DK160448B - Fremgangsmaade til direkte bestemmelse af fri, ubundet analyt. - Google Patents

Description

i

DK 160448 B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til direkte bestemmelse af fri, ubundet analyt i en prøve, som indeholder en andel analyt bundet til en receptor i prøven, hvor der med udtrykket "analyt bundet til en receptor i prøven" ikke menes "antigen-antistof", men sy-5 stemerne thyroidhormoner og thyroxinbindende proteiner (TBP); aldoste-ron, progesteron og testosteron med kønshormonbindende globulin; diphenyl hydantoin og albumin; antihæmofil faktor og dens inhibitorer; proteo-lytiske enzymer og deres inhibitorer eller aktivatorer; cortisol og cor-tisolbindende protein; samt Bj^-vitamin med "intrinsic factor".

10 I al almindelighed vil en overvejende del af analyten være bundet reversibelt, om end fast til receptoren. Desuden vil receptoren i mange tilfælde have positioner der står til rådighed for binding af yderligere analyt, om end der i overensstemmelse med massevirkningsloven vil være en meget lille mængde analyt fri i opløsning. Receptoren vil sædvanlig-15 vis være opløselig og er i de fleste tilfælde et protein.

Betydningen af fri analyter er, at den fysiologiske virkning af mange medikamenter og hormoner står i meget nærmere forbindelse med koncentrationen af fri medikamenter eller hormoner, som er i cirkulation end med de totale mængder af dem. Eksempler på sådanne fri analyter og 20 deres receptorer er thyroidhormoner og thyroxinbindende proteiner (TBP); aldosteron, progesteron og testosteron med kønshormonbindende globulin; di phenylhydantoin og albumin; antihæmofil faktor og dens inhibitorer; proteolytiske enzymer og deres inhibitorer eller aktivatorer; cortisol og cortisol bindende protein; og Bjg-vitamin med den endogene faktor, 25 "intrinsic factor". Mange andre kendes eller vil blive kendt i fremtiden. Det mest gennemgribende undersøgte og det mest vigtige af disse systemer er thyroidhormon-TBP bindingssystemet. Da størstedelen af den kendte teknik angår dette system, er fri thyroidanalyser i stor udstrækning emnet for den efterfølgende diskussion. Det må imidlertid bemærkes, 30 at de samme problemer og fremgangsmåder vil være relevante for bestemmelsen af andre fri analyter som ovenfor nævnt.

Man har sædvanligvis vurderet funktionel thyrometabolisk status ved måling af det totale serumindhold af thyroidhormonet thyroxin (3,5,3',5'-L-tetraiodothyronin, T4). Mere end 99,95% af det cirkulerende 35 T4 tjener som et metabolisk inert reservoir, der transporteres i serum, primært bundet til thyroxinbindende globulin (TBG) og sekundært til thyroxi nbindende præalbumin (TBPA) og albumin med den fælles betegnelse thyroxinbindende protein (TBP). Der er meget, der taler for, at de re-

DK 160448 B

2 sterende mindre end 0,1% af den fri eller ubundne fraktion af cirkulerende T4 er fysiologisk aktive, fordi de diffunderer ind i væv for at udøve deres virkning, koncentrationen deraf er en vigtig determinant for hormonfjernelseshastigheden og anomali i TBP påvirker normalt ikke kon-5 centrationen. Man tror, at det er prækursoren for triodothyronin (T3), som også er til stede i serum i fri og i proteinbundet form. Igen korre-Terer det fri T3 niveau bedst med funktionel thyroidstatus.

Den absolute mængde af T4 i prøver, uden hensyntagen til fri eller bundet status, er blevet målt ved total T4 prøver. Den sædvanlige frem-10 gangsmåde omfatter denaturering af TBP med alkohol eller tilsætning af et fortrængningsmiddel såsom salicylat for at frigøre en stor del af T4'et til opløsning efterfulgt af tilsætning af radioisotopmærket T4 og en T4 receptor såsom en ionbytningsharpiks eller et uopløseligt antistof. Prøve og mærket T4 får lov til at konkurrere om begrænsede posi-15 tioner på receptoren. Receptoren fraskilles så fra de opløselige reaktanter, og den til receptoren bundne mængde radioaktivitet bestemmes.

Denne radioaktivitet er omvendt proportional med mængden af oprindelig tilstedeværende T4 i prøven. Da total T4 stiger og falder med TBP-, især TBG-, niveauerne i det euthyroide individ, kan en abnorm thyroidfunktion 20 imidlertid fejlagtigt indikeres ved en hvilken som helst faktor, som ændrer koncentrationen af de bindende proteiner. Androgener, estrogener, anaboliske steroider, glucocorticoider og normal graviditet ændrer TBG-niveauerne. Total T4 analysen alene har således ikke vist sig at være en pålidelig indikator for den thyrometaboliske status.

25 Der kompenseres sædvanligvis for ændringer i TBG-niveauer ved en ændring i de totale T4-niveauer, da hypothalam-thyroidaksens negative tilbageføringsmekanisme virker i retning af at holde koncentrationen af fri T4 konstant. Den ubundne eller "fri" del af thyroxin i serum er derfor den mest nyttige konstantindikator for thyrometabolisk status. Mæng-30 den af ubundet thyroxin styres af massevirkningsloven og er i høj grad en funktion af det totale cirkulerende T4 og koncentrationen af TBG.

Vanskelighederne ved at korrelere thyrometabolisk status med total T4 førte til udviklingen af thyroidhormonoptagningsanalysen. Denne prøve måler den relative mængde serum TBG-bindende kapacitet, dvs. den som ik-35 ke allerede er besat ved optagning af thyroidhormon in vivo. Thyroidhor-monoptagningsimmunoanalyser gennemføres sædvanligvis ved tilsætning af mærket T3 til en serumprøve indtil T3'et absorberes af de umættede TBP-bindende positioner, idet det uabsorberede T3 uddrives fra reaktions-

DK 160448 B

3 blandingen, ved at blandingen bringes i kontakt med en uopløselig T3-re-ceptor såsom en ionbytningsharpiks eller et antistof, og det uddrevne mærkede T3 måles. T4 kan også anvendes. Et forholdsmæssigt stort antal ubesatte bindingspositioner vil blive indikeret ved en tilsvarende lav 5 mængde mærket thyroidhormon bundet til den uopløselige receptor.

I stedet for en direkte måling af fri T4 er den procentuelle thyro-idhormonoptagning blevet multipliceret med resultaterne af en total T4-eller proteinbundet iodanalyse på samme prøve for at nå til fri thyro-xinindekset (Clark et al., "Journal Clin. Endocrinol." 25:39-45 (1965)).

10 Fri thyroxinindekset er baseret på den forudsætning, at optagningsresultatet er omvendt proportionalt med det umættede TBP i serum, og at fri T4 varierer direkte med total T4 og omvendt proportionalt med ikke beregnede TBP-niveauer. Fri thyroxinindekset lider af forskellige mangler.

Det er i stand til at give begrænset følsomhed og præcision, separate 15 bestemmelser er nødvendige, og optagningsprøven, hvorpå indekset er baseret, kan give fejlagtige værdier, når den anvendes på syge euthyroi-de patienter, personer med arvelig TBG-mangel, personer med forøgede TBP-koncentrat!oner og i de patienter, som behandles med medikamenter såsom phenylbutazon, diphenylhydantoin, salicyl at og prednison.

20 Et krav om to adskilte bestemmelser er også en integreret del af den kinetiske fri T4 analyse, der er beskrevet i USA patentskrift nr. 4.046.870. Her analyseres to serier reagensglas. I begge serier etableres først en ligevægt mellem mærket T4, endogen prøve T4 og TBP. I den ene serie er der et middel til stede til erstatning af en stor del af T4 25 fra TBP, dvs. at denne serie frembringer en bestemmelse af total T4. Da den anden serie ikke indeholder noget sådant middel, vil den i det væsentlige blive en T4 optagningsbestemmelse. Hver reaktionsblanding sættes så til uopløseligt T4 antistof, inkuberes i et fastsat tidsrum, faserne adskilles, og den faste fase analyseres for mærkestoffet. De re-30 lative reaktionshastigheder i de to serier beregnes for hvert par reagensglas, og resultaterne sammenlignes med en standardkurve. Udover ulemperne ved, at der kræves to sæt analyser for hver bestemmelse som ved det nært beslægtede fri thyroxinindeks, kræver denne metode trivielle beregninger. Desuden er metoden, da den er en kinetisk metode, yderst 35 tidsafhængig, hvilket gør det vanskeligt nøjagtigt at gennemføre bestemmelser i stort antal samtidig.

USA patentskrift nr. 3.799.740 omhandler en teknik til i en enkelt beholder at opnå et mål for fri T4, det effektive thyroxinforhold. Denne

DK 160448 B

4 metode er imidlertid fortsat i det væsentlige baseret på en dobbelt opgørelse af thyroinhormonoptagning og total T4. I overensstemmelse med denne metode ekstraheres prøve T4 fra TBG, og en alikvot af denne ekstrakt kombineres med et kompleks af mærket T4 med TBG og med en alikvot 5 umættet TBG fra samme prøve. En anionselektiv harpiks sættes så til reaktionsblandingen, inkuberes i et omhyggeligt kontrolleret tidsrum, harpiksen fjernes, og mængden af mærkestof i supernatanten bestemmes. Selv om en del af analysetrinnene ved denne metode kan gennemføres i en enkelt beholder, er T4 ekstraktionsproceduren besværlig og indfører be-10 tragtelig fejl i bestemmelsen. Den anden fejl indføres ved håndteringen af to prøveal i kvoter. Endelig er fremgangsmåden som helhed proceduremæssig kompleks.

På lignende måde omhandler USA patentskrift nr. 3.941.564 en fri T4 analyse, som kan gennemføres i en enkelt beholder. Her kombineres en 15 prøve og en alikvot af mærket T4, så ekstraheres det mærkede og umærkede T4 fra serum TBP på en dextrangelsøjle ved høj pH-værdi. En procentdel af det samlede tilsatte mærkestof tilbageholdes af søjlen efter eluering med umættet TBP og en del af den forekstraherede prøve. Denne procentdel, den fri thyroxinækvivalent, er et indirekte mål for fri T4, som kan 20 kvantificeres ved sammenligning med passende standarder. Selv om denne metode ikke udtrykkeligt kræver en total T4 analyse som en del af fremgangsmåden, lider den ikke desto mindre af de samme fejl som indføres gennem ekstraktionen af T4 og mærket T4 fra TBG på dextrangelsøjlen.

Desuden er søjlekromatografi ubekvem, unøjagtig og ikke egnet til kl i -25 ni sk brug i stor målestok. Denne metode medfører også håndtering af dobbelte patientprøver, en umiddelbar fejlkilde, og indebærer et urimeligt antal håndteringstrin.

En anden gruppe beslægtede analyser, generisk betegnet fri thyroxi nprøver, kræver også bestemmelse af det totale endogene T4. I disse 30 prøver inkuberes serum med mærket T4, indtil mærket og umærket T4 er ensartet fordelt mellem TBP og den fri del af T4. Samtidig med eller efter denne inkubation adskilles det ubundne T4 fra den TBP-bundne fraktion under anvendelse af forskellige teknikker, fx. trækul- eller dextrangel absorption, ultrafiltrering eller dialyse. Igen kombineres resul -35 tatet matematisk med resultaterne af en total T4 bestemmelse på samme prøve. Disse prøver lider derfor af den fra andre fri T4 metoder noterede principielle mangel, dvs. behovet for en total T4 analyse til kvantificering af den procentuelle fri T4 givet ved det andet element i den

5 DK 160448 B

dobbelte analyse. Dette multiplicerer de i hver prøve involverede fejl og fordobler udgiften og tidsbehovet. Man støder også på nogle specielle problemer ved disse metoder, fx. behovet for stærkt renset mærket T4 i dialyse- og ultrafiltreringsteknikkerne. Eksempler på disse metoder er 5 Oppenheimer et al, "Journal of Clinical Investigation" 42 (11): 1769-1782 (1963) og Cavaleri et al, "Journal of Nuclear Medicine" 10 (9): 566-570 (1969). Der kendes en lignende analyse for fri testosteron under anvendelse af dialyseadskillelse.

Endelig er fri T4 blevet bestemt direkte ved dialyse af en prøve og 10 analyse af dialysatet ved gaskromatografi eller elektroforese. Disse metoder mangler bindingsanalysernes følsomhed, præcision og enkelthed, kræver stort teknisk sagkundskab og er for langsomme til rutinemæssig laboratoriebrug.

Opfindelsen har følgelig som formål at reducere de tekniske og teo-15 retiske mangler, som er forbundet med kendte fri analytanalyser, samt den tid og det fagkundskab, der kræves for at gennemføre sådanne analyser. Et andet formål er at forbedre præcisionen, at formindske prisen og at reducere antallet af reagenser, som kræves ved sådanne analyser.

Det er ligeledes et formål med opfindelsen at undgå behovet for en 20 total analytanalyse ved bestemmelse af fri analytkoncentration. Endvidere er det et formål at tilvejebringe en fremgangsmåde til direkte bestemmelse af fri analyt, at eliminere prøveanalytekstraktioner i analyser til bestemmelse af fri analytkoncentration, at undgå håndtering af dobbelte alikvoter af prøver, som skal bestemmes, og at simplificere 25 fjernelsen af fri analyt fra opløsninger indeholdende endogent bundet analyt.

Ovenstående formål opfyldes ved, at man ved bestemmelsen af fri, ubundet analyt a) bringer prøven i kontakt med en kendt mængde af en umærket re-30 ceptor for analyten med det formål at binde den frie analyt, b) fjerner prøven fra kontakt med den umærkede receptor, c) bringer den umærkede receptor i kontakt med et mærket reagens i form af i) en mærket analytanalog, eller 35 ii) en mærket opløselig analytreceptor, d) fjerner receptoren i trin c) fra ubundet mærket reagens, e) bestemmer mængden af bundet eller ubundet mærket reagens, og f) korrel erer den i trin e) bestemte mængde med mængden af fri

DK 160448 B

6 analyt i prøven.

Det er imidlertid i modsætning til ved de hidtil kendte metoder til bestemmelse af fri analyt, fuldstændigt unødvendigt derefter at bestemme den totale analyt, fordi resultatet af fremgangsmåden ifølge opfindelsen 5 er et direkte kvantitativt mål for fri analyt frem for en procentdel. Resultaterne kan simpelthen afbildes på en typisk standardkurve, og den fri analyt bestemmes direkte. Opfindelsen letter på bemærkelsesværdig vis byrderne ved de hidtil kendte teknikker til bestemmelse af fri ana-lyter og erstatter dem med en elegant, følsom, præcis og enkel frem-10 gangsmåde.

Der er mindst tre analytreceptorer involveret i fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Prøvereceptoren er den naturlige receptor, der findes i prøven som et kompleks med forskellige mængder analyt. Den mærkede og den umærkede receptor er begge reagenser, der anvendes ved fremgangs-15 måden. Mens den umærkede receptor anvendes til at binde fri analyt i alle udførelsesformer for opfindelsen, anvendes den mærkede receptor kun i et specifikt alternativ. To eller flere af disse receptorer kan være den samme, eller de kan alle være forskellige.

Den umærkede receptor for analyt må udvælges med omhu. Som et gene-20 relt princip bør den have en meget høj affinitet for analyten, men en lav kapacitet til binding af analyten, dvs. at den ikke bør være i stand til at absorbere signifikant større mængder analyt, end hvad der forventes at blive fundet frit i prøven. Dette er fordi trinnet, hvor umærket receptor bringes i kontakt med prøven, er rettet mod binding af den nor-25 malt fri analyt. Det foretrækkes ikke, at analyten afdrives fra analyt-receptorkomplekset i prøven. Ellers kan analysefølsomheden påvirkes ugunstigt, og hvis en tilstrækkelig stor del af analyten absorberes fra analyt-receptorkomplekset, vil fremgangsmåden i det væsentlige måle total analytkoncentration. Ydermere vil der, hvis kapaciteten og affinite-30 ten af den umærkede receptor afviger radikalt fra prøveanalytreceptoren, blive indført en grad af tidsafhængighed i analysens førstetrins-absorp-tion forårsaget af den gradvise fjernelse af analyt fra dens kompleks med prøvereceptoren. I de fleste tilfælde vil denne fjernelse ikke resultere i kunstigt høje niveauer af fri analyt, fordi en parallel ab-35 sorption vi l indtræffe i standarderne og kontrol prøverne, men inkubationstiden for standarder, kontrol prøver og prøver bør kontrolleres omhyggeligt.

Egnede umærkede receptorer er svage ionbytterharpikser, uorganiske

DK 160448 B

7 sorptionsmaterialer såsom dem, der er beskrevet i USA patentskrift nr. 3.666.854, eller proteiner såsom analytantistof. Når den umærkede ana-lytreceptor gøres uopløselig før kontakt med prøven, kan man anvende samme analytreceptor, som findes i prøveanalyt-receptorkomplekset, fx.

5 TBG, Analytantistof foretrækkes imidlertid, og til fri thyroxinanalyse har en beregnet affinitetskonstant på ca. 1,4 x 10*° liter/mol vist sig at være tilfredsstillende.

Den umærkede receptor gøres sædvanligvis uopløselig for at lette fjernelse af prøven fra kontakt med receptoren. Receptoren kan før, 10 under eller efter fri analytbinding, gøres uopløselig ved at den absorberes eller bindes covalent til en inert overflade, eller ved at den ag-gregeres eller tværbindes covalent, indtil den bliver uopløselig, fx. ved polyethylenglycolpræcipitering eller glutaraldehydtværbinding i overensstemmelse med kendte teknikker. Kendt er også metoder til absorp-15 tion eller binding af receptorer, såsom proteiner, til uopløselige bærere.

En særligt foretrukket konventionel teknik er absorption af et analytantistof på den indvendige overflade af plastprøverør før kontakt med prøven. Her bliver prøverøret den eneste reaktionsbeholder for hele be-20 stemmeisen af fri analyt, og manupulation af reagenserne simplificeres betragteligt, fordi der ikke behøves centrifugering eller filtrering for at adskille opløselig fase fra uopløselig fase ved gennemførelse af fremgangsmåden. Selv om det er inden for opfindelsens rammer at uopløse-liggøre den umærkede receptor, efter at den har bundet den fri analyt, 25 er det klart nødvendigt, at uopløseliggørelsesteknikken i sådanne tilfælde ikke også gør prøvereceptoren uopløselig. Når prøvereceptoren og den umærkede receptor er immunologisk forskellige, kan den umærkede receptor præcipiteres efter absorption af fri analyt og under tilstedeværelse af prøvereceptoren ved, at der simpelthen tilsættes tilstrækkeligt 30 umærket receptorantistof til at udvirke en immunpræcipitering af umærket receptor.

Mængden af umærket receptor, der anvendes, vil være en funktion af dens kapacitet og affinitet for analyt under analysebetingelserne. Imidlertid er mængden udtrykt som bindingspositioner alene sædvanligvis 35 større end det skønnede interval for fri analyt, som man venter at finde i prøven, men mindre end summen af det mærkede reagens og den skønnede fri analyt. Når det mærkede reagens er mærket analytanalog, skal den umærkede receptors bindingspositioner være begrænsende. Konventionelle

DK 160448 B

8 antistofabsorberede prøverør, der hidtil anvendtes til total analytbe-stemmelser, fx. total T4, er tilfredsstillende.

Den mærkede analytreceptor skal være opløselig, og det er kun praktisk gennemførligt at anvende en sådan receptor, hvor analyten samtidig 5 kan binde to receptorer, dvs. umærket og mærket analytreceptor. Fx. skal analyten, når både den umærkede og den mærkede receptor er analytanti-stoffer, være polyepitopisk. Som følge deraf anvendes mærkede receptorer sædvanligvis til højmolekylvægtanalyter, som med større sandsynlighed har mindst to bindingspositioner. Mærkede receptorer og fremgangsmåder 10 til deres fremstilling er velkendte, idet sådanne receptorer er blevet anvendt i nogen tid ved de såkaldte sandwich immunoanalyser og histokemi. Da der ønskes maksimal binding af mærket receptor til analyt, når dette specielle mærkede reagens anvendes, foretrækkes det, at receptoren udvælges efter en så høj affinitet og kapacitet som muligt, således at 15 en maksimal mængde analyt bindes. Det foretrækkes at anvende analytanti-stof, som er blevet mærket radioisotopi sk.

De mærkede analytanloger er også en velkendt klasse af reagenser.

De fremstilles ved at erstatte mindst et atom i den native analyt med en påviselig gruppe, sædvanligvis en radioisotop eller et enzym, som kan 20 sammenkædes med analyten ved hjælp af en bærergruppe eller ved direkte substitution af et analytatom. Et eksempel på sidstnævnte er T4, hvori et af jodatomerne er blevet erstattet med en radioisotop af jod, såsom 125I eller 131I.

Der kendes egnede mærkestoffer til det mærkede reagens, enten ana-25 lytanalogen eller analytreceptoren. Fx. er det udover enzymer og radioisotoper inden for opfindelsens rammer at anvende stabile fri radikaler, fluorescerende forbindelser eller reaktanter såsom coenzymer eller kemi-luminescente forbindelser.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen bringes en prøve indeholdende 30 fri analyt og receptorbundet analyt i kontakt med umærket analytreceptor. Som beskrevet ovenfor er den umærkede receptor fortrinsvis analyt -antistof absorberet på den indvendige overflade af en plastbeholder, fx. et polypropylenprøverør. Hvis receptoren er et protein, kan den være tværbundet med glutaraldehyd og absorberet på overfladen i overensstem-35 mel se med USA patentskrift nr. 4.069.352.

Generelt er det ikke fordelagtigt at anvende prøve i fuld styrke, især når prøven er blodserum. Den forhøjede koncentration af opløst materiale i sådanne prøver kan indvirke ugunstigt på analytreceptorens op-

DK 160448 B

9 førsel. Desuden er antistofbel agte overflader receptorer med forholdsvis lav kapacitet og høj affinitet. Den effektive anvendelse af dem med de ekstremt lave koncentrationer af fri analyt, der hyppigt findes i prøver, underbygges betragteligt ved prøvefortynding. Prøvefortynding for-5 trænger en lille mængde analyt fra dens receptor, som, når den kombineres med fri analyt, resulterer i, at der bindes tilstrækkelig analyt til overfladen til, at en efterfølgende bestemmelse af receptorbundet analyt kan gennemføres. Det foretrækkes således at sætte vand eller puffer til prøven i en mængde fra ca. 2 til 15 gange prøvevolurnenet, enten før el-10 ler under prøvens kontakt med den umærkede receptor. Sædvanligvis er en 1:10 fortynding af prøven i 0,01M fosfatforpufret saltvand indeholdende en lille mængde okseserumalbumin acceptabel.

Reaktionsblandingen, som ikke indeholder mærket reagens, inkuberes i et tidsrum og ved en temperatur, som er tilstrækkelige til, at recep-15 toren absorberer i det mindste en betydelig del af den fri analyt. Disse parametre vil variere stærkt i afhængighed af sådanne faktorer som ionstyrke, prøvefortynding og receptoraffinitet. Da ligevægten til gunst for associering af analyt med receptor er betragteligt større end den for dissociering fra endogen analyt-receptorkomplekset, foretrækkes det 20 kun at anvende en kort inkubation på dette sted, fx. fra ca. 5 til 12 minutter og en temperatur, ved hvilken reaktionskomponenterne er stabile. En foretrukket inkubation til en bestemmelse af fri T4 er ca. 10 minutter ved ca. 37°C under anvendelse af den ovenfor beskrevne prøvefortynding og T4 antistof affinitet.

25 Efter inkubationen adskilles den umærket receptorbundne analyt fra de andre reaktionskomponenter. Dette kan gennemføres ved de ovenfor beskrevne teknikker til uopløseliggørelse af receptoren. Imidlertid er bortsugning eller fradekantering af væskeindholdet i et receptorbelagt rør mest bekvemt. Det foretrækkes at vaske den uopløselige receptorbund-30 ne analyt med en puffer eller vand for at sikre, at det uopløselige materiale i det væsentlige er fri for prøvereceptor eller prøvereceptor-bundet analyt.

Dernæst analyseres mængden af bundet analyt ved tilsætning enten af mærket analytanalog eller mærket opløselig analytreceptor efterfulgt af 35 adskillelse af den opløselige fase fra den uopløselige og bestemmelse af mærkestofindholdet i mindst én af faserne. Der anvendes fortrinsvis en mærket analytanalog, i hvilket tilfælde den uopløselige receptors bindingspositioner skal være i underskud i forhold til den samlede mængde af

DK 160448 B

10 analyt og mærket analyt, således at en konkurrerende fortrængningsligevægt kan finde sted. Ellers er mængden af receptorbindingspositioner i almindelighed irrelevant, med mindre ikke specifik mærket receptorbinding bliver et problem. Mængden af mærket analytanalog er ikke kritisk.

5 Mængden af mærket receptor bør være større end mængden af umærket receptorbundet analyt. De mærkede reagenser tilsættes sadvænligvis som forpuf rede opløsninger.

Sædvanligvis vil man lade det mærkede reagens komme i ligevægt med den uopløselige receptorbundne analyt før faseadskillelsen. Det er mu-10 ligt at forøge analysefølsomheden ved at fjerne det mærkede reagens, før en betydende mængde af receptorbundet analyt er dissocieret i opløsning.

Om dissociering indtræffer, afhænger imidlertid af tiden, og det er følgelig vanskeligt at gennemføre analyser på store prøvegrupper. Det foretrækkes i stedet at lade reaktionsblandingen nå en stabil tilstand. Li-15 gevægt er afhængig af de samme faktorer, som analytbinding med umærket receptor og kan let bestemmes af den erfarne fagmand. Når det drejer sig om T4, er en inkubation på ca. 1 time ved ca. 37°C tilfredsstillende.

Faseadskillelsen gennemføres effektivt ved hjælp af kendte teknikker såsom centrifugering, filterering eller, når der anvendes belagte 20 rør, dekantering eller bortsugning. Det uopløselige produkt kan så vaskes med vand eller puffer som i de forudgående trin. Det uopløselige materiale analyseres så fortrinsvis for mærkestofindhold, selv om også det tilbageværende opløselige mærkede reagens kan bestemmes. De med prøverne opnåede resultater sammenlignes så med resultaterne for på lignen-25 de måde behandlede kontrol prøver og standarder ved interpolation for at nå til et direkte kvantitativt mål for fri analyt.

Opfindelsen beskrives nærmere i de efterfølgende eksempler.

Eksempel 1 30 Dette eksempel viser den lethed, hvormed en analyse af fri T4 i prøver fra to patienter kan gennemføres under anvendelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Polypropylenrør belagt med kaninantistof for T4 mærkedes to og to efter følgende skema.

35

TABEL I

n DK 160448 B

Rør nr. Indhold i rør Fri T4 tilsat (pg i 0,1 ml) 5 _ 1,2 Fri T4-serum-bl ind, 0 ng/dl 0 3,4 Fri T4-serum-standard, 0,25 ng/dl 0,25 5,6 Fri T4-serum-standard, 1,0 ng/dl 1,00 7,8 Fri T4-serum-standard, 2,9 ng/dl 2,90 10 9,10 Fri T4-serum-standard, 4,9 ng/dl 4,90 11,12 Fri T4-serum-standard, 7,35 ng/dl 7,35 13,14 Patient "X"-serum-prøve "X" 15,16 Patient "Y"-serum-prøve "Y" 15 Der anvendtes dobbeltprøver af statistiske årsager, ikke på grund af et obligatorisk analysekrav. Følgende reagenser fik lov til at nå omgivelsestemperatur og sattes til de passende rør som dobbeltprøver; (a) 100 ml fri T4-serum-blind, 0 ng/dl, (b) 100 mi kroliter af hver fri T4-serum-standard i koncentrationer 20 på 0,25, 1,0, 2,9, 4,9 og 7,35 ng/dl, (c) 100 mi kroliter af hver prøve.

Der må drages omsorg for, at afpippeteringen af 100 mikroliterpor-tionerne foretages reproducerbart og på samme måde for såvel standarder som for prøver. 1,0 ml pH 7,4 0,01M fosfatforpufret saltvand indeholden-25 de okseserumalbumin og opvarmet til 37°C sattes til hvert rør til fortynding af prøver, standarder og blindprøve. Prøverne og pufferen blandedes ved hvirvel strømning. Alle rør inkuberedes så i et 37°C vandbad i 125 10 minutter, hvorefter rørenes indhold bortsugedes. 1,0 ml I T4 i trispuffer (0,5 uCi) pH 8,5 indeholdende 0,006M natriumsalicyl at, 0,004M 30 8-anilino-l-naphthalin-sulfonsyre og 0,7M natriumchlorid tilsattes, og rørene inkuberedes i 60 minutter ved 37°C. Indholdet i alle rør bortsugedes, og radioaktiviteten i rørene blev derefter talt i en gamma-tæller i 1 minut med vinduet indstillet til jod-125. Resultaterne af denne analyse er anført i tabel II nedenfor. Tællingerne pr. minut for standar-35 derne afbildedes på semilogaritmisk kurvepapir, og koncentrationen af fri T4 i de ukendte patientserumprøver bestemtes ved interpolation. Pa-tientserum-resultaterne er også anført i tabel II.

12

DK 160448 B

TABEL II

Rør-nr. Indhold i rør Tællinger Koncen- pr. tration 5 minut af fri T4 (bundet) (ng/dl) 1 Fri T4-serum-blind 26.458 0 2 " " " " 26.269 0 10 3 Fri T4-standard 25.054 0,25 4 " " " 24.487 0,25 5 Fri T4-standard 21.044 1,0 6 ...... 21.090 1,0 7 Fri T4-standard 16.412 2,9 15 8 " " " 16.737 2,9 9 Fri T4-standard 14.442 4,9 10 " " " 14.991 4,9 11 Fri T4-standard 13.012 7,35 12 " " " 13.447 7,35 20 13 Patient "X"-serum-prøve 20.356 1,25 14 " " " 20.664 1,15 15 Patient "Y"-serum-prøve 18.054 2,2 16 " " " " 17.281 1,5 25

Eksempel 2

En serie serumprøver fra gravide kvinder analyseredes for procent T3-optagning, total T4 og efter den i eksempel 1 beskrevne fremgangsmåde. Fri thyroxinindexet (FTI) beregnedes ud fra resultaterne af de 30 første to analyser og sammenlignedes med fremgangsmåden ifølge eksempel 1. Som det kan ses af tabel III nedenfor er der god korrelation mellem resultaterne opnået ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen og det hidtil anvendte fri thyroxinindex.

35

TABEL III

DK 160448 B

13

Prøve % T3U Total T4 FTI Fri T4 (30-40%) (4,5-11,5 ug%) (4,5-11,5 ug%) (0,8-2,3 ng/dl) 5 _ 265 25,3 15,4 ug% 11,11 ug% 2,3 ng/dl 272 25,6 14,1 10,34 1,8 271 27,3 11,8 9,19 1,4 274 24,9 11,6 8,27 1,2 10 295 31,6 11,5 10,42 1,8 308 25,8 8,6 6,32 1,4 310 23,6 18,2 12,27 2,5 311 30,5 8,6 7,51 1,8 313 23,6 12,4 8,36 1,9 15 345 23,7 11,2 7,59 1,0 368 24,4 12,1 8,45 1,3

Claims (10)

1. Fremgangsmåde til direkte bestemmelse af fri, ubundet analyt i en prøve, som indeholder en andel analyt bundet til en receptor i prø- 5 ven, hvor der med udtrykket "analyt bundet til en receptor i prøven" ikke menes "antigen-antistof", men systemerne thyroidhormoner og thyroxin-bindende proteiner (TBP); aldosteron, progesteron og testosteron med kønshormonbindende globulin; diphenylhydantoin og albumin; antihæmofil faktor og dens inhibitorer; proteolytiske enzymer og deres inhibitorer 10 eller aktivatorer; cortisol og cortisolbindende protein; samt B^-vita-min med "intrinsic factor", KENDETEGNET ved, AT man a) bringer prøven i kontakt med en kendt mængde af en umærket receptor for analyten med det formål at binde den frie analyt, b) fjerner prøven fra kontakt med den umærkede receptor, 15 c) bringer den umærkede receptor i kontakt med et mærket reagens i form af i) en mærket analytanalog, eller i i) en mærket opløselig analytreceptor, d) fjerner receptoren i trin c) fra ubundet mærket reagens, 20 e) bestemmer mængden af bundet eller ubundet mærket reagens, og f) korrelerer den i trin e) bestemte mængde med mængden af fri analyt i prøven.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, AT analytrecep- 25 toren er et antistof, der anbringes som belægning på i det mindste en del af en beholders indvendige overflade.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, KENDETEGNET ved, AT den umærkede analytreceptor vaskes efter den er bragt i kontakt med prøve- 30 analyt, men før den bringes i kontakt med mærket reagens.

4. Fremgangsmåde ifølge et eller flere af de foregående krav, KENDETEGNET ved, AT prøveanalyten er thyroxin, triiodothyronin, testosteron eller diphenylhydantoin. 35

5. Fremgangsmåde ifølge et eller flere af de foregående krav, KENDETEGNET ved, AT receptormængden er sådan, at antallet af receptorens bindingspositioner er mindre end den samlede mængde af prøveanalyt og DK 160448 B 15 prøveanalytanalog.

6. Fremgangsmåde til bestemmelse af frit thyroidhormon i et fluidum, der også indeholder endogent bundet thyroidhormon, i overensstem- 5 mel se med fremgangsmåden ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, AT man a) bringer fluidet i kontakt med en kendt mængde af en umærket receptor for hormonet, hvorved det frie hormon absorberes fra fluidet, b) adskiller receptoren fra fluidet, c) bringer receptoren i kontakt med mærket hormon, 10 d) adskiller receptoren fra ubundet, mærket hormon, e) bestemmer mængden af ubundet eller receptorbundet mærket hormon, og f) korrelerer den i trin e) bestemte mængde med mængden af frit hormon i fluidet. 15

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, KENDETEGNET ved, AT thyroidhormo-net er thyroxin.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 6 eller 7, KENDETEGNET ved, AT re-20 ceptoren er et thyroxinantistof anbragt som belægning på i det mindste en del af en beholders indvendige overflade, og AT fluidet er en fortyndet prøve.

9. Fremgangsmåde ifølge et eller flere af kravene 6-8, KENDETEG-25 NET ved, AT receptoren vaskes, efter at den er adskilt fra fluidet.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 8, KENDETEGNET ved, AT thyroxinanti-stoffet omsættes med glutaraldehyd før thyroxinantistoffet anbringes som belægning på overfladen. 30