CN110753846B - 免疫组织化学抗原成像标尺外推方法 - Google Patents

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Abstract

本公开中提供了一种用于IHC抗原成像标尺外推的方法。本公开提供了特别涉及由已知梯度密度的一系列二级哺乳动物IgG的血清型和任选的抗原浓度揭示的抗原浓度标尺的方法。前述方法的主要应用是以靶标蛋白质浓度标尺，来支持对载片进行的图像分析。该方法用于从二级蛋白质浓度标尺形成一级抗原浓度标尺。然后将一级抗原浓度标尺应用于共生组织切片，以接近被检测到的细胞缺陷例如癌症的组织切片。

Description

免疫组织化学抗原成像标尺外推方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年6月15日提交的美国临时申请No.62/520187和2017年6月15日提交的美国临时No.62/520319的优先权，其每一个的公开内容均通过引用整体结合于此。
技术领域
本发明涉及用于IHC(免疫组织化学)抗原成像标尺外推的方法。本发明特别涉及由已知梯度密度的靶标系列的二级哺乳动物IgG的血清型和任选的抗原浓度揭示的抗原浓度标尺的方法。前述方法的主要应用是以靶标蛋白质浓度标尺，来支持对载片进行的图像分析。该方法用于从二级蛋白质浓度标尺形成一级抗原浓度标尺。然后将一级抗原浓度标尺应用于共生组织切片，以接近被检测到细胞缺陷例如癌症的组织切片。
背景技术
当样品中未知浓度的分析物需要定量时，可使用免疫分析。为了获得最准确的未知浓度测定，不仅必须根据常规测定的形成标准(标准偏差或最佳信号窗口)，而且还要根据免疫测定能够多好地预测未知样品价值来形成免疫测定方法。首先，需要确立测定的关键成功因素。然后需要形成免疫测定法，以确立概念验证。在优化阶段，通过计算将在基质中测量实验样品的精密度，可以确定免疫测定方法的可定量范围。然后通过将分析物加标到基质中并确定基质中分析物的回收百分比来执行加标回收。如果精度曲线在期望的工作范围内，则在几天内分析加标的回收样品即可完成免疫分析的验证。如果精度曲线极限不在期望的工作范围内，则在验证之前需要进一步优化免疫测定。
直接的应用中公开的方法的主要应用是以靶标蛋白质浓度标尺支持对载片进行的图像分析。本发明公开的方法用于从二级蛋白质浓度标尺形成一级抗原浓度标尺。然后将一级抗原浓度标尺应用于共生组织切片，以接近被检测到的细胞缺陷例如癌症的组织切片。
发明内容
总体上，在本发明的一个方面提供了用于IHC抗原成像尺度外推的方法。
在本发明的另一个方面，发明公开了一种方法，通过该方法从二级哺乳动物IgG血清和抗原浓度的已知的梯度密度靶标系列建立抗原浓度标尺。
在本发明的又一个方面，前述方法的主要应用是以靶标蛋白质浓度标尺支持对载片进行的图像分析。
在本发明的还一个方面，方法用于从二级蛋白质浓度标尺形成一级抗原浓度标尺。
在本发明的又一个方面，然后将一级抗原浓度标尺应用于共生组织切片，以接近被检测到细胞缺陷例如癌症的组织切片。
在以下描述中公开了本发明的其他方面。
发明详述
通过参考以下本发明的详细描述，可以更容易地理解本发明，该详细描述形成本公开的一部分。应当理解，本发明不限于在此描述和/或示出的特定设备、方法、条件或参数，并且在此使用的术语仅是示例性的，并不意图限制所要求保护的发明。另外，如在包括所附权利要求书的说明书中所使用的，单数形式“一种”、“一个”和“该”包括复数，并且除非明确指出，否则对特定数值的引用至少包括该特定值。范围可以在本文中表示为“大约”或“近似”另一个特定值。当在另一个实施例表示这样的范围时。此外，应当理解，除非另外指出，否则本文所述的尺寸和材料特性是作为示例而非限制，并且是为了更好地理解适当效力的样本实施方式，而且根据特定的应用，所述值以外的变化也可以在本发明的范围内。
本发明不限于在其应用中所阐述的结构细节和组件的布置。在以下描述中或者在以下描述中示出或者在附图中示出。本发明能够有其他实施例并且能够以各种方式被实施或执行。同样地，本文中出于描述的目的而使用的措词和术语不应视为限制性的。“包括”、“包含”、“具有”、“含有”、“涉及”及其变体以及其他项目的使用。
免疫组织化学(IHC)染色一般而言用于评估患者组织切片中特定抗原位点的呈递。针对组织切片上的染色强度应用主观解释，以指定异常或癌性疾病的诊断水平。一般而言，假定IHC处理始终正确运行，并且组织切片将用可见的色原标记物进行标记，以识别可能存在的异常或癌性疾病。但是，抗原修复(Antigen Retrieval)或染色试剂的失效不会留下识别伪影的特征。因此，就实验室技术人员或病理学家而言，有很大的可能性无法做出有效的诊断测定。换句话说，物理形态可能不足以发出异常状况的信号，但如果抗原位点没有被标记，载片所提供的不比在苏木和曙红(H&E)载片上所发现的要多。
为了完成计算，有些要求中的传递是必需的。需要知道的参数如下：
抗体A：稀释比、ID、和宿主种类(例如25，ER，小鼠)
抗体B：稀释比和ID(例如20，Ki-67)。不需要宿主种类的原因是，无论抗体A使用哪种宿主，抗体B一定是“小鼠/家兔”中的另一种。
已知一级抗体由从宿主动物(小鼠或家兔)获得的加工过的宿主血清组成，该血清被所需抗原组分接种。然后，宿主产生血清蛋白，其中抗原位点现在包含针对抗原拮抗剂的抗体反应物。当抗体随后与包含靶标抗原的蛋白质接触时，抗原和抗体结合在一起。结果是抗体的宿主种类(小鼠或家兔)可以自由地与二级染色试剂盒反应。
IHC靶标可用于针对共生组织切片形成抗原密度标尺的基础如下：
载片的粘合剂结合位点密度超过单个蛋白质的区域位移至少两个数量级。
一级抗体和二级蛋白质具有已知的原子质量kDa，可以转换为纳克的重量。
一级和二级靶标具有明确界定的圆形沉积区域，在其上施加了已知分配体积的靶材材料。由于蛋白质沉积物包含交联偶联剂，因此它们不比深层蛋白质更能沉入载片涂层的孔隙中。因此，知道蛋白质的原子质量、沉积物中每种蛋白质类型的蛋白质数量以及靶标的面积，就可以计算出靶标的活性表面蛋白质密度。
暴露于一级抗体试剂的载片上的施加浓度、分配体积和表面积是已知的。可以合理地假设，在试剂的暴露时间内，大多数悬浮的抗体将掉落并被受体抗原位点捕获。只有直接落在抗原位点上的那些才能被捕获，并通过缓冲液洗涤步骤将平衡洗掉。因此，当浓度比临界值大于25％以上且小于25％的饱和值，则可以确立沉积的抗体浓度。
a.临界值定义为靶标位点密度不足以捕获所施加的蛋白质浓度。
b.饱和值定义为无法捕获所有施加的蛋白质浓度。
知道了一级稀释比，就可以选择正确的一级标靶浓度靶标，并且可以验证一级浓度。
每个二级和一级靶标是混合[(小鼠或家兔)+(驴+交联剂+真菌抑制剂)]或[(KLH与抗原A或KLH与抗原B)+(非结合KLH+交联剂+真菌抑制剂)的混合物。每个点的总蛋白质量相同，但是由于构成特定靶标的蛋白质之间的原子质量可能不同，因此必须对混合比例进行一些微调。例如，
遵循20log(稀释度)曲线后，2D二级靶标序列的范围为10％至100％，其中稀释范围为1：1至1,000：1。单个2D/3D靶标用于测量2D基底和3D粒子之间的染色强度增量。可以将增量应用于2D阵列的平衡，以产生与在组织切片中或组织切片上看到的3D行为非常匹配的颜色密度标尺。
二级100％2D/3D和2D靶标验证了这两个沉积物在2D染色强度方面匹配。这是3D粒子成分没有消耗足够的100％蛋白质材料导致2D成分移位的验证。
二级染色剂结合了1到20x的酶增益功能，这是染色剂结构的功能。因此，随着增益的增加，较低浓度的二级靶标将转变至饱和，而当增益下降至1时，只有较高浓度的二级靶标会被明显地染色。
如果二级靶标阵列未共价固定，则IHC载片所经历的抗原修复过程将损坏沉积物。尽管这提供了AR影响的量度，但是在产生可应用于组织的抗原密度标尺方面没有用，因为无从得知AR对组织的影响是什么。因此，抗原密度标尺只能反映组织切片上或组织切片内的残留量。这就是为什么提供两个抗原修复靶标用于评估AR过程的QC用途。
由于二级和一级靶标蛋白质之间的大小差异很可观，因此一级蛋白质将确立蛋白质浓度密度。如果我们接受KLH亚基KLH1和KLH2具有50:50分布的前提，那么它们的平均值370kDa可用于设定一级靶标稀释度。
在平均一级抗体原子质量为150kDa的情况下，单个抗体的重量为150kDa(1.6605x10-12)，相当于249x10-12ng的重量。如果我们选择将载片的单个区域作为唯一暴露的部分，那么我们可以获知施加的一级试剂的量。因此，在内部尺寸为20.3mm2×0.14mm高的封闭毛细管间隙中，体积为57.2μl。直径为1mm的靶标区域的比率，代表靶标点之一的面积，其将产生0.1μl的施加的一级抗体试剂。
将一级抗体试剂从其浓缩液稀释至1至100μg/ml的范围。因此，对于1-100μg/ml的一级稀释度，靶标将暴露于0.1至1μg的抗体中。给定抗体的重量标称值为249x10-12ng，则1mm靶标最大蛋白质暴露范围为41.06至4106个抗体。
为了确保100％的捕获能力，一级靶标的安全系数应为100到1000x。选择1000x选项，则一级靶标需要包含4x106抗原位点。尽管KHL亚基大于所施加的抗体，但这种增加不足以使捕获的抗体数量超过1：1。每个KLH亚基具有370kDa的平均原子质量，其等于614.4x10-12ng的重量。
可以从蛋白质的分子量和平均蛋白质部分特异性体积,非常简单且可靠地估计蛋白质分子的体积。(部分特异性体积＝体积/分子量)。实验确定的可溶性球状蛋白质部分特异性体积的平均值为～0.73cm3/g。该值因蛋白质而异，但是范围很窄。反应式减少到～(1.212x103×MW)nm3的蛋白质体积。因此，对于KLH亚基个体体积是448.44nm3。如果将蛋白质建模为球体，则球体的直径将变为0.132*MW1/3，单位为nm。对于KLH亚基，是9.436nm。
对于1mm的靶标直径，KLH亚基的单层需要11.237*1027个蛋白质。对于4x106蛋白质的有效靶标密度，最小稀释比变为1：2.8x1021。实际上，任何接近1：1000的稀释都是可行的，因为对一级抗体的评估主要取决于其活性蛋白质的浓度。因此，靶标密度仅受其低浓度下限限制。
二级靶标阵列的梯度稀释倍数在1：1和1,000：1之间。稀释度的线性斜率以-20log(稀释度)的形式，以下称为dBd。对于1：1到1,000：1之间列出的稀释范围，半对数范围是0到-60dBd。选择-3dBd稀释梯度，二级靶标稀释度变为0，-3，-6，-9，-12，-15，-18，-21dBd。
染色会随着一级抗体浓度和二级染色试剂盒中酶的增加而饱和或临界。饱和是指酶位点的密度超过从色原中沉淀出着色剂的能力。换句话说，染色颜色尽可能深得可以被识别。当一级抗体的浓度和二级染色试剂盒的酶增益过低时，会发生临界，导致无法看到足够的着色剂沉淀。这两个因素导致二级路径的暗度变为饱和(100％)或临界(0％)。根据图2，此运动被视为可见靶标的数量。随着二级酶增益的增加，100％点密度向0％位置移动。通常的酶增益为1、2、4、5、8、10、15和20。这些转换通过以下方式将二级阵列移向0％位置：
·20倍所有靶标移动-26dBd
·15倍所有靶标移动-23.52
·10倍所有靶标移动-20
·5倍所有靶标移动-13.98
·4倍所有靶标移动-12.04
·2倍所有靶标移动-6.02
·1倍仅2D 100％点接近黑色
如果存在一级靶标阵列，则二级酶增益的增加会使染色强度向低一级浓度点偏移。如果一级抗体浓度增加，情况也是如此。抗原修复过程将导致一级和二级靶标均降解到一定水平，从而逆转了向临界值的移动。如果在IHC染色结束时有三个或三个以上的点消失了，则可以认为载片的抗原修复时间过长、温度过高、或两者皆有，并且组织上失去过多的抗原呈递，从而使诊断解释显得无关紧要。该决定独立于一级抗体的功效，因为已经证明二级染色会受到损害。抗体步骤上没有办法可以克服这一损害水平。
典型地，AR损坏会导致次级阵列向100％位置移动三个或更多点，这被认为是过多的，并且应使用酶含量更高的二级染色试剂盒或更高浓度的抗体重做载片。
一级抗原靶标颜色密度因此是抗体浓度乘以二级染色试剂盒的酶增益的总和。而二级靶标密度仅为酶增益乘以二级靶标蛋白浓度。
取决于数字成像系统，照明强度的变化会将图像的动态范围改变为压缩(变暗)或饱和(变亮)。这些变化将改变抗原的颜色标尺，而抗原密度的数字标尺不会改变。因此，数字标尺是独立的，而颜色标尺则取决于照明强度。
在QC模式下，共生靶标可提供IHC过程反馈，如图3所示。显示了四行二级阵列，其区别在于指定、超过、非常超过和过度超过分别是5％、10％、30％和40％的范围内执行抗原修复的程度。抗原修复过程试图通过撤销甲醛和蛋白质之间的席夫碱键来显露抗原位点。抗原变为显露的速度在很大程度上是取决于反应的温度。随着温度升高，发生有成核沸腾(nucleate boiling)的机会。成核沸腾对组织和蛋白质沉积物均造成物理损害。理想地，抗原修复活性在载片上是均匀的，但实际上不会发生，因此取决于所使用的方法和环境而使得区域具有或多或少的抗原修复活性，。假设具有统一的抗原修复活性，则以下可用于指示该载片可用于诊断测定：
如果AR最小或过多，则二级阵列可能无法反映失效。但是，两个AR靶标将发出过多失效条件的信号。
·低AR被观察为固定靶标下的2D/3D和固定靶标上的2D均为黑色。二级阵列看上去最佳，靶标也没有向左移动的AR。
·在下列情况下，IHC染色器中可以出现低AR活性：
AR加热器没有工作或设置在80℃以下
AR缓冲液具有中性pH值7，而不是6或9
暴露时间太短
·高AR被观察为固定靶标下的2D/3D变得非常白，并且固定靶标上的2D少于50％黑色。二级阵列也将大体上变白。
·在下列情况下，IHC染色器中可以出现高AR活性：
加热器工作在温度>95℃
暴露时间太长
·在两种情况下会产生色原沉淀错误：
如果在高浓度下，二级靶标的染色强度下降，而不是在最大暗度下下降。二级阵列应始终相对于位点密度增加。如果不是这样，则色原沉淀已耗尽二级试剂盒的容量。解决方案是增加一级抗体稀释度(与降低抗体浓度相同)。
自被激活以来，色原试剂已经变质(通常发生在DAB中)。解决方案是使用新的DAB混合物。
通过常规显微镜观察显微镜载片对于照明水平是主观的。在全载片成像(WholeSlide Imaging，WSI)中，扫描仪使用完美的白孔穴和黑孔穴来建立白平衡和对比度。手动显微镜不是这种情况。图3图示了照明水平过暗(最佳时为-5％)，最佳(+0)以及过亮(如+10或+15％)时对图像的影响。当光线水平低于最佳水平时，染色强度会降低。就癌症分期而言，这可能会使诊断比原先的要高一个阶段。当光水平高于最佳水平时，图像会变白。就癌症分期而言，这可能会使诊断比原先的要低一个阶段。抗原颜色密度和数字标尺由一级和二级靶标形成，可以叠加在WSI图像上。数值标尺是独立项，而颜色密度是相关项。当将抗原密度颜色和数字标尺应用于WSI时，随着用户上下移动照明级别，数字刻度保持固定。另一方面，随着照明水平的变化，颜色密度标尺也会发生变化。优点是用户可以选择将表观照明向上/向下移动到组织图像上的最佳“可见”特征，而不会丢失与颜色密度的数值关系。随着放大倍率的改变，这也将起作用。
可以通过两种形式形成抗原密度标尺。A型基于以下假设：一级抗体总是相对于组织抗原位点施加少于10％的过量抗体。B型使用一级抗原梯度密度阵列。
A型：仅基于二次的抗原尺
该形式仅使用二级靶标阵列。嵌入2-D条形码中的传递信息包括(a)一级抗体数据：抗体的宿主物种和-dBd的稀释度；以及(b)二级酶增益。
二级梯度密度靶标阵列由靶标之间-3dBd递减后的已知浓度的蛋白质组成。通过使用一级抗体的最小稀释度选择最大浓度。大多数用户采用抗体试剂制造商提供的浓度规格，并稀释至1ug/ml的恒定中间浓度。由此，根据需要进行所有其他稀释以适应不同的组织类型。一般而言，第二组一级抗体稀释度在1：1至1,000：1之间。
为了适应二级酶增益的范围，二级阵列必须由更宽范围的稀释度组成。因此，以-3dBd的梯度，二级阵列的最低稀释度开始于1,000：1或-60dBd，其以SdBd表示。然后，8点序列的最大值变为-0dBd或1：1。抗原修复的作用降解了以ARdBd表示的二级蛋白质。二级阵列中的八个点中每个点代表-3dBd的增量。丢失两个靶标(不再可见)的抗原修复损失将为+6dBd。这意味着对于2D靶标，二级阵列为(-S+AR)dBd或[+6至-54dBd]。现在必须将抗体浓度和二级酶增益作为因素。抗体浓度为AdBd，而酶增益为EdBd。因此，二级阵列将为(-S+AR-E)dBd，而组织将为(+AR-E+A)dBd。下一个必须施加的因素是100％2D到3D的差异。100％2D/3D靶标中的3D对象与100％2D之间的染色差别代表二次染色色原沉淀常数，该常数用于将颜色色密度分配给数值标尺，并分配给DdBd。颜色密度的差异将应用于阵列中的每个2D标靶。因此，2D阵列的染色颜色密度为(+AR -E +A +D)dBd。
例如，如果酶增益为10x，则E＝-20dBd。然后，2D二级阵列将变为：-14、-17、-20、-23、-26、-29、空白、空白dBd。朝向0％的两个点已被抗原修复过程充分破坏，以致于无法通过染色修复，因此为空白。例如，如果2D/3D颜色密度差为10x，则D＝+20dBd，使3D二级阵列为-34、-37、-40、-43、-46、-49、空白、空白dBd。假定一级抗体试剂会在一级靶标中找到合适的抗原位点，其产生100％收率。还假设每个KLH蛋白质有两个以上的抗原肽链，但每个KLH蛋白质只有一种抗体可以有效结合并被染色。在同一KLH蛋白质上的找到合适抗原的任何附加抗体，由于重叠占位，会被防止实现被二级染色。因此，每个一级抗原携带的可被检测到的蛋白质中的抗原位点数目是一个。由于一级靶标每微米包含的蛋白质数量与二级靶标相同，因此将来自500ug/ml抗体原版的一级稀释液应用于二级阵列数据，以将二级颜色密度调整为数字抗原密度。监控二级靶标，选择具有中等颜色密度的靶标。中间颜色密度定义为最大黑色和最大白色之间的50％点。然后，该点等于3dBd范围之外的1.5dBd。然后，该点将起到锚点的功能，根据该锚点建立抗原密度尺。使用高于中点的最后一个靶标范围将变为-41.5dBd。
二级蛋白质被稀释至10ug/ml主稀释液。每个阵列是小鼠或家兔与驴IgG蛋白质混合而成的混合物。尽管蛋白质的原子量均不同，但以下假设所有蛋白质均为150kDa，并且每个靶标点的蛋白质总数恒定，混合比不是恒定的。目前，仅考虑反应蛋白质的浓度。原子量为150kDa时，单个蛋白质分子量MW＝249.07x10-12ng。标准靶标点的直径为1mm。如果印刷的沉积物厚1μm，并且沉积物浓度为10μg/ml，则将沉积31.5x106蛋白质。直径为1μm的区域将包含31.5个蛋白质。如果我们允许一种蛋白质等于1个抗原位点，则可以确立抗原密度。二级阵列每次沉积使用相同数量的蛋白质，但是随着小鼠或家兔浓度的降低，小鼠或家兔与驴之间的比率也会发生变化。100％的靶标完全是鼠标或家兔，并且与尺上的0dBd点匹配。
仅当一级抗体结合到组织上的抗原位点时，二级才会在组织上染色。它并不特别取决于所施加抗体的浓度，除了必须提供足够的抗体浓度以结合可用的抗原位点外，因此，在组织上的抗原密度测量值保持恒定，但是必须针对抗原修复破坏和二级酶增益校正数值。然后必须统一颜色密度与数值测量值。
在先前的示例中，酶增益为10倍，抗原修复导致二级阵列损失了两个点。酶增益为-20dBd，而抗原修复损失为+6dBd。其结果是-14dBd。稀释后将转化为：
B型：基于一级抗原的标尺
该形式使用一级和二级靶标阵列双方。嵌入2-D条形码中的传递信息包括(a)一级抗体数据：抗体的宿主物种和稀释度(dB)；以及(b)二级酶增益。批号数据包括有关使用哪个一级靶标组合的信息。
如果存在一级靶标序列，则将是3个点，其中最浓缩的点与二级阵列的浓度相同，为100％，但这些点以-6dBd的梯度间隔开。实际上，一级阵列和二级阵列具有相同的稀释斜率。一级靶标为-0、-6、-12dBd，并表示为PdBd。可以合理预期,抗原修复将破坏与第二阵列的破坏几乎相同。一级阵列受第二染色剂作用，因此具有相同的酶增益功能。因此，一级阵列将为(-A+AR-E)dBd，其中一级靶标密度由一级抗体稀释度控制。唯一的要求是P始终大于A。对于10x的酶增益＝-20dBd以及+6dbd抗原修复损失，一级阵列为-20，-26，-32dBd。基于对二级阵列的影响，抗原修复损失不能作用于一级靶标上，不足以将其消灭。尽管二级阵列足以产生抗原密度尺，重要的是要验证一级稀释液的正确施加。因此，一级靶标以这种能力发挥作用。
本申请将申请号为62/520319的标题为“用于免疫组织化学染色的过程记录载片”的中公开的具有标靶蛋白质浓度标尺的载片的定义的参考全部并入。具有在申请号62/520319中也定义的靶标蛋白质浓度标尺的前述载片由最少两个二级靶标蛋白质阵列和任选的一种或多种一级抗原靶标阵列组成。
在本发明的一个实施例中，前述的二级靶标蛋白质阵列形成为两条线：一种小鼠IgG和另一种家兔IgG与无效IgG血清蛋白混合以形成五种或更多种成分梯度密度序列，其从20log(稀释度)曲线中的最大密度到最小密度，其中稀释度范围为1：1至1,000：1。
在另一个实施例中，在最后的工艺步骤中，所识别的那些抗原位点通过色原沉淀而变色。因此，小鼠与家兔靶标阵列反映了二次染色试剂盒色原沉淀的20log(稀释度)曲线。
在另一个实施例中，用于形成一级抗原密度标尺的方法的优选解决方案是以成功地组成靶标混合物为基础，以靶标蛋白质浓度标尺将它们沉积到载片上，并且在粘合剂和靶标材料之间具有共价键。
在另一个实施例中，推断成功地应用了靶标阵列，并且一级和二级染色试剂均能合理地执行，然后可以通过计算机算法容易地完成数据集之间的曲线拟合。在另一个实施例中，一级染色剂可以选自任何IHC认可的使用小鼠或家兔宿主蛋白质的抗体，该蛋白质也不与荧光标记物结合或与酶位点(例如HRP或AP)整合。在另一个实施例中，二级染色剂可以选自但不限于酶增益为1x至25x的二级染色剂，它们分别在小鼠和家兔之间是唯一独立的，它们各自使用不同的颜色色原。
在本发明的另一实施例中，需要注意的是，绝对地基于一种载片的性能结果可能与在另一个时间做的另一种载片的性能结果不同。这是由于二级染色试剂盒之间的性能与一级结合的一级抗体的性能不同而引起的。但是，对于具有靶标蛋白浓度标尺和抗原标尺的任何一张载片，其性能都是有效的，并且与使用不同染色试剂完成的另一张载片具有相当的等效性。
在另一实施例中，然后将一级抗原浓度标尺应用于共生组织切片，以接近被检测到细胞缺陷例如癌症的组织切片。
在另一个实施方案中，具有靶标蛋白质浓度标尺的载片描述如下：
载片，包括：检测区和对照区，其中
所述检测区是组织切片或疏松细胞的空间，可用于通过免疫组织化学(IHC)处理并随后进行检查；以及
所述对照区包括一组或多组一级和/或二级靶标阵列，其中
二级靶标阵列包括一个或多个(例如1-50、5-45、10-40、15-35或20-30，尤其1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)二级靶标加样点(点可以是任何规则或不规则形状，例如圆形，椭圆形，正方形，菱形等)，每个二级靶标加样点是宿主蛋白质(例如IgG)和无效蛋白质(例如IgG)以一定比例固定到载片上。
术语“无效蛋白质”是指与二级抗体无反应性的蛋白质，用于与宿主蛋白质混合以获得梯度稀释液。优选的无效蛋白质是驴蛋白质(IgG)或马蛋白质(IgG)。
术语“宿主蛋白质”是指与一级抗体具有相同起源的蛋白质(特别是IgG)，例如小鼠、大鼠、家兔、驴、马和山羊蛋白(IgG)。
载片的一种示例如图1所示，其靶标的详细标识如图2所示。
本文将各种实施例描述为示例。对于本领域技术人员将显而易见的是，在不脱离本文所呈现的本发明(等)的更广范围的情况下，可以进行各种修改并且可以使用其他实施方式。在示例性实施方式上的这些和其他变型旨在被本发明所覆盖。
附图说明
图1示出IHC染色后，含有一级和二级染色捕获靶标的部分载片示意图，其中识别出不同的靶标。
图2示出IHC染色后，抗原修复处理对其中一种二级蛋白质阵列的影响。
图3显示具有二级蛋白质浓度标尺的载片，该载片具有共生组织切片并进行IHC染色。

Claims (12)

1.一种用于免疫组织化学成像外推以形成浓度标尺的非诊断目的和/或非治疗目的的方法，包括以下步骤：
（a）将显微镜载片暴露于包括了一级抗体的一级染色试剂；
其中，
所述显微镜载片包括检测区和对照区，其中
所述检测区是被配置为包括组织切片或疏松细胞以用于免疫组织化学和随后检查的空间；以及
所述对照区包括沿着梯度浓度施加在所述显微镜载片上的一组二级抗体的两个二级靶标阵列，沿着梯度浓度施加在所述显微镜载片上的一组抗原的一个或者多个抗原阵列，以及沿着梯度浓度施加在所述显微镜载片上的一组一级抗体的一级靶标阵列，其中所述一级靶标阵列和所述二级靶标阵列具有相同的稀释斜率，
黑色平衡，以及
白色平衡；
所述对照区的二级靶标阵列、抗原阵列和一级靶标阵列用于免疫组织化学的抗原修复过程的质量控制；
（b）通过所述一级染色试剂中的一级抗体捕获抗原；
（c）将在步骤（a）中的所述一级染色试剂中的一级抗体和含有用于识别所述抗原的二级染色试剂中的二级抗体结合；
（d）通过色原沉淀使步骤（c）中所识别的抗原着色；
（e）计算并且比较在抗原阵列和组织切片或者疏松细胞之间的所述抗原的颜色和密度；以及
（f）通过（a）-（e）形成浓度标尺，使用所述浓度标尺测量所述组织切片或所述疏松细胞中的所述抗原的浓度，或者确定所述组织切片的细胞缺陷。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述一级抗体是小鼠IgG或家兔IgG。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述一组抗原和所述一组二级抗体被施加在任何规则或不规则形状的加样点。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述一级抗体是小鼠或家兔宿主蛋白的抗体，并且所述小鼠或家兔宿主蛋白不与荧光标记物结合或与酶偶联。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述二级染色试剂选自具有1x至25x的酶增益的二级染色试剂，所述二级染色试剂中每一个在小鼠和家兔之间是唯一独立的并且使用不同的颜色色原。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法在被粘合剂涂覆的所述显微镜载片上实施。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述梯度浓度的稀释范围为1：1至1000：1。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，使用所述浓度标尺以生成浓度-染色密度的对数-对数关系。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述黑色平衡位于所述两个二级靶标阵列的第一阵列的一端，并且所述白色平衡位于所述两个二级靶标阵列的第二阵列的一端。
10.根据权利要求3所述的方法，其中所述加样点是圆形、椭圆形、方形或菱形。
11.根据权利要求4所述的方法，其中所述酶是HRP或AP。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述组织切片是癌症的组织切片。
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