CN105324654A - 其上具有质量对照物的显微镜载玻片 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于组织样本的显微镜载玻片。载玻片包括伸长的平面基底，其包括第一主表面，该第一主表面具有其内可以附着组织样本的样本附着区；第一阳性对照物样本，其在邻近于样本附着区的第一位置处附着在第一主表面上；以及第二阳性对照物样本，其在邻近于样本附着区的第二位置处附着在第一主表面上。第一和第二位置被间隔为使得第一和第二阳性对照物样本的染色质量指示组织样本的染色质量。还提供了包含显微镜载玻片的套件和制作方法以及使用显微镜载玻片的方法。

Description

其上具有质量对照物的显微镜载玻片

技术领域

本发明涉及分子病理学的领域。更具体地，本发明针对用于确保显微镜载玻片上的组织样本的有质量的染色的设备和方法。

背景技术

组织诊断对于患者护理而言正在变得更加重要并且要求愈加自动化以满足对于吞吐量的日益增长的需求。自动化免疫染色技术被广泛地使用在大多数IHC实验室中。仪器被设计成模仿手动免疫染色过程，包括诸如抗原修复、抗体和溶液施加、培育和清洗之类的关键步骤。不同的系统具有不同程度的灵活性和载玻片容量，但是其目标是相同的：最小化错误并且提供高质量的染色，因此可以从患者样本提取一致的解释。

然而，不管这些自动染色器中的工程控制工具的供给如何，使组织具有染色溶液的不正确分配和由于气泡或厚的、松散的或折叠的组织区段的存在而引起的患者样本的不完整覆盖并不罕见，这然后产生伪阴性和非均匀染色的组织以供分析。参见例如Shi,S.-R.,Taylor,C.R.,AntigenRetrievalImmunohistochemistryBasedResearchandDiagnostics,2010,Wiley，新加坡。另外，市面上的典型自动染色器将染色区域限制到大约50mm长。一个制造商的盖玻片技术将染色区域限制到21×50mm。另一制造商的液体涡流空气混合协议覆盖了25×50mm染色区域。当前不存在验证这些指定染色区域内的整个组织区段被等同或完全染色的控制方法。

当前，载玻片上的组织的不充分染色仅仅被回顾性地标识。许多并不如此明显（not-so-obvious）的事件可能已经被忽视。来自Dako的HercetTest^TM包括单独载玻片，其包含具有0、1+和3+的染色强度分数的三个团块化的、福尔马林固定的、嵌入石蜡的人类乳腺癌细胞系，该单独载玻片作为批量对照物而被包括在每一个染色过程中。然而，批量对照物不能标识批次内的每一个个体载玻片上的任何染色缺陷。

另一先前的方案在已经包含阳性或阴性组织或细胞对照物的载玻片顶部上制备患者样本区段。这些组织的源根据设施而变化并且其染色行为将由于患者可变性而从批次到批次不同。如图1中所示，现有技术提供具有其上附着组织样本3和细胞对照物4的平面基底2的组织样本载玻片1。细胞对照物4是以在样本和基底2的一个纵向端5之间的区域中附着到载玻片的细胞团块（cellpellet）的形式。图2描绘了由马里兰州罗克维尔的Bio-Quick公司销售的现有技术的另一组织样本载玻片1'，其包括用于癌症标记IHC化验的细胞对照物4a-i的9点式阵列（http://www.bio-quick.com/qc-dots%C2%AE-cancer-array-ca-control-slides）。细胞对照物4a-i可以包括阳性和阴性对照物，但是每一个被示为与彼此是不同的对照物。尽管载玻片1包含细胞团块阵列，但是其供给与包含单个细胞团块的载玻片类似的信息。也就是说，细胞团块标记仅仅用于从被分析的组织样本接收到的信号的校准。像载玻片1那样，载玻片1'将对照物4a-I定位在样本与基底2'的一个纵向端5'之间并且可以因此取决于样本的大小和操作者的技术而靠近或远离患者的样本。这些对照物到组织的单侧的位置因此不会提供组织样本自身是否被完全且均匀地染色的可靠指示。

现有技术因此缺少以确保组织样本已经以其整体既完全又均匀地被染色的方式使用对照物的载玻片。

发明内容

本发明提供具有邻近于样本附着区的阳性对照物样本的显微镜载玻片。这些载玻片适合于组织样本的分析，诸如病理学染色，并且提供关于染色质量的实时确认。阳性对照物样本或阳性对照物包括在组织样本的分析期间可以被检测的一个或多个生物标记。因此，从阳性对照物染色的缺失将提供染色失败的实时标识。可选地，阴性对照物样本也可以被包括在载玻片上。阴性对照物样本或阴性对照物不包含在阳性对照物中发现的一个或多个生物标记。从阴性对照物染色因此也提供染色失败的实时标识。

因此，在一方面中，本发明提供了一种用于要染色的组织样本的显微镜载玻片。显微镜载玻片包括伸长的基本上平面的基底，该基底包括具有在其内可以附着组织样本的样本附着区的第一主表面。载玻片还包括在邻近于样本附着区的第一位置处附着在第一主表面上的第一阳性对照物样本和在邻近于样本附着区的第二位置处附着在第一主表面上的第二阳性对照物样本。第一和第二位置被间隔为使得第一和第二阳性对照物样本的染色质量指示组织样本的染色质量。

在另一方面中，本发明提供了一种用于要染色的组织样本的显微镜载玻片。显微镜载玻片包括伸长的基本上平面的基底，该基底包括具有在其内可以附着组织样本的样本附着区的第一主表面。载玻片包括在邻近于样本附着区的第一位置处附着在第一主表面上的第一阳性对照物样本和在邻近于样本附着区的第二位置处附着在第一主表面上的第二阳性对照物样本。第一和第二位置被间隔为使得样本附着区的至少一部分在第一和第二位置之间沿基底的纵轴延伸。

在又一方面中，本发明提供一种制作本发明的显微镜载玻片的方法，该方法包括将阳性对照物样本的薄层在第一和第二位置处转移和附着到显微镜载玻片上的步骤，其中第一和第二位置被间隔为使得第一和第二阳性对照物样本的染色质量指示组织样本的染色质量。

在再一方面中，本发明提供一种分析方法，该方法包括利用用于分别定位在第一和第二位置处的阳性对照物样本的检测手段来对本发明的显微镜载玻片染色的步骤。第一和第二位置被间隔为使得阳性对照物样本的染色质量指示组织样本的染色质量，以及从至少第一和第二位置检测阳性对照物样本。

附图说明

图1描绘了具有在邻近于载玻片的组织附着区的位置处的作为对照物的细胞团块的现有技术载玻片。

图2描绘了具有在邻近于载玻片的组织附着区的位置处的多个细胞团块的另一现有技术载玻片。

图3描绘了具有跨载玻片的组织附着区的一部分定位的细胞团块的根据本发明的实施例的载玻片。

图4描绘了具有跨组织附着区的一部分定位的细胞团块的根据本发明的实施例的另一载玻片。

图5描绘了具有彼此与组织附着区相对并且沿载玻片的相对边缘定位的细胞团块的根据本发明的实施例的又一载玻片。

图6描绘了图5的载玻片的可替换实施例，其中细胞团块二者彼此纵向间隔并且与载玻片的纵轴横向间隔。

图7描绘了具有在载玻片的组织附着区附近定位的三个细胞团块的本发明的另一实施例。

图8描绘了具有在载玻片的组织附着区附近定位的四个细胞团块的根据本发明的实施例的再一载玻片。

图9描绘了具有彼此跨组织附着区定位的不同细胞团块对的根据本发明的实施例的又一载玻片。

图10描绘了具有沿载玻片的相对边缘并且邻近于组织附着区定位的不同细胞团块的多个对的根据本发明的实施例的另外又一载玻片。

图11描绘了具有由基本上均匀间隔的细胞团块周边定界的组织附着区的根据本发明的实施例的可替换载玻片。

图12描绘了具有由不同类型的团块周边定界的组织附着区的根据本发明的实施例的另一可替换载玻片。

图13描绘了具有在载玻片上的组织附着区附近的八个细胞团块的根据本发明的实施例的载玻片。

图14描绘了根据本发明的实施例的又一可替换载玻片，其中在载玻片的组织附着区附近定位的细胞团块进一步被提供在显微镜载玻片的第一主表面上的支撑平台上。

图15描绘了具有在载玻片的组织附着区附近定位的细胞团块的根据本发明的实施例的又一可替换载玻片，其中组织样本被附着在显微镜载玻片的第一主表面上的平面凹陷区内。

图16描绘了具有在载玻片的组织附着区附近定位的细胞团块的根据本发明的实施例的又一可替换载玻片，显微镜载玻片进一步包括在样本附着区上方抬高的基本上平面的标记区。

图17描绘了根据本发明的实施例的用于制作载玻片的系统。

具体实施方式

本发明提供了包括创新性对照物样本布局的显微镜载玻片，其提供了附着到载玻片的组织样本的正确染色的较高置信度。本发明的载玻片适合于组织样本的自动染色和分析。本发明的显微镜载玻片特别适合于组织样本的自动的、多回合的、复用的分析。这些载玻片使得能够实现关于组织成像/分析期间的染色质量的确认。这些载玻片还提供通过在每一个染色回合之后提供的图像回顾来确认在所有染色回合完成之后的染色质量。在一些实施例中，本文所公开的显微镜载玻片和方法可以在组织化学、免疫染色、免疫组织化学、免疫分析、免疫荧光或荧光原位杂交方面是特别可适用的。

如图3中所示，本发明的第一方面提供了一种显微镜载玻片10，其用于对与其附着的组织样本15染色。载玻片10包括伸长的基本上平面的基底12，该基底12具有第一主表面14，该第一主表面14具有样本附着区16（其周边由假想线指示），组织样本15可以附着在该样本附着区16内。载玻片10还提供在邻近于样本附着区16的第一位置处附着在第一主表面14上的第一阳性对照物样本20a和在邻近于样本附着区16的第二位置处附着在第一主表面14上的第二阳性对照物样本20b。第一和第二位置被间隔为使得第一和第二阳性对照物样本20a和20b的染色质量指示组织样本15的染色质量。也就是说，当对照物样本20a和20b分别被定位在组织样本15与基底12的纵向边缘17a和17b之间时，在组织样本15染色之后两个对照物样本20a和20b中的信号的检测指示染色覆盖包括了基底12的两端，这是与如果仅位于单个邻域处的单个对照物样本证实染色相比而言对组织样本15的完全染色的更好的指示。通过在基底的组织附着区附近提供多个阳性对照物样本，本发明当在组织样本附近的对照物均证实已经被染色时提供完全组织染色的更大置信度。所检测到的信号从阳性对照物样本的缺少将指示对组织样本完全染色的失败。对照物样本的染色在每一个染色回合之后基底上的组织成像期间将是明显的，因此提供组织自身被正确染色的实时置信度。此外，由于图像将被保留以供后续分析，因此本发明将允许对照物样本染色记录的供给，如果批准对其的进一步回顾的话。

合期望地，第一和第二位置被间隔为使得样本附着区16的至少一部分在第一和第二位置之间沿基底12的纵轴延伸。术语“基底12的纵轴”意指在相对端17a与17b之间沿基底12的伸长长度中心延伸的线。出于本说明书的目的，基底12的纵轴还被设想成沿主表面14延伸。因此，将存在位置的纵向间隔，使得样本附着区16的至少一部分在它们之间纵向延伸。如本文将描述的，第一和第二位置的这样的纵向间隔还可以包括位置之间的横向间隔，即其中至少一个位置在基底12的纵轴与伸长边缘18a或18b之间间隔。在这些实施例中的每一个中，第一和第二位置被视为沿载玻片的纵轴间隔，甚至是在任一个或二者还与纵轴横向间隔时。对于本发明的每一个实施例，在对照物样本20a与20b之间延伸的线将穿过样本附着区16。本发明设想到，如果组织样本的一部分沿两个对照物样本之间的线定位，组织样本15的正确染色的置信度可以更高。

本发明设想到显微镜载玻片10的基底12由适合于组织染色和分析的材料形成，该材料诸如是适合于实验室玻璃器皿的玻璃。基底12合期望地是基本上平面的构件，并且除以下指出的某些实施例之外，主表面14合期望地为平面表面。虽然基底12被描绘为具有矩形形状，但是本发明还设想到基底12可以具有圆形形状或具有非线性边缘或单个连续非线性边缘的其它形状。

对于本发明的显微镜载玻片的所有实施例，组织附着区由假想线（虚线）指示，该假想线示出其所指示的周边。没有线需要出现在载玻片基底的主表面上，尽管本发明设想到实际的组织附着区可以由主表面上的线或蚀刻到主表面中的微沟道来指定。此外，虽然组织附着区的形状典型地被示为基本上矩形的，但是组织附着区的周边边界的形状可以是提供包含要分析的组织样本（或其部分）的充足表面积的任何形状（诸如椭圆形或圆形）。本发明设想到对照物样本在基底的主表面上的定位将向用户指示下述区域，在该区域内应当附着组织样本以便根据本发明来正确定位。类似地，虽然患者组织样本由一般椭圆形形状来图示，但是预见到患者样本可以是任何形状，诸如圆形、方形、矩形或不规则形状。患者样本的形状不影响本发明的各方面。阳性对照物样本的布局可以基于患者样本的尺寸和形式而被相应地调节以实现所期望的效果，即控制患者样本的染色可变形。

而且，本发明设想到由本发明所采用的阳性对照物样本合期望地选自细胞团块、对照物组织样本或加载有诸如细胞匀浆、缩氨酸、蛋白质和DNA之类的生物材料的载体。载体可以是颗粒、凝胶或其它形式。患者的组织样本可以被分段到这些载玻片上，其中的阳性对照物样本将提供诸如不一致的染色溶液分配之类的染色失败的实时标识以及关于用于大组织样本的边界染色的关注。

第一和第二阳性对照物样本优选地包含至少一种共同的生物标记（即标记）。通过生物标记或标记，其意图包括可以通过检测手段检测的任何细胞组分。示例性细胞组分包括蛋白质、核酸分子或碳水化合物。优选地，该共同的生物标记可以通过用于检测组织样本的相同检测手段来检测。可替换地，第一和第二阳性对照物样本可以包含不同的生物标记。本发明设想到，只要两个阳性对照物样本均是通过某种检测手段可检测的，本发明的目标（即对染色失败的标识）就得以实现。因此，本发明设想到，第一和第二阳性对照物样本不必是相同的，或者不必包括由相同细胞系形成的细胞团块，只要它们包含共同的生物标记即可。可替换地，即使第一和第二阳性对照物样本包含完全不同的生物标记，也可以使用本发明来标识染色失败，只要对照物二者均可以在分析组织样本时被检测到即可。

本发明还设想到每一个阳性对照物样本可以自身包含两种或更多不同种类的生物标记，例如抗原。虽然每一个细胞系可以通过各种检测手段来检测，但是本发明还设想到，表达不同种类的抗原的细胞系可以被混合在一起以生成细胞团块。这些阳性对照物样本对于复用的实验而言特别有用。因此，第一标记在两个阳性对照物样本中作为用于复用的实验的第一回合的阳性对照物而被检测。第二标记在两个阳性对照物样本中作为用于复用的实验的第二回合的阳性对照物而被检测，等等。

因此将理解的是，在本发明的对照物样本中提供的每一个标记将包括跨载玻片基底的组织附着区的一部分定位的对应配对关联标记。如以上所讨论的，配对关联标记可以是相同的。可替换地，配对关联标记可以是不同的生物标记，只要它们二者能够在分析组织样本时被检测即可。

如图4中所示，本发明还提供了显微镜载玻片110，其中对于本发明的其它实施例，相同的编号指代相同的组件。对于本发明的所有实施例，所应用的组织样本将总是被编号为“15”。术语“相同的编号”指示共享其标注的后两位数字的载玻片的不同实施例的相同组件典型地将彼此类似。类似地，在其标注中具有相同的后两位数字的组件还可以由后缀字母标注，该后缀字母指示这些组件在构造或构成方面基本上相同但是被不同地提供。

载玻片110包括具有平面主表面114的基本上平面的基底112。主表面114包括其中可以通过常规手段附着组织样本15的样本附着区116。载玻片110包括分别在主表面114的第一和第二位置处提供的第一和第二阳性对照物样本120a和120b。第一阳性对照物样本120a在样本附着区116和基底112的第一纵向边缘117a之间，并且第二阳性对照物样本120b横向傍靠样本附着区116定位。通过“横向傍靠……定位”，其意指位置沿横向于基底112的伸长轴的线定位在样本附着区116与基底112的横向边缘118a和118b中的一个之间。

如图5中所示，本发明还设想到显微镜载玻片210，其被设计成使得用于附着第一和第二阳性对照物样本220a和220b的第一和第二位置在主表面214上的样本附着区216的相对侧上，即位置跨样本附着区216基本上横向间隔。再一次，相同的编号指代本发明的相同组件。如图5中所示，对照物样本220a定位在样本15和基底212的边缘218a之间，而对照物样本220b相对地定位在样本15和基底212的边缘218b之间。

图6描绘了本发明的另一显微镜载玻片310。载玻片310包括基本上平面的基底312，其包括第一主表面314，该第一主表面314具有用于接收要分析的组织样本的组织样本附着区316。载玻片310还包括分别在表面314上的第一和第二位置处定位的第一和第二对照物样本320a和320b。第一和第二位置二者沿基底的纵轴纵向间隔以及横向间隔或者与纵轴的任一侧间隔。也就是说，对照物样本320b被示为相比于更靠近纵向端317a和边缘318b定位的对照物样本320b更靠近纵向端317b和边缘318a定位。第一和第二位置彼此基本上对角地跨过样本附着区316，即二者跨样本附着区316纵向和横向间隔，尽管本发明设想到术语“对角地”简单地指示两个位置之间绘制的线可以被说成是穿过为组织样本定界的多边形的两个非邻近边缘。

图7描绘了本发明的又一显微镜载玻片410，其中相同的编号表示相同的组件。载玻片410包括基本上平面的基底412，其包括第一主表面414，该第一主表面414具有用于接收要分析的组织样本15的组织样本附着区416。载玻片410还包括分别在表面414上的第一、第二和第三位置处定位的第一、第二和第三对照物样本420a、420b和420c。对照物样本420a、420b和420c的纵向和横向间隔合期望地确保在三个位置之间延伸的线段每一个都穿过样本附着区416。本发明还设想到两个对照物样本可以定位成邻近于彼此，使得它们之间的线段不穿过样本附着区416，尽管合期望的是三个对照物样本都没有共享主表面414上的公共纵坐标以便提供在所有三个证据染色时完全组织染色的进一步置信度。

虽然对照物样本420a-c被指示为包括相同的生物标记，但是本发明还设想到在组织附着区附近提供三个或更多对照物样本的实施例，其中每一个对照物样本还可以提供生物标记的不同组合而不脱离于本发明。通过说明而非限制性的方式，第一对照物样本可以包括生物标记“X”和“Y”，第二对照物样本可以包括生物标记“Y”和“Z”，而第三对照物样本包括生物标记“Z”和“X”。通过采用根据本发明的在组织附着区附近的三个这样的不同对照物样本，配对生物标记“X”、“Y”和“Z”可以提供覆盖组织样本的染色的较高程度的置信度。因此，虽然可能合期望的是所采用的每一个对照物样本具有与一个或多个其他对照物样本相同的组分，但是对照物样本内的生物标记的组合可以变化，只要在组织附着区附近的对照物样本的生物标记的分布提供了根据本发明的跨组织附着区的一部分定位的两个或更多生物标记即可。

图8描绘了本发明的又一显微镜载玻片510。载玻片510包括基本上平面的基底512，其包括第一主表面514，该第一主表面514具有用于接收要分析的组织样本15的组织样本附着区516。载玻片510还包括分别在表面514上的第一、第二、第三和第四位置处定位的第一、第二、第三和第四阳性对照物样本520a、520b、520c和520d。对照物样本520a、520b、520c和520d的纵向和横向间隔合期望地确保在四个位置之间延伸的线段每一个都穿过样本附着区516。本发明还设想到两个或三个对照物样本可以邻近于彼此定位，使得它们之间的线段不穿过样本附着区516，尽管合期望的是四个对照物样本都没有共享主表面514上的公共纵坐标以便提供当所有四个证据染色时完全组织染色的进一步置信度。

如本领域普通技术人员将领会到的，本发明还设想到，在某些实施例中，两个或更多阳性对照物样本可以形成基本上连续的线，其围绕样本附着区的整个周边。用于周边定界样本附着区的对照物样本的精确数目和间隔可以因此如所期望的那样选择。

如图9中所示，本发明还设想到显微镜载玻片610，其被设计成使得除了用于附着第一和第二阳性对照物样本620a和620b的第一和第二位置之外，显微镜载玻片610还包括用于附着第三和第四对照物样本622a和622b的第三和第四位置。再一次，相同的编号指代本发明的相同组件。如图9中所示，第一和第二阳性对照物样本620a和620b包含可以通过相同检测手段检测的共同的生物标记。本发明设想到第三和第四对照物样本622a和622b可以包含与对照物样本620a和620b中的共同生物标记不同的共同生物标记。可替换地，第三和第四对照物样本622a和622b可以包含与第一和第二阳性对照物样本的生物标记相同的生物标记，但是处于不同的信号水平。第三和第四对照物样本622a和622b还可以充当如第一和第二阳性对照物样本那样的阴性对照物。

如图9中所示，载玻片610包括基本上平面的基底612，其包括第一主表面614，该第一主表面614具有用于接收要分析的组织样本15的组织样本附着区6164。第一和第二位置二者沿基底的纵轴纵向间隔以及横向间隔（即与纵轴的任一侧间隔或者关于纵轴间隔）。也就是说，对照物样本620a被示为相比于更靠近纵向端617b和边缘618b定位的对照物样本620b更靠近纵向端617a和边缘618a定位。第一和第二位置彼此基本上对角地跨过样本附着区616，即跨样本附着区616纵向间隔，尽管本发明设想到精确的位置不需要如此在几何上受限为彼此跨区域616精确地相对。类似地，第三和第四位置二者沿基底的纵轴纵向间隔以及横向间隔或者与纵轴的任一侧间隔。也就是说，对照物样本622a被示为相比于更靠近纵向端617b和边缘618a定位的对照物样本622b更靠近纵向端617a和边缘618b定位。第三和第四位置彼此基本上径向地跨过样本附着区616，即跨样本附着区616纵向间隔，尽管本发明设想到精确的位置不需要如此在几何上受限为彼此跨区域616精确地相对。

如图10中所示，本发明还设想到显微镜载玻片710，其被设计成使得除了用于附着第一和第二阳性对照物样本720a和720b的第一、第二位置、用于附着第三和第四对照物样本722a和722b的第三和第四位置之外，显微镜载玻片710还包括用于附着第五和第六对照物样本724a和724b的第五和第六位置。再一次，相同的编号指代本发明的其它实施例的相同组件。如图10中所示，第一和第二阳性对照物样本720a和720b包含可以通过相同检测手段检测的共同的生物标记。本发明设想到第三和第四对照物样本722a和722b可以包含与第一和第二对照物样本720a和720b不同的共同生物标记，并且第五和第六对照物样本724a和724b可以包含仍旧不同的共同生物标记。可替换地，第三和第四对照物样本722a和722b以及第五和第六对照物样本724a和724b可以包含与第一和第二阳性对照物样本的生物标记相同的生物标记，但是处于不同的信号水平。一对第三和第四对照物样本722a和722b或者第五和第六对照物样本724a和724b还可以充当阴性对照物。

如图10中所示，载玻片710包括基本上平面的基底712，其包括第一主表面714，该第一主表面714具有用于接收要分析的组织样本15的组织样本附着区716。第一和第二位置二者沿基底的纵轴纵向间隔以及横向间隔或者与纵轴的任一侧间隔。也就是说，对照物样本720a被示为相比于更靠近纵向端717b和边缘718b定位的对照物样本720b更靠近纵向端717a和边缘718a定位。第一和第二位置彼此基本上径向地跨过样本附着区716，即跨样本附着区716纵向间隔，尽管本发明设想到精确的位置不需要如此在几何上受限为彼此跨区域716精确地相对。

用于附着第三和第四阳性对照物样本722a和722b的第三和第四位置在主表面714上的样本附着区716的相对侧上。即，位置跨样本附着区716基本上横向间隔。对照物样本722a定位在样本15和基底712的边缘718a之间，而对照物样本722b相对地定位在样本15与基底712的边缘718b之间。

类似于第一和第二位置，第五和第六位置二者沿基底的纵轴纵向间隔以及横向间隔或者与纵轴的任一侧间隔。也就是说，对照物样本724a被示为相比于更靠近纵向端717a和边缘718b定位的对照物样本724b更靠近纵向端717b和边缘718a定位。第五和第六位置彼此基本上径向地跨过样本附着区716，即跨样本附着区716纵向间隔，尽管本发明设想到精确的位置不需要如此在几何上受限为跨区域716彼此精确地相对。

如以上的图9和10和以下的图12中所图示的，包含不同量的生物标记（例如抗原水平（与之前讨论的不同类型的生物标记相反））的两个或更多阳性对照物样本可以被包括在显微镜载玻片上。在这样的实施例中，每一个对照物样本类型被至少成对提供使得相同对照物样本的对跨组织附着区的某个部分定位。例如，可以选择具有不同水平的抗原表达的不同细胞系以生成各个细胞团块。可替换地，可以选择具有不同量的细胞的相同细胞系以生成不同的细胞团块。这些细胞团块可以以在样本附着区附近的预定图案来布置。因此，对照物可以包含低、中或高水平的某个生物标记。可替换地，对照物可以包含零、中或高水平的某个生物标记。这些对照物样本可以被量化并且将结果与它们的预期表达水平或细胞量相比较。这些结果可以确定是否存在跨显微镜载玻片表面的足够且均匀的覆盖，或者样本抗原是否被正确修复（特别是对于用于大组织样本的酶促抗原修复方法）。

在其它实施例中，包含两种或更多不同种类的生物标记（例如抗原）的阳性对照物样本被包括在显微镜载玻片上。在这些实施例中，每一个阳性对照物样本还可以包含不同的抗原水平。例如，可以选择具有不同水平的蛋白质表达的不同细胞系以生成各个细胞团块。可替换地，可以选择包含不同种类的抗原的细胞系使得每一个不同的细胞团块包含不同量的细胞。这些细胞团块可以以在样本附着区附近的预定图案来布置。这些阳性对照物样本可以被量化并且将结果与它们的预期表达水平相比较。

对于复用的实验，多个细胞团块可以用于确保所有标记之上的染色强度范围。在这样的情况中，对照物可以被选择并且以设计成允许用于所有标记的空间图案的估计的图案来在载玻片上排列。

除了具有不同生物标记水平或不同种类的生物标记的阳性对照物样本之外，也可以添加阴性对照物样本。因此，在某些实施例中，本发明的显微镜载玻片可以包含阳性和阴性对照物样本二者。本发明的显微镜载玻片可以因此包括在邻近于样本附着区的位置处附着在第一主表面上的一个或多个阴性对照物样本。

表1呈现了根据本发明的某些实施例的对于生成细胞团块对照物而言有用的示例性细胞系。细胞系具有不同水平的HER2表达。

表1细胞系和相关Her2蛋白质表达

(*)McCabe,A.等人,AutomatedQuantitativeAnalysis(AQUA)ofInSituProteinExpression,AntibodyConcentration,andPrognosis.JournaloftheNationalCancerInstitute,2005.97(24):1808-1815页。

图11描绘了本发明的再一显微镜载玻片810。再一次，相同的编号指代相同的组件。载玻片810包括基本上平面的基底812，其包括第一主表面814，该第一主表面814具有用于接收要分析的组织样本15的组织样本附着区816。载玻片810还包括分别在表面814上的八个位置处定位的八个对照物样本820a到820h。如图11中所示，显微镜载玻片810包括由基本上均匀间隔的细胞团块周边定界的组织附着区。

图12描绘了本发明的又一显微镜载玻片910，其中相同的编号指代相同的组件。载玻片910包括基本上平面的基底912，其包括第一主表面914，该第一主表面914具有用于接收要分析的组织样本15的组织样本附着区916。载玻片910还包括分别在表面914上的八个位置处交替定位的八个对照物样本920a到920d和922a到922d。如图12中所示，显微镜载玻片910包括由基本上均匀间隔的细胞团块周边定界的组织附着区。合期望地，阳性对照物样本920a-d包含可以通过相同的检测手段检测的共同的生物标记。类似地，对照物样本922a-d可以包含与920a-d的共同生物标记不同的共同生物标记。可替换地，对照物样本922a-d可以包含与阳性对照物样本的生物标记相同的生物标记，但是处于不同的检测水平。对照物样本922a-d还可以充当相比于阳性对照物样本920a-d那样的阴性对照物。

图13描绘了本发明的又一显微镜载玻片1010。载玻片1010包括基本上平面的基底1012，其包括第一主表面1014，该第一主表面1014具有用于接收要分析的组织样本15的组织样本附着区1016。载玻片1010还包括在表面1014上的八个位置处分别定位的八个阳性对照物样本1020a到1020h。如图13中所示，对照物样本1020a、1020h和1020g定位在组织样本15与纵向边缘1017a之间，并且形成平行于纵向边缘1017a的线段。对照物样本1020h还基本上定位在对照物样本1020a和1020g之间的中间。类似地，对照物样本1020c、1020d和1020e定位在组织样本15与纵向边缘1017b之间，并且形成平行于纵向边缘1017b的线段。对照物样本1020d还基本上定位在对照物样本1020c与1020e之间的中间。

如图13中所示，对照物样本1020b基本上定位在对照物样本1020a与1020c之间的中间。对照物样本1020a、1020b和1020c定位在组织样本15与边缘1018a之间，并且基本上形成平行于边缘1018a的线段。对照物样本1020f基本上定位在对照物样本1020e与1020g之间的中间。对照物样本1020e、1020f和1020g定位在组织样本15与边缘1018b之间，并且基本上形成平行于边缘1018b的线段。

图14描绘了本发明的又一显微镜载玻片1110，其中相同的编号指代相同的组件。载玻片1110包括基本上平面的基底1112，其包括第一主表面1114，该第一主表面1114具有用于接收要分析的组织样本15的组织样本附着区1116。载玻片1110还包括在样本附着区1116附近定位的八个阳性对照物样本1120a到1120h。另外，载玻片1110包括附着到主表面1114的基本上平面的平台1130a-h，每一个分别提供基本上平面的平台表面1132a-h。每一个平台表面1132a-h因此均分别支撑其上的对照物样本1120a-h。平台表面1132a到1132h被抬高到第一主表面1114以上，使得如果对照物样本1120a-h均指示成功的染色，则将存在组织样本15也被正确染色的仍然更大的置信度，特别是在载玻片1110在染色期间面向上取向（即第一主表面1114面向上）时。合期望地，平台1130a-h具有大于组织样本的厚度，然而本发明设想到任何厚度将提供染色的增强的置信度。

对照物样本1120a、1120h和1120g（以及平台1130a、1130h和1130g）定位在组织样本15与纵向边缘1117a之间，并且形成平行于纵向边缘1117a的线段。对照物样本1120h还基本上定位在对照物样本1120a与1120g之间的中间。类似地，对照物样本1120c、1120d和1120e（以及平台1130c、1130d和1130e）定位在组织样本15与纵向边缘1117b之间，并且基本上形成平行于纵向边缘1117b的线段。对照物样本1120d还基本上定位在对照物样本1120c与1120e之间的中间。

对照物样本1120b基本上定位在对照物样本1120a与1120c之间的中间。对照物样本1120a、1120b和1120c定位在组织样本15与边缘1118a之间，并且形成平行于边缘1118a的线段。对照物样本1120f基本上定位在对照物样本1120e与1120g之间的中间。对照物样本1120e、1120f和1120g定位在组织样本15与边缘1118b之间，并且基本上形成平行于边缘1118b的线段。

图15描绘了本发明的又一显微镜载玻片1210，其中相同的编号指代相同的组件。载玻片1210包括基本上平面的基底1212其包括所应用的平面的基底平台1240。所应用的基底平台包括平台表面1242和与基底1212的第一主表面1214开放配准的孔1250。主表面1214包括用于接收要分析的组织样本15的通过孔1250暴露的组织样本附着区1216。载玻片1212还包括在孔1250附近在平台表面1242上定位的八个阳性对照物样本1220a-h。孔1250和第一主表面1214限定用于附着组织样本的平面凹陷区。如图15中所示，对照物样本1220a、1220h和1220g定位在组织样本15与纵向边缘1217a之间，并且基本上形成平行于纵向边缘1217a的线段。对照物样本1220h还基本上定位在对照物样本1220a与1220g之间的中间。类似地，对照物样本1220c、1220d和1220e定位在组织样本15与纵向边缘1217b之间，并且基本上形成平行于纵向边缘1217b的线段。对照物样本1220d还基本上定位在对照物样本1220c与1220e之间的中间。

对照物样本1220b基本上定位在对照物样本1220a与1220c之间的中间。对照物样本1220a、1220b和1220c定位在组织样本15与边缘1218a之间，并且基本上形成平行于边缘1218a的线段。对照物样本1220f基本上定位在对照物样本1220e与1220g之间的中间。对照物样本1220e、1220f和1220g定位在组织样本15与边缘1218b之间，并且形成平行于边缘1218b的线段。本发明还设想到基底平台1240还可以限定流体连通地从孔1250延伸到基底1212的边缘的伸长沟道（未示出），以便帮助在染色之后染色剂从样本附着区1216的排出。当载玻片1210被染色以使得主表面1214处于面向上取向时，样本附着区1216与平台表面1242之间的相对高度提供了当所有对照物样本1220a-h都指示其已经被染色时组织样本15的正确染色的进一步的置信度。

图16描绘了本发明的又一显微镜载玻片1310，其中相同的编号指代相同的组件。载玻片1310包括基本上平面的基底1312，其包括第一主表面1314，该第一主表面1314具有用于接收要分析的组织样本15的组织样本附着区1316。载玻片1310还包括一般如图13中针对载玻片1010描述的分别在表面1314上的八个位置处定位的八个阳性对照物样本1320a-h。载玻片1310还包括附着到主表面1314的标签1360。标签1360包括标签表面1362，在该标签表面1362上印刷了诸如关于载玻片、组织样本或染色过程的信息之类的指示。这样的指示还可以由印刷在表面1362上的条形码来提供或者通过附着于其的另一标签来提供。如图16中所示，标签1360位于纵向边缘1317a与对照物样本1320a、1320h和1320g之间。本发明设想到类似于标签1360的标签可以被类似地提供在体现本发明的任何载玻片上。

在另一方面中，本发明提供了用于组织样本分析的套件。该套件包括根据本发明的某些实施例的一个或多个显微镜载玻片。该载玻片被适配成接收要分析的组织样本。合期望地，该载玻片还被适配成接收包括与要执行的分析有关的指示的标签。该套件还可以包括用以提供关于载玻片的信息以及用以指导关于载玻片的正确使用的用户手册。

在另一方面中，本发明提供了用于制作根据本发明的各方面的显微镜载玻片的方法，该方法包括在至少第一位置和第二位置处将阳性对照物样本的薄层转移和附着到显微镜载玻片上。优选地，所使用的载玻片是带电载玻片。优选地，在将阳性对照物样本的薄层转移和附着到显微镜载玻片上之后，包括后续的烘烤步骤。

在某些实施例中，薄层对照物样本是样本的大约5微米区段。

在某些实施例中，阳性对照物样本包括细胞团块。优选地，细胞团块包括悬浮在融化的石蜡中的福尔马林固定的细胞。

图17描绘了用于将对照物样本附着到本发明的显微镜载玻片的系统1500。系统1500包括印模1582，该印模1582具有基本上平面的印刷头面1584，该印刷头面1584具有从其伸出的一个或多个打印头1568。打印头1586提供用于支持沉积在载玻片的主表面上的一定量的对照物样本材料的平面表面。系统1500在包含融化的石蜡和福尔马林固定的细胞团块的悬浮物的蓄液器1588中浸泡打印头1586。细胞团块将粘附到打印头1586。系统1500然后将印模1582转移到载玻片1510的主表面1514。使印模1582与表面1514接触以便实现细胞团块到主表面1514的转移。打印头1586被排列在打印面1584上以便在载玻片1510的样本附着区1516附近在对应于本发明的对照物样本的位置处沉积细胞团块。如本领域中已知的，载玻片可以带电以更好地使得能够实现细胞团块的转移。此外，本发明设想到载玻片然后将会被烘烤以将对照物样本附着就位。本发明还设想到可以采用不同的打印头，其具有不同地排列的打印头以便将包括不同标记的对照物样本沉积在载玻片的样本附着区附近的其它可用位置中。典型地，所沉积的细胞的厚度对于细胞的单层而言在大约5微米的量级上，其粗略地等同于附着到载玻片的组织区段的厚度。该接触打印方法是高吞吐量的、简单的且低成本的。

出于说明而非限制的目的，用于将对照物样本沉积到本发明的载玻片上的其它方法包括：使用微分配技术将融化的蜡溶液中的福尔马林固定的细胞团块的试样添加到载玻片上。可替换地，对照物样本的细胞可以被福尔马林固定并且被石蜡嵌入在载玻片大小的块中。可以将来自该块的完整切片放置到载玻片上并且稍后通过机械或化学手段将样本附着区刻出。另外可替换地，该块可以被掏空以便限定以载玻片的样本附着区的形状的孔，使得仅样本附着区的周边轮廓被应用到载玻片。

在另一方面中，本发明提供了一种分析方法。

在一个实施例中，该分析方法包括利用用于阳性对照物样本的检测手段对根据本发明的实施例的显微镜载玻片染色；以及从至少第一和第二位置检测阳性对照物样本。

在某些实施例中，来自阳性对照物样本的所有位置的信号的存在提供了染色质量的实时确认。相应地，信号从阳性对照物样本的一些位置的缺少指示染色失败。

在某些实施例中，载玻片还包括在邻近于样本附着区16的位置处附着在第一主表面上的一个或多个阴性对照物样本，并且其中来自阴性对照物样本的一些位置的信号的存在指示染色失败。

在某些实施例中，显微镜载玻片还包括组织样本。

在某些实施例中，阳性对照物样本是细胞团块并且检测步骤包括遮住图像的不包含细胞团块的部分，并且计及细胞团块的每一个细胞内部的标记的定位。优选地，该方法还包括执行二区划（two-compartment）图像分段的步骤，其勾画了每一个细胞的核加上围绕细胞团块的每一个细胞的每一个核的环形区域。优选地，该方法还包括下述步骤：测量视野中的细胞团块的每一个细胞的两个区划中的每一个标记的平均染色，并且总结这些细胞级度量以产生总体视野度量。视野度量可以包括已知核标记的平均核表达。更优选地，该方法还包括通过检查线性统计模型中的系数来检测伪像，以及使用线性统计模型估计空间染色伪像，其中响应是针对每一个细胞团块的视野级染色度量以及预测量是载玻片的两个空间尺度。甚至更优选地，该方法还包括通过使用拟合模型估计和减掉不均匀的染色剖面来校正微小的空间伪像的步骤。

虽然已经示出和描述了本发明的特定实施例，但是对本领域技术人员将显然的是，可以做出改变和修改而不脱离于本发明的教导。在前述描述和附图中阐述的事项仅仅通过说明而非限制的方式来提供。意图在基于现有技术以随附权利要求的适当角度考察时在随附权利要求中限定本发明的实际范围。

Claims (47)

1.一种用于组织样本的显微镜载玻片，所述载玻片包括：

伸长的平面基底，所述基底包括第一主表面，所述第一主表面具有其内可以附着组织样本的样本附着区；

第一阳性对照物样本，其在邻近于所述样本附着区的第一位置处附着在所述第一主表面上；

第二阳性对照物样本，其在邻近于所述样本附着区的第二位置处附着在所述第一主表面上；

其中所述第一和第二位置被间隔为使得所述第一和第二阳性对照物样本的染色质量指示所述组织样本的染色质量。

2.权利要求1的显微镜，其中所述第一和第二位置被间隔为使得所述样本附着区的至少一部分沿所述基底的纵轴在所述第一和第二位置之间延伸。

3.权利要求1的显微镜载玻片，其中所述第一和第二位置中的至少一个傍靠所述样本附着区横向定位。

4.权利要求1的显微镜载玻片，其中所述第一和第二位置中的至少一个横向定位在所述样本附着区与所述基底的伸长边缘之间。

5.权利要求1的显微镜载玻片，其中所述第一和第二位置在所述样本附着区的相对侧上。

6.权利要求1的显微镜载玻片，其中所述第一和第二位置从所述样本附着区径向跨过。

7.前述权利要求中任意一项的显微镜载玻片，还包括在邻近于所述样本附着区的第三位置处附着在所述第一主表面上的第三阳性对照物样本。

8.权利要求7的显微镜载玻片，还包括在邻近于所述样本附着区的第四位置处附着在所述第一主表面上的第四阳性对照物样本。

9.权利要求8的显微镜载玻片，还包括在邻近于所述样本附着区的一个或多个其他位置处附着在所述第一主表面上的一个或多个阳性对照物样本。

10.权利要求7-9中任意一项的显微镜载玻片，其中三个或更多阳性对照物样本沿所述样本附着区的周边被基本上均等地间隔。

11.前述权利要求中任意一项的显微镜载玻片，其中两个或更多阳性对照物样本形成围绕所述样本附着区的整个周边的连续线。

12.前述权利要求中任意一项的显微镜载玻片，其中阳性对照物样本选自以下各项所组成的组：细胞团块、对照物组织样本或加载有生物材料的载体。

13.前述权利要求中任意一项的显微镜载玻片，其中阳性对照物样本和组织样本包括相同的生物标记。

14.权利要求13的显微镜载玻片，其中检测手段是免疫分析并且其中阳性对照物样本和组织样本包括相同种类的抗原生物标记。

15.前述权利要求中任意一项的显微镜载玻片，其中所述第一和第二阳性对照物样本包含共同的生物标记。

16.前述权利要求中任意一项的显微镜载玻片，其中所述第一和第二阳性对照物样本包含不同的生物标记，并且对照物二者均在分析组织样本时是可检测的。

17.权利要求1-11中任意一项的显微镜载玻片，还包括在邻近于所述样本附着区的位置处附着在所述第一主表面上的一个或多个阴性对照物样本。

18.前述权利要求中任意一项的显微镜载玻片，其中每一个对照物样本包括生物标记，所述生物标记包括跨载玻片基底的组织附着区的一部分定位的另一对照物中的对应配对关联生物标记。

19.权利要求18的显微镜载玻片，其中两个配对关联生物标记是相同的生物标记。

20.权利要求18的显微镜载玻片，其中两个配对关联标记是不同的，并且二者能够在分析组织样本时被检测。

21.前述权利要求中任意一项的显微镜载玻片，其中每一个对照物样本包含两种或更多不同种类的生物标记。

22.前述权利要求中任意一项的显微镜载玻片，其中所述载玻片包括在所述组织附着区附近的三个或更多对照物样本，并且跨所述组织附着区的一部分定位的至少两个对照物样本包括共同的生物标记。

23.前述权利要求中任意一项的显微镜载玻片，其中包括不同量的生物标记的对照物样本被包括在所述显微镜载玻片上，并且被至少成对地提供以使得相同对照物样本的对跨所述组织附着区的某个部分被定位。

24.前述权利要求中任意一项的显微镜载玻片，其中至少一个所述对照物样本被抬高到所述样本附着区以上。

25.权利要求24的显微镜载玻片，还包括在对照物样本所位于的所述位置处定位在所述第一主表面上的至少一个支撑平台，所述支撑平台包括抬高到所述第一主表面以上的支撑表面，其中所述至少一个对照物样本被附着到所述支撑表面。

26.权利要求24的显微镜载玻片，其中所述样本附着物还包括平面凹陷区，所述基底限定了流体连通地从所述平面凹陷区延伸到所述第一主表面上的开口的凹陷。

27.前述权利要求中任意一项的显微镜载玻片，其中所述基底还包括抬高到所述样本附着区以上的基本上平面的标签区。

28.一种套件，包括被适配成接收要分析的组织样本的根据前述权利要求中任意一项的显微镜载玻片。

29.根据权利要求28的套件，其中载玻片还被适配成接收包括与要执行的分析有关的指示的标签。

30.一种制作前述权利要求中任意一项的显微镜载玻片的方法，所述方法包括：

在第一位置和第二位置处将阳性对照物样本的薄层转移和附着到显微镜载玻片上。

31.权利要求30的方法，其中阳性对照物样本包括细胞团块。

32.权利要求31的方法，其中细胞团块包括悬浮在融化的石蜡中的福尔马林固定的细胞。

33.权利要求30的方法，其中所述转移步骤包括接触印刷。

34.权利要求30的方法，其中所述转移步骤包括通过微分配技术将融化的蜡溶液中的福尔马林固定的细胞团块的试样添加到载玻片上。

35.权利要求30的方法，其中所述转移步骤包括：

对福尔马林固定的、嵌入石蜡的细胞的载玻片大小的块进行分段；

将所述块转移到显微镜载玻片上；以及

移除所述块的部分以生成权利要求1-19中任意一项的显微镜载玻片。

36.一种分析方法，包括：

对权利要求1-27中任意一项的显微镜载玻片染色；

检测来自至少第一和第二位置的阳性对照物样本。

37.权利要求36的方法，其中来自阳性对照物样本的所有位置的信号的存在提供染色质量的确认。

38.权利要求36的方法，其中来自阳性对照物样本的所有位置的信号的存在提供染色质量的实时确认。

39.权利要求36的方法，其中信号从阳性对照物样本的一些位置的缺少指示染色失败。

40.权利要求36的方法，其中载玻片还包括在邻近于所述样本附着区的位置处附着在所述第一主表面上的一个或多个阴性对照物样本，并且其中来自阴性对照物样本的一些位置的信号的存在指示染色失败。

41.权利要求36的方法，其中阳性对照物样本是细胞团块并且所述检测步骤包括遮住图像的不包含细胞团块的部分，并且计及细胞团块的每一个细胞内部的标记的定位。

42.权利要求41的方法，还包括执行二区划图像分段的步骤，其勾画了每一个细胞的核加上围绕细胞团块的每一个细胞的每一个核的环形区域。

43.权利要求42的方法，还包括下述步骤：测量视野中的细胞团块的每一个细胞的两个区划中的每一个标记的平均染色，并且总结这些细胞级度量以产生总体视野度量。

44.权利要求43的方法，其中所述视野度量包括已知核标记的平均核表达。

45.权利要求44的方法，还包括以下步骤：

通过检查线性统计模型中的系数来检测伪像，以及

使用所述线性统计模型来估计空间染色伪像，其中响应是针对每一个细胞团块的视野级染色度量并且预测量是载玻片的两个空间尺度。

46.权利要求45的方法，还包括通过使用拟合模型估计和减掉不均匀的染色剖面来校正微小的空间伪像的步骤。

47.权利要求36的方法，其中显微镜载玻片还包括组织样本。