방정식은 ~(1.212×103×MW)ηm3의 단백질 체적까지 감소한다. 그러므로, KLH 서브 유닛에 대해, 개별 체적는 448.44ηm3이다. 단백질이 구형으로 모델링되면, 구의 직경은 0.132×MW1/3inηm가 된다. KLH 서브 유닛에 대해, 이는 9.436ηm이다.
1mm의 타깃 직경에 대해, KLH 서브 유닛의 단일층은 11.237×1027단백질을 필요로 한다. 4×106 단백질의 활성 타깃 밀도에 대해, 최소 희석 비율은 1:2.8×1021이 된다. 실용적인 측면에서, 일차 항체의 평가가 그 활성 단백질 농도에 의해 좌우되기 때문에, 1:1000에 근접하는 임의의 희석이 작용 가능하다. 그러므로, 타깃 밀도는 그의 저농도 바닥 값에 의해서만 제한된다.
이차 타깃 어레이는 1:1 및 1,000:1 사이의 단계적 희석 증분이다. 희석용 선형 기울기는 -20log(희석)(이후 dBd라고 함)으로서 발생한다. 1:1 및 1,000:1 사이에 열거된 희석 범위에서, 편대수(semi-log) 범위는 0 내지 -60dBd이다. -3dBd 희석 단계를 선택하면, 이차 타깃 희석은 0, -3, -6, -9, -12, -15, -18, -21dBd가 된다.
착색은 일차 항체의 농도 및 이차 착색 키트의 효소 이득의 함수로서 포화 또는 컷오프를 경험할 수 있다. 포화는 효소 부위의 밀도가 크로모겐로부터 착색제를 침전시키기 위한 용량을 초과할 때이다. 다시 말하면, 착색 색채가 실현될 수 있을 만큼 어둡다. 일차 항체의 농도 및 이차 착색 키트의 효소 이득이 너무 낮아 착색제 침전이 불충분할 때 컷오프가 발생한다. 이러한 두가지 요인은 이차 라인의 암흑이 포화(100%) 또는 컷오프(0%)로 전환되도록 한다. 도 2를 기준으로, 이러한 이동은 가시적인 타깃의 수로서 보여진다. 이차 효소 이득이 증가함에 따라, 100% 도트 밀도가 0% 위치를 향하여 이동한다. 일반적인 효소 이득은 1, 2, 4, 5, 8, 10, 15, 20이다. 이는 이차 어레이를 0% 위치를 향하여 이동하는 것으로 해석된다.
● 20x 모든 타깃 이동 -26dBd
● 15x 모든 타깃 이동 -23.52
● 10x 모든 타깃 이동 -20
● 5x 모든 타깃 이동 -13.98
● 4x 모든 타깃 이동 -12.04
● 2x 모든 타깃 이동 -6.02
● 1x 흑색과 인접한 2D 100)% 도트만
일차 타깃 어레이가 존재하면, 이차 효소 이득의 증가는 착색 밀도를 낮은 일차 농도 도트를 향하여 이동시킨다. 일차 항체 농도가 증가되는 경우에도 동일하다. 항원 회수 과정은 일차 및 이차 타깃 모두를 어느 정도로 저하시켜 컷오프을 향하는 이동을 역전시킨다. IHC 착색의 종료 시, 슬라이드에서 셋 이상의 도트가 사라지면, 과도한 항원 회수 지속 기간, 온도, 또는 이 둘 모두를 가졌다고 여겨질 것이며, 지나치게 많은 항원의 존재는 조직 상에서 손실되므로, 진단 해석을 미미하게 한다. 이차 착색이 이미 손상된 것으로 보이므로, 이러한 결정은 일차 항체의 효능과 무관하다. 항체 단계에서는 어떤 것도 이러한 손상 수준을 극복할 수 없다.
통상적으로, 셋 이상의 도트에 의해 이차 어레이를 100% 위치로 이동시키는 AR 손상은 과도한 것으로 여겨지며, 더 높은 효소 이득 이차 착색 키트 또는 더 높은 농도의 항체를 사용하여 슬라이드가 다시 만들어져야 한다.
따라서, 일차 항원 타깃 색 밀도는 항체 농도에 이차 착색 키트이 효소 이득을 곱한 것의 총 합이다. 이차 타깃 밀도는 효소 이득에 이차 타깃 단백질 농도를 곱한 것일 뿐이다.
디지털 영상 시스템에 따라, 조명 강도의 변화는 이미지의 동적 범위를 압축(더 어두워짐) 또는 포화(더 밝아짐)로 이동시킬 것이다. 이러한 변화는 항원 색채 척도를 이동시키는 한편, 항원 밀도 수치 척도는 이동시키지 않을 것이다. 그러므로, 수치 척도는 독립적이며, 색채 척도는 조명 강도에 따라 결정된다.
QC 모드에서, 도 3에 도시된 바와 같이, 공존의 타깃은 IHC 과정 피드백을 제공한다. 5, 10, 30, 40%의 공칭 이내인, 초과하는, 매우 초과하는, 그리고 과도하게 초과하는 것으로부터 수행되는 항원 회수의 정도에서 차이가 표시된 4개의 라인의 이차 어레이가 존재한다. 항원 회수 과정은 포름알데히드 및 단백질 사이의 시프(Schiff) 염기 결합을 역전시켜 항원 부위의 마스킹 해제를 도모한다. 항원이 노출되는 속도는 반응의 온도에 크게 의존한다. 온도가 증가함에 따라, 유핵 비등(nucleated boiling)의 기회가 발생한다. 유핵 비등은 조직 및 단백질 침착물 모두에 물리적인 손상을 일으킨다. 이상적으로, 항원 회수 활동은 슬라이드를 통해 균일하지만, 현실적으로는 발생하지 않아, 사용된 방법 및 환경에 따라 항원 회수 활동이 크거나 적게 이루어지는 면적이 생긴다. 균일한 항원 회수 활동을 가정하면, 슬라이드가 진단 판단에 사용 가능한 것임을 나타내는 데에 후술하는 것이 사용될 수 있다.
AR이 최소이거나 과도하면, 이차 어레이는 그 실패를 반영하지 못할 수 있다. 그러나, 2개의 AR 타깃은 과도한 실패 조건을 나타낼 것이다.
ㅇ 낮은 AR은 고정 타깃 하의 2D/3D 및 고정 타깃 상의 2D는 모두 흑색인 것으로 보인다. AR이 타깃의 왼쪽으로 이동하지 않고 이차 어레이가 완벽하게 보일 것이다.
ㅇ IHC 착색제 내에서의 후술하는 상황에서 낮은 AR 활동이 발생할 수 있다.
AR 히터가 작동하지 않거나 80℃ 미만으로 설정됨
AR 버퍼가 6 또는 9이 아닌 중립 pH 7을 가짐
노출 시간이 지나치게 짧음
ㅇ 높은 AR은 고정 타깃 하의 2D/3D가 크게 표백되고 고정 타깃 상의 2D가 50% 흑색 미만인 것으로 보인다. 이차 어레이도 크게 표백될 것이다.
ㅇ IHC 착색제 내의 후술하는 상황에서 높은 AR 활동이 발생할 수 있다.
온도 > 95℃에서 작동하는 히터
노출 시간이 지나치게 김
ㅇ 두 가지 상황에서 크로모겐 침전 오류가 발생할 수 있다.
고농도 이차 타깃인 경우, 착색 강도가 최대 암흑 보다 낮아진다. 이차 어레이는 부위 밀도와 비교하여 항상 증가하여야 한다. 그렇지 않다면, 크로모겐 침전이 이차 시약 키트 용량을 소진시킨 것이다. 해결 수단은 (항체 농도의 감소와 동일하게) 일차 항체 희석을 증가시키는 것이다.
크로모겐 시약은 활성화됨에 따라(DAB에서 종종 발생함) 변질되었다. 해결 수단은 새로운 DAB 혼합물을 사용하는 것이다.
종래의 현미경을 통하여 현미경 슬라이드를 보는 것은 조명 수준과 관련하여 주관적이다. 전체 슬라이드 영상(WSI)에서, 스캐너는 완벽한 백색 및 흑색 홀을 사용하여 백색 밸런스 및 콘트라스트를 설정한다. 수동적 현미경인 경우 그렇지 않다. 도 3은 조명 수준이 지나치게 어둡고(최적으로부터 -5%), 최적(+0), 지나치게 밝을 때(+10 또는 +15%)의 이미지에 대한 영향을 도시한다. 조도가 최적 미만이면, 착색 밀도가 압축된다. 암 단계에 있어서, 이는 진단을 필요한 것보다 한 단계 더 높게 이동시킬 수 있다. 조도가 최적을 초과하면, 이미지가 표백된다. 암 단계에 있어서, 이는 진단을 필요한 것보다 한 단계 더 낮게 이동시킬 수 있다. 항원 색 밀도 및 수치 눈금자가 일차 및 이차 타깃으로부터 전개되어 WSI 이미지에 중첩될 수 있다. 수치 척도는 독립적인 용어인 한편, 색 밀도는 종속적인 용어이다. 항원 밀도 색채 및 수치 눈금자가 WSI에 적용되면, 사용자가 조명 수준을 위 또는 아래로 이동시킴에 따라, 수치 척도는 고정된 상태로 유지된다. 다른 한편으로는, 조명 수준이 변화함에 따라 색 밀도 척도가 이동한다. 사용자가 수치 관계와 색 밀도를 잃지 않으면서 조직 이미지 상에 가장 좋은 '보기(see)' 특성으로 명백하게 조명을 올리고/낮추는 선택권을 갖는다는 점에 이점이 있다. 이는 또한 배율이 변경됨에 따라 기능할 것이다.
항원 밀도 눈금자가 전개될 수 있는 데에 두 가지의 형태가 있다. 유형 A는 일차 항체가 항상 조직 항원 부위와 비교하여 10% 초과 항체 미만으로 적용된다는 가정을 기초로 한다. 유형 B는 일차 항원 구배 밀도 어레이를 사용한다.
유형 A: 2 차 단독 기반 항원 눈금자
이 형태는 이차 타깃 어레이만을 사용한다. 2-D 바 코드에 포함된 전달된 정보는 (a) 일차 항체 데이터: 항체용 숙주종 및 -dBd에서의 희석 및 (b) 이차 효소 이득을 포함한다.
이차 구배 밀도 타깃 어레이는 타깃 간의 -3dBd 감분(decrement)을 따르는 단백질의 알려진 농도로 구성된다. 최대 농도는 일차 항체에 사용되는 최소 희석에 의해 선택된다. 대부분의 사용자는 항체 시약 제조자가 제공한 농도 사양을 취하여 1ug/ml의 일정한 중간 농도로 희석한다. 이로부터 다른 모든 희석이 필요한 만큼 만들어져 상이한 조직 유형을 수용한다. 일반적으로, 제2 세트의 일차 항체 희석의 범위는 1:1 및 1,000:1 사이이다.
이차 효소 이득의 범위를 수용하기 위해, 이차 어레이는 더 넓은 희석 범위로 구성되어야 한다. 그러므로, -3dBd 단계에서, 1,000:1 또는 SdBd로 대표되는 -60dBd로 이차 어레이의 최하 희석이 시작된다. 그러면, 8-도트 시리즈의 최대는 -0dBd 또는 1:1로 된다. 항원 회수의 작용은 ARdBd로 대표되는 이차 단백질을 감소시킨다. 이차 어레이에서, 8개 중 하나인 각 도트는 -3dBd 증분을 나타낸다. 2개의 타깃(더 이상 가시적이지 않음)의 손실에 대한 항원 회수 손실은 +6dBd가 될 것이다. 이는 이차 어레이가 2D 타깃에 대해 (-S + AR) dBd이거나 [+6 to -54dBd]인 것을 의미한다. 항체 농도 및 이차 효소 이득이 이제 고려되어야 한다. 항체 농도는 AdBd일 것인 한편, 효소 이득은 EdBd이다. 그러므로, 이차 어레이는 (-S + AR -E) dBd일 것인 한편, 조직은 (+AR -E + A) dBd일 것이다. 적용되어야 하는 새로운 요인은 100% 2D 내지 3D 차이이다. 100% 2D/3D 타깃의 3D 객체와 100% 2D 사이의 착색 차이는 2 차 착색 크로모겐 침전 상수를 나타내며, 이는 색 밀도를 수치 척도에 할당하고 DdBd에도 할당한다. 색 밀도의 차이는 어레이 내의 2D 타깃의 각각에 적용된다. 그러므로, 2D 어레이는 착색 색 밀도에서 (+AR -E +A +D) dBd로서 제공된다.
예를 들면, 효소 이득은 10배(10x), E = -20dBd이었다. 그러면 2D 이차 어레이는: -14, -17, -20, -23, -26, -29, 블랭크(blank), 블랭크(blank) dBd가 될 것이다. 착색에 의해 복구될 수 없어 블랭크인 항원 회수 과정에 의해 충분히 손상된 0%를 향하는 2개의 도트 예를 들면, 2D/3D 색 밀도 차이는 10배(10x), D = +20dBd이며, 3D 이차 어레이를 -34, -37, -40, -43, -46, -49, 블랭크, 블랭크 dBd로 만든다. 일차 항체 시약이 100% 수율이 이루어지는 일차 타깃에서 적합한 항원 부위를 찾는 것으로 가정한다. 또한, KLH 단백질 당 2개보다 많은 항원 펩타이드 가닥이 있는 한편, KLH 단백질 당 하나의 항체만이 효과적으로 결합할 수 있고 착색될 수 있는 것으로 가정한다. 동일한 KLH 단백질에서 적합한 항원을 발견하는 임의의 추가적인 항체는 중첩 점유(overlapping occupancy)로 인해 이차 착색에 의해 완료되는 것이 방지될 것이다. 따라서, 검출될 수 있는 단백질을 수반하는 일차 항원 당 항원 부위의 수는 1이다. 일차 타깃은 이차 타깃과 마이크론 당 동일한 수의 단백질을 포함하므로, 500ug/ml 항체 마스터(master)로부터의 일차 희석이 이차 어레이 데이터에 적용되어 이차 색 밀도를 수치 항원 밀도로 조절한다. 이차 타깃을 모니터링하여 중간 색 밀도를 갖는 타깃을 선택한다. 중간 색 밀도는 최대 흑색 및 최대 백색 사이의 50% 지점으로서 정의된다. 그러면 그 지점은 3dBd 범위 외의 1.5dBd와 동일하다. 그러면, 그 지점은 항원 밀도 눈금자가 설정되는 앵커로서 기능한다. 상기 중간점 이상의 마지막 타깃 범위를 사용하면 -41.5dBd가 된다.
이차 단백질은 10ug/ml 마스터 희석으로 희석된다. 각 어레이는 당나귀 IgG 단백질과 혼합된 마우스 또는 토끼의 혼합물이다. 모두 150kDa이고 타깃 도트 당 총 단백질 수는 일정하고 혼합 비율은 일정하지 않은 가정하에서 단백질은 모두 상이한 원자 질량을 갖는다. 지금은 반응성 단백질 농도만이 고려된다. 150kDa에서, 개별 단백질 분자량은 MW = 249.07×1012ng이다. 표준 타깃 도트는 직경이 1mm이다. 인쇄된 침착물이 1um 두께이면, 침착물 농도는 10 ug/ml이고, 31.5×106 단백질이 침착된다. 그러면, 1um 직경 면적이 31.5 단백질을 가질 것이다. 하나의 단백질이 하나의 항원 부위와 동일하다고 하면, 항원 밀도가 설정될 수 있다. 이차 어레이는 침착물 당 동일한 수의 단백질을 사용하지만, 마우스 또는 토끼의 농도가 감소됨에 따라, 마우스 또는 토끼 및 당나귀 간의 비율이 변화한다. 100% 타깃은 전체적으로 마우스 또는 토끼이며, 눈금자 상의 0dBd 지점에 일치한다.
일차 항체가 조직 상의 항원 부위에 결합되면, 이차는 조직 상의 착색일 것이다. 특히, 충분한 항체 농도가 이용 가능한 항원 부위에 결합되도록 제공되어야 하는 것을 제외하고는, 적용된 항체의 농도에 의존하지 않는다. 그러므로, 조직 상에서의 항원 밀도 측정은 상수로서 유지되지만, 항원 회수 손상 및 이차 효소 이득에 대해 수치가 수정되어야 한다. 그러면 수치 측정에 대한 색 밀도는 조화를 이루어야 한다.
이전의 예에서, 효소 이득은 10배(10x)이고, 항원 회수는 이차 어레이로부터의 2개의 도트의 손실을 초래하였다. 효소 이득은 -20dBd인 한편, 항원 회수 손실은 +6dBd이다. 결과는 -14dBd이다. 그러면 희석은 아래와 같다.
| 수치 밀도 dBd | 색 밀도 dBd |
% 타깃 마우스/토끼: 당나귀 |
1 um2 내의 항원 밀도 마우스/토끼 |
| 0 | -14 | 100 | 31.5 |
| -3 | -17 | 70.8 | 23.32 |
| -6 | -20 | 50.1 | 15.78 |
| -9 | -23 | 35.5 | 11.18 |
| -12 | -26 | 25.1 | 7.90 |
| -15 | -29 | 17.78 | 5.60 |
| -17 예상 | -32 예상 | 12.59 | 3.96 |
| -20 예상 | -35 예상 | 9.9 | 3.12 |
유형 B: 일차 항원 기반 눈금자
이 형태는 일차 및 이차 타깃 어레이 모두를 사용한다. 2-D 바 코드에 포매되어 전달된 정보는 (a) 일차 항체 데이터: 항체용 숙주종 및 dBdilution에서의 희석 및 (b) 이차 효소 이득을 포함한다. 로트(lot) 코드 데이터는 어떤 일차 타깃 조합이 사용되는지에 관한 정보를 포함한다.
일차 타깃 계열이 존재하는 경우, 가장 농축된 도트는 이차 어레이와 동일한 100% 농도를 가진 세 개의 도트들일 것이고, 도트들은 -6dBd 단계에서 간격을 두고 있다. 사실상, 일차 어레이 및 이차 어레이는 동일한 희석 기울기를 갖는다. 일차 타깃은: -0, -6, -12dBd이 되며, Pdbd로서 표시된다. 항원 회수 손상이 이차 어레이와 거의 동일할 것으로 예상하는 것이 타당하다. 일차 어레이는 이차 착색에 의해 작용되므로 동일한 효소 이득 기능을 경험한다. 그러므로, 일차 어레이는 (-A + AR -E) dBd이 될 것이며, 일차 타깃 밀도는 일차 항체 희석에 의해 제어된다. P가 항상 A보다 크다는 것이 유일한 요건이다. 10배(10x) 효소 이득 = -20dBd 및 +6dBd 항원 회수 손실이며, 일차 어레이는 -20, -26, -32dBd이다. 이차 어레이에 대한 영향을 기초로, 항원 회수 손실은 이들을 제거하기에 충분한 일차 타깃에 작용하지 않는다. 이차 어레이가 항원 밀도 눈금자를 생성하는 데에 충분하지만, 일차 희석이 정확하게 적용된 것은 확인하는 것이 중요하다. 그러므로, 일차 타깃은 그 용량 내에서 기능한다.
본 출원은 그 전체에 "Process Record Slide for Immunohistochemical Staining"을 명칭으로 하는 출원번호 62/520319에 개시된 타깃 단백질 농도 척도를 갖는 슬라이드의 정의의 기준을 포함한다. 출원번호 62/520319에도 정의된 바와 같은 타깃 단백질 농도 척도를 갖는 상술한 슬라이드는 최소한 2개의 이차 단백질 타깃 어레이로 구성되며, 선택적으로 하나 이상의 일차 항원 타깃 어레이로 구성된다.
본 발명의 일 실시예에서, 상술한 이차 단백질 타깃 어레이는 2개의 라인으로 형성되며: 20log (희석) 곡선에서 최대 밀도부터 최소 밀도로 진행하는 5개 이상의 부재 구배 밀도 시리즈를 형성하기 위해 더미 IgG 혈청 단백질과 혼합되는 마우스 IgG 및 다른 토끼 IgG 중 하나이며, 희석은 1:1 및 1,000:1 사이의 범위일 수 있다.
다른 실시예에서, 마지막 공정 단계에서, 식별된 항원 부위는 크로모겐 침전에 의해 착색된다. 그러므로, 마우스 & 토끼 타깃 어레이는 이차 착색 키트 크로모겐 침전의 20log (희석) 곡선을 반영한다.
다른 실시예에서, 일차 항원 밀도 척도를 형성하는 방법의 바람직한 해결 수단은 성공적으로 타깃 혼합물을 구성하여 이를 타깃 단백질 농도 척도로 슬라이드 상으로 침착시키고 접착제 및 타깃 물질 사이에 공유 결합을 갖는 것에 기반한다.
다른 실시예에서, 타깃 어레이가 성공적으로 적용되고 일차 및 이차 착색 시약이 모두 합리적으로 수행된다고 추론하면, 데이터 세트 사이의 곡선 피팅이 컴퓨터 알고리즘에 의해 용이하게 수행될 수 있다. 다른 실시예에서, 형광 마커에 결합되지 않거나 효소 부위(HRP 또는 AP 등)와 일체화되지 않는 마우스 또는 토끼 숙주 단백질을 사용하는 임의의 IHC 승인 항체로부터 일차 착색이 선택될 수 있다. 다른 실시예에서, 효소 이득이 1배(1x) 내지 25배(25x)이며, 각각 상이한 색채 크로모겐을 사용하는 마우스 및 토끼 사이에서 고유하게 독립적인 이차 착색으로부터 이차 착색이 선택될 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 실시예에서, 하나의 슬라이드 상의 절대 기준에서의 성능 결과가 다른 시간에 수행된 다른 슬라이드와 동일하지 않을 수 있다는 점에 주목하는 것이 적절하다. 이는 성능 로트면에서 이차 착색 키트가 일차 결합 일차 항체와 같은 로트까지 달라지는 사실에 비롯된다. 그러나, 타깃 단백질 농도 척도를 갖는 임의의 하나의 슬라이드에 대한 성능에서, 항원 척도가 유효할 것이며, 상이한 착색 시약을 사용하여 수행된 다른 슬라이드와 거의 동등할 것이다.
다른 실시예에서, 다음으로, 암과 같은 검출된 세포 결손의 조직 절편으로 접근하기 위해 일차 항원 농도 척도가 공존의 조직 절편에 적용된다.
다른 실시예에서, 타깃 단백질 농도 척도를 갖는 슬라이드가 후술된다.
검출 구역 및 제어 구역을 포함하는 슬라이드에 있어서,
검출 구역은 조직 절편 또는 느슨한 세포가 면역 조직 화학적 특성(IHC) 및 후속하는 검사를 통한 처리에 적용되는 공간이고,
제어 구역은 하나 이상의 세트의 일차 및/또는 이차 타깃 어레이를 포함하며,
이차 타깃 어레이는 하나 이상(예를 들면, 1 내지 50, 5 내지 45, 10 내지 40, 15 내지 35 또는 20 내지 30, 특히, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10)의 이차 타깃 로딩 도트(도트는 원형, 타원, 정사각형, 다이아몬드 등의 임의의 규칙적인 또는 불규칙적인 형상일 수 있음)를 포함하며, 각각의 이차 타깃 로딩 도트는 특정 비율로 슬라이드에 고정된 숙주 단백질(예를 들면, IgG) 및 더미 단백질(예를 들면, IgG)의 혼합물이다.
"더미 단백질"이라는 용어는 이차 항체에 대해 비반응성이며 구배 희석을 얻기 위해 숙주 단백질과 혼합하는 데에 사용되는 단백질을 의미한다. 바람직한 더미 단백질은 당나귀 단백질(IgG) 또는 말 단백질(IgG)이다.
"숙주 단백질"이라는 용어는 마우스, 쥐, 토끼, 당나귀, 말, 및 염소 단백질(IgG)과 같은 일차 항체와 동일한 기원을 갖는 단백질(특히, IgG)을 의미한다.
슬라이드의 일 예가 도 2의 타깃이 상세하게 식별되는 도 1에 도시된다.
다양한 실시예가 예로서 본원에 설명된다. 본원에 제시된 본 발명의 더 넓은 범위로부터 벗어나지 않고 다양한 수정이 만들어질 수 있고 다른 실시예가 사용될 수 있는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 예시적인 실시예에 따른 이러한 변형 및 다른 변형은 본 발명에 속하는 것으로 의도된다.
본 출원은 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 2017년 6월 15일에 출원된 미국 가출원 번호 US 62/520187 및 2017년 6월 15일에 출원된 미국 가출원 번호 62/520319의 우선권을 주장한다.
Claims (10)
- 항원 농도 및 이차 포유 동물 IgG의 알려진 구배 밀도 타깃 시리즈로부터 항원 농도 척도가 전개되는 IHC 영상 외삽(extrapolation) 방법에 있어서,
(a) 항체로 구성되는 일차 착색 시약에 현미경 슬라이드를 노출시키는 단계;
(b) 일치하는 항원 타깃 상에서 상기 항체를 포집하는 단계;
(c) (a) 단계에서의 상기 항체 및 이차 타깃 어레이 사이에서 항원 식별용 이차 착색 시약 키트와 결합하는 단계;
(d) 크로모겐 침전에 의해 (c) 단계의 상기 식별된 항원을 착색하는 단계;
(e) 색채 강도를 산출/비교하는 단계를 포함하고, 상기 현미경 슬라이드는 검출 구역 및 제어 구역을 포함하고,
상기 검출 구역은 조직 절편 또는 느슨한 세포가 면역 조직 화학적 특성(IHC) 및 후속하는 검사를 통한 처리에 적용되는 공간이고, 상기 제어 구역은 2개의 이차 포유 동물 IgG 어레이를 포함하며, 선택적으로 특정 비율로 상기 슬라이드에 고정되는 하나 이상의 세트의 항원 어레이를 포함하는 IHC 영상 외삽(extrapolation) 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 항체는 마우스 IgG 또는 토끼 IgG 유형 항체인 것을 특징으로 하는 IHC 영상 외삽(extrapolation) 방법. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
항원 및 이차 포유 동물 IgG 로딩 도트는 모두 원형, 타원형, 정사각형, 다이아몬드 등의 규칙적인 또는 불규칙적인 형상인 것을 특징으로 하는 IHC 영상 외삽(extrapolation) 방법. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 항체는
형광 마커에 결합되지 않거나 효소 부위(HRP 또는 AP 등)와 일체화되지 않은 마우스 또는 토끼 숙주 단백질을 사용하는 IHC 승인 항체로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 IHC 영상 외삽(extrapolation) 방법. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 이차 착색 시약은
효소 이득이 1배(1x) 내지 25배(25x)이며, 각각 상이한 색채 크로모겐을 사용하는 마우스 및 토끼 사이에서 고유하게 독립적인 이차 착색으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 IHC 영상 외삽(extrapolation) 방법. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 방법은 최소한 조직 절편과 공존하는 마우스 및 토끼 IgG 단백질의 구배 밀도 어레이를 갖는 접착제 코팅 현미경 슬라이드 상에서 구현되는 것을 특징으로 하는 IHC 영상 외삽(extrapolation) 방법. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
모든 상기 어레이 타깃은 20log(희석) 곡선 상의 부재이며, 상기 희석은 1:1로부터 1,000:1까지의 범위인 것을 특징으로 하는 IHC 영상 외삽(extrapolation) 방법. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 착색 시약에서의 반응성 변동을 보상하면서, 20log(희석) 프로파일을 갖는 이차 단백질 시리즈로부터 보다 많은 수의 지점을 사용하는 확장된 척도로 20log(희석) 프로파일 상에 확장된 항원 척도가 3개의 지점으로부터 투영되는 것을 특징으로 하는 IHC 영상 외삽(extrapolation) 방법. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
각 항원 척도는 공존의 조직 절편 내의 동일한 항원 밀도를 측정하는 데에 적용되는 것을 특징으로 하는 IHC 영상 외삽(extrapolation) 방법. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
일차 항원 농도 척도는 암과 같은 검출된 세포 결손의 조직 절편으로 접근하기 위해 공존의 조직 절편에 적용되는 것을 특징으로 하는 IHC 영상 외삽(extrapolation) 방법.
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201762520319P | 2017-06-15 | 2017-06-15 | |
| US201762520187P | 2017-06-15 | 2017-06-15 | |
| US62/520,187 | 2017-06-15 | ||
| US62/520,319 | 2017-06-15 | ||
| PCT/CN2018/091689 WO2018228577A1 (en) | 2017-06-15 | 2018-06-15 | Method for ihc antigen imaging scale extrapolation |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20200041861A KR20200041861A (ko) | 2020-04-22 |
| KR102342988B1 true KR102342988B1 (ko) | 2021-12-27 |
Family
ID=64660854
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020207001301A KR102342988B1 (ko) | 2017-06-15 | 2018-06-15 | Ihc 항원 영상 척도 외삽 방법 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP3639031A4 (ko) |
| JP (1) | JP7440411B2 (ko) |
| KR (1) | KR102342988B1 (ko) |
| CN (1) | CN110753846B (ko) |
| WO (1) | WO2018228577A1 (ko) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008506956A (ja) | 2004-07-20 | 2008-03-06 | ウメディク インコーポレイテッド | 動的内部較正の真の用量応答曲線を測定するための方法 |
| JP2011508197A (ja) | 2007-12-24 | 2011-03-10 | オンクイミューン リミテッド | イムノアッセイのためのキャリブレータ |
| WO2015187158A1 (en) | 2014-06-04 | 2015-12-10 | Indevr, Inc. | Universal capture array for multiplexed subtype-specific quantification and stability determination of influenza proteins |
| US20170160171A1 (en) * | 2015-11-20 | 2017-06-08 | Oregon Health And Science University | Multiplex immunohistochemistry image cytometry |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2003302137A1 (en) * | 2002-07-15 | 2004-06-15 | Technical Instrument San Francisco | Quality control of assays |
| US20080070324A1 (en) * | 2002-07-15 | 2008-03-20 | Floyd Alton D | Quantity control device for microscope slide staining assays |
| US20070141723A1 (en) * | 2005-12-16 | 2007-06-21 | Sompuram Seshi A | Immunohistochemistry staining controls |
| WO2009085573A2 (en) * | 2007-12-28 | 2009-07-09 | Spring Bioscience Corporation | Quality control cell device for immunohistochemistry assay and methods of use thereof |
| WO2012078138A1 (en) * | 2010-12-07 | 2012-06-14 | Wei-Sing Chu | Cell array quality control device for pathological analysis |
| GB2490652A (en) * | 2011-04-18 | 2012-11-14 | Microtest Matrices Ltd | Methods of quantifying antibodies, especially IgE antibodies in a sample |
| CN102435728B (zh) * | 2011-09-07 | 2014-06-25 | 福州大学 | 一种用于免疫组化过程质量检控的阳性参照物的制备方法 |
| WO2013090567A2 (en) | 2011-12-13 | 2013-06-20 | Lab Vision Corporation | Immunohistochemical validation devices and methods |
| CN103116018B (zh) * | 2013-01-25 | 2015-04-15 | 福州迈新生物技术开发有限公司 | 一种免疫组化质量控制参照物及质量控制方法 |
| CN103116029B (zh) * | 2013-01-29 | 2015-01-21 | 福州迈新生物技术开发有限公司 | 一种免疫组化用二抗显色系统灵敏度、亲和力的测定方法 |
| KR20150136599A (ko) * | 2013-03-30 | 2015-12-07 | 클래리언트 다이아그노스틱 서비시즈, 인크. | 품질 대조군이 구비되어 있는 현미경 슬라이드 |
| US20160258848A1 (en) * | 2015-03-04 | 2016-09-08 | Agilent Technologies, Inc. | Methods and compositions for multiplex tissue section analyses using visible and non-visible labels |
| EP3253800B1 (en) * | 2015-03-27 | 2021-03-03 | Opko Diagnostics, LLC | Prostate antigen standards and uses thereof |
-
2018
- 2018-06-15 KR KR1020207001301A patent/KR102342988B1/ko active IP Right Grant
- 2018-06-15 JP JP2020519175A patent/JP7440411B2/ja active Active
- 2018-06-15 EP EP18816945.2A patent/EP3639031A4/en active Pending
- 2018-06-15 CN CN201880038946.3A patent/CN110753846B/zh active Active
- 2018-06-15 WO PCT/CN2018/091689 patent/WO2018228577A1/en unknown
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008506956A (ja) | 2004-07-20 | 2008-03-06 | ウメディク インコーポレイテッド | 動的内部較正の真の用量応答曲線を測定するための方法 |
| JP2011508197A (ja) | 2007-12-24 | 2011-03-10 | オンクイミューン リミテッド | イムノアッセイのためのキャリブレータ |
| WO2015187158A1 (en) | 2014-06-04 | 2015-12-10 | Indevr, Inc. | Universal capture array for multiplexed subtype-specific quantification and stability determination of influenza proteins |
| US20170160171A1 (en) * | 2015-11-20 | 2017-06-08 | Oregon Health And Science University | Multiplex immunohistochemistry image cytometry |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Angela R Dixon et al, Expert Rev Mol Diagn (2015), vol 15(9), pp 1171-1186. |
| Juho Konsti et al, Diagnostic Pathology (2012), vol 7:29, pp 1-9. |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2020523616A (ja) | 2020-08-06 |
| KR20200041861A (ko) | 2020-04-22 |
| EP3639031A1 (en) | 2020-04-22 |
| WO2018228577A1 (en) | 2018-12-20 |
| CN110753846A (zh) | 2020-02-04 |
| JP7440411B2 (ja) | 2024-02-28 |
| CN110753846B (zh) | 2024-03-26 |
| EP3639031A4 (en) | 2021-05-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Vyberg et al. | Proficiency testing in immunohistochemistry—experiences from nordic immunohistochemical quality control (NordiQC) | |
| Cuzick et al. | Prognostic value of a combined estrogen receptor, progesterone receptor, Ki-67, and human epidermal growth factor receptor 2 immunohistochemical score and comparison with the Genomic Health recurrence score in early breast cancer | |
| Mani et al. | Quantitative assessment of the spatial heterogeneity of tumor-infiltrating lymphocytes in breast cancer | |
| Cummings et al. | Biomarker method validation in anticancer drug development | |
| US6962789B2 (en) | Method for quantitating a protein by image analysis | |
| ES2394224T3 (es) | Uso de perfiles de localización subcelular como indicadores de prognóstico o predictivos | |
| Belien et al. | Fully automated microvessel counting and hot spot selection by image processing of whole tumour sections in invasive breast cancer. | |
| Dupouy et al. | Continuous quantification of HER2 expression by microfluidic precision immunofluorescence estimates HER2 gene amplification in breast cancer | |
| Tsuda et al. | HER2 testing on core needle biopsy specimens from primary breast cancers: interobserver reproducibility and concordance with surgically resected specimens | |
| Powell et al. | A new rabbit monoclonal antibody (4B5) for the immunohistochemical (IHC) determination of the HER2 status in breast cancer: comparison with CB11, fluorescence in situ hybridization (FISH), and interlaboratory reproducibility | |
| CN103201627A (zh) | 组织学样品中单个靶标分子的定量 | |
| True | Methodological requirements for valid tissue-based biomarker studies that can be used in clinical practice | |
| Sompuram et al. | Quantitative assessment of immunohistochemistry laboratory performance by measuring analytic response curves and limits of detection | |
| Ranefall et al. | Automatic quantification of immunohistochemically stained cell nuclei based on standard reference cells | |
| Clarke et al. | A novel, automated technology for multiplex biomarker imaging and application to breast cancer | |
| Wei et al. | Serum S100A6 concentration predicts peritoneal tumor burden in mice with epithelial ovarian cancer and is associated with advanced stage in patients | |
| Rhodes et al. | The use of cell line standards to reduce HER-2/neu assay variation in multiple European cancer centers and the potential of automated image analysis to provide for more accurate cut points for predicting clinical response to trastuzumab | |
| Buck et al. | Metabolic tumor constitution is superior to tumor regression grading for evaluating response to neoadjuvant therapy of esophageal adenocarcinoma patients | |
| Chen et al. | Validation of tissue array technology in head and neck squamous cell carcinoma | |
| Jubb et al. | Quantitative analysis of colorectal tissue microarrays by immunofluorescence and in situ hybridization | |
| Masuda et al. | Tissue thickness interferes with the estimation of the immunohistochemical intensity: introduction of a control system for managing tissue thickness | |
| KR102342988B1 (ko) | Ihc 항원 영상 척도 외삽 방법 | |
| Kim et al. | An original approach for quantification of blood vessels on the whole tumour section | |
| KR102592030B1 (ko) | 착색용 공정 기록 슬라이드 및 이의 사용 방법 | |
| KR102342993B1 (ko) | 면역 조직 화학적 착색을 위한 공정 기록 슬라이드 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |