KR102592030B1 - 착색용 공정 기록 슬라이드 및 이의 사용 방법 - Google Patents
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Abstract
착색을 위한 공정 기록 슬라이드가 여기에 설명되어 있다. 공정 기록 슬라이드에는 샘플을 장착하기 위한 탐지 영역과 하나 이상의 제어 타깃을 포함하는 제어 영역이 포함된다. 또한 면역 조직 화학 (IHC) 또는 면역 화학 (ICC) 착색 공정에서 공정 기록 슬라이드를 사용하는 방법이 여기에 설명되어 있다.
Description
면역 조직 화학 방법 및 기타 면역 화학 방법들은 다단계 절차이다. 이러한 방법에는 시약 교환, 배양 및 세척이 포함된다. 이러한 절차에는 숙련된 인력과 종종 자동화된 착색 기계가 필요하다. 결과는 공정 품질 관리 표준이 불 균일 하거나 부족하기 때문에 실험실 또는 기관마다 크게 다를 수 있다. 처리된 슬라이드의 진단 해석은 대부분의 경우, 착색 과정에 관여하지 않은 병리학자의 주관적 분석에 의존한다.
본 개시의 양태는 첨부한 도면과 함께 읽을 때 다음의 상세한 설명으로부터 가장 잘 이해된다. 업계의 표준 관행에 따르면 다양한 기능이 확장되지 않는다. 사실, 다양한 기능의 크기는 논의의 명확성을 위해 임의로 늘리거나 줄일 수 있다.
도 1은 일부 실시 예에 따른 공정 기록 슬라이드이다.
도 2는 일부 실시 예에 따른 공정 기록 슬라이드이다.
도 3A는 일부 실시 예에 따른 제조 공정 동안의 공정 기록 슬라이드이다. 도 3B는 일부 실시 예에 따라 제조 공정이 완료된 후의 공정 기록 슬라이드이다. 도 3C는 일부 실시 예에 따른 착색 공정 후 공정 기록 슬라이드이다.
도 4는 일부 실시 예에 따른 파라핀 코팅을 포함하는 공정 기록 슬라이드이다.
도 5A 및 도 5B는 일부 실시 예에 따른 슬라이드의 1 차 타깃 밀도 구배 어레이 및 2 차 타깃 밀도 어레이이다.
도 6은 일부 실시 예에 따른 슬라이드의 항원 회수 타깃이다.
도 7은 일부 실시 예에 따른 슬라이드의 제어 영역이다.
도 8A 및 8B는 일부 실시 예에 따른 착색 공정 후의 슬라이드이다.
도 9는 일부 실시 예에 따른 슬라이드를 사용한 착색 공정이다.
도 10은 일부 실시 예에 따른 착색된 슬라이드의 이미징 결과이다.
도 11은 일부 실시 예에 따른 효소 증폭 공정이다.
도 12는 일부 실시 예에 따라 임의의 마우스 또는 토끼 기반 1 차 항체와 함께 작동하는 단일 1 차 항체 제어 슬라이드이다.
도 13은 일부 실시 예에 따라 하나의 마우스 기반 1 차 항체 및 하나의 토끼 기반 1 차 항체의 사용을 지원하는 이중의 1 차 항체 제어 슬라이드이다.
도 1은 일부 실시 예에 따른 공정 기록 슬라이드이다.
도 2는 일부 실시 예에 따른 공정 기록 슬라이드이다.
도 3A는 일부 실시 예에 따른 제조 공정 동안의 공정 기록 슬라이드이다. 도 3B는 일부 실시 예에 따라 제조 공정이 완료된 후의 공정 기록 슬라이드이다. 도 3C는 일부 실시 예에 따른 착색 공정 후 공정 기록 슬라이드이다.
도 4는 일부 실시 예에 따른 파라핀 코팅을 포함하는 공정 기록 슬라이드이다.
도 5A 및 도 5B는 일부 실시 예에 따른 슬라이드의 1 차 타깃 밀도 구배 어레이 및 2 차 타깃 밀도 어레이이다.
도 6은 일부 실시 예에 따른 슬라이드의 항원 회수 타깃이다.
도 7은 일부 실시 예에 따른 슬라이드의 제어 영역이다.
도 8A 및 8B는 일부 실시 예에 따른 착색 공정 후의 슬라이드이다.
도 9는 일부 실시 예에 따른 슬라이드를 사용한 착색 공정이다.
도 10은 일부 실시 예에 따른 착색된 슬라이드의 이미징 결과이다.
도 11은 일부 실시 예에 따른 효소 증폭 공정이다.
도 12는 일부 실시 예에 따라 임의의 마우스 또는 토끼 기반 1 차 항체와 함께 작동하는 단일 1 차 항체 제어 슬라이드이다.
도 13은 일부 실시 예에 따라 하나의 마우스 기반 1 차 항체 및 하나의 토끼 기반 1 차 항체의 사용을 지원하는 이중의 1 차 항체 제어 슬라이드이다.
다음의 개시는 제공된 주제의 상이한 특징을 구현하기 위한 많은 상이한 실시 예 또는 예를 제공한다. 본 개시를 단순화하기 위해 요소 및 배열의 특정 예가 아래에 설명된다. 물론 이들은 단지 예 일 뿐이며 제한하려는 것은 아니다. 예를 들어, 이어지는 설명에서 두 번째 특성을 덮는 또는 그 위에 첫 번째 특성을 형성하는 것은 첫 번째와 두 번째 특성이 직접 접촉하여 형성되는 실시 예를 포함할 수 있고, 첫 번째 및 두 번째 특성은 직접 접촉하지 않을 수도 있는 첫 번째 및 두 번째 특성 사이에 형성될 수 있는 추가 특성의 실시 예를 포함할 수도 있다. 또한, 본 개시는 다양한 예 들에서 참조 번호 그리고/또는 문자를 반복할 수 있다. 이러한 반복은 단순성과 명확성을 위한 것이며 그 자체가 논의된 다양한 실시 예 그리고/또는 구성 사이의 관계를 지시하는 것은 아니다.
면역 조직 화학 방법 및 기타 면역 화학적 방법의 경우, 자동 및 수동 절차 모두 관리가 부가되어야 하는 단계를 포함한다. 예를 들어 슬라이드의 표본이 손실되거나 손상되지 않도록 주의해야 한다. 잔류물이 증폭되므로 결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 시약 적용 간에 시료를 철저히 세척하고 이전 시약의 이월 그리고/또는 후속 시약의 원치 않는 희석을 방지하기 위해 과잉 액체를 제거하지만 시료가 건조되어서는 안된다. 또한 슬라이드 영역을 덮기 위해 충분한 항체 시약을 적용해야 하지만 시약 비용이 비싸기 때문에 낭비를 최소화해야 한다.
또한, 효소 용액 및 과산화요소 발색 시약과 같은 면역 화학적 방법 뿐 만 아니라 면역 조직 화학적 방법에 사용되는 시약은 작동 온도 또는 실온에서 제한된 안정성을 갖는다. 제한된 안정성은 시약을 자주 준비하게 한다. 또한, 잘못된 결과를 초래하는 비 특이적 항체 결합은 문제로 남아 있다.
일반적으로 면역 조직 화학 (IHC) 착색은 환자 조직 절편에서 특정 항원 부위의 존재를 평가하는 데 사용된다. IHC 분석에서는 비 정상 또는 암 상태의 진단 수준을 할당하기 위해 조직 절편의 착색 밀도에 대해 주관적인 해석이 적용된다. IHC 처리가 올바르게 작동하고, 마커가 존재한다면 비 정상 또는 암 상태를 식별하는 가시적 크로모겐 마커로 조직 절편에 표시될 것이라는 가정이 종종 이루어진다. 그러나 항원 회수 과정의 실패 또는 실험실 기술자의 실수 또는 착색 과정 중에 종종 식별 가능한 인공물이 남지 않는다. 이 경우 IHC 분석은 헤마톡실린 및 에오신 (H & E) 착색에 의해 제공된 것 이상을 제공하지 않는다. 또한 착색 과정의 실패 또는 실수는 때때로 오진으로 이어져 후속 치료에 영향을 미친다.
결과를 개선하고 시약 준비를 최소화하는 방법과 시약은 수동 및 자동 면역 조직 화학적 방법 모두를 용이하게 한다. 많은 개선은 효소 연계 면역 흡착 분석 (ELISA), 면역 형광 분석 및 현장 혼성화와 같은 관련 면역 화학적 방법에 쉽게 적용될 수 있다.
위와 같은 이유로 면역 조직 화학 법 및 면역 화학 법의 오류를 완전히 제거하는 것은 어렵다. 이와 같이 오류의 존재 그리고/또는 정도를 밝히는 다양한 방법이 개발되었다. 그 중 몇 가지 방법과 그 방법의 한계를 아래에서 설명한다.
"퀵겔(Quicgel) 방법에 의한 유방암에서 에스트로겐 수용체의 정량적 면역 세포 화학적 분석을 위한 제어 장치로서 배양된 세포의 사용"(전체가 본원에 참조로 포함됨)을 참조할 수 있다. 이 참조 문헌은 조직 고정, 처리 및 착색의 변화가 에스트로겐 수용체 (ER) 면역 조직 화학 분석의 불량한 재현성에 크게 원인이 됨을 나타낸다. ER 함량이 알려진 MCF-7 세포의 동결된 한천 현탁 알갱이를 55 개의 침습성 유방암 (IBC) 샘플 각각에 첨가하여 제어군으로 사용했다. 이미지 분석은 MCF-7 세포 및 IBC의 양성 영역 (분석된 총 핵당 양성 핵) 및 양성 착색 (양성 핵 영역의 광학 밀도 합계를 연구된 모든 핵의 광학 밀도 합계로 나눈 값)의 백분율을 결정했다. MCF-7 세포는 덱스트란 코팅된 목탄 분석에 의해 150 fmol/mg의 ER의 평균 값을 가졌다. 55 개 예에 포함된 MCF-7 세포의 이미지 분석은 평균 70.81의 양성 면적을 나타냈다. IBC 사례의 양성 착색은 0에서 98.5까지였다. 알려진 ER 함량과 MCF-7 세포의 양성 영역을 사용하여, 임상 표본의 양성 영역을 펨토몰(femtomole) 등가물로 변환하는데 전환 계수를 사용하였는데, 이는 55 개의 IBC에 대해 0에서 1,790 (평균, 187) 범위였다. ER의 알려진 펨토몰(femtomole)의 양이 있는 제어군을 포함하면 품질 관리 및 ER 정량을 위한 내부 표준이 제공된다.
중국 특허 공개 제102435728호 공보를 참조할 수 있다(전체 내용이 여기에 참조로 포함됨). 이 참조 문헌은 면역 조직 화학 공정의 품질을 검사하고 제어하기 위해 양성 제어군을 준비하고 활용하는 방법을 설명한다. 중국 특허 공개 제102435728호 공보에 따르면, 제어 타깃은 상이한 농도의 슬라이드에서 항체와 특이적으로 반응하는 폴리펩티드 또는 단백질을 흡착하여 구축된다. 그런 다음 샘플 조직을 슬라이드에 장착하고 기존의 면역 조직 화학 공정이 슬라이드에서 수행된다. 샘플 조직과 제어 타깃이 동일한 착색 과정을 거치기 때문에 폴리펩티드/단백질의 착색 결과는 조직에 대한 면역 조직 화학 과정의 결과를 나타낸다. 중국 특허 공개 제102435728호 공보는 또한 면역 조직 화학 슬라이드에 양성 제어 단백질 또는 폴리펩티드를 배열하는 방법을 설명한다.
중국 특허 공개 제102435728호 공보의 방법을 평가하는 일반적인 기술은 제어 타깃에서 단백질/펩티드의 밀도가 일치하지 않음을 이해할 것이다. 그 이유는 덱스트란 중합체에 대한 펩티드 부분의 결합은 혼합 용액의 점도, 덱스트란에서 과잉 펩티드를 제거하는 세척 공정 및 온도에 달려 있기 때문이다. 또한 침전된 중합체 알갱이의 크기는 욕조 농도, 반응 온도 및 NaOH 주입에 따라 달라진다.
중국 특허 공개 제102435728호 공보의 방법을 평가하는 일반적인 기술은 알려진 반응성 (착색 밀도)의 구축 타깃이 어렵다는 것을 이해할 것이다. 그 이유는 중합체 알갱이에서 사용 가능한 펩티드의 농도를 쉽게 유도할 수 없기 때문이다. 따라서 결과 제어군은 예/아니요 1 차 항체 검출기일 뿐이다.
중국 특허 공개 제102435728호 공보의 방법을 평가하는 일반적인 기술은 덱스트란이 타깃으로 삼을 항체에 대한 단백질을 포획할 수 있지만 포획된 단백질은 예/아니요 결과만을 제공한다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 예를 들어 디지털 이미징을 지원하기 위해 기준선 탐지 눈금자를 설정할 수 없다.
중국 특허 공개 제102435728호 공보의 방법을 평가하는 일반적인 기술은 슬라이드에 흡수된 단백질/펩티드가 항원 회수 과정 동안 종종 누출된다는 것을 이해할 것이다. 상대적으로 슬라이드 크기가 작으므로 제어 타깃과 샘플 영역 사이의 근접성으로 인해 누출된 단백질/펩티드가 조직 절편으로 이동할 수 있다. 따라서 누출은 공존하는 조직 절편에 결합하고 접착제를 밀어서 비 특이적 착색을 유발할 수 있다.
중국 특허 공개 제102435728호 공보에 설명된 것과 다르게 구성된 Horizon Diagnostics사가 제공한 슬라이드를 참조한다. Horizon Diagnostics사의 슬라이드에서 제어 타깃은 배양된 세포주다. 세포주는 DNA에 특정 항원 펩티드의 코딩 서열을 포함하도록 유전적으로 조작된다. 유전자 조작 세포는 포르말린에 의해 슬라이드의 조직 블록에 고정되고, 느슨한 세포 슬러리 형태로 파라핀화 된다. 또한 비 반응성 세포를 포함한 제어 타깃도 음성 제어군으로 슬라이드에 포함된다. 제어 타깃의 어레이를 생성하기 위해 각 셀 그룹은 다른 코어와 정렬된 실린더 코어로 형성되고, 전체 어레이는 슬라이드에 적용하기 위해 단일 절편으로 절단된다. 이러한 세포계는 원하는 대로 복제할 수 있으므로 재생 가능한 것으로 간주된다.
Horizon Diagnostics사에 의해 만들어진 슬라이드를 평가하는 일반적인 기술은 제어 타깃에 제시된 반응성 항원의 제어할 수 없는 밀도 변화로 인해 제어 타깃이 예/아니요 결과 만을 제공할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 그 이유는 세포의 양이나 세포가 생산하는 항원의 양을 조절하기 어렵기 때문이다. 따라서 각 제어 타깃에는 서로 다른 양의 항원이 포함된다. 또한 제어 타깃은 항원 회수 과정을 거치기 때문에 제어 타깃의 항원의 양에 또 다른 변수를 도입한다.
Horizon Diagnostics사에 의해 만들어진 슬라이드를 평가하는 일반적인 기술 중 하나는 각 세포의 항원의 양이 항원을 생성하는 세포주와 빈 세포주를 어떤 비율로 혼합하는 것만으로 잘 조절될 수 없다는 것을 이해할 것이다. 그 이유는 다른 세포주에서 정전기 전하가 종종 다르기 때문이다. 따라서, 다른 세포주는 종종 세포 배양 과정에서 해리되고 다른 세포의 절편으로 성장하여 항원 밀도 규모의 생성이 있을 것 같지 않거나 불가능하다.
Horizon Diagnostics사에 의해 만들어진 슬라이드를 평가하는 일반적인 기술은 세포 재생산이 제한된 복제 수명을 갖기 때문에 세포주 성과가 일관되지 않다는 것을 이해할 것이다. 새로운 세포주가 이전 세포주와 동일한 항원 밀도를 가질 것이라는 보장은 없다.
Horizon Diagnostics사에 의해 만들어진 슬라이드를 평가하는 일반적인 기술은 Horizon Diagnostics사의 제어 타깃을 만드는 것이 조직 블록을 구성하고, 블록을 분할하고, 슬라이드에 절단 절편을 적용하는데 필요한 수작업으로 인해 비용이 효율적이지 않다는 것을 이해할 것이다.
현미경 슬라이드에 장착된 세포 및 조직에서 수행되는 분석을 위한 제어 및 교정기 역할을 하는 방법 및 장치를 설명하는 미국 특허 공보 제2016/0274006A1호 공보 (전체 내용이 여기에 참조로 포함됨)를 참조할 수 있다. 미국 특허 공보 제2016/0274006A1호 공보의 장치는 투명한 구형 비드와 같이 입자 개체에 연결된 펩티드 항원 결정부와 같은 품질 제어 모이어티를 포함하고, 비드는 바람직하게는 대략 세포 크기이다. 품질 제어 모이어티는 분석에서 분석물과 유사한 방식으로 작동하도록 설계되어 양성 분석 반응을 생성한다. 비드는 새로운 액체 매트릭스에 의한 착색 단계 동안 현미경 슬라이드에 유지되며, 이는 건조 시에 응고되고 비드가 현미경 슬라이드에 부착되도록 한다.
그러나 이러한 미국 특허 공보 제2016/0274006A1호 공보의 제어 및 교정 솔루션은 실용성이 제한적이다. 제어 타깃 물질이 비드에 코팅되어 있고 드문드문 위치하고 있기 때문에 타깃의 안정성이 약하고 타깃 데이터를 추출하기가 어렵다. 또한 단일 비드를 이미징 할 때 착색 색상이 상부 중앙에서 테두리로 변경되어 추가 변수를 도입한다.
분석 공정, 특히 다단계 면역 조직 화학적 분석에 사용되는 시약의 품질을 결정하기 위한 장치 및 방법을 설명하는 미국 특허 공보 제7271008B2호 공보 (전체가 본원에 참조로 포함됨)를 참조할 수 있다. 특히, 장치는 기질에 부착된 복수의 화합물이 있는 기질을 포함하며, 여기서 각 화합물은 분석에 사용되는 시약과 반응한다.
미국 특허 공보 제7271008B2호 공보의 장치는 2 차 항체에 의한 착색을 평가하는 품질 관리를 제공한다. 그러나 미국 특허 공보 제7271008B2호 공보의 장치는 샘플과 함께 동일한 IHC 착색 단계를 거치지 않는다. 따라서 장치에 의한 IHC 착색의 대표성이 제한된다. 또한 이 장치는 기질에 아미노-실란을 사용하므로 항원 회수 처리에서 살아남을 수 있는 공유 결합을 형성할 수 없다. 또한, 알칼리성 포스파타아제 타깃은 항원 회수 온도에 노출되면 분해된다. 따라서 미국 특허 공보 제7271008B2호 공보의 장치는 IHC 착색 과정에서 알려지지 않은 변수를 도입하는 것으로 알려진 항원 회수 과정을 모니터링하는 데 유용하지 않다.
상기의 관점에서, 본 명세서는 일부 실시 예에서 공정 기록 슬라이드 및 이러한 문제를 해결하는 착색 방법을 설명한다. 구체적으로, 본 명세서는 환자 샘플과 제어 타깃이 착색 과정에 공존하고 경험할 수 있도록 하는 공정 기록 슬라이드를 설명한다. 이와 같이, 샘플 처리에서 제어 타깃도 착색되며, 이는 알려진 타깃 기준선에 대한 편차로서 처리 오류의 존재 및 정도를 나타낸다. 일반적인 기술의 하나는 샘플에 적용된 착색 시약의 농도 변화가 주관적 분석에 영향을 미칠 것임을 인식할 것이다. 과도한 1 차 항체는 종종 조직 절편에 비 특이적 착색을 유발한다. 항원 회수 처리를 무시하면 1 차 항체, 2 차 항체 및 크로모겐 시약의 효능이 착색 색상 밀도 (조직 절편의 항원 밀도 표시)에 영향을 미친다. 항체 단백질의 노화는 Fab와 Fc 영역 사이의 경첩(hinge)이 곧 끊어지고 이어서 Fc 영역이 분할된다. Fab 및 Fc 영역을 모두 포함하는 항체 만이 성공적으로 작동한다. 침전용 발색제를 포함하는 많은 크로모겐 시약은 수명이 짧으며 일부는 몇 시간 정도로 짧다. 결과적으로 노화 정도가 다른 크로모겐 시약은 성능이 다르기 때문에 착색 색상 밀도가 달라진다. 따라서 시약의 성능은 관찰된 샘플의 착색 색상 밀도에 영향을 미칠 수 있다. 시료와 제어 타깃 모두 동일한 착색 시약을 사용하기 때문에 분석을 위한 보다 객관적인 정보를 제공하기 위해 제어 타깃에서 시약 수명과 양의 변화를 고려한다. 이러한 실시 예에 따르면, 공정 기록 슬라이드는 모든 IHC 및 ICC 슬라이드에서 사용될 수 있도록 비용에 민감한 가격대 내에서 바람직한 정확도 및 정밀도로 효과적인 공정 품질 관리(QC)를 제공할 수 있다.
공정 기록 슬라이드
일부 실시 예에서, 본 명세서는 공정 기록 슬라이드에 관한 것이다. 본 명세서에서 "공정 기록 슬라이드"라는 용어는 "슬라이드", "PRS" 또는 "PRS-IHC"라고도 한다. 용어 "PRS-IHC"에서 "IHC" 부분은 슬라이드의 구성 또는 기능을 면역 조직 화학 (IHC) 착색에만 제한하는 것을 의미하지 않는다. 오히려, 일반적인 기술의 하나는 본원에 기술된 공정 기록 슬라이드가 면역 화학 (ICC)과 같은 다른 착색 공정에도 사용될 수 있음을 이해할 것이다.
일부 실시 예에서, 본 명세서는 면역 조직 화학 (IHC) 또는 면역 화학 (ICC) 분석에 일반적으로 관련된 단계의 효능을 쉽게 결정할 수 있는 공정 기록 슬라이드에 관한 것이다. 이러한 단계에는 파라핀 제거, 항원 회수, 1 차 착색, 2 차 착색 등이 포함된다.
도 1을 참조하면, 일부 실시 예에서, 공정 기록 슬라이드 (100)는 기판 (101), 접착층 (103) 및 하나 이상의 제어 타깃 (141)을 포함한다.
일부 실시 예에서 기판 (101)은 유리 기판, 플라스틱 기판 또는 중합체 기판을 포함한다.
일부 실시 예에서, 접착층 (103)은 접착제를 포함한다. 일부 실시 예에서, 접착제는 유리 기판과 같은 기판 (101)에 공유 결합한다.
일부 실시 예에서, 접착제는 슬라이드 상에 약간 친수성 표면을 제공한다. 일부 실시 예에서, 접착제의 재료는 생체 재료에 제공되고 표면 습윤성을 위해 제조 시, 조정 가능한 말단 그룹을 포함한다. 일부 실시 예에서, 말단기는 -ROH, -R(C=O)OH, -RNH3, -R(C=O)NH2 및 -RNH2로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 기를 포함한다. 일부 실시 예에서, 접착층 (103)은 써모-피셔 수퍼 프로스트(Thermo-Fisher Super Frost) 슬라이드 GL4951P의 코팅에서 발견되는 접착제와 동일하거나 유사한 접착제를 포함한다.
일부 실시 예에서, 하나 이상의 제어 타깃 (141)은 접착층을 통해 기판층 위에 침착 된다. 일부 실시 예에서, 하나 이상의 제어 타깃은 슬라이드 (100)의 제어 영역 (140)에 배치된다.
일부 실시 예에서, 제어 타깃 (141)은 IHC 또는 ICC 공정에 사용되는 하나 이상의 시약과 반응하고 색상 형태의 판독과 같은 판독을 생성하는 화학적 화합물을 포함한다. 각각의 제어 타깃 (141)은 상이한 농도의 화합물을 포함한다. 화학적 화합물의 농도 변화는 IHC 또는 ICC 공정에서 하나 이상의 시약과의 상호 작용 후 제어 타깃 (141) 사이에 식별 가능한 차이를 제공한다.
일부 실시 예에서, 공정 기록 슬라이드 (100)는 슬라이드 (100)의 전체 또는 일부를 덮는 보호 코팅 (105)을 더 포함한다. 일부 실시 예에서, 보호 코팅 (105)은 외부 환경으로부터 제어 타깃 (141)을 밀봉한다. 아래에 설명된 바와 같이, 제어 타깃 (141)은 때때로 단백질, 펩티드 또는 생물학적 기원의 다른 타깃을 포함한다. 따라서, 보호 코팅 (105)은 산화 또는 미생물 공격으로부터 제어 타깃 (141)을 보호한다.
일부 실시 예에서, 보호 코팅 (105)은 파라핀 코팅이다. 이들 실시 예에 따르면, 파라핀 코팅은 동일한 탈 파라핀화 단계에 의해 IHC 또는 ICC 분석에 의해 연구될 조직/세포 샘플 상에 매립 파라핀과 함께 제거된다.
도 1-3C을 참조하면, 일부 실시 예에서, 공정 기록 슬라이드 (100)는 샘플을 수용하도록 구성된 검출 영역 (120) 및 제어 영역 (140)을 포함한다.
일부 실시 예에서, 검출 영역 (120)은 조직 절편 또는 느슨한 세포와 같은 환자 샘플을 보유하도록 구성된다.
일부 실시 예에서, 제어 영역 (140)은 검출 영역에 보유된 샘플과 함께 착색 공정을 겪는 하나 이상의 제어 타깃(141)을 보유한다.
일부 실시 예에서, 검출 영역 (120) 및 제어 영역 (140)은 표시된 경계를 갖는다. 일부 실시 예에서, 감지 영역 (120) 및 제어 영역 (140)은 마킹 된 경계를 갖지 않고 각각의 기능에 따라 분류된다.
일부 실시 예에서, 제어 타깃 (141)은 하나 이상의 제어 타깃 로딩 도트 (1411)의 형태로 배열된다. 일부 실시 예에서, 로딩 도트는 규칙적 또는 불규칙한 형상이다. 일부 실시 예에서, 원, 타원, 정사각형 또는 다이아몬드 모양을 포함하는 규칙적인 모양이다. 일부 실시 예에서, 제어 타깃 (141)은 2D 또는 3D 구성으로 배열된다.
일부 실시 예에서, 제어 타깃 (141)은 제어 타깃 로딩 도트 (1411)의 하나 이상의 어레이와 같은 하나 이상의 제어 타깃 어레이 (1415)의 형태로 배열된다. 일부 실시 예에서, 각각의 제어 타깃 어레이 (1415)는 동일하거나 유사한 화학적 및 생화학적 특성을 갖는 한 유형의 제어 타깃을 포함한다. 일부 실시 예에서, 각각의 제어 타깃 어레이 (1415)는 대조되는 광학 특성을 초래하는 한 유형의 제어 타깃을 포함한다.
이러한 실시 예에 따르면, 검출 영역 (120)과 제어 영역 (140)이 동일한 슬라이드에 위치하기 때문에, IHC 또는 ICC 공정 동안, 샘플은 검출 영역 (120)에 유지되고 제어 영역 (140)의 제어 타깃 (141)은 동일한 착색 단계를 거친다 (도 9 참조). 이와 같이, 제어 타깃 (141)의 착색 정도는 IHC 또는 ICC 과정에서 발생한 공정 오류의 유무와 정도를 나타내며, 제어 타깃 (141)은 IHC 또는 ICC 과정의 공정 오류를, 알려진 타깃 기준선에 대한 편차로 분석할 수 있도록 한다. 또한, 후속 디지털 이미지 캡처 및 공정과 함께, 착색된 제어 타깃 (141)은 두 가지 척도를 포함하는 항원 밀도 눈금자 역할을 할 수 있다: 예를 들어 진단 결정과 같은 도움을 제공하기 위해 공존 샘플에 적용될 수 있는 수치 항원 밀도 및 색상 밀도.
일부 실시 예에서, 제어 타깃 (141)은 제어 타깃 (141)이 IHC 또는 ICC 착색에 일반적으로 사용되는 전 처리 단계에 의해 현저하게 영향을 받지 않도록 슬라이드 위에 침착 된다. 일부 실시 예에서, 전 처리 단계는 탈 파라핀화 또는 항원 회수를 포함한다. 전 처리 단계는 아래에 자세히 설명되어 있다.
일부 실시 예에서, 슬라이드 (100)는 슬라이드 정보 영역 (160)을 더 포함한다. 일부 실시 예에서, 슬라이드 정보 영역 (160)은 로트 번호, 제조일, 제어 타깃 유형 등과 같은 슬라이드의 유형에 대한 정보를 포함한다. 제어 타깃 유형에 대한 정보와 같은 슬라이드 정보가 광범위하기 때문에, 일부 실시 예에서, 슬라이드 정보 영역 (160)은 슬라이드 정보를 기록하는 바코드를 포함한다. 일부 실시 예에서, 바코드는 슬라이드의 상세한 설명에 대한 웹 사이트 링크를 포함한다.
도 3을 참조하면, 일부 실시 예에서, 슬라이드 (100)는 돌출 구조 (107)를 더 포함한다. 이들 실시 예에 따르면, 돌출 구조 (107)는 적층 될 때 인접한 슬라이드가 파라핀 코팅 또는 제어 타깃을 손상시키지 않도록 보장한다. 일부 실시 예에서, 돌출 구조 (107)는 제어 영역 (140)을 넘어 연장되는 한 쌍의 바 또는 다중 도트를 포함한다. 이러한 범퍼는 직접 인쇄 잉크젯 라벨 프린터가 일반적으로 매거진의 바닥으로부터 표시되지 않은 슬라이드를 공급하는 것을 돕는다. 따라서 범퍼는 매거진으로부터 조제하는 동안 한 슬라이드가 다른 슬라이드 위로 미끄러질 때 파라핀 코팅과 아래의 타깃이 손상되지 않도록 한다.
보호 코팅
일부 실시 예에서, 보호 코팅 (105)은 파라핀 코팅이다.
도 4를 참조하면, 일부 실시 예에서, 파라핀 코팅은 제어 타깃을 밀봉하는 제어 타깃 위의 파라핀 왁스 코팅이다.
일반적으로 파라핀 왁스는 석유, 석탄 또는 오일 셰일에서 파생된 흰색 또는 무색의 연질 고체이며, 20~40 개의 탄소 원자를 포함하는 탄화수소 분자의 혼합물로 구성된다. 이것은 실온에서 고체이며 약 37°C (99°F) 이상에서 녹기 시작한다. 끓는점은 370°C (698°F) 이상이다. 파라핀 왁스의 일반적인 응용 분야에는 윤활, 전기 절연 및 양초가 포함된다: 착색 파라핀 왁스는 크레용으로 만들 수 있다. 그것은 때때로 파라핀이라고 불리는 등유 및 기타 석유 제품과 구별된다.
병리학 실험실에서, 물이 없는 파라핀 왁스는 조직의 얇은 샘플을 절단하기 전에 포름알데히드 고정 조직을 스며들게 하는데 사용된다. 이 절차에서는 알코올의 강도 (75 %에서 절대치)를 통해 조직에서 물을 제거하고 자일렌과 같은 유기 용매 또는 자일롤과 같은 지방족 대체물 중 하나에서 조직을 제거한다. 그런 다음 조직을 진공 오븐에서 일정 시간 동안 액체 파라핀 왁스에 넣어 모든 공기가 추출되었는지 확인한 다음, 액체 왁스로 몰드 블록 프레임에 넣어 냉각 및 고형화 한다. 그런 다음 절편을 마이크로톰으로 자른다.
조직 절편을 파라핀에 매립하는 것은 장기간 동안 생검 조직을 보존하기 위한 관행이다. 그러나, 본 발명자들이 알고 있는 한, 현미경 슬라이드의 선택된 영역에 코팅층으로서 파라핀을 적용하는 것은 보고되지 않았다.
아래에 설명된 바와 같이, 제어 타깃 슬라이드는 펩티드 또는 단백질을 포함하므로 박테리아 또는 진균에 대한 풍부한 식품 공급원이 된다. 펩티드와 단백질, 그리고 이의 항원 부위 (예: 항원결정부)는 때때로 항체에 결합하는 능력을 손상시키는 산화에 민감하다. 또한 후속 반응에는 수산기가 포함되며, 이는 공기 중 산 및 염기와의 반응을 통해 손상될 수 있다. 따라서 단백질 침착물이 포함된 슬라이드는 종종 미생물 성장을 지원하는 온도보다 낮은 온도에서 보관해야 하며 진공 밀봉 상태로 포장해야 한다. 환경에 노출된 슬라이드와 같이 보호되지 않은 슬라이드는 주변 온도, 습도 및 공기 오염 수준에 따라 보관 수명이 2~5 일로 짧다. 이는 침착물의 효과적인 활용을 제한하는 제약이다.
파라핀은 항 진균 및 항균 기능을 가지고 있으며 밀봉된 물질의 산화를 방지한다. 본 발명자는 파라핀 코팅이 생체 재료의 수명을 3~5 일에서 1~2 년으로 연장하여 공정 기록 슬라이드의 유통 기한을 크게 증가시킨다는 것을 발견했다.
샘플에서 매립 파라핀의 제거는 일반적으로 IHC 또는 ICC 착색 중에 수행된다 (이 공정은 "파라핀 제거" 라고 함). 따라서, 일부 실시 예에서, 보호층 (105)에 포함된 파라핀의 제형은 매립 공정에서 사용되는 파라핀의 제형과 동일하거나 유사하다. 이와 같이 파라핀 코팅은 파라핀 제거와 동시에 제거할 수 있어 착색 과정을 단순화할 수 있다.
일부 실시 예에서, 파라핀은 액화되고, 슬라이드에 적용되고, 고체화 되어 파라핀 코팅을 형성한다.
일부 실시 예에서, 파라핀은 용매와 혼합되어 실온에서 물질 상태를 고체에서 액체로 변화시킨다. 일부 실시 예에서, 용매는 자일렌 또는 지방족 용매, 예를 들어 자일롤을 포함한다. 용매와 혼합하면 점도가 감소하고 침착 후 응고 속도가 느려진다. 일부 실시 예에서, 용매는 톨루엔, 페인트 시너, 테레빈 유, 또는 아세톤 및 등유의 50:50 혼합물을 포함한다. 파라플라스트 엑스트라(Paraplast X-tra)는 페놀계 산화 방지제인 부틸화 하이드록시톨루엔을 추가적으로 포함하여 단백질, 펩티드 또는 무기 타깃의 산화 분해를 더욱 감소시킨다.
일부 실시 예에서, 고체 파라핀은 파라핀 용융 온도인 75°C를 넘지 않는 온도에서 용융된다. 녹은 파라핀은 포화점이 관찰될 때까지 (즉, 고체가 형성될 때까지) 지방족 용매와 함께 천천히 첨가된다. 혼합물을 약 45°C로 냉각시킨다. 혼합물이 완전히 맑아 질 때까지 추가의 지방족 용매를 첨가한다.
일부 실시 예에서, 파라핀 코팅은 현미경 슬라이드에 미리 침착 된 생체 재료 및 특수 착색 반응성 침착물 위에 도포된다. 아래에 설명된 바와 같이 생체 재료에는 단백질, 펩티드, 접합된 단백질, 단백질 코팅된 비드, 펩티드 코팅된 비드, 접합된 코팅된 비드, 착색 물질을 고유하게 포착하는 특수 착색 반응성 말단기 등이 포함된다.
일부 실시 예에서, 파라핀은 스프레이, 잉크젯 침착, 패드 인쇄와 같은 전사 인쇄, 스크린 인쇄 및 증기 침착에 의해 슬라이드에 적용된다. 일부 실시 예에서, 파라핀 코팅은 제어 타깃 및 제어 타깃을 둘러싸는 슬라이드 표면 모두를 밀봉하는 일체형(monolithic) 표면 코팅으로 파라핀 입자를 용융 및/또는 혼합하기 위해 가열함으로써 슬라이드 위에 적용된다.
일부 실시 예에서, 파라핀 코팅이 슬라이드에 적용된 후, 슬라이드가 가열되어 파라핀으로부터 용매를 제거함으로써 파라핀이 경화된 상태로 되돌아가는 것을 보장한다. 용매를 제거하는 공정은 슬라이드의 파라핀 왁스면에서 적외선을 조사하여 수행된다. 이 방법은 파라핀 또는 파라핀 아래에 있는 생체 물질보다 용매를 우선적으로 타깃으로 하여 필요한 열 에너지를 최소화한다. 증발된 용매는 지장없이 파라핀을 자유롭게 떠난다.
일부 실시 예에서, 파라핀은 정제된 파라핀, 합성 중합체 및 기타 물질의 혼합물이다. 일부 실시 예에서, 파라핀의 바람직한 용융 온도, 경도 및 점도는 성분의 비율에 대해 실험함으로써 얻어진다.
일부 실시 예에서, 파라핀 코팅은 5 미크론 이하의 두께를 갖는다.
일부 실시 예에서, 보호 코팅 (105) 내의 파라핀은 56°C 미만과 같은 60°C 미만의 용융 온도를 갖는다.
일부 실시 예에서, 파라핀은 자일렌, 자일롤 또는 그의 지방족 대체물에 의해 용해될 수 있다.
일부 실시예에서, 파라핀 제형은 써모 피셔(Thermo Fisher)에 의한 티슈 프렙(TissuePrep) 및 티슈 프렙 2(TissuePrep 2), 용융 온도 56°C, 라이카(Leica)에 의한 파라플라스트 & 파라플라스트 플러스(Paraplast & Paraplast Plus), 용융 온도 56°C, 라이카(Leica)에 의한 파라플라스트 엑스트라(Paraplast X-tra), 용융 온도 50-54°C를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시 예에서 파라핀 코팅의 주변 온도 경도는 제형에 아직 첨가되지 않은 경우 첨가된 부틸화 하이드록시톨루엔과 함께 이용 가능한 가장 단단한 제형으로 선택된다.
1 차 타깃 및 1 차 타깃 어레이
일부 실시 예에서, 제어 타깃 (141)은 1 차 항체 시약을 시험하기 위한 하나 이상의 1 차 타깃을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "1 차 타깃"은 FcyR1 부위 중 하나에 의해서만 1 차 항체에 특이적으로 결합하는 반응성 및 비 반응성 요소의 조성물을 의미한다. 본원에 사용된 용어 "1 차 단백질"은 1 차 항체의 FcyRI에 결합하는 단백질을 의미한다. 본원에 사용된 용어 "1 차 더미 단백질"은 임의의 1 차 항체 또는 2 차 항체에 반응하지 않을 단백질을 의미한다. 본원에 사용된 용어 "최대 타깃 밀도"는 인접한 단백질의 최대 단층 밀도를 의미한다. 본원에 사용된 용어 "대용 항원"은 IHC 또는 ICC 분석에서 사용되는 1 차 항체에 의해 표적화 되지 않지만 그럼에도 불구하고 예를 들어 두 FcyRI 영역 중 하나만을 통해 1 차 항체에 결합하는 단백질을 의미하고, 이 1 차 항체(마우스 또는 토끼 기반)는 IHC 또는 ICC 분석에 사용된다. 본원에 사용된 용어 "마우스 전용 대용 항원"은 마우스 기반 1 차 항체의 FcyRI에만 고유하게 반응하는 단백질 또는 항원을 의미한다. 본원에 사용된 용어 "토끼 전용 대용 항원"은 토끼 기반 1 차 항체의 FcyR1에만 고유하게 반응하는 펩티드 또는 단백질을 의미한다.
태반 포유 동물 단백질은 중량이 50-65kDa 범위이다. 1 차 항체 IgG 단백질은 일반적으로 Y 모양으로 모형화 되는 2 개의 Fab 및 1 개의 Fc 영역으로 구성된다. Fc는 경첩(hinge)에 의해 두 개의 Fab 영역에 연결된다. 모든 비 접합 항체는 길항제 항원 펩티드에 의한 숙주의 접종을 통해 숙주 포유류 (대부분 마우스 또는 토끼) 내에서 성장한다. 숙주는 짝짓기 항원을 포획할 수 있는 항체의 Fab 영역의 N-말단 근처에 결합 아미노산 서열을 조립하여 문제가 되는 길항제 항원 펩티드와 싸우는 항체를 생산한다. 항체의 Fc 영역은 항상 숙주 포유류의 영역이다. 숙주 항체의 Fc 영역은 전형적으로 가장 낮은 것에 대한 가장 높은 결합 친화도의 순위로 2 차 항체에 이용 가능한 3 개의 결합 부위를 갖는다: FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) 및 FcyRIII (CD16).
1 차 더미 단백질은 종종 2 차 항체에 결합할 수 있기 때문에 마우스, 토끼, 염소, 소 및 양에 반응하지 않는 것으로 선택된다. 일부 실시 예에서, 더미 1 차 단백질은 말, 당나귀, 얼룩말, 맥 또는 코뿔소와 같은 말 과(科)의 임의의 구성원이다. BSA (소 혈청 알부민)는 BSA가 열과 시간 없이는 조직이나 대부분의 슬라이드 접착 화학물에 공유 결합하지 않기 때문에 적합한 단백질이 아니다. 소, 양, 염소도 적절한 더미 단백질이 아니며, 일부 경우 이러한 단백질은 1 차 항체의 특이성에 따라 마우스 또는 토끼와 혼동될 수 있다.
1 차 단백질은 숙주 항-마우스 또는 숙주 항-토끼이다. 호스트는 염소 또는 말과(科)의 구성원으로 제한된다.
펩티드에 기초한 1 차 단백질은 또한 KLH 서브 유닛 (키홀 림펫 헤모시아닌)과 같은 운반 단백질에 공유적으로 부착된 C-말단에 시스테인 잔기를 갖는 마우스 또는 토끼 FcyRI 반응성 펩티드로 구성될 수 있다. KLH 서브 유닛은 결합을 통해 펩티드의 시스테인 잔기에 결합하는 유리 아민 부위에서 황-SMCC(Sulfo-SMCC)로 활성화된다. 활성화되지 않은 KLH 서브 유닛만으로도 1 차 더미 단백질을 만들기에 충분하다.
완전한 단백질인 KLH는 약 8000kDa라는 점에 유의하는 것이 중요하다. 완전한 단백질 상태에서는 pH 또는 온도에 대해 안정하지 않아 단백질이 서브 유닛으로 분리된다: 390kDa의 KLH1 및 350kDa의 KLH2. 이러한 서브 유닛 중 하나는 황-SMCC(Sulfo-SMCC)가 활성화될 때 일반적으로 펩타이드의 C-말단에 시스테인 잔기가 있는 펩타이드에 대해 운반 단백질로 사용될 수 있다.
도 5A를 참조하면, 일부 실시 예에서 1 차 타깃은 1 차 타깃 어레이 (1415)로 배열된다. 일부 실시 예에서, 1 차 타깃 어레이 (1415)는 1 차 타깃 밀도 구배 어레이이다. 어레이 내의 각 타깃은 동일한 최대 타깃 밀도 (단백질/표면적)를 가져야 한다. 그러나 1 차 및 더미 1 차 단백질 사이의 비율은 넓은 범위의 1 차 항체 희석물을 식별할 수 있도록 비율로 조정된다. 일반적으로 두 개의 1 차 대용 항원 타깃에 의한 검출은 농도를 검출 전달 곡선에 그리기에 충분하다. 일부 실시 예에서, 1 차 타깃 밀도 구배 어레이는 복수의 1 차 타깃 로딩 도트를 포함하며, 여기서 하나의 어레이는 마우스 기반이고 다른 하나는 토끼 기반이다.
일부 실시 예에서, 1 차 타깃의 밀도는 100 %, 80 %, 60 %, 40 % 등과 같은 선형 방식으로 증가 또는 감소한다. 일부 실시 예에서, 1 차 타깃의 밀도는 100 %, 33 %, 10 %, 3 % 등과 같은 대수 방식으로 증가 또는 감소한다.
일부 실시 예에서, 1 차 타깃 밀도 구배 어레이에서, 가장 높은 1 차 타깃 밀도를 갖는 로딩 도트에서 1 차 타깃 밀도가 충분히 높아서 1 차 타깃이 착색 공정 동안 로딩 도트를 포화 상태로 만들 수 없다.
일부 실시 예에서, 보편적 대용 항원은 단백질 A 또는 단백질 G이다. 단백질 A는 FcyRI 및 태반 포유 동물의 Fab 영역 내의 일부 영역에 결합한다. 단백질 G는 대부분의 태반 포유류의 FcyRI 부위에만 결합한다.
일부 실시 예에서, 대용 항원은 마우스 또는 토끼에만 특이성을 가져야 한다. 특이성을 뒷받침하기 위해 대용 항원은 각각 항-마우스 및 항-토끼 단백질, 운반 단백질 위의 항-마우스 및 항-토끼 펩티드, 또는 각각 항-마우스 및 항-토끼 VHH 단백질 영역으로 구성될 수 있다.
일부 실시 예에서, 더미 대용 항원은 말과(科)의 동물 또는 염소를 제외한 발굽이 달린 태반 포유 동물의 항체를 포함한다. 말과(科)에는 말, 당나귀, 맥, 코뿔소 및 노새와 같은 동물이 포함된다. 말과(科)는 진화적으로 그리고 유전적으로 더 멀리 떨어져 있어 비 특이적 착색의 발생을 줄인다. 염소는 2 차 착색이 순차 상 항-염소 단백질을 사용하기 때문에 자주 사용할 수 없으며, 이는 반응하지 않은 염소 1 차 부위에 결합한다.
착색 과정에서 사용되는 대용 항원과 1 차 항체 사이의 상호 작용 방식은 실제 항원과 1 차 항체 사이의 상호 작용 방식과 다르지만, 대용 항원 타깃은 1 차 항체의 효능에 대한 평가를 제공할 수 있다. 1 차 항체는 mg/ml 단위의 농도 분석과 함께 제공된다. 그러나 분석은 완전한 IgG 단백질을 나타내는 분석 비율을 가리키지 않는다. 타깃에서 대용 항원의 밀도 농도가 알려져 있기 때문에 적용된 1 차 항체 농도의 포획을 결정할 수 있다. 외삽에 의해 공존하는 조직 절편의 항원 밀도를 결정할 수 있다. 조직에서 항원 밀도의 분해능은 1 차 항체 (단일 클론성 또는 다 클론성)에 의한 누적 변위, 2 차 항체 및 2 차 착색의 효소 이득으로 제한된다. 적용된 1 차 항체의 농도는 조직 유형에 따라 다르며 항상 약간의 초과 한계가 포함된다. 따라서, 1 차 항체가 변위 한계 내에서 사용 가능한 모든 항원 부위에 결합할 것이라고 가정한다.
일부 실시 예에서, 1 차 타깃 밀도 구배 어레이는 보편적인 대용 항원의 로딩 도트 어레이이다. 일부 실시 예에서, 어레이의 로딩 도트는 대용 항원의 밀도 증가 또는 감소를 포함한다. 일부 실시 예에서, 대용 항원은 더미 대용 항체와 같은 하나 이상의 더미 단백질과 혼합되고, 대용 항원의 농도 증가 또는 감소는 최대 타깃 농도를 유지하면서 대용 항원과 더미 단백질 사이의 비율을 변경함으로써 달성된다.
일부 실시 예에서, 제어 영역 (140)은 대용 항원 타깃의 적어도 2 개의 어레이를 포함한다. 일부 실시 예에서, 제어 영역 (140)은 항-마우스 항체를 포함하는 제 1 대용 항원 타깃 어레이 및 항-토끼 항체를 포함하는 제 2 대용 항원 타깃 어레이를 포함하며, 둘 다 더미 대용 항원과 혼합되어 최대 타깃 농도를 유지하면서 원하는 반응성 밀도를 형성한다.
따라서, 이들 구체 예에 따르면, IHC 또는 ICC 단계에서 대용 항원 1 차 타깃은 효소 이득 및 2 차 타깃에 의해 개발된 항원 회수 인자를 사용하여 1 차 항체 농도를 평가할 수 있다.
항원 회수 타깃
일부 실시 예에서, 제어 영역 (140)은 항원 회수 타깃을 포함한다.
IHC 및 ICC 착색 분석은 종종 항원 회수 ("AR"이라고도 함) 공정을 포함한다. AR 공정은 열 유도 항원결정부 회수 (HIER) 방법 또는 온수 항원 회수 방법으로 수행할 수 있다. 사용된 방법과 특정 방법의 구현에 따라 상당한 양의 변형이 소개되고 그 결과는 실무자마다 그리고 슬라이드마다 다양하다. AR 버퍼 및 버퍼 온도의 직접 측정은 종종 정확하지 않다. 그러나 적절한 제어가 없으면 실무자들은 AR 버퍼의 온도와 조건이 이상적이라고 맹목적으로 가정해야 하는 경우가 많다. 따라서 통제력이 부족하면 AR 공정이 최종 평가에 포함되지 않아 잘못된 판단을 내릴 수 있다.
AR 공정에서 가장 일반적인 문제는 항원의 회수 부족 또는 과다 회수이다. 회수 부족 상태는 AR 온도가 너무 낮거나 노출 시간이 충분하지 않은 경우 발생한다. 과다 회수된 상태는 AR 온도가 너무 높거나 AR 상태에 대한 노출이 너무 길거나 AR 버퍼 상태가 너무 가혹할 때 발생한다 (예 : pH 9.5 초과 또는 pH 5.5 미만).
따라서, 일부 실시 예에서, 항원 회수 타깃은 AR 공정 동안 회수 부족, 명목 회수 및 회수 과다에 대한 표시를 제공하도록 구성된다.
일부 실시 예에서, 제어 영역 (140)은 3D AR 타깃 (ARM3D) 및 2D 타깃 (ARM2D)을 포함한다. 2D 및 3D 타깃은 아래 부분에서 자세히 설명한다.
일부 실시 예에서, ARM2D 타깃은 최소의 포름알데히드 고정을 갖는 100 % 농도의 마우스 및 토끼 단백질 (또는 다른 종으로부터의 단백질)의 50:50 혼합물을 포함한다. 일부 실시 예에서, 단백질은 IgG이다. 2D 타깃은 해당 3D 타깃보다 적은 신호를 생성하고 ARM2D 타깃은 최소한의 고정을 갖기 때문에 ARM2D 타깃의 착색은 불충분한 항원 회수를 나타낸다.
일부 실시 예에서, ARM3D 타깃은 포름알데히드로 과다 고정된 3D 비계에 침착 된 100% 농도의 마우스 및 토끼 단백질 (또는 다른 종으로부터의 단백질)의 50:50 혼합물을 포함한다. 3D 타깃은 해당 2D 타깃보다 더 많은 신호를 생성하고, ARM3D 타깃이 과다 고정되어 있기 때문에 ARM3D 타깃의 착색이 없으면 AR 공정이 너무 공격적임을 나타낸다.
일부 실시 예에서, 항원 회수 타깃은 ARM2D 또는 ARM3D 타깃에 더하여 1 차 타깃 구배 어레이 또는 2차 타깃 구배 어레이를 추가로 포함한다. 일부 실시 예에서, 1차 타깃 어레이 또는 2차 타깃 어레이는 전술한 것과 동일하거나 유사하다.
일부 실시 예에서, 2차 타깃 구배 어레이는 마우스 또는 토끼 밀도 구배 어레이이다. 이들 실시 예에 따르면, 마우스 및 토끼 구배 밀도 어레이의 10 % ~ 30 % 이하의 타깃 도트가 가시적인 착색을 나타내지 않을 때, 명목상 회복된 상태가 표시된다. AR 공정의 정도는 착색되지 않은 저 농도 2 차 타깃의 수로 평가할 수 있다.
2D/3D 타깃
일부 실시 예에서, 1 차 타깃, 2 차 타깃 또는 항원 회수 타깃과 같은 제어 타깃은 2D 타깃을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "2D 타깃"은 펩티드, 단백질, 항원, 항체 또는 임의의 다른 제어 타깃 물질이 슬라이드의 2D 평면에 침착됨을 의미한다.
2D 타깃은 침착하기가 더 쉽고 따라서 제조 비용이 상대적으로 저렴하다. 따라서 비용이 고려될 때 2D 타깃이 사용된다.
일부 실시 예에서, 1 차 타깃, 2 차 타깃 또는 항원 회수 타깃과 같은 제어 타깃은 3D 타깃을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "3D 타깃"은 펩티드, 단백질, 항원, 항체 또는 임의의 다른 제어 타깃 물질 중 적어도 하나가 지지 구조에 적용되고 복합물이 슬라이드의 3D 공간에 침착됨을 의미한다.
하나 이상의 실시 예에서, 3D 타깃은 슬라이드에 3D 비계를 형성하고 비계에 제어 타깃 재료를 침착함으로써 구성된다. 일부 실시 예에서, 3D 비계는 다당류 클러스터이다. 다당류는 펩타이드 또는 단백질 표면에서 수산기 또는 아민 그룹과 공유 결합을 형성하여 단백질을 함께 연결하고 타깃을 슬라이드 코팅 접착제에 고정시킨다. 일부 실시 예에서, 제어 타깃은 포름알데히드 고정에 의해 3D 비계에 고정된다. 그런 다음 타깃은 2D 및 3D 구성 요소로 구성된다.
하나 이상의 실시 예에서, 3D 타깃은 1 차 또는 2 차 타깃 물질이 공유 결합되는 서브 미크론 비드로 구성된다. 그런 다음 포름알데히드 고정을 적용하여 정상적인 항원 회수 처리에 대해 1 차 또는 2 차 타깃 물질을 안정화한다. 그러면 침착 된 타깃은 2D 및 3D 구성 요소로 구성된다.
2D 타깃과 비교하여, 3D 타깃은 착색 샘플과 더 유사하게 행동한다. 조직 절편 및 세포와 같은 IHC 또는 ICC의 착색 샘플은 높이가 있다. 샘플의 높이는 일반적으로 4~10 미크론이다. 착색에서 타깃이 된 항원 부위는 조직 절편의 노출된 표면 위의 어디에나 있을 수 있다. 따라서 샘플의 항원 부위는 단면의 바닥 표면 상단 또는 조직의 측벽을 따라 어느 곳에서나 평면일 수 있다. 따라서 샘플의 측벽에 있는 항원은 2D 타깃이 할 수 있는 것보다 훨씬 더 많은 착색제를 크로모겐으로부터 촉발시킬 수 있다. 2D 요소에 3D 요소를 포함하면 가상의 3D 배열을 형성하기 위해 다른 2D 타깃 도트에 적용할 수 있는 단계 오프셋이 생성된다. 실험적으로 0.5 미크론보다 큰 3D 타깃은 조직 절편만큼 어둡게 착색된다는 것이 밝혀졌다.
또한, 착색 공정에서 일반적으로 사용되는 시약인 DAB는 상대적으로 짧은 시간에 걸쳐 노화되어 색과 강도의 변화를 가져온다. 본 발명자들은 DAB에서 착색된 3D가 샘플과 유사한 방식으로 색상 및 강도 변화를 표적으로 한다는 것을 발견했다.
특수 착색
일부 실시 예에서, 제어 타깃은 특수 착색을 포함한다.
일부 실시 예에서, 특수한 착색제는 알시안 블루(Alcian Blue), 알라닌 블루(Alanine Blue) - 오렌지 G 용액, 아잔(Azan) 염료, 비엘쇼프스키(Bielschowsky)은 염료, 브라우 앤 벤(Brow & Benn) - 그람 염료(Gramm Stain), 크레실 바이올렛(Cresyl Violet), DAB, 폰타나 마손(Fontana Masson), 고르돈 앤 스위트의 은 염료(Gordon and Sweet's silver staining), 그로셋의 메탄아민 은 방법, 홀(Hall)의 빌리루빈 염료, 존스 메탄아민 은 방법, 룩솔 패스트 블루(Luxol Fast Blue), 룩솔 패스트 블루 - 크레실 바이올렛, 무시카르민(Mucicarmine) (메이어의 방법), 뮬러 - 모우리(Muller-Mowry) 콜로이드 철, 오렌지 G, 뉴클리어 패스트 레드(Nuclear Fast Red), 디아스타제 소화를 이용한 PAS, 주기성 산 쉬프(PAS), 인 텅스텐 산, 헤마톡실린, 피크로 시리우스 레드(Picro Sirius Red), 톨루이딘 블루 산성화(Toluidine Blue Acidified), 트리 크롬 -- 코모리스 원-단계, 트리크롬 -- 마손(Trichrome -- Masson's), 빅토리아 블루, 폰 코사(Von Kossa), 웨이저트의 레소르신 푹신(Weigert's Resorcin Fuchsin), 웨이저트의 철 해마톡실린(Weigert's Iron Haematoxylin), 젤(Zell) -- 니엘슨 방법(Neelsen Method) 혹은 이들의 조합들을 포함한다.
이미징 참조 타깃
일부 실시 예에서, 제어 영역 (140)은 이미징 참조 타깃을 더 포함한다. 일부 실시 예에서, 이미지 타깃은 흑색 타깃 혹은 타깃들, 화이트 타깃 혹은 타깃들 또는 투명 타깃을 포함한다.
착색된 생체 물질을 함유하는 현미경 슬라이드의 디지털 영상은 착색된 물질에 대해 사전 스크리닝 및 잠재적으로 완전한 진단 결정을 수행하도록 진화하고 있다. 일반적으로, 영상 시스템은 디지털 영상이 백색 또는 흑색 경계에서 압축되지 않도록 조명광 레벨을 조정해야 한다. 일반적인 해결책은 라벨이 위치할 것으로 예상되는 곳에 흑백 타깃을 위치시키는 것이다. 기본 가정은 백색과 흑색 타깃이 슬라이드가 나타낼 수 있는 극단을 나타내는 것이다. 그러나, 그렇게 함으로써 조직 절편의 착색에 의해 구현될 수 있는 것보다 흑색이 훨씬 더 검고 백색이 훨씬 더 하얗게 되므로 디지털 척도에 압축이 존재한다.
일부 실시 예에서, 이미징 참조 타깃은 슬라이드에 인쇄된다. 일부 실시 예에서, 이미징 참조 타깃은 흑색 타깃과 화이트 타깃 쌍을 포함한다. 일부 실시 예에서, 이미징 참조 타깃은 착색 공정에 사용되는 시약에 반응하지 않는 인쇄된 페인트 침착물이다.
일부 이미징 시스템에서는 투과된 빛만 사용된다(슬라이드의 바닥으로부터의 조명). 다른 이미징 시스템에서는 투과광과 반사광 (슬라이드 상단의 조명)이 모두 있다. 세 번째 명확한 참조 타깃은 반사광 조명을 지원한다. 따라서, 투과광 조명의 경우 흑백 참조는 각각 검은색 안료 타깃과 투명 타깃이고, 반사광 조명의 경우 흑백 참조는 투명 타깃과 흰색 타깃이다. 단일 항체 슬라이드의 예는 도 12를, 이중 항체 슬라이드는 도 13을 참조한다. 흑백 타깃은 실제로 일련의 점이며, 잉크젯 프린터에서 슬라이드가 제공될 때 타깃 도트가 손상되지 않도록 보호하기 위해 범퍼 역할을 하는 추가 기능을 제공하는 막대일 수도 있다. 잉크젯 프린터는 잡지 하단에서 슬라이드를 분배한다. 범퍼는 나머지 슬라이드 무더기가 슬라이드의 파라핀 코팅이나 타깃을 긁어 내지 못하도록 한다. 이러한 동일한 범프는 또한 슬라이드가 포장된 형태로 실어져야 파라핀 층이 인접한 슬라이드의 바닥에 부착되지 않는다.
투과광을 이용한 이미징은 조직에서 항원 밀도의 잘못된 표현을 초래한다. 이것은 착색된 조직이 모든 항원 부위가 단일 평면에 있는 하나의 암석으로 된 판이 아니기 때문에 발생한다. 오히려 조직은 두께 내 어느 곳에서나 항원 부위를 가질 수 있다. 2 차 착색은 입자가 효소 부위를 덮고 지속적인 침전을 차단할 때까지 계속 침전되는 착색제 입자를 생성한다. 항원 부위가 조직 절편의 측벽에 있으면 효소는 결코 덮이지 않으며 침전물은 항원의 존재를 과도하게 나타낸다. 투과광에서는 침전된 착색제가 더 두껍기 때문에 '어두움'이 발생한다. 반대로 반사광은 착색제 더미의 상단 표면만 '봄으로써' 항원 밀도를 보다 정확하게 표현한다.
일부 실시 예에서, 백색 타깃은 완전한 백색에 가까운 색상을 갖는다. 완벽한 흰색은 얻기 어렵기 때문에 일부 실시 예에서 흰색 타깃의 색상은 완벽한 흰색에서 5-10 % 떨어져 있다. 완벽한 흰색에서 5 % 미만 떨어져 있는 흰색은 생성하기 어렵고 완벽한 흰색에서 10 % 이상 떨어진 색상은 신호 강도로 착색하기 위한 제어로서 충분히 정확하지 않을 수 있다.
일부 실시 예에서, 백색 타깃은 백색 색소를 포함한다. 일부 실시 예에서, 백색 색소는 강한 빛에 노출되지 않은 상태에서 시간의 경과에 따라 안정한 금속 산화물 또는 금속 황산염 색소이다. 일부 실시 예에서, 백색 색소는 산화 알루미늄, 산화 티탄 또는 황산 바륨을 포함한다. 일부 실시 예에서, 금속 산화물 또는 금속 황산염은 비드 형태이다.
일부 실시 예에서, 흑색 타깃은 흑색 색소를 포함한다. 일부 실시 예에서, 흑색 색소는 탄소계 색소를 포함한다. 일부 실시 예에서, 흑색 색소는 탄소 먼지를 포함한다. 일부 실시 예에서, 탄소 먼지의 직경은 2 미크론 미만이다.
일부 실시 예에서, 이미징 참조 타깃은 무수물 기반 에폭시를 포함한다. 일부 실시 예에서, 이미징 참조 타깃은 안료를 무수물 기반 에폭시와 혼합하고 무수물 기반 에폭시를 경화하여 생성된다. 에폭시 결합제와 색소의 매칭은 색소와 에폭시 결합제 사이에 바람직한 습윤이 있는 한 특별히 제한되지 않는다.
일부 실시 예에서, 무수물 기반 에폭시는 아미노-실란 기반 촉매의 미 반응 아민을 제거할 수 있는 무수물 촉매를 포함한다. 유리 아민 그룹은 생체 물질과 일부 착색 시약을 모두 포획한다. 이러한 유리 아민은 IHC 및 ICC 공정에서 비 특이적 착색을 유발한다. 따라서, 미 반응 아민의 제거는 비 특이적 착색을 감소시킨다.
일부 실시 예에서, 무수물 기반 에폭시 페인트는 메틸 테트라히드로프탈산 무수물 또는 디페닐요오도늄 헥사플루오로 비산염과 같은 무수물 촉매를 포함한다.
일부 실시 예에서, 무수물 기반 에폭시를 365nm의 파장을 포함하는 UV 광과 같은 UV 광에 노출시키는 것을 포함하는 무수물 기반 에폭시를 경화시킨다. 일부 실시 예에서, 무수물 기반 에폭시 페인트를 경화시키는 것은 무수물 기반 에폭시 페인트를 가열하여 에폭시가 결합되도록 하는 것을 추가로 포함한다. UV 개시 무수물 기반 에폭시 및 그 동반 시약은 특별히 제한되지 않는다. 일반적인 연구는 무수물 생산 회사에 의한 제품 검색을 수행함으로써 바람직한 무수물 기반 에폭시를 확인할 수 있다.
일부 실시 예에서, 무수물 기반 에폭시를 포함하는 이미징 참조 타깃은 1 차 타깃, 2 차 타깃 또는 항원 회수 타깃의 침착 전에 슬라이드에 침착 된다. 그 이유는 무수물 기반 에폭시의 경화 과정에서 열처리가 1 차 타깃, 2 차 타깃 또는 항원 회수 타깃에 포함된 생체 물질을 손상시킬 수 있기 때문이다. 일부 실시 예에서, 무수물 기반 에폭시는 UV에 의해 경화되고, 이미징 참조 타깃의 침착은 UV가 펩티드 및 단백질을 손상시킬 가능성이 적기 때문에 1 차 타깃, 2 차 타깃 또는 항원 회수 타깃의 침착 후에 발생할 수 있다.
일부 실시 예에서, 이미징 참조 타깃 공식에는 계면 활성제가 없으므로, 잉크/페인트가 이러한 슬라이드가 경험할 수 있는 착색 및 시약의 범위에 반응하는 것을 방지한다.
일부 실시 예에서, 이미징 참조 타깃은 패드 스탬프에 의해 슬라이드에 인쇄된다. 다른 실시 예에서, 주사기가 타깃 침착의 크기를 제어할 수 있기 때문에 이미징 참조 타깃은 주사기에 의해 인쇄된다.
이미징 참조 타깃을 사용하면 모든 디지털화 범위가 완벽한 흑백 참조의 사용에 비해 흑백의 슬라이드 정의 내에 있기 때문에 디지털 분석이 최적화된다. 디지털 분석은 착색된 샘플에 존재하는 항원의 양을 보다 정확하게 결정하기 위해 참조 타깃의 색상을 내삽 하는데 도움이 된다. 이미지 참조 타깃은 제어 타깃에서 반응의 양을 측정하기 위한 참조 포인트를 제공하기 위해 디지털 분석의 보정을 지원하기 위해 사용된다.
참조 타깃 침착 방법
일부 실시 예에서, 본 명세서는 공정 기록 슬라이드 상에 제어 타깃을 침착하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시 예에서, 슬라이드 및 제어 타깃은 전술한 것과 동일하거나 유사하다.
일부 실시 예에서, 제어 타깃을 침착하는 방법은 슬라이드에 1 차 제어 타깃 또는 2 차 제어 타깃을 침착하는 것을 포함한다.
일부 실시 예에서, 1 차 제어 타깃 또는 2 차 제어 타깃을 침착 시키는 것은 다음을 포함한다: 미리 결정된 농도로 제어 타깃의 용액을 준비; 제어 타깃을 고정; 그리고 슬라이드 위에 인쇄.
일부 실시 예에서, 제어 타깃의 용액을 준비하는 것은 단백질과 슬라이드 접착제 사이의 연계기로서 기능하기 위해 제어 타깃 및 다당류를 포함하는 용액을 준비하는 것을 포함한다.
일부 실시 예에서, 제어 타깃을 고정하는 것은 제어 타깃을 포름알데히드로 고정하는 것을 포함한다. 포름알데히드는 제어 타깃을 교차 연결하여 제어 타깃이 정상적인 항원 회수 프로토콜을 견딜 수 있도록 한다.
일부 실시 예에서, 제어 타깃은 가교 결합된다. 조직 내에서 단백질은 조직의 다른 부분에 결합되어 단백질이 확산 및 변성되지 않도록 한다. 용액의 제어 타깃에는 느슨한 단백질이 포함되어 있기 때문에 제어 타깃은 열과 pH에 더 민감하므로 특히 IHC 또는 OCC에서 AR 공정을 진행할 때 슬라이드에서 확산되고 변성되는 경향이 있다.
일부 실시 예에서, 1 차 타깃은 다음과 같이 준비된다:
· 45ug/ml의 농도로 1ml의 1 차 단백질 마스터 희석액 세트를 만든다. 45ug/ml 농도를 실현하기 위해 필요에 따라 dH2O로 당나귀-항-마우스, 당나귀-항-토끼 및 당나귀 IgG (H & L) 단백질을 희석한다. 일반적으로 이러한 단백질은 구매 시 농도가 1~10mg/ml이다. 곰팡이 성장 억제제로 10ul의 티머솔(Thimersol)을 첨가한다.
· 각 마스터 희석액을 10ul 0.2 % 포름알데히드로 40-60°C에서 1-4 시간 동안 고정한다.
· 선형 중합체로 0.45 % 농도의 아밀로스 30ul를 첨가하고 (곰팡이 성장 억제제로 티머솔(Thimersol) 첨가) 30 분 동안 혼합한다.
· 미 반응 포름알데히드를 제거하기 위해 0.1M 중탄산 암모늄 20ul를 추가한다.
· 마스터 단백질 용액을 사용하여 당나귀와 마우스 및 당나귀와 토끼의 타깃 혼합물을 만든다. 각 타깃에는 700ul의 마스터 단백질 용액이 포함되어 있다.
일부 실시 예에서, 2 차 타깃은 다음과 같이 준비된다:
· 45ug/ml의 농도로 1ml의 1 차 단백질 마스터 희석액 세트를 만든다. 45ug/ml 농도를 실현하기 위해 필요에 따라 dH2O로 마우스, 토끼 및 당나귀 IgG (H & L) 단백질을 희석한다. 일반적으로 이러한 단백질은 구매 시 농도가 10 ~ 60mg/ml이다. 곰팡이 성장 억제제로 10ul의 티머솔(Thimersol)을 첨가한다.
· 각 마스터 희석액을 10ul 0.2 % 포름알데히드로 40-50°C에서 1-4 시간 동안 고정한다.
· 선형 중합체로 0.45 % 농도의 아밀로스 30ul를 첨가하고 (곰팡이 성장 억제제로 티머솔(Thimersol) 첨가) 30 분 동안 혼합한다.
· 미 반응 포름알데히드를 제거하기 위해 0.1M 중탄산 암모늄 20ul를 추가한다.
· 마스터 단백질 용액을 사용하여 당나귀와 마우스 및 당나귀와 토끼의 타깃 혼합물을 만든다. 각 타깃에는 700ul의 마스터 단백질 용액이 포함되어 있다.
일부 실시 예에서, 준비된 1 차 또는 2 차 타깃, 또는 이미지 참조 타깃은 다음과 같이 한 번의 인쇄 주기로 슬라이드에 인쇄된다:
· 접착 코팅된 현미경에 타깃 용액 인쇄
· 모든 물이 증발하고 식을 때까지 60°C에서 공기 건조
· 파라핀-용매 혼합물을 인쇄된 타깃 어레이에 스프레이로 도포
· 파라핀을 리플로우 하여 타깃 어레이의 밀봉을 완료하고 용매를 제거. 따라서 파라핀을 경화시키고 고체 상태로 되돌림.
IHC 또는 ICC 착색 방법
일부 실시 예에서, 본 명세서는 면역 조직 화학 (IHC) 또는 면역 세포 화학 (ICC) 착색 방법에 관한 것이다. 일부 실시 예에서, 본 명세서는 상기 기재된 바와 같은 공정 기록 슬라이드를 사용하는 면역 조직 화학 (IHC) 또는 면역 세포 화학 (ICC) 착색 방법에 관한 것이다.
일부 실시 예에서, IHC 또는 ICC 착색 공정은 고정된 샘플을 파라핀에 매립하고 파라핀을 제거하여 샘플의 세포 구조 내에 항원 부위를 노출시키는 것을 포함한다.
일부 실시 예에서, 파라핀을 제거하는 단계는 다음과 같이 구성된다: 65 ~ 75°C 범위의 온도에서 3-10 분 동안 파라핀을 반 액체 상태로 가온 한 다음 반 액체 파라핀을 지방족 용매로 액화시키는 것을 포함하는데, 이 지방족 용매는 자일렌 또는 자일롤에 이어서 무수 에탄올, 95 % 에탄올, 70 % 에탄올, 50 % 에탄올 및 염기 기반 완충 용액의 재수화가 차례로 이어진다.
일부 실시 예에서, IHC 또는 ICC 착색 공정은 포름알데히드 고정 장치를 제거하여 샘플의 항원 부위를 노출시키는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시 예에서, 열 유도 항원결정부 회수 (HIER) 공정을 수행하거나 다 주기 온수 항원 회수 공정을 수행하는 것을 포함하여 포름알데히드 고정 장치를 제거한다.
일부 실시 예에서, HIER 공정은 샘플을 물의 존재 하에 가열함으로써 포름알데히드와 조직 사이의 Schiff 염기 결합을 파괴하는 것을 포함한다. 일부 실시 예에서, 샘플을 가열하는 것은 샘플을 89°C~95°C 범위의 온도에 적용하는 것을 포함한다. 일부 실시 예에서, 샘플은 열에 노출될 때 완충 시약에 노출된다. 일부 실시 예에서, 완충 시약은 6~10, 예를 들어 6~9 범위의 pH를 갖는다. 시약의 pH 선택은 조직 유형과 같은 샘플 유형에 따라 달라진다.
일부 실시 예에서, 수성 항원 회수 공정은 샘플을 약 60°C~약 65°C 범위의 매립 파라핀의 용융 온도보다 약 10°C 높은 온도에 두는 것을 포함한다. 일부 실시 예에서, 수성 항원 회수 공정은 샘플을 비누로 처리하고 파라핀을 용해 및 제거하기 위해 연속적인 세척을 포함한다.
파라핀 제거 및 고정 복구에서 작업자의 오류 또는 공정 결함이 후속 착색 공정을 차단하고 위조 음성 결과를 초래할 수 있다는 점에 유의해야 한다. 이러한 위조 음성 결과는 공정 기록 슬라이드에서 제어 타깃의 착색 결과를 검토하여 감지할 수 있지만 작업자의 오류 또는 처리 결함으로 인해 샘플, 시간 및 자원이 낭비되므로 피해야 한다.
이 시점에서, 항원 부위가 노출되고 착색 시약을 적용하여 타깃 항원의 존재 및 양을 나타내는 신호를 생성할 수 있다.
일부 실시 예에서, IHC 또는 ICC 착색 공정은 하나 이상의 1 차 항체를 적용하는 것을 추가로 포함한다. 하나 이상의 1 차 항체가 적용되는 경우, 2 차 항체에 의한 교차 반응을 피하기 위해 항체가 다른 동물 종의 항체여야 한다. 예를 들어, 2 개의 1 차 항체가 사용되고 첫 번째 항체가 마우스 항체인 경우 두 번째 1 차 항체는 토끼 항체와 같이 마우스가 아닌 항체여야 한다. 이들 실시 예에 따르면, 하나 이상의 1 차 항체는 샘플에서 일치하는 항원 부위 뿐 만 아니라 단백질/펩티드 항원 또는 대용 항원과 같은 1 차 제어 타깃에 결합할 것이다. 일부 실시 예에서, 1 차 항체는 ER, PR, Her2 또는 Ki67을 표적화 하는 항체를 포함한다.
도 11을 참조하면, 일부 실시 예에서 1 차 항체는 효소 발색성 리포터와 같은 발색성 리포터와 같은 리포터와 접합된다. 이들 실시 예에 따르면, 2 차 항체가 필요하지 않다.
일부 실시 예에서, 1 차 항체는 리포터와 접합되지 않는다. 이들 실시 예에 따르면, 1 차 항체를 타깃으로 하는 2 차 항체가 적용된다. 일부 실시 예에서, 2 차 항체는 리포터와 결합된다.
도 11을 참조하면, 일부 실시 예에서 항원의 신호를 추가로 증폭하기 위해 다단계 신호 증폭 공정이 수행된다. 다단계 신호 증폭 공정의 예는 다음을 포함한다: 효소 표지 된 3 차 항체가 효소 표지 된 2 차 항체와 반응하는 2배(x) 이득, 3 단계 간접; APAAP 면역 복합체의 2배(x) 이득은 2 차 항체와 반응한다. 일부 실시 예에서, 1 차 항체 및 면역 복합체의 항체는 동일한 종에서 제조된다. 신호 증폭 공정에는 다음이 포함된다: LAB 또는 LSAB, 효소 표지 된 (연쇄상) 아비딘은 비오티닐화 된 2 차 항체와 반응한다; CSA 기술에 대한 10배(x) 이상의 이득, 1 차 항체의 비오티닐화 된 2 차 항체에 대한 스트랩타비딘-효소 복합체; 단일 1 차 항체에 결합된 10 개의 2 차 항체와 70 개의 효소 부위를 포함하는 중합체의 10배(x) 이상의 이득.
일부 실시 예에서, 리포터는 기질이 존재할 때 크로모겐 침전을 일으킬 수 있는 효소이다. 모두 동일한 최종 상태의 크로모겐 침전에 도달한다.
일부 실시 예에서, 리포터 효소는 호스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP), 알칼리성 포스파타제 (AP) 또는 포도당 산화 효소를 포함한다.
일부 실시 예에서, 일반적으로 사용되는 3 개의 2 차 착색 그룹 중 1 개 또는 2 개 및 여러 대조 착색제 중 하나가 사용된다: 호스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP), 알칼리성 포스파타제 (AP), 포도당 산화 효소 및 핵 대조 착색제.
일부 실시 예에서, 크로모겐은 3,3'- 다이아미노 벤지딘 (DAB), 아미노 -9- 에틸 카바졸 (AEC), DAB + 니켈 증강제, 패스트 레드, TMB, 스테이옐로우(StayYellow), BCIP/NBT, BCIP/TNBT, 나프톨(Naphitol)AS-MX 포스페이트 + 패스트 블루(Fast Blue) BB, 나프톨(Naphihol)AS-MX 포스페이트 + 피스트 레드(Fast Red) TR, 나프톨(Naphitol) AS-MX 포스페이트 + 새로운 푹신, 스테이그린(StayGreen) 및 NBT 혹은 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시 예에서, 기질 및 리포터 효소 조합 뿐 만 아니라 결과 색상은 다음과 같다:
HRP (호스래디쉬 퍼옥시다제)
· DAB (3,3'-Diaminobenzidine) >> 갈색에서 적갈색
· AEC (3-아미노-9-에틸카르바졸) >> 적색
· DAB + 니켈 인핸서 >> 흑색
· TNB (3,3 ', 5,5'-테트라메틸벤지딘) >> 블루
· 스테이 옐로우 >> 옐로우
AP (알칼리성 포스파타제)
· BCIP/NBT >> 파랑
(5- 브로모-4-클로로-3-인돌릴-포스페이트)/(니트로 블루 테트라졸륨)
· 나프톨 AS-MX 포스페이트 + 패스트 블루 >> 블루
· 나프톨 AS-MX 포스페이트 + 패스트 레드 >> 레드
· 나프톨 AS-MX 포스페이트 + 새로운 푹신 >> 레드
· 스테이 그린 >> 그린
GO (포도당 옥시다제)
· 니트로 블루 테트라졸리움 클로라이드(NBT) >> 블루에서 보라
일부 실시 예에서, IHC 또는 ICC 착색 공정은 핵 대조 착색과 같은 대응 착색을 추가로 포함한다. 일부 실시 예에서, 핵 대조 착색은 청색을 생성하는 헤마톡실린과 같은 하나 이상의 핵 착색을 사용한다.
착색 기재 또는 화합물의 선택은 색상 요건, 안정성 요건 및 지역 규제 표준을 기반으로 할 수 있다.
예를 들어, DAB는 미국 및 중국과 같은 국가에서 일반적으로 사용되는 반면 AEC는 다른 국가에서 일반적으로 사용된다. DAB는 DAB에 의해 생성된 갈색-빨간색이 AEC의 빨간색에 비해 채도가 높기 때문에 AEC보다 자주 사용된다. 그러나 AEC 착색은 DAB 착색보다 안정적이다. 실험에 따르면 원래 DAB는 단기간에 걸쳐 현저하게 노화되어 4 시간 내에 색 채도가 눈에 띄게 떨어진다. 최신 버전의 DAB에는 DAB의 안정성을 몇 시간에서 며칠로 확장하는 안정제가 포함되어 있다. DAB는 또한 후속 버퍼 세척 주기 동안 세척되는 경향이 있다. 반면 AEC는 몇 주에서 몇 달 동안 안정적으로 유지된다.
전 세계의 규제 표준은 이러한 기술이 실행 가능하고 이용 가능해지면 조직 절편 및 느슨한 세포의 처리를 위한 시약, 방법 및 기기를 확인하는데 검증된 제어를 사용하도록 요구하거나 주장한다. 이러한 규제 제어는 혈액학 및 임상 화학에서 결과를 검증하고 품질을 보증하기 위해 오랫동안 시행되어 왔다. 제어 테스트의 결과는 Levey-Jennings 차트의 형태로 표시된다 (Westgard et al. 1981). Westgard J, Barry P, Hunt M, Groth T (1981) "임상 화학의 품질 관리를 위한 다중 규칙 Shewhart 차트". Clin Chem27: 493-501.
항원 이미징 척도 외삽
일부 실시 예에서, IHC 또는 ICC 착색 방법은 1 차 및 2 차 타깃의 착색된 결과를 추정함으로써 공존하는 환자 샘플에서 항원 농도를 추정하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시 예에서, IHC 또는 ICC 착색 방법은 1 차 및 2 차 타깃의 착색된 결과를 추정함으로써 IHC 또는 ICC 착색 단계의 공정 품질 관리(QC)를 결정하는 것을 추가로 포함한다.
슬라이드에 침착 된 제어 타깃의 양이 미리 결정되어 있기 때문에, 분자 질량, 침착물의 각 단백질 유형의 제어 타깃의 분자의 수, 타깃의 영역 및 슬라이드 코팅의 다공성 및 타깃의 활성 표면 단백질 밀도를 계산할 수 있다.
1 차 항체의 시약에 노출된 슬라이드 위의 적용된 농도, 분배된 부피 및 표면적은 공지되어 있다. 시약의 노출 시간 동안 대부분의 부유 항체가 떨어지고 수용 항원 부위에 의해 포획되었을 것이라고 합리적으로 가정할 수 있다. 항원 부위 바로 위에 있는 부분만 포획되고, 완충액 세척 단계에 의해 남은 부분이 세척된다. 따라서, 예를 들어 농도가 컷오프보다 25 % 초과이고 포화 상태에서 25 % 미만인 경우와 같은 적절한 조건 하에서 침착 된 항체 농도를 설정할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "컷오프"는 적용된 단백질 농도를 포획하기에 불충분 한 타깃 부위 밀도로 정의된다; 포화도는 적용된 단백질 모두를 포획할 수 없는 농도로 정의된다.
1 차 희석 비율을 알면 올바른 1 차 타깃 밀도 목표를 선택할 수 있고 1 차 농도를 검증할 수 있다.
본 발명의 한 실시 예에서, 각각의 2 차 및 1 차 타깃은 [(마우스 또는 토끼 IgG) + (당나귀 IgG + 가교제 + 진균 억제제)] 또는 [(KLH와 항원 A 또는 KLH와 항원 B) + (비 접합 KLH + 가교 결합제 + 곰팡이 억제제)] 또는 대용 항원 [(당나귀-항-마우스 IgG 또는 당나귀-항-토끼 IgG) + 가교 결합제 + 당나귀 IgG + 곰팡이 억제제]. 각 도트은 전체 단백질의 부피가 같지만 특정 타깃을 구성하는 단백질 간에 원자 질량이 달라지도록 혼합 비율이 약간 조정된다.
일부 예시의 단백질의 분자량은 다음과 같다:
마우스 IgG = 155kDa
토끼 IgG = 150kDa
당나귀 IgG, 당나귀-항-마우스, 그리고 당나귀-항-토끼 = 160kDa
단백질 A = 42kDa
단백질 G = 58 또는 65kDa
단백질 A/G = 50kDa
단백질 L = 76kDa
닭 IgY = 180kDa
KLH 서브 유닛: KLH1 및 KLH2 = 각각 350 및 390kDa.
본 발명의 다른 실시 예에서, 2D 2 차 타깃 구배는 1 ~ 1000:1의 단계적 희석 증가분을 포함한다. 일부 실시 예에서, 희석은 -20log (희석) 개요를 따르며, 여기서 희석은 -3dBd 단계로 증가한다. 용어 -20log (희석) = dBd는 수정 용어를 쉽게 적용할 수 있도록 데이터를 선형화 하기 위해 반 대수 기반으로 희석을 설명한다. 용어 (희석)는 희석 X를 의미하며 X는 1:1에서 1,000:1에 해당하는 [1..1000]이다. dBd라는 용어는 희석 또는 희석 강도의 데시벨로 정의된다. 수정 용어에는 항원 회수 손상, 효소 이득 또는 1 차 항체 시약 희석이 포함된다;
2 차 착색은 착색 시약의 구성의 기능인 1 ~ 20배(x)의 효소 이득 기능을 통합한다. 따라서 이득이 증가함에 따라 낮은 농도의 2 차 타깃은 포화 상태로 이동하는 반면 이득이 하나로 떨어지면 고농도 2 차 타깃만 눈에 띄게 착색된다;
펩티드가 있는 KLH 서브 유닛에 기초한 2 차 및 접합된 1 차 타깃 단백질 사이의 크기 차이가 상당하기 때문에, 더미 희석제는 펩티드가 KLH 서브 유닛에 대한 질량의 현저한 변화를 만듦으로 활성화되지 않은 KLH 단위여야 한다.
단백질 A, G 및 A/G에 대한 KLH 서브 유닛의 예상 결합 능력은 4 ~ 6 개의 단백질로 예측된다. 적합한 더미를 위해 KLH는 단백질 A, G, A/G 또는 L 단백질 중 어떤 단백질에도 완전히 반응하지 않는 닭 IgY와 결합되어야 한다. 닭 IgY는 단백질 A/G보다 거의 4 배 더 크지만 KLH에 덜 결합되어 최종 결과는 거의 동일하다. 어느 쪽을 선택하든 질량은 650 ~ 700kDa가 된다. 마우스 및 토끼 IgG에 대해 아래에 자세히 설명된 대로 KLH 서브 유닛 질량 수치를 연결하고 계산을 수행할 수 있다.
본 발명의 다른 실시 예에서, 1 차 타깃은 단백질 A, G 또는 A/G로부터 제조될 수 있다. 1 차 항체는 주로 마우스 IgG 또는 토끼 IgG 숙주 Fc 영역을 기반으로 한다. 그러나 FcyRI 영역은 마우스 IgG1 및 토끼 IgG에서 발견된다. 단백질 A는 토끼 IgG에 강하게 결합하지만 마우스 IgG1에는 약하게 결합한다. 단백질 G는 토끼 IgG에 강하게 결합하고 마우스 IgG1에 중간 정도로 결합한다. 단백질 A/G는 토끼 IgG에 강하게 결합하고 마우스 IgG1에 중간 정도로 결합한다. 단백질 L은 다른 것의 FcyRI에 비해 Fab 경쇄에서 마우스 IgG1에 강하게 결합하고 토끼 IgG에 약하게 결합한다. 일부 실시 예에서, 단백질 G 또는 A/G가 사용된다. 둘 다 쌍극자 구조로 나타나며 1 차 항체에 대한 단일 연결만 지원한다.
단백질 A, G, A/G 및 L은 대부분의 태반 포유 동물 IgG에 결합하며, BSA(소 혈청 알부민)가 이들 단백질에 결합되지 않을 경우, BSA(소 혈청 알부민)는 2 차 착색 키트 적용 전 차단 단계가 작동하지 않음을 의미한다. 특히 염소는 단백질 A, G, A/G 또는 L에 대한 결합이 차단된다. 대부분의 2 차 착색 키트는 염소를 일부 단계에서 숙주 단백질로 사용하기 때문에 다른 접근 방식과 다르다. 따라서 차단제는 말, 당나귀, 맥 및 코뿔소 IgG 단백질과 같은 말과(科)를 기반으로 하는 것이 좋다. 말과(科)는 태반 포유류에서 유전적으로 일찍 분리되어 2 차 착색 시약에는 거의 반응하지 않지만 단백질 A, G 및 A/G에는 결합한다. 미 반응 1 차 타깃 부위를 충분히 차단할 수 있다.
1 차 항체에 대한 결합 연결은 2 차 항체와 반응하기 위해 항상 2 개의 FcyRI 부위 중 하나를 열어 두기 때문에, 포획된 1 차 항체는 2 차 착색을 지원하기 위해 이용 가능한 하나 이상의 FcyRI 부위와 함께 기능적으로 온전해야 한다. 따라서 포획된 착색 1 차 항체는 1 차 분석/희석 수치 대비 실제 적용된 농도를 나타낸다.
평균 1 차 항체 원자 질량은 150kDa이고, 단일 항체 분자의 분자량은 150kDa (1.6605x10-12)이며, 이는 249x10-12ng의 무게와 동일하다. 슬라이드의 단일 영역이 노출된 유일한 부분이라고 가정하면 적용되는 1 차 시약의 양을 결정할 수 있다. 예를 들어 내부 치수가 20.3mmsq Х 0.14mm 인 닫힌 모세관 간극을 사용하면 부피는 57.2μL이다. 2.832nl의 적용된 1 차 항체 시약을 생성하는 1 미크론의 타깃 영역에 대한 비율;
1 차 항체 시약은 농축액에서 10ug/ml의 중간 희석액으로 희석된다. 그런 다음 슬라이드에 적용하기 위해 중간 희석액을 1:1에서 1000:1로 희석한다. 결과적으로 각각 1:1에서 25.1:1의 희석을 위해 1 micron2 영역에 31.5에서 7.08 개의 항체가 침착 된다.
100 % 포획 능력을 보장하기 위해 1 차 타깃은 100 ~ 1000 배 범위의 안전 계수를 가져야 한다. 1000배(x) 옵션이 선택되면 1 차 타깃은 4x106 항원 영역을 포함해야 한다. KHL 서브 유닛은 적용된 항체보다 크지만, 증가는 포획된 항체의 수를 1:1 이상으로 변경하기에 충분하지 않다. 각 KLH 서브 유닛은 370kDa의 평균 원자 질량을 가지며 이는 614.4Х10-12ng의 무게에 해당한다.
단백질 분자의 부피는 단백질의 분자량 및 평균 단백질 부분 별 부피 (부분 별 부피 = 부피/분자량)로부터 근사 할 수 있다. 가용성 구형 단백질에 대해 실험적으로 결정된 부분 별 부피의 평균은 ~ 0.73 cm3/g이다. 이 값은 단백질마다 다르지만 범위는 좁다. 방정식은 ~ (1.212 Х 103 Х MW) nm3의 단백질 부피로 감소한다. 따라서 KLH 서브 유닛의 경우 개별 볼륨은 448.44nm3 이다. 단백질이 구라고 가정하면 구의 직경은 0.132ХMW1/3 in nm로 계산된다. 이 계산 방법에 따르면 KLH 서브 유닛의 직경은 약 9.436nm이다;
직경이 1mm이고 KLH 서브 유닛의 단층을 포함하는 제어 타깃 도트의 경우 11.237 x 1027 단백질이 필요하다. 4x106 단백질의 활성 타깃 밀도에 대한 최소 희석 비율은 1:2.8x1021이다. 실질적으로 1:1000에 접근하는 모든 희석은 1 차 항체의 평가가 활성 단백질 농도에 의해 좌우되기 때문에 실행 가능하다. 따라서 타깃 밀도는 낮은 농도 하한가에 의해서만 제한된다.
한 실시 예에서, 2 차 타깃 어레이는 1~1000:1의 단계적 희석 증가분이다. 희석에 대한 선형 기울기는 dBd = -20log (희석)로 발생한다. 희석 범위가 1~1,000:1 인 경우 세미 로그 범위는 0dB ~ -60dBd이다. 일부 실시 예에서, 2 차 타깃의 -3dB 단계적 희석은 -0, -3, -6, -9, -12, -15, -18, -21dBd의 희석 시리즈의 결과가 된다.
2 차 및 1 차 타깃 어레이는 모두 반 가역적으로 고정되어 있으므로 AR 공정 동안 샘플 또는 AR 타깃과 비교하여 더 작은 정도의 열화를 겪는다. 분해는 완전한 단백질이 아니라 떨어져 나온 단백질 부분에서 발생한다. 일부 실시 예에서, AR 공정 단백질 타깃 및 샘플 부분에 계속 작용함에 따라 구배 스케일 패턴으로 간주되는 AR 손상은 100 % 위치로 이동한다. 반면에 2 차 효소 이득은 기울기 배열이 10 % 위치로 이동하도록 한다. 일부 구체 예에서, 효소 이득은 1, 2, 4, 5, 8, 10, 15 또는 20이다. 이것은 다음과 같은 방법으로 2 차 어레이를 10 % 타깃 쪽으로 이동시키는 것으로 해석된다.
1. 20배(x) 모든 타깃 이동 -26dBd
2. 15배(x) 모든 타깃 이동 -23.52
3. 10배(x) 모든 타깃 이동 -20
4. 5배(x) 모든 타깃 이동 -13.98
5. 4배(x) 모든 타깃 이동 -12.04
6. 2배(x) 모든 타깃 이동 -6.02
7. 1배(x) 검정색에 가까운 2D 100 % 도트만
전형적으로, 3 개 이상의 도트만큼 2 차 어레이를 100 % 위치로 이동시키는 AR 손상은 과도한 것으로 간주되며, 더 높은 효소 이득 이차 착색 키트 또는 더 높은 농도의 항체를 사용하여 착색을 다시 해야 한다.
따라서 1 차 항원 타깃 색상 밀도는 2 차 착색 키트의 효소 이득에 항체 농도를 곱한 총합이다. 2 차 타깃 밀도는 효소의 이득에 2 차 타깃 단백질 농도를 곱한 것이다.
디지털 이미징 시스템에 따라, 조도의 변화는 이미지의 동적 범위를 채도 (더 어두워 짐) 또는 컷오프 (더 밝아 짐)로 이동시킬 것이다. 이러한 변화는 항원 색상 척도를 이동시키는 반면 항원 밀도 수치 척도는 그렇지 않다. 따라서 숫자 눈금은 독립적이고 색상 눈금은 조명 강도에 따라 달라진다.
본 발명의 하나의 실시 예에서, 도 13 참조, 제어 영역 (140) 내에서, 전술한 2 차 단백질 타깃 어레이는 2 개의 라인으로 형성된다: 마우스 IgG 중 하나와 다른 토끼 IgG는 더미 IgG 혈청 단백질과 혼합되어 -20log (희석) 선형 기울기에서 최대 밀도에서 최소 밀도로 진행하는 5 개 이상의 구성원 구배 밀도 시리즈를 형성하며, 여기서 희석은 초기 1000:1 희석 후 1:1 ~ 1,000:1 사이 일 수 있다.
본 발명의 다른 실시 예에서, 전술한 2 차 타깃 어레이는 당나귀 IgG와 혼합된 마우스 IgG 또는 토끼 IgG의 33, 16.5 및 4 %의 3 가지 농도로 형성된다.
다른 실시 예서, 마지막 공정 단계에서, 확인된 항원 부위는 크로모겐 침전에 의해 착색된다. 따라서, 마우스 및 토끼 타깃 어레이는 2 차 착색 키트 크로모겐 침전의 -20log (희석) 선형 기울기를 반영하거나 타깃 어레이는 2 차 착색 반응성 및 효소 이득을 반영한다.
또 다른 실시 예에서, 1 차 타깃 밀도 구배 어레이를 형성하기 위한 방법에 대한 해결책은 타깃 혼합물을 성공적으로 구성하고, 접착제 코팅된 슬라이드 상에 침착 시키고, 접착제와 타깃 물질 사이에 공유 결합을 갖는 것을 전제로 한다.
또 다른 실시 예에서, 타깃 어레이가 성공적으로 침착 되고 1 차 및 2 차 착색 시약 모두가 합리적으로 수행한다고 추론하면, 데이터 세트 간의 곡선 피팅이 컴퓨터 알고리즘에 의해 수행될 수 있다. 또 다른 실시 예에서, 1 차 착색은 형광 마커에도 접합되지 않거나 효소 부위 (예: HRP 또는 AP)와 통합되지 않은 마우스 또는 토끼 숙주 단백질을 포함하는 임의의 IHC 또는 ICC 승인 항체로부터 선택된다. 다른 실시 예에서, 2 차 착색은 각각 상이한 색의 크로모겐을 사용하는 마우스와 토끼 사이에서 각각 독특하게 독립적인 1배(x) ~ 25 배(x)의 효소 이득을 갖는 2 차 착색을 포함한다.
본 발명의 다른 실시 예에서, 하나의 슬라이드에 대한 절대적 기준의 성능 결과가 다른 시간에 수행되는 다른 슬라이드와 동일하지 않을 수 있다는 점에 유의하는 것이 적절하다. 이는 2 차 착색 키트가 1 차 접합된 1 차 항체와 마찬가지로 성능이 많이 달라진다는 사실에서 비롯된다. 그러나 공정 기록 슬라이드의 결과는 제어 타깃에 의해 검증될 수 있으며 다른 착색 시약을 사용하여 수행된 다른 슬라이드와 동등성을 제공할 수 있다.
일부 실시 예에서, 1 차 항원 농도 척도가 암과 같은 세포 결함을 검출하기 위해 조직 절편에 접근하기 위해 공존하는 조직 절편에 적용된다.
다양한 실시 예가 본 명세서에서 예로서 설명된다. 본 명세서에 제시된 본 발명(들)의 더 넓은 범위를 벗어나지 않고 다양한 수정이 이루어질 수 있고 다른 실시 예가 사용될 수 있다는 것은 전문가들에게 명백할 것이다. 예시적 실시 예에 대한 이들 및 다른 변형은 본 발명(들)에 의해 의도적으로 포함된다.
실시예
하기 실시 예들은 본 발명의 예시를 위한 방식으로 제시되며 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
［ 실시예 1 ］스프레이 적용 방법을 이용한 파라핀 차폐 코팅
낮은 기류로 슬라이드 표면에 분무한다. 일부 실시 예에서, 저 액체 대 공기 혼합이 사용된다. 혼합물을 마스크를 통해 슬라이드 상에 분무하여 제어 타깃을 덮는다. 파라핀 밀봉을 유동 시키기 위해 재 가열할 필요없이 5 미크론 이하의 두께의 층을 형성하기 위해 전형적으로 한 두번의 통과를 필요로 한다. 파라핀 혼합물 저장소와 스프레이 헤드는 파라핀이 유체이고 스프레이 헤드에서 슬라이드로 비행하는 동안 유체로 유지되도록 둘 다 56°C 보다 약간 높게 가열된다. 침전된 파라핀 혼합물은 주변 열을 1 분 동안 60°C로 올리면 리플 로우 되어 용매가 빠져나가고 냉각되면 파라핀이 경화 상태로 돌아갈 수 있다.
［ 실시예 2 ］스크린 인쇄 방법을 이용한 파라핀 차폐 코팅
스테인리스스틸 인쇄 스크린은 2 개의 평행한 측면 사이에서 스크린의 와이어를 통해 전류를 통과시킴으로써 가열될 것이다. 스크린의 온도는 파라핀 용융 온도보다 약간 낮아야 파라핀이 스크린의 바닥면으로 스며 들지 않는다. 이러한 온도에서 파라핀은 액체보다 페이스트처럼 작용한다. 침전된 파라핀은 주변 열을 1 분 동안 60°C로 올리면 리플로우 된다. 그런 다음 적용된 파라핀 혼합물의 모든 용매가 배출되고 파라핀은 경화 상태로 돌아간다.
［ 실시예 3 ］잉크 젯 방법을 이용한 파라핀 차폐 코팅
통합된 히터를 포함하는 잉크젯 헤드는 파라핀을 액체 상태로 유지하기 위해 사용된다. 예를 들어 지방족 용매인 자일롤은 파라핀을 고체에서 액체로 바꾸는데 사용된다. 침전된 파라핀 혼합물은 주변 열을 1 분 동안 60°C 로 올리면 리플로우 된다. 그런 다음 적용된 파라핀 혼합물의 용매가 배출되고 파라핀은 경화 상태로 돌아간다.
［ 실시예 4 ］롤러 전사 인쇄 방법을 이용한 파라핀 차폐 코팅
가열된 롤러는 가열된 저장소로부터 파라핀 필름을 끌어당긴다. 롤러는 기모 롤러로 벽을 페인트 하는 것과 같은 방식으로 파라핀 필름을 슬라이드에 훨씬 많이 옮긴다. 침전된 파라핀 혼합물은 주변 열을 1 분 동안 60°C로 올리면 리플로우 된다. 그런 다음 적용된 파라핀 혼합물의 용매가 배출되고 파라핀은 경화 상태로 돌아간다.
［ 실시예 5 ］ 항원 회수 노출 시간 대 PRS 2 차 타깃의 단순 로그 계열로의 저하
시험 연구는 AR 노출에서의 변화가 2D 2 차 타깃 및 AR 타깃에서 보여 질 것을 검증하고자 하였다.
예상됐던 결과는 항원 회수 노출 시간 및 신호 강도 감소의 선형 기울기였다. 실제로 89°C 이상의 AR 버퍼를 얻는데 걸리는 시간을 무시하면 기울기가 선형이다. 백색 밸런스와 대비를 최적으로 설정하기 위해 PRS 흑백 타깃으로 8-bit 디지털화를 사용하면 기울기는 1.3lsb/minute, +/- 0.2lsb이다. 실험은 AR 타깃과 2 차 타깃의 신호가 89°C 시간 표시를 지나 20 분 동안 AR 노출 시 선형 방식으로 감소함을 보여준다. 20 분 후, 제어 타깃의 50 % 이상이 심각한 스트레스 하에 있었기 때문에 2 차 타깃의 유용성이 손상되었다.
［ 실시예 6 ］2 차 타깃의 일관성
시험 연구는 두 가지 요소가 탐구 되고 있다:
I. 단일 로트 코드 2 차 단백질 공급원 및 희석을 사용하여 조립된 슬라이드 배치 사이의 점과 점(dot-to-dot) 간의 비교.
II. 상이한 로트 코드 2 차 단백질 및 희석을 사용하여 조립된 슬라이드 간의 점과 점(dot-to-dot) 간의 비교.
100% 및 40% 타깃 제형을 사용하여 테스트를 수행하였다. 100 개의 슬라이드가 인쇄되었고, 모두 Scytek의 아비딘-비오티닐화된 복합체(ABC) 유형 마우스 및 토끼 2 차 착색 키트로 처리되었다. 추가 변수만 추가하므로 항원 회수가 수행되지 않았다. 이 둘의 분포는 1.5% 이내였다.
［ 실시예 7 ］더미 단백질의 선택
2 개의 상이한 로트의 마우스, 토끼 및 소 IgG 단백질을 사용하여 10 개의 상이한 2 차 어레이를 구축하였다. 어레이들은 IgG 단백질의 100, 40 및 20 %의 희석으로 구성되었다. 100 및 40% 희석 그룹에 대한 분포는 1.5% 이내였다. 20% 희석 그룹은 예상치 못한 착색 강도의 증가를 보여주었다. 본 발명자들은 이 이슈가 ABC 착색 키트의 소 IgG와 비오티닐화된 염소-항-다가 시약 간의 예상치 못한 상호 작용에 의한 것임을 발견하였다. 문제는 소 IgG를 당나귀로 대체함으로써 해결되었다. 테스트가 반복되었고 20% 그룹은 이제 1.5% 이내이다.
［ 실시예 8 ］ 2 차 로그 계열 PRS를 이용한 품질 관리
품질 관리(QC) 모드에서, 공존하는 타깃은 도 6에 나타낸 바와 같이 IHC 공정 피드백을 제공한다.
도 6에 의하면, 아주 얼마 안되는, 약간 초과, 초과 및 과도하게 초과 (각각 5, 10, 30 및 40 %) 내에서 수행된 항원 회수 정도에 노출된 2 차 타깃의 4 개의 어레이 (마우스 및 토끼의 50:50 혼합)가 있다. 착색 결과는 위에 나열된 각 조건을 나타내는 4 개의 다른 슬라이드에서 나온다. 항원 회수 공정은 포름알데히드와 단백질 사이의 쉬프 (Schiff) 염기 결합을 역전시켜 항원 부위를 가리는 것을 추구한다. 항원이 노출되는 속도는 반응 온도에 따라 다르다. 온도가 증가함에 따라 핵 비등의 기회가 생긴다. 핵 비등은 조직과 단백질 침전물 모두에 물리적 손상을 일으킨다. 이상적으로는 항원 회수(AR) 활동은 슬라이드를 통해선 균일하지만, 실제로는 그렇지 않은 경우가 많으며, 항원 회수 활동이 약간 더 많거나 적은 영역이 존재한다. 이러한 항원 회수 활동의 불 균일성을 무시하면 다음을 사용하여 슬라이드를 진단 결정에 사용할 수 있음을 나타낼 수 있다.
AR이 불충분하거나 과도하면, 2 차 어레이는 실패를 반영하지 못할 수 있다. 그러나 두 AR 타깃은 불충분하거나 과도한 실패 조건을 나타낸다.
a. 낮은 AR은 고정된 2D/3D이고 고정된 타깃의 2D는 모두 흑색이다. 2 차 어레이는 AR이 타깃의 왼쪽으로 이동하지 않아도 완벽하게 나타난다. IHC 착색제의 다음과 같은 상황에서 AR 활동이 낮을 수 있다.
i. AR 히터가 작동하지 않거나 80°C 미만으로 설정
ii. AR 버퍼는 6 또는 9가 아닌 중성 pH 7,
iii. 노출 시간이 너무 짧음
b. 고정되어 있는 2D/3D가 진정으로 표백되고, 고정 타깃보다 2D가 50% 미만이면 높은 AR이 나타난다. 2 차 어레이도 역시나 광범위하게 표백된다. IHC 착색제의 다음과 같은 상황에서 높은 AR 활성이 발생할 수 있다.
i. 95°C 이상 온도에서 작동하는 히터
ii. 노출 시간이 너무 김
c. 두 가지 상황에서 크로모겐 침전 오류가 발생할 수 있다:
i. 고농도의 2 차 타깃에서 얼룩 강도는 최대 어두움보다는 감소한다. 2 차 어레이는 영역 밀도와 비교하여 항상 증가해야 한다. 그렇지 않으면, 크로모겐 침전이 2 차 시약 키트 용량을 소진시킨다. 해결책은 1 차 항체 희석을 증가시키는 것이다 (항체 농도 감소와 동일).
ii. 크로모겐 시약이 활성화된 이후 악화된다(종종 DAB에서 발생). 해결책은 새로운 DAB 혼합물을 사용하는 것이다.
착색은 1 차 항체의 농도 및 2 차 착색 키트의 효소 이득의 함수로서 포화 또는 차단을 경험할 수 있다. 포화는 효소 부위의 밀도가 크로모겐으로부터 착색제를 침전시키는 능력을 초과할 때이다. 다시 말하면, 착색의 색은 실현될 수 있는 만큼 어둡다. 1 차 항체의 농도 및 2 차 착색 키트의 효소 이득이 너무 낮을 경우, 컷오프가 발생하여 착색제 침전이 불충분해질 수 있다. 이 두 가지 요인으로 인해 보조선의 어두움이 포화(100%) 또는 컷오프(0%)로 이동한다. 도 6을 기준으로 이 움직임은 보이는 타깃의 수로 나타난다. 2 차 효소 이득이 증가함에 따라 100% 도트 밀도는 0 % 위치로 이동한다. 일반적인 효소 이득은 1, 2, 4, 5, 8, 10, 15 및 20이다. 이는 다음을 통해 2 차 어레이를 0% 위치로 이동시킨다.
· 20배(x) 모든 타깃 이동 -26dBd
· 15배(x) 모든 타깃 이동 -23.52
· 10배(x) 모든 타깃 이동 -20
· 5배(x) 모든 타깃 이동 -13.98
· 4배(x) 모든 타깃 이동 -12.04
· 2배(x) 모든 타깃 이동 -6.02
· 1배(x) 2D 100 % 흑색에 가까운 도트만
1 차 타깃 어레이가 존재하는 경우, 2 차 효소 이득의 증가는 착색 밀도를 낮은 1 차 농도 도트 쪽으로 이동시킨다. 1 차 항체 농도가 증가하는 경우에도 동일하다. 항원 회수 공정은 1 차 및 2 차 타깃 모두를 어느 정도 수준으로 분해 시켜 컷오프로의 이동을 역전시킨다. IHC 착색의 말미에 3개 이상의 도트가 사라지면 슬라이드가 과도한 항원 회수 기간, 온도 또는 둘 다를 가지고 있고, 너무 많은 항원 존재가 조직 상에서 손실되므로 진단을 미미하게 만든다고 간주될 것이다. 이 결정은 이미 2 차 착색이 손상된 것으로 나타났기 때문에 1 차 항체의 효능과 무관하다. 항체 단계의 어느 것도 이 손상 수준을 극복할 수 없다.
［ 실시예 9 ］PRS는 항원 밀도 척도로 조명 수준을 추적
종래의 현미경을 통해 현미경 슬라이드를 보는 것은 투과 광 조명 레벨에 대해 주관적이다. 전체 슬라이드 영상 (WSI)에서 스캐너는 완벽한 백색과 흑색 구멍을 사용하여 백색 밸런스와 대비를 설정한다. 수동 현미경의 경우에는 그렇지 않다. 도 10은 조명 수준이 너무 어둡거나 (최적에서 -5 %), 최적 (+0), 너무 밝을 때 (+10 또는 + 15 %)에서와 같이 영상에 미치는 영향을 보여준다. 광도가 최적보다 낮으면 착색 밀도가 압축된다. 암 단계의 관점에서 이것은 진단을 필요한 것보다 한 단계 높게 전환시킬 수 있다. 조명 수준이 최적보다 높으면 영상의 표백 현상이 나타난다. 암 단계의 관점에서 이것은 진단을 필요한 것보다 한 단계 아래로 이동시킬 수 있다. 항원 색상 밀도 및 수치 눈금자는 1 차 및 2 차 타깃에서 개발되며 WSI 영상에 겹쳐질 수 있다. 수치 스케일은 독립 항이고 색상 밀도는 종속 항이다. 항원 밀도 색상 및 수치 눈금자가 WSI에 적용되면 사용자가 조명 레벨을 위 또는 아래로 이동함에 따라 수치 척도는 고정된 상태로 유지된다. 한편, 조명 레벨이 변함에 따라 색상 밀도 척도가 이동한다. 장점은 사용자가 색상 밀도와의 수치적 관계를 잃지 않으면서 조직 영상에서 가장 잘 보이는 기능으로 외관상의 조명을 상/하로 이동하도록 선택할 수 있다는 것이다. 배율이 변경될 때에도 작용한다.
［ 실시예 10 ］항원 밀도 눈금자의 구성
일부 실시 예에 따르면, 두 가지 유형의 항원 밀도 눈금자가 개발된다.
1. 유형 A는 1 차 항체가 항상 조직 항원 부위에 대하여 10% 미만의 초과 항체에 적용된다는 가정에 기초한 2 차 타깃 어레이를 사용한다.
2. 유형 B는 1 차 타깃 어레이(1 차 항원 구배 밀도 어레이)를 사용한다.
유형 A: 2 차 단독 기반 항원 눈금자
이 형태는 2 차 타깃 어레이 만을 사용한다. 2D 바코드에 포함된 정보는 (a) 1 차 항체 데이터: 항체에 대한 숙주 종 및 -dBd의 희석(dBd는 dB 희석이다)및 (b) 2 차 효소 이득을 포함한다.
이차 구배 밀도 타깃 어레이는 타깃 사이의 -3dBd 감소에 따른 2 차 타깃 단백질의 알려진 농도로 구성된다. 최대 농도는 1 차 항체에 사용되는 최소 희석에 의해 선택된다. 사용자는 항체 시약 제조업체가 제공한 농도 사양을 사용하여 일정한 중간 농도 1ug/ml로 희석한다. 그로부터 다른 모든 희석은 다른 조직 유형을 수용하기 위해 필요에 따라 이루어진다. 일반적으로, 1 차 항체 희석의 두 번째 세트는 1:1 ~ 1,000:1의 범위이다.
2 차 효소 이득의 범위를 수용하기 위해 2 차 어레이는 더 넓은 범위의 희석을 포함한다. 따라서, -3dBd 단계에서 2 차 어레이의 최저 희석은 1,000:1 또는 -60dBd에서 시작하며, 이는 SdBd(2 차 dB 희석)로 표시된다. 8 도트 계열의 최대 값은 -0dBd 또는 1:1이 된다. 항원 회수의 작용은 ARdBd(항원 회수 dB 희석)로 표시되는 2 차 타깃을 저하시킨다. 2 차 어레이에서 각 도트, 8개 중 하나는 -3dBd 증가분을 나타낸다. 두 타깃(더 이상 보이지 않음)의 손실에 대한 항원 회수 손실은 + 6dBd이다. 이는 2 차 어레이가 2D 타깃들의 경우(-S + AR)dBd 또는 [+6 ~ -54dBd]를 의미한다. 항체 농도 및 2 차 효소 이득은 이제 고려되어야 한다. 항체 농도는 AdBd이고, 효소 이득은 EdBd이다. 따라서 2 차 어레이는 (-S+AR-E)dBd 인 반면, 조직은 (+AR-E+A)dBd이다. 적용되는 다음 요소는 100% 2D에서 3D로의 차이이다. 100% 2D/3D 타깃의 3D 객체와 100% 2D 사이의 착색 차이는 2 차 착색 크로모겐 침전 상수를 나타내며, 이는 색 밀도를 수치 척도에 할당하고, DdBd에도 할당한다. 색상 밀도의 차이는 어레이의 각 2D 타깃에 적용된다. 따라서, 2D 어레이는 착색 색상 밀도를 (+AR-E+A+D)dBd로 나타낸다.
효소 이득이 10배(x) 라면, E=-20dBd이다. 그러면 2D 2 차 어레이는 -14, -17, -20, -23, -26, -29, ( ), ( ) dBd 가 된다. 0%를 향한 2 개의 도트는 항원 회수 공정에 의해 충분히 손상되어 착색에 의해 회복될 수 없으며 따라서 공란이 되었다. 예를 들어 2D/3D 색 밀도 차이가 10배(x) 인 경우, D = +20dBd가 3D 2 차 어레이를 -34, -37, -40, -43, -46, -49, ( ), ( ) dBd로 나타낸다. 1 차 항체 시약은 100% 산출량이 발생하는 1 차 타깃에서 적합한 항원 부위를 발견할 것으로 추정된다. 또한 KLH 단백질 당 2 개 이상의 항원 펩타이드 가닥이 존재하지만, 하나의 항체만이 KLH 단백질 당 효과적으로 결합하여 착색될 수 있다고 가정된다. 동일한 KLH 단백질에서 적합한 항원을 발견하는 임의의 추가 항체는 중복 점유로 인해 2 차 착색으로 완료되지 않는다. 따라서, 검출될 수 있는 1 차 항원 운반 단백질 당 항원 부위의 수는 하나이다. 1 차 타깃은 2 차와 동일한 미크론 당 단백질 수를 포함하므로, 500ug/ml 로부터 항체 마스터의 1 차 희석은 2 차 어레이 데이터에 적용되어 2 차 색상 밀도를 수치 항원 밀도로 조정한다. 2 차 타깃을 모니터링 하려면 중간 색상 밀도를 가진 타깃을 선택한다. 중간 색상 농도는 최대 흑색과 최대 백색 사이의 50% 지점으로 정의된다. 그러면 포인트는 3dBd 밖 범위의 1.5dBd에 해당한다. 이 포인트가 항원 밀도 눈금자가 설정되는 앵커로 기능한다. 중간 점 이상의 마지막 타깃 범위를 사용하면 -41.5dBd가 된다.
2 차 타깃은 10㎍/mL 마스터 희석으로 희석된다. 각각의 어레이는 당나귀 IgG 단백질과 혼합된 마우스 또는 토끼의 혼합이다. 단백질은 모두 상이한 원자 질량을 갖지만, 모두 150kDa이고 타깃 도트 당 총 단백질 수는 일정하다고 가정할 것이며, 혼합 비율은 일정하지 않다. 현재로서는 반응성 단백질 농도만 고려되고 있다. 150kDa에서 개별 단백질 분자량이 MW = 249.07×10-12ng이다. 표준 타깃 도트의 직경은 1mm이다. 인쇄된 침전물이 1μm 두께이고, 침전물 농도가 10μg/mL 인 경우, 31.5×106개 단백질들이 침전된다. 직경 1μm 면적에는 31.5개의 단백질이 있다. 하나의 단백질이 1 개의 항원 부위에 해당하도록 허용하면 항원 밀도가 확립될 수 있다. 2 차 어레이는 침전물 당 동일한 수의 단백질을 사용하지만, 마우스 또는 토끼의 농도가 감소함에 따라 마우스 또는 토끼와 당나귀 사이의 비율이 변한다. 100% 타깃은 전적으로 마우스 또는 토끼이며 눈금자의 0dBd 점과 일치한다.
1 차 항체가 조직의 항원 부위에 결합할 때, 2 차는 조직에서만 착색될 것이다. 적용되는 항체의 농도는, 이용 가능한 항원 부위에 결합하기에 충분한 항체 농도가 제공되어야 한다는 것을 제외하고는 특별히 제한되지 않는다. 따라서, 조직 위에서 항원 밀도 측정은 일정하게 유지되지만, 수치는 항원 회수 손상 및 2 차 효소 이득에 대해 수정되어야 한다. 그런 다음 색 밀도 대 숫자 측정을 조화시켜야 한다.
이전 예에서, 효소 이득은 10배(x)이고 항원 회수는 2 차 어레이로부터 2 개의 도트의 손실을 야기하였다. 항원 회수 손실은 + 6dBd 인 반면, 효소 이득은 -20dBd이다. 결과는 -14dBd이다. 희석은 다음과 같이 번역된다:
| 수치 밀도 dBd |
색상 밀도 dBd |
% 타깃 마우스/ 토끼:당나귀 |
1μm2에서의 항원 밀도 마우스/토끼 |
| 0 | -14 | 100 | 31.5 |
| -3 | -17 | 70.8 | 23.32 |
| -6 | -20 | 50.1 | 15.78 |
| -9 | -23 | 35.5 | 11.18 |
| -12 | -26 | 25.1 | 7.90 |
| -15 | -29 | 17.78 | 5.60 |
| -17 | -32 | 12.59 | 3.96 |
| -20 | -35 | 9.9 | 3.12 |
유형 B: 1 차 항원 기반 눈금자 이 형태는 1 차 및 2 차 타깃 어레이를 모두 사용한다. 2D 바코드에 매립되어 전달된 정보는 (a) 일차 항체 데이터:항체의 숙주 종 및 dBd의 희석 그리고 (b) 이차 효소 이득을 포함한다. 로트 코드 데이터에는 사용 중인 1 차 타깃 조합에 대한 정보가 포함된다.
1 차 타깃 계열이 존재하는 경우, 가장 농축된 도트는 2 차 어레이와 동일한 100% 농도를 가진 세 개의 도트들일 것이고, 도트들은 -6dBd 단계에서 간격을 두고 있다. 사실상, 1 차 어레이와 2 차 어레이는 동일한 희석 기울기를 갖는다. 1 차 타깃은 -0, -6, -12dBd가 되고 PdBd(1 차 dB 희석)로 표시된다. 항원 회수가 2 차 어레이의 손상과 거의 동일하게 손상될 것으로 예상하는 것이 합리적이다. 1 차 어레이는 2 차 착색에 의해 작용하므로 동일한 효소 이득 기능을 경험한다. 따라서, 1 차 어레이는 (-A + AR -E)dBd가 되며, 일차 타깃 밀도는 1 차 항체 희석에 의해 제어된다. 유일한 요구 사항은 P가 항상 A보다 크다 이다. 10배(x) 효소 이득 = -20dBd 및 + 6dbd 항원 회수 손실의 경우 1 차 어레이는 -20, -26, -32dBd이다. 항원 회수 손실은 2 차 어레이에 대한 영향에 기초하여 이들을 제거할 수 있을 만큼 1 차 타깃에 작용하지 않는다. 2 차 어레이는 항원 밀도 눈금자를 생성하기에 충분하지만, 1 차 희석이 올바르게 적용되었는지 확인하는 것이 중요하다. 따라서 1 차 타깃은 해당 용량에서 작동한다.
전술한 내용은 이 분야 전문가들이 본 개시의 양태를 더 잘 이해할 수 있도록 여러 실시 예의 특징을 개략적으로 설명한다. 이 분야의 전문가들은 동일한 목적을 수행하고/하거나 본 명세서에 도입된 실시 예의 동일한 이점을 달성하기 위한 다른 공정 및 구조를 설계 또는 수정하기 위한 기초로서 본 개시를 용이하게 사용할 수 있음을 인식해야 한다. 이 분야의 전문가들은 또한 그러한 균등한 구성이 본 개시의 정신 및 범위를 벗어나지 않으며, 본 개시의 정신 및 범위를 벗어나지 않고 본 명세서에서 다양한 변화, 대체 및 변경할 수 있음을 인식해야 한다.
본 출원은 2019 년 10 월 10 일에 출원된 미국 특허 출원 제 16/597,930 호로부터 우선권을 주장하고, 2018 년 10 월 12 일에 출원된 미국 가 출원 번호 62/745,074로부터 우선권을 주장하며, 각각의 개시는 그 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.
Claims (20)
- 조직 절편 또는 느슨한 세포를 포함하는 샘플을 보관하도록 구성된 검출 영역을 포함하는 슬라이드로서, 그리고
다음의 제어 영역을 포함하는:
면역 조직 화학 또는 면역 화학 검출 공정 중 중간 단계의 오류 및 성능 측정을 나타내는; 그리고
착색된 조직 또는 세포의 색상 및 항원 밀도를 정성적으로 또는 정량적으로 결정하기 위한 참조를 제공하는 한편,
상기 제어 영역은,
1 차 타깃 어레이를 포함하고, 상기 1 차 타깃 어레이가 1 차 타깃 로딩 도트를 포함하고, 상기 1 차 타깃 로딩 도트가 복수의 1 차 타깃을 포함하고, 상기 복수의 1 차 타깃 각각이 면역 조직 화학 또는 면역 화학 탐지 과정에서 사용되는 1 차 항체의 숙주 단백질을 포함하는, 슬라이드. - 제 1 항에 있어서,
모이어티와 결합하도록 구성된 접착제 코팅을 추가로 포함하고, 여기서 접착제 코팅은 -ROH, -R(C=O)OH, -RNH3, -R(C=O)NH2 및 -RNH2로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 말단기를 포함하는, 슬라이드. - 제 1 항에 있어서,
상기 제어 영역이 1 차 타깃 어레이를 포함하고, 1 차 타깃 어레이가 하나 이상의 1 차 타깃 로딩 도트를 포함하고, 하나 이상의 1 차 타깃 로딩 도트의 각각의 1 차 타깃 로딩 도트가 1 차 항체의 숙주 FcyRI 펩티드에 반응하는 단백질을 포함하는 단백질 부위로 구성되며, 단백질은 단일 또는 복수의 1 차 항체 숙주에 반응하며 각 단백질 부위는 단일 1 차 항체 단백질을 슬라이드에 고정시키는, 슬라이드. - 제 3 항에 있어서,
상기 FcyRI 펩티드는 수송 단백질에 결합되고, 수송 단백질은 비 반응성 단백질을 포함하고, 비 반응성 단백질은 면역 조직 화학 또는 면역 화학 검출 과정에 사용되는 2 차 착색 시약에 비 반응성인, 슬라이드. - 제 4 항에 있어서,
상기 1 차 타깃 어레이가 복수의 1 차 타깃 로딩 도트를 포함하고, 복수의 1 차 타깃 로딩 도트의 각각의 1 차 타깃 로딩 도트가 동일한 반응성 FcyRI 펩티드를 포함하고, 복수의 1 차 타깃 로딩 도트 각각이 동일한 반응성 FcyRI 펩티드를 포함하며, 타깃 로딩 도트는 복수의 1 차 타깃 로딩 도트의 서로 다른 1 차 타깃 로딩 도트와 상이한 농도의 반응성 FcyRI 펩티드를 갖는, 슬라이드. - 제 4 항에 있어서,
상기 1 차 타깃 어레이가 복수의 1 차 타깃 로딩 도트를 포함하고, 복수의 1 차 타깃 로딩 도트의 각각의 1 차 로딩 도트는 상이한 반응성 펩티드를 포함하고, 복수의 1 차 타깃 로딩 도트의 각각의 1 차 타깃 로딩 도트는 복수의 1 차 타깃 로딩 도트의 서로 다른 1 차 타깃 로딩 도트와 상이한 농도의 반응성 펩티드를 갖는, 슬라이드. - 제 1 항에 있어서,
상기 제어 영역은 1 차 타깃 어레이를 포함하고, 1 차 타깃 어레이는 1 차 로딩 도트를 포함하고, 1 차 타깃 로딩 도트는 복수의 1 차 타깃을 포함하고, 복수의 1 차 타깃 각각은 면역 조직 화학 또는 면역 화학 탐지 과정에서 사용되는 1 차 항체의 숙주 단백질에 대한 단백질 A, 단백질 G, 단백질 A/G 또는 단백질 L를 포함하는, 슬라이드. - 제 1 항에 있어서,
상기 제어 영역은 2 차 타깃 어레이를 포함하고, 2 차 타깃 어레이는 2 차 타깃 로딩 도트를 포함하고, 상기 2 차 타깃 로딩 도트는 복수의 2 차 타깃을 포함하고, 다음을 포함하는 각각의 복수의 2 차 타깃:
면역 조직 화학 또는 면역 화학 탐지 과정에서 사용되는 1 차 항체의 숙주 단백질; 그리고
더미 단백질
을 포함하는, 슬라이드. - 제 8 항에 있어서,
상기 제어 영역은 복수의 2 차 타깃 어레이를 포함하고, 동일한 2 차 타깃 어레이 내의 복수의 2 차 타깃 어레이 각각은 동일한 숙주 단백질을 포함하고, 상이한 2 차 타깃 어레이에 있는 복수의 2 차 타깃 어레이 각각은 상이한 숙주 단백질을 포함하는, 슬라이드. - 제 1 항에 있어서,
상기 제어 영역은 이미징 참조 타깃을 더 포함하는, 슬라이드. - 제 10 항에 있어서,
이하의 것을 적어도 한 가지 포함하는 이미징 참조 타깃;
탄소 먼지를 포함하는 흑색 참조 타깃;
금속 산화물 또는 금속 황산염을 포함하는 백색 참조 타깃; 또는
임의의 면역 조직 화학 또는 면역 화학 시약에 대한 비 반응성 단백질을 포함하는 명확한 참조 타깃
을 포함하는, 슬라이드. - 제 10 항에 있어서,
이하의 것을 포함하는 이미징 참조 타깃:
백색 참조 타깃 및 흑색 참조 타깃을 위한 무수물 계 에폭시; 그리고
명확한 참조 타깃을 위한 말과 포유류의 단백질
을 포함하는, 슬라이드. - 제 1 항에 있어서,
상기 제어 영역은 면역 조직 화학 또는 면역 화학 탐지 과정에서 항원 회수의 정도를 모니터링하도록 구성된 항원 회수 타깃을 추가로 포함하는, 슬라이드. - 제 13 항에 있어서,
상기 항원 회수 타깃은 3D 타깃을 정의하기 위해 상기 1차 타깃에 공유 결합된 서브 미크론 비드를 포함하는, 슬라이드. - 제 1 항에 있어서,
상기 제어 영역이 파라핀 코팅으로 덮여 있는, 슬라이드. - 제 1항에 있어서,
다음 중 적어도 하나:
슬라이드 유형을 식별하는 마킹;
상기 제어 영역에 의해 지원되는 항원을 식별하기 위한 코드; 또는
배치 번호(batch number)
를 포함하는, 슬라이드. - 다음을 포함하는 제 1 항에 따른 슬라이드를 이용한 면역 조직 화학 착색 방법으로서:
고정 부분 중 조직 절편에서 항원 부위를 노출하고 제어 타깃을 노출하기에 충분한 부분을 제거하는 단계;
조직 절편 및 제어 타깃을 착색하는 단계;
착색 과정의 품질을 평가하는 단계를 포함하며,
상기 착색하는 단계는,
하나 이상의 1 차 항체를 슬라이드에 적용하고, 모이어티와 접합된 하나 이상의 2 차 항체를 슬라이드에 적용하는 단계; 또는 모이어티와 접합된 하나 이상의 1 차 항체를 슬라이드에 적용하는 단계; 그리고
타깃이 된 항원의 존재를 나타내기 위해 모이어티의 존재 하에 색을 생성하는 착색 시약을 적용하는 단계;를 포함하고,
상기 평가하는 단계는,
조직 절편으로부터 분리된 제어 영역에 위치한 제어 타깃 또는 항원 회수 타깃의 착색 결과를 평가하는 것을 포함하는 슬라이드를 이용한 면역 조직 화학 착색 방법. - 제 17 항에 있어서,
상기 슬라이드를 이용한 면역 조직 화학 착색 방법은, 제어 타깃으로부터 파라핀 보호층을 제거하는 단계를 추가로 포함하고,
상기 파라핀 보호 층을 제거하는 단계는,
슬라이드를 65 ~ 75°C 범위의 온도로 3-10 분 동안 가온 하여 제어 영역 및 조직 절편에 걸쳐 반액화 파라핀을 얻는 단계;
반액화 파라핀을 유기 용매로 액화시키는 단계;
무수 에탄올의 단계적 시퀀스를 사용하여 최대 60% 에탄올 농도로 제어 및 탐지 영역을 재 수화하는 단계; 그리고 완충 용액에서 제어 타깃들을 재 수화하는 단계를 포함하는 슬라이드를 이용한 면역 조직 화학 착색 방법. - 제 18 항에 있어서,
상기 유기 용매는 지방족 용매, 자일렌 및 자일롤로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상을 포함하고, 상기 완충 용액은 염기 기반 완충 용액인 슬라이드를 이용한 면역 조직 화학 착색 방법. - 삭제
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