JPS61178985A - ジソピラミド検定用トレ−サ−及び抗体発現のための免疫源 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は診断的検定分析及び抗体発現のための免疫源に
関する。より特には、（１）流体、特に生物学的流体例
えば血清、唾液、尿、血漿、髄液及び羊水中のジソピラ
ミドの量を測定するための試薬（例えばトレーサー）；
（２）試薬と共に用いる抗体を発現させる免疫源；（３
）合成方法（試薬及び免疫源の製造方法）：及び（４）
ジソピラミド検定を実施するための分析方法に関する。

く技術的背景〉 ジソピラミド［Ｄｉｓｏｐｙｒａｍｉｄｅ）、又は４−
ジイソプロピルアミノ−２−フェニル−２−（２−ピリ
ジル）−ブチルアミドは心臓のリズムの不正常な速度を
制御するために、抗不整脈剤として使用される薬品であ
る。こｎはしばしばベータブロック剤として投与される
。この薬品は有毒なものとなる可能性があり、治療用濃
度は有毒な濃度に近くなることかある。個人によってそ
の応答及び薬物濃度の保持時間に差があるので定休の血
清又は血漿中に存在するこの薬品濃度をモニターするこ
とが安全且つ有効な薬物濃度を保持するために望ましい
。

試験試料中の、例えば生物学的流体のリガンド（配位子
）を測定するために典型的に使用される評価法の一つは
競争結合免疫検定法である。（本開示の目的においては
、用語”リガンドとは免疫評価の方法によって定量的に
測定される生物学的興味のある物質を指す）、リガンド
はリガンド及びリガンド類似体に対して特異性を持つ、
限られた数の受容体の結合サイト又は抗体に対して標＠
を付した試薬又は“リガンド類似体”又は１トレーサー
”と競争（反応）をする。試料中のリガンド濃度は抗体
と結合するリガンド類似体の景をきめ；結合しようとす
るリガンド類似体の量は試料中のリガンド濃度に反比例
する、その理由けりガンドとリガンド類似体がそれぞｎ
、その濃度に比例して抗体と結合するからである。

過去には然し、客体の血清／血漿ジンビラミド濃度を酵
素免疫検定法で、又は液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）の技術によって測定していた。か＼る方法を凌ぐ改
良法はジソピラミド用の螢光偏光免疫検定法であり、ジ
ソピラミドのより迅速な評価を可能とし、従ってより速
いジソピラミドの治療用濃度の調節を可能とするであろ
う。

螢光偏光法は競争結合免疫検定法で生じたトレーサー抗
体抱合体（コンシュケート）の量を測定するための定量
的手段を提供する。螢光偏光法はある種の化合物では平
面偏光によって励起されると、その回転の割合に反比例
の関係の偏光度を持った螢光を発するという原理に基づ
いている。

従ってか＼る螢光化合物（フルオロフォーア（ｆｌｕｏ
ｒｏ−ｐｈｏｒｅ　）　）　ｋ用いて標識を付した螢光
トレーサー抗体抱合体は平面偏光で励起されて、フルオ
ロフォーアが光が吸収され光を発する間の時間、回転を
束縛されているため高い偏光度のま＼の光を発する。逆
に結合していないトレーサー化合物が平面偏光によって
励起された場合は、その回転が対応する結合したトレー
サー抗体抱合体よりも著ゐしく迅速であり、そして分子
はより思い思いに配向する。その結果、結合していない
トレーサー分子から発せられた光の偏光はない。か＼る
螢光偏光法は米国特許第４，４２０，５６８号（Ｗａｎ
ｇ　ｅｔ　ａｌ、）に応用されており、これはフルオロ
フォーアとしてトリアジニルアミノフルオレセイン部分
の使用をめざしている。

〈発明の構成〉 本発明は、高感度トレーサー、トレーサーの製造方法の
点で前述のＷａｎｇ特許を越えるはかり知れない進歩を
当業界にもたらし、且つジソピラミドの測定用に特に適
したトレーサーを用いる検定法を提供する。更に本発明
によって実施した検定法は下文でより詳述する様に特に
正確で高感度である。

本発明は特に、ジソピラミド用の螢光偏光検定法で使用
するためのトレーサー、か＼る評価全実施するための分
析方法、抗体全発現させるための免疫源及びトレーサー
及び免疫源七つくるための合成法をめざすものである。

本発明の第一の態様は新規な構造を有する独自のトレー
サーの発見に関連する。本発明の第一の態様によれば、
１０種のトレーサー化合物がジソピラミドの螢光分光検
定法用に提供される。これらの化合物はトレーサー４１
−４及び６−１１として特定されている。類似化合物、
化合物４５、の比較情報も示す。

トレーサー　Ａ１： Ｎ−４−クロロ−６−（ｐ−（１−カルバミル−３−（
ジイソプロピルアミノ）−１−（２−ピリジル）プロピ
ル〕アニリノ）トリアジン−２−イル−５−アミノフル
オレセイン。

トレーサー　ム２： Ｎ−４−クロロ−６−（ｐ−［１−カルバミル−３−（
ジイソプロピルアミノ）−１−（２−ピリジル）プロピ
ル〕アニリノ）トリアジン−２−イル−６−アミノフル
オレセイン。

トレーサー　Ａ３： Ｎ−４−メトキシ−６−［ｐ−（１−カルバミル−３−
（ジイソプロピルアミノ）−１−（２−ピリジル）プロ
ピル］アニリノ）トリアジン−２−イル−５−アミノフ
ルオレセイン。

トレーサー　ム４： Ｎ−４−メトキシ−６−（ｐ−〔１−カルバミル−３−
（ジイソプロピルアミノ）−１−（２−ピリジル）プロ
ピル〕アニリノ）トリアジン−２−イル−６−アミノフ
ルオレセイン。

化合物＆５： Ｎ−（ｐ−（１−カルバミル−３−（ジイソプロピルア
ミノ）−１−（２−ピリジル）プロピル〕フェニル）−
５−カルバミルフルオレセイン。

トレーサー　ムロ： Ｎ−（ｐ−Ｃ１−カルバミル−３−（ジイソプロピルア
ミノ）−１−（２−ピリジル）プロピル〕フェニル）−
６−カルバミルフルオレセイン。

トレーサー　／１１１１７： Ｎ−４−りｏｏ−６−（ｍ−（１−カルバミル−３−（
ジイソプロピルアミノ）−１−（２−ピリジル）プロピ
ル〕アニリノ）トリアジン−２−イル−５−アミノフル
オレセイン。

トレーサー　Ａ８： Ｎ−４−りｏｏ−５−（ｍ−［１−カルバミル−３−（
ジイソプロピルアミノ）−１−（２−ピリジル）プロピ
ル］アニリノ）トリアジン−２−イル−６−アミノフル
オレセイン。

トレーサー　ム９： Ｎ−４メトキシ−６−（ｍ−（１−カルバミル−３−（
ジイソプロピルアミノ）−１−（２ニピリジル）プロピ
ル〕アニリノ）トリアジン−２−イル−５−アミノフル
オレセイン。

トレーサー　ム１０： Ｎ−４−メトキシ−６−（ｍ−［１−カルバミル−３−
（ジイソプロピルアミノ）−１−（２−ピリジル）プロ
ピル］アニリノ）トリアジン−２−イル−６−アミノフ
ルオレセイン。

トレーサー　ム１１： Ｎ−［ｍ−［１−カルバミル−３−（ジイソプロピルア
ミノ）−１−（２−ピリジル）プロピル］フェニル）−
６−カルバミルフルオレセイン。

本発明の第二の態様は、ｐ−アミノジソピラミドと蛋白
質との反応生成物であり、抗体を発現させる免疫源の発
見に関係する。

上述のトレーサーは例えば血清又は血漿中のジソピラミ
ド濃度の定量での試薬として有用である。免疫源はトレ
ーサー化合物と共に使用するための、抗体発現用に有効
である。

本発明の第三の態様はトレーサー化合物及び免疫源製造
のための方法即ち合成方法に関する。

トレーサー４１−４及び６−１１、及び化合物Ｊｆ６５
として上に列挙した１１の化合物はすべて、ｐ−アミノ
ジソピラミド、即ち４−ジインプロピル−２−（ｐ−ア
ミノフェニル）−２−（ピリジル）ブチルアミド、゛又
はｍ−アミノジソピラミド即ち４−ジイソプロピルアミ
ノ−２−（ｍ−アミノフェニル）−２−（２−ピリジル
）ブチルアミドと他の化合物との反応生成物である。

トレーサーム１はｐ−アミノジソピラミドと５−〔（４
，６”　５−ＤＴＡＦ”、″ＤＴＡＦ　　Ｔ”又はＤＴ
ＡＦ　　Ｆｏｒｍ　ｉ”としても知られている、との反
応生成物である。

トレーサーＡ２はｐ−アミノジソピラミドと６−〔（４
，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノコフルオ
レセイン、′″６−ＤＴＡＦ”、’ＤＴＡＦ　Ｈ”又は
’ＤＴＡＦｐｏｒｍ　Ｔドとしても知られている、との
反応生成物である。

トレーサーＡ３はｐ−アミノジソピラミドと６−〔（４
−クロロ−６−メトキシトリアジン−２−イル）アミノ
コフルオレセインとの反応生成物である。

化合物Ａ５はｐ−アミノジソピラミドと５−カルボキシ
フルオレセインとの反応生成物である。

トレーサーＡ６はｐ−アミノジソピラミドと６−カルボ
キシフルオレセインとの反応生成物である。

トレーサーＡ７はｍ−アミノジソピラミドと５−〔（４
，６−ジクロトリアジン−２−イル）アミノコフルオレ
セイン、”５−ＤＴＡＦ″、″ＤＴＡＦ　　Ｔ″又は”
ＤＴＡＦ　Ｆｏｒｍドとしても知られている、との反応
生成物である。

トレーサーＡ８はｍ−アミノジソピラミドと６〔・（４
，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノコフルオ
レセイン、”６−ＤＴＡＦ’、”ＤＴＡＦ　　ＴＴ”又
は’ＤＴＡＦ　ＦｏｒｍＴＴ”としても知られている、
との反応生成物である。

トレーサー＆９はｍ−アミノジソピラミドと５−〔（４
−クロロ−６−メトキシトリアジン−２−イル）アミノ
〕フルオレセインとの反応生成物である。

トレーサーＡＩＯはｍ−アミノジソピラミドと６−１：
（４−クロロ−６−メトキシトリアジン−２−イル）ア
ミノコフルオレセインとの反応生成物である。

トレーサーＡｌｌｕｍ−アミノジソピラミドと６−カル
ボキシフルオレセインとの反応生成物である。

トレーサーム１−４及び６−１１、化合物ム５及びそれ
らをつくり出すのに使用された反応物質についての構造
式は、下文で示されている。

本発明の第四の態様は、本発明のトレーサー及び免疫源
を使用する、螢光偏光免疫検定法による、ジソピラミド
を定量する改良された分析方法に関する。トレーサー＆
１及び２がか＼る分析法で使用するのに好ましい化合物
であジ；そしてトレーサーム１が最も好ましい。

本発明の第四の態様によれば、試料ジソピラミド抗血清
、及び均質溶液中でジソピラミド抗血清の存在に対して
測定可能な螢光偏光応答を生じ得る螢光剤標識會付した
ジソピラミド誘導体と接触させ、均質溶液中を平面偏光
を通過させ、且つそこからの螢光偏光応答を測定する諸
工程から成ること全特徴とする、改良された螢光偏光検
定法が提供される。か＼る評価法は先に説明した理由で
、はかり知ることの出来ない利点を提供する。

本発明の更なる目的及び％徴は実施例を参照の上、以下
の詳細な説明を一読することにより理解されよう。

く構造式による説明〉 式１−４．８．１０及び１２は本発明の生成物の形成に
使用した反応物の構造式と名称を示す。

式５は本発明のトレーサーの形成に使用した反応物の前
駆体の互換構造式と名称を示す。

式６及び７は本発明の生成物の形成に使用した中間体の
構造式と名称を示す。

式９．１１及び１３−１６は本発明のトレーサ５イ造式
と名称を示す。

式１７は本発明の分析方法の態様での、アナライト（ａ
ｎａｌｙｔｅ　）、又は分析対象物質、の構造式と名称
を示す。

個々について示すと： 式１及び２は反応物ｐ−及びｍ−アミノフェニルアセト
ニトリルを示す。

式３は反応物２−ブロモピリジンを示す。

式４は反応物２−クロロエチルジイソプロピルアミノを
示す。

式５は本発明の生成物の形成に使用した反応物の前駆体
、フルオレセインの互換構造式を示す。

弐６は式１乃至４に示した化合物の反応生成物として製
造された、中間体４−ジイソプロピルアミノ−２−（ｐ
−及びｍ−アミノフェニル）−２−（２−ピリジル）−
ブチσニトリルを示す。式６及び７の破線の結合はそｎ
ぞれの位置（ｐ−又はｍ−）ｔｌ−向く。

式７は弐６に示した化合物と硫酸との反応生成物として
製造された中間体４−ジイソプロピルアミノ−２−（ｐ
−及びｍ−アミノフェニル）−２−（２−ピリジル）ブ
チルアミドを示す。

弐８は反応物５−及び６−〔（４，６−ジクロロトリア
ジン−２−イル）アミノコフルオレセインを示す。破線
の結合は、（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）
アミノ部分が結合しているフルオレセイン部分のそれぞ
れの位置（番号を付した炭素原子５及び６）を向く。

式９は本発明の２種の生成物、トレーサーＮ、ｏ　ｓ　
、　１及び２、Ｎ−４−クロロ−６−（ｐ−〔１−カル
バミル−３−（ジイソプロピルアミノ）−１−（２−ピ
リジル）プロピル〕アニリノ）トリアジン−２−イル−
５−アミノフルオレセイン及びＮ−４−クロロ−６−（
ｐ−［１−カルバミル−３−（ジイソプロピルアミノ）
−１−（２−ピリジル）プロピル〕アニリノ）トリアジ
／−２−イル−６−アミノフルオレセインを示す。破線
結合はｐ−アミノジインピラミド部分が結合しているフ
ルオレセイン部分のそｎぞれの位置（番号を付した炭素
原子５及び６）°を向く。

式１０は反応物５−及び６−〔（４−クロロ−６−メト
キシトリアジン−２−イル）アミノコフルオレセインを
示す。破線結合はｐ−又はｍ−アミノジソピラミド部分
が結合しているフルオレセイン部分のそれぞれの位置（
番号を付した炭素原子５及び６）を向く。

式１１は本発明の２種の生成物、トレーサーＮｏｓ、３
及び４、Ｎ−４−メトキシ−６−（ｐ−（１−カルバミ
ル−３＝（ジイソプロピルアミノ）−１−（２−ピリジ
ル）プロピル〕アニリノ）トリアジン−２−イル−５−
アミノフルオレセイン及びＮ−４−メトキシ−６−（ｐ
−（１−カルバミル−３−（ジインプロピルアξ］）−
１−（２−ピリジル）プロピル〕アニリノ）トリアジン
−２−イル−６−アミノフルオレセインを示す。破線結
合はｐ−アミノジソピラミド部分が結合しているフルオ
レセイン部分のそれぞれの位置（番号を付した炭素原子
５及び６）を向く。

式１２は反応物５−及び６−カルボキシフルオレセイン
を示す。破線結合はカルボン酸部分が結合しているフル
オレセイン部分のそれぞれの位置（番号を付した炭素原
子５及び６）を向く。

式１３は化合物産５及びトレーサーＡ６、Ｎ−［ｐ−［
ｔ−カルバミル−３−〔ジイソプロピルアミノ）−１−
（２−ピリジル）フロピル〕フェニル）−５−カルバミ
ルフルオレセイン及びＮ−（ｐ−（１−カルバミル−３
−（ジイソプロピルアミノ）−１−（２−ピリジル）プ
ロピル〕フェニル）−６−カルバミルフルオレセインを
示す。破線結合はＰ−アミノジソピラミド部分が結合し
ているフルオレセイン部分のそれぞれの位置（番号を付
した炭素原子５及び６）金向く。

式１４は本発明の２糧の生成物、トレーサーＮｏｓ、７
及び８、Ｎ−４−りｏｏ−６−（ｍ−［１−カルバミル
−３−（ジイソプロピルアミノ）　−１−（２−ピリジ
ル）プロピル］アニリノ）トリアジン−２−イル−５−
アミノフルオレセイン及びＮ−４−クロロ−６−（ｍ−
［１−カルバミル−３−（ジイソプロピルアミノ）−１
−（２−ピリジル）プロピル］アニリノ）トリアジン−
２−イル−６−アミノフルオレセインを示す。破線結合
はｍ−アミノジソピラミド部分が結合しているフルオレ
セイン部分のそれぞれの位置（番号を付した炭素原子５
及び６）ｔ−向く。

式１５は本発明の２種の生成物、トレーサーＮｏｓ、　
９及び１０．Ｎ−４−メトキシ−ｍｉｐ−（１−カルバ
ミル−３−（ジイソプロピルアミノ）−１−（２−ピリ
ジル）プロピル〕アニリノ）トリアジン−２−イル−５
−アミノフルオレセイン及びＮ−４−メトキシ−６−（
ｐ−（１−カルバミル−３−（ジイソプロピルアミノ）
−１−（２−ピリジル）プロピル〕アニリノ）トリアジ
ン−２−イル−６−アミノフルオレセイン奮示す。破線
結合はｍ−アミノジソピラミド部分が結合しているフル
オレセイン部分のそれぞれの位置（番号を付した炭素原
子５及び６）を向く。

式１６はトレーサー烹１１、Ｎ−（ｍ−（１−カルバミ
ル−３−（ジイソプロピルアミノ）−１−（２−ピリジ
ル）プロピル〕フェニル）−６−カルバミルフルオレセ
インを示す。

式１７はジソピラミド、本発明の分析法態様の分析対象
物を示す。

ｐ−アミノフェニルアセトニトリル　　ｍ−アミノフェ
ニルアセトニトリル（反応物）　　　　　　　　　　（
反応物）式１．　　　　　　　式２ 式１　　　　　２−クロロエチルジイソプロピルアミノ
（反応物） 式４゜ ４−ジイソプロピルアミノ−２−（ｐ−又はｍ−アミノ
フェニル）−２−（２−ピリジル）ブチロニトリル（中
間体） 弐６゜ ４−ジイソプロピルアミノ−２−（ｐ−又はｍ−アミノ
フェニル）−２−（２−ピリジル）ブチルアミド〔ｐ−
（又はｍ−）アミノジソピラミド）（中間体） 式７゜ ５−又は６−（０６−ジクロロトリアジン−２−イル）
アミノコフルオレセイン 〔ＤＴＡＦ″） （反応物） 弐８゜ １７Ｈ・　　　？Ｈ・ Ｎ−４−クロロ−６−（ｐ−（１−カルバミル−３−（
ジイソプロピルアミノ）−１−（２−ピリジル）プロピ
ル〕アニリノ）トリアジン−２−イル−Ｘ−アミノフル
オレセン（ｘ＝５、トレーサー４１；Ｘ＝６、トレーサ
ー４２）式９゜ ５−又は６−〔（４−クロロ−６−メトキシトリアジン
−２−イル）アミノコフルオレセイン （反応物） 式１０゜ Ｎ−４−メトキシ−６−（ｐ−（１−カルバミル−３−
（ジイソプロピルアミノ）−１−（２−ピリジル）プロ
ピル〕アニリノ）トリアジン−２−イル−Ｘ−アミノフ
ルオレセイン （ｘ＝５、トレーサー４３；ｘ＝６、トレーサー＆４）
５−又は６−カルボキシフルオレセイン（反応物） 式１ｚ Ｎ−（ｐ−［１−カルバミル−３−（ジイソプロピルア
ミノ）−１−（２−ピｌＪジル）フロピル〕フェニル）
−Ｘ−カルバミルフルオレセイン （ｘ＝５、化合物扁５；Ｘ＝６、トレーサー＆６）Ｎ−
４−りｏｏ　−５−（ｍ　−’［１−カルバミル−３−
（ジイソプロピルアミノ）−１−（２−ピリジル）プロ
ピル］アニリノ）トリアジン−２−イル−Ｘ−アミノフ
ルオレセイン（ｘ＝５、トレーサーＡ７；Ｘ＝６、トレ
ーサーＡ８）式１４ ％式％（ ］ （ｘ＝５、トレーサー屋９；ｘ＝６、トレーサー屋１１
）式１５゜ Ｎ−（ｍ−（１−カルバミル−３−（ジイソプロピルア
ミノ）−１−（２−ピリジル）プロピル〕フェニル）−
６−カルバミルフルオレセイン （トレーサー憲１１） 式１６゜ ジソピラミド （分析対象物） 式１７゜ く態様の詳細な記載、〕 本発明は螢光トレーサー化合物としてフルオレセイン誘
導体の使用を伴う。フルオレセインは、フルオレセイン
分子の環境の酸濃度（ｐＨ）によって、式５に示した、
２つの互変異性型で存在する。開環（酸）型では、その
型のフルオレセイン（及びフルオレ上４フ部分ｔｉする
誘導体化合物）を青色光を吸収し、約４ナノ秒の励起状
態寿命後に緑色螢光を発することが出来る様にする多数
の共役二重結合が存在する。開環及び閉環（ラクトン）
型はｐＨを調節することによって容易に相互変換させ得
る。一般に本発明のトレーサー化合物は溶液中で、生理
学上許容し得る塩例えばナトリウム、カリウム、アンモ
ニウム等の塩として存在し、本発明の分析的方法で使用
する時に化合物を開環の螢光剤型で存在させている。存
在する特定された塩はｐＨの調節に使用される緩衝剤に
よる。例えば燐酸ナトリウム緩衝剤の存在下では、本発
明の化合物はナトリウム塩として開環型で一般に存在す
る。

本明細書では、用語“フルオレセイン”とは、特定の分
子についてその螢光を論する時以外は、個々の化合物に
せよ、大きな分子の一成分としてでも、開環及び閉環型
の両方を含めることとする。螢光が起こるためには開環
型が必要となる。

フルオレセイン分子の炭素原子の番号付けは、開いた又
は閉じた型の分子のいずれを考えるかによって変る。従
ってフルオレセイン及びその化合物に関する文献は炭素
原子の番号付けに関して統一されていない。キサンチン
基に向合ったフェニル基の炭素原子は開環型では４、そ
して閉環型では５であり、一方隣接するカルボキシル基
に対する炭素原子は慣習的に化合物の閉環型では６、そ
して化合物の開環型では５である。本開示の目的のため
には、閉じた型の番号付けを採用しており、その理由は
合成に使用された物質が最も普遍的にそのシステムで付
番されていることによる。カルボキシル基に向合ったフ
ルオレセイン及ヒソの化合物の炭素原子は従って、本発
明の開示の目的に対しては”６”と付番する。

抗体に結合（錯化）していないトレーサーは自由に回転
し、螢光の吸収及び再発光に必要な時間が短い。その結
果、再発光光は比較的不規則に配向し、従って抗体に錯
化していないトレーサーの螢光偏光は低く、ゼロに近い
。特定の抗体と錯形成して、形成されたトレーサー抗体
錯体は、抗体分子の回転が比較的小さなトレーサー分子
よりもゆるやかであり、そのため観測される偏光（分極
）を増加させると考えられる。従って、抗体サイトに対
してリガンドがトレーサーと競争（反応）を行なう場合
には、トレーサー抗体錯体の螢光の観測される偏光はト
レーサーとトレーサー抗体錯体の間のある値となる。試
料が高い濃度のリガンドを含む場合には、実測される偏
光（分極）値は遊離のリガンドのそれに近付き、即ち低
い。試験試料−が低濃度のリガンドを含んでいる場合に
は、偏光（分極）値は結合したリガンドのそれに近く、
即ち高い。免疫検定の反応混合物を垂直及び次に水平偏
光した光で逐次的に励起させ、発光光の垂直成分だけを
分析することによって、反応混合物中の螢光の偏光を正
確に測定することが出来る。偏光と測定すべきリガンド
の濃度との間の精密な相関々係は既知濃度のキャリブレ
ータ−の偏光値を測定することによって定められる。リ
ガンドの濃度はこの方法で作成した標準曲線から内挿又
は外挿することが出来る。

本発明に従って形成された特異なトレーサーは螢光偏光
検定法で驚くべき程良好な結果を産むことが見出された
。

本発明の化合物の製造方法を実施例によって説明する。

実施例１ ８０℃の４１５−の無水トルエン中の５，２１のｐ−ア
ミノフェニルアセトニトリル（式１参照）と６．５１の
２−ブロモピリジン（式３参照）の混合物に１時間以上
かけて少し宛、３．３？のナトリウムアミドを加え、こ
の間も温度を８０乃至８５℃に保った。次に反応混合物
音１０５℃に１時間加熱した。この混合物に１３１Ｌｔ
の無水トルエン中の８．２？の２−クロロエチルジイソ
プロピルアミノ（式４参照）を加えた。得られた混合物
’ｋｌ　１０＋２℃に３．５時間加熱した。暗色混合物
を室温に冷却し、２０ｄの水でクエンチした。層に分れ
た。トルエン分画を硫酸ナトリウムで乾燥、濾過して、
粘稠油に真空濃縮した。１５０？のシリカゲル上でのク
ロマト分別及び９４．５％クロロホルム、５％エタノー
ル及び０．５係濃水酸化アンモニウムより成る溶媒系を
用いる溶離で’２．７２９−の純粋生成物を生じ、ＮＭ
Ｒにより４−ジイソプロピルアミノ−２−（ｐ−アミノ
フェニル）−２−（２−ピリジル）ブチロニトリル（式
６参照）と同定された。

上の合成法では、カリウムアミドでナトリウムアミドの
代用をさせることが可能である。

上記により製造した４−ジイソプロピルアミノ−２−（
ｐ−アミノフェニル）−２−（２−ピリジル）ブチロニ
トリルの０．７２９−と、１４ｍ／の濃硫酸の混合物を
１００＋２℃に４時間加熱した。溶液を室温に冷却して
氷の上にあけた。得られた混合物ｔＮａＯＨで塩基性（
ｐＨ約１１）にした。混合物を各２５ｍｊのクロロホル
ムで４回抽出した。抽出液を硫酸マグネシウムで乾燥、
濾過、真空濃縮してゴム状固体を得た。この固体を２５
１のシリカゲル上でクロマト分別し、８３．５％クロロ
ホルム、１５飴メタノール及び１．５％濃水酸化アンモ
ニウムより成る溶媒系を用いて溶離させて０．３５６Ｆ
の純粋生成物を得た。同一の方法を繰返して１．０７ｙ
−の純粋生成物を得、ＮＭＲによって４−ジイソプロピ
ルアミノ−２−（ｐ−アミノフェニル）−２−（２−ピ
リジル）ブチルアミド（式７参照）と同定された。

この化合物はｐ−アミノジソピラミド［ｐ−ａｍｉｎｏ
ｄｉｓｏ−ｐｙｒａｍｉｄｅ］又はジソピラミドハプテ
７　（ｄｉｓｏｐｙｒａｍｉｄｅｂａｐｔｅｎ　）　　
としても知られている。

実施例２ 実施例１の様にして製造したＰ−アミノジソピラミドの
５■、８■の５−〔（４，６−ジクロロトリアジン−２
−イル）アミノコフルオレセイン〔ＤＴＡＦ　　Ｉ”、
市場で入手可能々物質、式８参照）と０．５コのメタノ
ールの混合物を室温で１８時間攪拌した。粗反応生成物
を薄層クロマトグラフ法の０．５ｍシリカゲル板上に置
き、５０部のクロロホルム、５０部のメタノール及び０
．５部の酢酸の混合物を用いて溶離させた。生成物をシ
リカゲルからメタノールで溶出させ、０．５ｍシリカゲ
ル板上で再び５０部のクロロホルム、５０部のメタノー
ル及び０．５部の酢酸の混合物を用いて溶離させて再精
製した。主要燐光帯をとってシリカゲルからメタノール
で溶出させた。生成物はトレーサー＆１、Ｎ−４−クロ
ロ−６−（ｐ−（１−カルバミル−３−（ジイソプロピ
ルアミノ）−１−（２−ピリジル）プロピル〕アニリノ
）トリアジン−２−イル−アミノフルオレセイン（式９
参照）であった。

実施例３ ６〔（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノ
〕フルオレセイン〔ＤＴＡＦ　　ＩＩ”、式７参照）は
６−アミノフルオレセイン及び２．４．６−トリクロロ
トリアジンから、工大の実施例５又は７記載の方法を用
いて、合成できる。

実施例４ トレーサー４２ イン）の製造 実施例２で使用したＤＴＡＦ　　Ｔを６−ＣＣ４，６−
ジクロロトリアジン−２−イル）アミノコフルオレセイ
ン（ＤＴＡＦＨ″）に代えて、実施例２″に繰返した。

生成物はトレーサーム２、Ｎ−４−クロロ−６−（ｐ−
（１−カルバミル−３−ジイソプロピルアミノ）−１−
（２−ピリジル）プロピル〕アニリノ）トリアジン−２
−イル−６−アミノフルオレセイン（式９参照）であっ
た。

実施例５ ５−〔（４−クロロ−６−メトキシトリアジン−２−イ
ル）アミノ〕フルオレセイン（式１０参照）は以下の方
法で製造した： １？の５−アミノフルオレセインに５０ＴＲ１のメタノ
ール中で攪拌し、混合物を不溶物質と溶液とに分離した
。母液ｔ−２５０ＷＬｌ丸底フラスコにデカンテーショ
ンし水浴を用いて４℃に冷した。次に５ゴのクロロホル
ム中の４４−ジクロロ−６−メトキシトリアジンの溶液
？！？４℃で滴加し、混合物を更に６０分攪拌した。１
−の濃塩酸を混合物に加えた。塩酸添加で黄色固体が生
じた。攪拌を更に６０分続け、黄色沈殿を戸別して乾燥
した。母液を蒸発乾固して第二部分とし、５−〔（４−
クロロ−６−メドキントリアジ／−２−イル）アミノコ
フルオレセイン（式１０参照）全８５チ収軍で得た。

実施例６ トレーサー４３ イン）の製造 実施例２で使用したＤＴＡＦ　　Ｔを実施例５の生成物
に代え、１８の代りに２４時間の攪拌を行い、実施例２
を再び繰返した。生成物はトレーサーｓ３、Ｎ−４−メ
トキシ−６−（ｐ−（１−カルバミル−３−ジイソプロ
ピルアミノ）−１−（２−ピリジル）プロピル〕アニリ
ノ）トリアジン−２−イル−５−アミノフルオレセイン
（式１１参ｍ）であった。

実施例７ ６−［”（４−クロロ−６−メトキシトリアジン−２−
イル）アミノコフルオレセイン（式１０参照）は以下の
様にして製造した： ０℃のメタノールの５ｄ中の０．５．％６−アミノフル
オレセインを木綿でヂし、０℃のクロロホルム２．５　
ｄ中＋７）０．３５１の２．４−ジクロロ−６−メトキ
シトリアジンへと導いた。

この添加に約１時間を要した。０℃での４時間後、固体
が生成した。０．５ｄの濃塩酸を加えた。数分攪拌して
後、固体ｒ濾過し、ジクロロメタンで洗い空気乾燥した
。０．５５１の黄色生成物、６−〔（４−クロロ−６−
メトキシトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン
（式１００参照を得た。

実施例８ トレーサーム４ 実施例２に使用したＤＴＡＦ　　Ｔを実施例７の生成物
にかえ、攪拌ｔ−１８でなく２４時間にして実施例２を
再び繰返した。生成物はトレーサー４４、Ｎ−４−メト
キシ−６−（ｐ−［１−カルバミル−３−（ジイソプロ
ピルアミノ）−１−（２−ピリジル）プロピル〕アニリ
ノ）トリアジン−２−イル−６−アミノフルオレセイン
（式１１参照）であった。

実施例９ 化合物Ａ５ ０．５−の無水ピリジン中の１１．２Ｗの５−カルボキ
シフルオレセイン、３．６ｑのＮ−ヒドロキシサクシン
イミド及ヒｓ、＋Ｗ９のジシクヘキシルカルボジイミド
の溶液を室温で２時間攪拌した。０．２５−の無水ピリ
ジン中の、実施例１で製造した、Ｐ−アミノジソピラミ
ドの１０．０■會加えた。

溶液を室温で１８時間、攪拌するま＼にしておいた。溶
液ｔ−０，５ｗＸ　２０ｃＷＩＸ　２０ＣＭシリカゲル
板に置き６０／４０１０．４＋の比のクロロホルム／メ
タノール／酢酸で溶離させた。生成物は化合物ム５、Ｎ
−（ｐ−（１−カルバミル−３−（ジイソプロピルアミ
ノ）−１−（２−ピリジル）プロピル〕フェニル）−５
−カルバミルフルオレセイン（式１３参照）であった。

実施例６ トレーサーム６ ５−カルボキシフルオレセインの代りに６−カルボキシ
フルオレセインを用いて実施例９′（ｉ−繰返した。生
成物はトレーサーＡ６、Ｎ−（ｐ−（１−カルバミル−
３−（ジイソプロピルアミノ）−１−（２−ピリジル）
プロピル〕フェニル）−６−カルバミルフルオレセイン
（式１３参照）でおった。

実施例ｌｌ ｍ−アミノジソピラミドの製造 ｐ−アミノフェニルアセトニトリルをｍ−アミノフェニ
ルアセトニトリルに代えて、実施例１を繰返した。生成
物は４−ジイソプロピルアミノ−２−（ｍ−アミノフェ
ニル）−２−（２−ピリジル）ブチルアミド（式２及び
７参照）であった。この化合物はｍ−アミノシソビラミ
ドとしても知られている。

実施例１２ トレーサーム７ Ｐ−アミノジソピラミドをｍ−アミノジソピラミドに代
えて、実施例２を繰返した。生成物はトレーサー＆７、
Ｎ−４−クロロ−６−（ｍ−（１−カルバミル−３−（
ジイソプロピルアミノ）−１−（２−ピリジル）プロピ
ル〕アニリノ）トリアジン−２−イル−５−アミノフル
オレセイン（式１４参照）であった。

実施例１３−１６ Ｐ−アミノジソピラミドｆｍ−アミノシソビラミドに代
えて実施例４．６．８、及び１０を繰返した。（これを
順に実施例１３．１４．１５及び１６と呼ぶ）。

実施例１３の生成物はトレーサ−／１６８、Ｎ−４−ク
ロロ−６−（ｍ−（１−カルバミル−３−（ジイソプロ
ピルアミノ）−１−（２−ピリジル）プロピル〕アニリ
ノ）トリアジン−２−イル−６−アミノフルオレセイン
（式１４参照）であった。

実施例１４の生成物はトレーサー４９、Ｎ−４メトキシ
−６−（ｍ−（１−カルバミル−３−（ジイソプロピル
アミノ）−１−（２−ピリジル）プロピル〕アニリノ）
トリアジン−２−イル−５−アミノフルオレセイン（式
１５参照）であった。

実施例１５の生成物はトレーサー４１０．Ｎ−４−メト
キシ−６−（ｍ−［１−カルバミル−３−（ジイソプロ
ピルアミノ）−１−（２−ピリジル）プロピル〕アニリ
ノ）トリアジン−２−イル−６−アミツフルオレセイ／
（式１５参照）であった。

実施例１６の生成物はトレーサーＡｌｌ、Ｎ−（ｍ−（
１−カルバミル−３−（ジイソプロピルアミノ）−１−
（２−ヒＩＪ　、）ル）フロピル〕フェニル）−６−カ
ルバミルフルオレセイン（式１６参照）であった。

実施例１７ 免疫源の製造 ４溶液を以下の様にして調製した： ０．１Ｍ硼酸ナトＩＪウム緩衝液：３８１■の硼酸ナト
リウム１０水化物を８−の水に溶かし、１Ｍ塩酸でｐＨ
を９．０に調節し、１０ｄの溶液とするのに充分な水を
加えた。

１Ｍ硝酸ナトリウム：６９■の硝酸ナトリウムを１１の
水に溶かしｆｃ。

１Ｍ尿素：６０■の尿素を１ｍｌの水に溶がした。

０．０５Ｍ重炭酸ナトリウム：８．４ｐの重炭酸ナトリ
ウムを２ｔの水に溶かした。

実施例１の様にして調製した４０■のｐ−アミノジソピ
ラミドを２−のジメチルホルムアミドに溶がし０．６−
の水を加えた。この溶液を水浴で２−４℃に冷やして０
．４　ｍのＩＮ塩酸を加えた。新らしい１Ｍ硝酸ナトリ
ウム水溶液０．１２ｄを加えて２−４℃に保ちつつ混合
物を３０分間攪拌した。ｏ、ｉｙの１Ｍ尿素を加えて亜
硝酸全分解した。亜硝酸の有無は溶液の１滴を澱粉−ヨ
ード紙に置いてチェックした。澱粉ヨード紙が青黒色に
変ってはカらぬ。

上記の溶液を、９のｐＨを持った０、１Ｍ硼酸塩緩衝液
５ｄ中の牛の血清アルブミンの２−４℃溶液に滴加した
。

１５分間ｐｐＨ上ニターして、必要ならばＩＮ水酸化ナ
トリウム又はＩＮ塩酸でｐｕ２ｃ＋に調節した。溶液を
１晩２−４℃で攪拌し、０．０５Ｍ重炭酸ナトリウムの
２ｔｔ用いて２回、２ｔの水を用いて更に２回透析した
。生成物はｐ−アミノジソピラミドと牛の血清アルブミ
ン蛋白質との反応生成物であり、凍結貯蔵した。

上記の方法を記載どおり実施し、次にＰ−アミノジソピ
ラミドの２倍量上用いて繰返した。吸収データによると
、生成物は１２部のＰ−アミノジソピラミドと１部の牛
の血清アルブミン蛋白質であると算出された。

牛の血清アルブミン蛋白質を他の蛋白質物質にしても同
様な結果を得ることが出来、同様にｐ−アミノジソピラ
ミドｆｍ−アミノジソピラミドに代えることが出来る。

上述の反応条件はそれぞれの好ましい条件に応じて変え
られる。

反応は約０℃乃至約１００℃の、・最も好ましくは０℃
乃至８０℃の温度で実施出来、反応時間は反応温度にっ
ｎて、約０．５時乃至６日の間で変る。

本発明の分析方法、即ち本発明のトレーサー化合物及び
免疫源を用いる螢光免疫検定法に依るジソピラミドの定
置方法によれば、ジソピラミドを含有する又は含有する
と考えられる試料をトレーサーＡ１乃至４又は６乃至１
１の一つ（好ましくはトレーサーＡｌ）の生物学上許容
し得る塩、ジソピラミドに特異性を持つ抗体及びトレー
サーと混合する。抗体は実施例１７に記載した免疫源を
用いて製造される。ジソピラミドとトレーサー化合物は
限られた抗体サイトに対して競争して、錯体を形成する
。トレーサー及び抗体の濃度を一定に保つことにより、
形成されたトレーサー抗体錯体に対するジソピラミド−
抗体錯体の比が試料中のジソピラミドの童に正比例する
ことになる。従りて混合物を直線偏光々で励起し、トレ
ーサー及びトレーサー−抗体錯体から発せられる螢光の
偏光（分極）を測定すると、試料中のジソピラミドの量
を定量的に測定出来る。

本発明の方法を実施するｐＨは、トレーサーのフルオレ
セイン部分をその開いた型で存在させるのに充分なもの
でおる必要がある。ｐＨは約３乃至１２、より普通には
約５乃至１０の範囲、最も好ましくは約６乃至９の範囲
をとり得る。色々の緩衝液が検定している間のｐＨに到
達させ、これを維持するために使用出来る。代表的な緩
衝液には、ボレート、ホスフェート、カーボネート、゛
トリス、バービタル等がある。本発明に特定の緩衝液を
使用することは臨界的では無いが、トリス及びホスフェ
ート緩衝液が好ましい。緩衝剤のカチオン部分は一般に
溶液中のトレーサー塩のカチオン部分によってきまって
来よう。

本発明の螢光偏光検定用の試薬は、ジソピラミドに特異
性含有する抗体及び本文中で述べたトレーサーの一つで
ある。更にジンビラミド前処理溶液、稀釈緩衝液、ジソ
ピラミドセヤリビレーター及びジソピラミド対照を望ま
しくは用意する。

本発明で好ましいトレーサーの処方は、ｐＨ７，５の０
．１モルのトリス緩衝液；１５％（ｗｅｉｇｈｔ／ｖｏ
ｌｕｍｅ）　＝ｒ　−Ａ／酸ナナトリウム塩及び０．１
％ナトリウムアジド中の８０．０ナノモルのトレーサー
である。抗血清処方は０．９％（ｗｅｉｇｈｔ／ｖｏｌ
ｕｍｅ）塩化ナトリウム及び０．１％（ｗｅｉｇｈｔ／
ｖｏｌｕｍｅ）ナトリウムアジドを用いて稀釈した兎の
血清より成る。稀釈緩衝液はｐＨ７，５の０．１モル燐
酸す）　ＩＪウム；ｏ、１％（ｗｅｉｇｈｔ／ｖｏｌｕ
ｒｎｅ　）ナトリウムアジド；及び０．０１％（ｗｅｉ
ｇｈｔ／ｖｏｌｕｍｅ　）牛のガンマ−グロブリンより
成る。

前処理処方はｐＨ７，５の０．１モルトリス緩衝液；０
．１％（ｗｅｉｇｈｔ／ｖｏｌｕｍｅ）ナトリウムアジ
ド；及び１５％（ｗｅｉｇｈｔ／ｖｏｌｕｍｅ）コール
酸ナトリウム塩より成る。ジソピラミド・キャリブレー
タ−は１轟り０．０．０．５．１．０、ｚＯ１４，０及
び８、θマイクログラムのジソピラミドと正常人の血清
ヲ０．１％のナトリウムアジド防腐剤と共に含んでいる
ものが有用である。ジソピラミド対照はｄ当り１．５．
３．０及び６．０マイクログラムの濃度でジソピラミド
と正常人の血清とを含み、そして０．１％ナトリウムア
ジド防腐剤がこの場合も有効である。

さて、本発明の改良された検定の好ましい方法を詳細に
説明する。この検定法は９均質（均一）検定法”である
、このことは最終の偏光の読取りを結合したトレーサー
を結合し々いトレーサーから分離しないま＼の溶液から
行なう。

このことは、例えば読取りを行なう前に結合した放射性
トレーサーを結合していない放射性トレーサーから分離
しなければならない放射線免疫検定法よりも明らかな長
所である。

本発明の好ましい検定方法に工れば、ジンビラミドキャ
リブレータ−１対照及び未知試料を同一の方法で調製す
る必要がある。イリノイ州アボット・パークのアボット
ラボラトリーズ〔Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ、　Ａｂｂｏｔｔ　ｐａｒｋ。

Ｉ　１ｌｉｎｏｉｓ　）から購入できるアボット・ティ
ディエックス・ボーラリゼーション・アナライザー（Ａ
ｂｂｏｔｔ　ＴＤｘ■Ｐｏ１ａｒｉｚａｔｉｏｎ　Ａｎ
ａｌｙｚｅｒ）と組合わせて使用することが企図されて
いる好ましい方法では、５０マイクロリツトルの血清又
は血漿試料ｋＴＤｘ■サンプル・カートリッジ又は等何
物の試料井中にピヘットで入れる。試薬パック及び回転
装置を装置に装着すると、１開始”ボタンを押すことに
よって評価が自動的に進行する。

人手による評価同定が望ましい場合には、試料を稀釈緩
衝液と混合する。抗体及び予備処理溶液を試料が入った
試験管に入れて、バックグランドを読む。次にトレーサ
ーと稀釈緩衝液を試料に加え、そして培養後、螢光偏光
を読取る。

各キャリブレータ−１対照又は試料の螢光偏光値が測定
され、装置例えばアボット・チーデーニック・ボーラリ
ゼーション・アナライザーの出力テープ上に印字される
。標準カーブは非線形回帰分析を用いて各キャリブレー
タの分極度Ｐ対その濃度をプロットすることに依って装
置内でつくられている。各対照及び試料の濃度は記憶さ
れた補正曲線読取って出力テープ上に印字する。

前述の好ましい方法に関しては、ジンビラミドトレーサ
ー、抗体、前処理溶液、キャリブレータ−及び対照は約
２乃至約８℃の貯蔵状態から取出して直接使用する必要
がちり、一方稀釈緩衝液は室温で貯蔵する必要があるこ
とを理解されたい。標準カーブと対照は２週間毎に実施
する必要があり、各キャリブレータ−及び対照は２回実
施する。対佃は各バッチで行う必要があジ、ナベでの試
料について２回行なう。

トレーサーＡ１−４及び６及び化合物ム５ｔジンビラミ
ドの螢光偏光免疫検定決定法での有効性について試験し
た。

結果は工大の表１に示す。

結果は、正味のミリ偏光（分極）単位、スパン（ミリ偏
光単位での）及び強度を用いて定量化出来る。ミリ偏光
単位の測定は一切ジソピラミドが無い場合、トレーサー
の最大量が抗体に結合した時の最大偏光を示している。

正味のミ１７偏光（分極）単位が高ければ、トレーサー
の抗体への結合がより良い。スパンは正味ミリ偏光（分
極）と抗体に結合したトレーサーの最低量との差の指標
である。より大きなスパンはデータのより良い数値解析
をもたらす。強度はバックグランドからの信号の強度の
尺度である。従って、より高い強度はより正確な測定結
果を与える。強度は垂直偏光強度生水平偏光強度×２と
して約１ナノモル（即ち、大略０．８−１．２ナノモノ
）・で測定される。

表１は正味ミリ偏光単位、スパン及び強度を用いて示し
た、本発明のトレーサーの結果全示しており、化合物ム
５と比較して得られた結果が遥かにすぐれている。比較
的小さなジンビラミドとトレーサー分子の間の構造上の
実質的差から、本発明のトレーサーがジンビラミドに特
異性を有する抗血清によって良く識別されるとは誰も期
待しておらず、これは驚くべきことである。

表　　１ トレーサー＄１　　　１８０　　　　１４０　　　　　
４５００−６５００トレーサー＄２　　　　１７０　　
　　　１１５　　　　　５４００−７４００トレーサー
＃３　　　１９０　　　　　１４６　　　　　４５００
−５９００トレーサー＄４　　　２００　　　　１１７
　　　　　４７００−５２００化合物＃５　　　３　　
（測定せ°リ　　１凹００−１４ρ００トレーサー＋６
　　１７０−２０５　　（測定せ“−ｆｉ　　　６００
０−７５００いずれの場合も、合成した化合物のクロマ
トグラフ的分離では複数個のクロマトグラフ帯を生じ、
これらは別々に試験した。表１に示したデータは、列挙
しである各々のトレーサー化合物について実測された最
良のクロマトグラフ帯についてのものか、あるいは数個
のクロマトグラフ帯について実測された値を組合わせ（
平均をとった）ものである。

本発明の分析方法は、先行技術の酵素免疫検定法よりも
、螢光偏光についてより迅速な検定作業を可能にしてい
る。

本発明の分析方法は先行技術の検定法に比してジンビラ
ミドの主要代謝中間体についてより低い交差反応性も有
している。

前述の態様の詳細な記載及び実施例は本発明の範囲を例
示するためのものであって、本発明の範囲を限定するた
めのものではないことを理解されたい。当業者にとって
はさまざまの改善も可能であろう、従って本発明の範囲
は特許請求の範囲とその等何物によって定められるべき
ものである。

゛（Δ〆

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ｎ−４−クロロ−６−（ｐ−〔１−カルバミル−３
   −（ジイソプロピルアミノ）−１−（２−ピリジル）プ
   ロピル〕アニリノ）トリアジン−２−イル−５−アミノ
   フルオレセイン、Ｎ−４クロロ−６−（ｐ−〔１−カル
   バミル−３−（ジイソプロピルアミノ）−１−（２−ピ
   リジル）プロピル〕アニリノ）トリアジン−２−イル−
   ６−アミノフルオレセイン、Ｎ−４メトキシ−６−（ｐ
   −〔１−カルバミル−３−（ジイソプロピルアミノ）−
   １−（２−ピリジル）プロピル〕アリニノ）トリアジン
   −２−イル−５−アミノフルオレセイン、Ｎ−４−メト
   キシ−６−（ｐ−〔１−カルバミル−３−（ジイソプロ
   ピルアミノ）−１−（２−ピリジル）プロピル〕アニリ
   ノ）トリアジン−２−イル−６−アミノフルオレセイン
   、Ｎ−（ｐ−〔１−カルバミル−３−ジイソプロピルア
   ミノ）−１−（２−ピリジル）プロピル〕フェニル）−
   ６−カルバミルフルオレセイン、Ｎ−４−クロロ−６−
   （ｍ−〔１−カルバミル−３−（ジイソプロピルアミノ
   ）−１−（２−ピリジル）プロピル〕アニリノ）トリア
   ジン−２−イル−５−アミノフルオレセイン、Ｎ−４−
   クロロ−６−（ｍ−〔１−カルバミル−３−（ジイソプ
   ロピルアミノ）−１−（２−ピリジル）プロピル〕アニ
   リノ）トリアジン−２−イル−６−アミノフルオレセイ
   ン、Ｎ−４−メトキシ−６−（ｍ−〔１−カルバミル−
   ３−（ジイソプロピルアミノ）−１−（２−ピリジル）
   プロピル〕アニリノ）トリアジン−２−イル−５−アミ
   ノフルオレセイン、Ｎ−４−メトキシ−６−（ｍ−〔１
   −カルバミル−３−（ジイソプロピルアミノ）−１−（
   ２−ピリジル）プロピル〕アニリノ）トリアジン−２−
   イル−６−アミノフルオレセイン、Ｎ−（ｍ−〔１−カ
   ルバミル−３−（ジイソプロピルアミノ）−１−（２−
   ピリジル）プロピル〕フェニル）−６−カルバミルフル
   オレセインより成る群から選ばれた化合物。 ２、ｐ−アミノジソピラミド又はｍ−アミノジソピラミ
   ドとフルオレセイン誘導体との反応の生成物である特許
   請求の範囲第１項記載の化合物。 ３、フルオレセインの誘導体が、５−〔（４，６−ジク
   ロロトリアジン−２−イル）−アミノ〕−フルオレセイ
   ン、６−〔（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）
   −アミノ〕−フルオレセイン、５−〔（４−クロロ−６
   −メトキシトリアジン−２−イル）−アミノ〕−フルオ
   レセイン、６−〔（４−クロロ−６−メトキシトリアジ
   ン−２−イル）−アミノ〕フルオレセイン及び６−カル
   ボキシフルオレセインより成る群から選ばれたものであ
   る特許請求の範囲第２項記載の生成物。 ４、ｐ−アミノジソピラミド又はｍ−アミノジソピラミ
   ドと蛋白質との反応の生成物。 ５、Ｐ−アミノジソピラミド又はｍ−アミノジソピラミ
   ドを、５−〔（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル
   ）アミノ〕フルオレセン、６−〔（４，６−ジクロトリ
   アジン−２−イル）アミノ〕フルオレセイン、５−〔（
   ４−クロロ−６−メトキシトリアジン−２−イル）アミ
   ノ〕フルオレセイン、６−〔（４−クロロ−６−メトキ
   シトリアジン−２−イル）アミノ〕フルオレセイン及び
   ６−カルボキシフルオレセインより成る群から選ばれた
   化合物とを反応させることを特徴とするＮ−４−クロロ
   −６−（ｐ−〔１−カルバミル−３−（ジイソプロピル
   アミノ）−１−（２−ピリジル）プロピル〕アニリノ）
   トリアジン−２−イル−５−アミノフルオレセイン、Ｎ
   −４−クロロ−６−（ｐ−〔１−カルバミル−３−（ジ
   イソプロピルアミノ）−１−（２−ピリジル）プロピル
   〕アニリノ）トリアジン−２−イル−６−アミノフルオ
   レセイン、Ｎ−４メトキシ−６−（ｐ−〔１−カルバミ
   ル−３−（ジイソプロピルアミノ）−１−（２−ピリジ
   ル）プロピル〕アリニノ）トリアジン−２−イル−５−
   アミノフルオレセイン、Ｎ−４メトキシ−６−（ｐ−〔
   １−カルバミル−３−（ジイソプロピルアミノ）−１−
   （２−ピリジル）プロピル〕アニリノ）トリアジン−２
   −イル−６−アミノフルオレセイン、Ｎ−（ｐ−〔１−
   カルバミル−３−（ジイソプロピルアミノ）−１−（２
   −ピリジル）プロピル〕フェニル）−６−カルバミルフ
   ルオレセイン、Ｎ−４−クロロ−６−（ｍ−〔１−カル
   バミル−３−（ジイソプロピルアミノ）−１−（２−ピ
   リジル）プロピル〕アニリノ）トリアジン−２−イル−
   ５−アミノフルオレセイン、Ｎ−４−クロロ−６−（ｍ
   −〔１−カルバミル−３−（ジイソプロピルアミノ）−
   １−（２−ピリジル）プロピル〕アニリノ）トリアジン
   −２−イル−６−アミノフルオレセイン、Ｎ−４メトキ
   シ−６−（ｍ−〔１−カルバミル−３−（ジイソプロピ
   ルアミノ）−１−（２−ピリジル）プロピル〕アニリノ
   ）トリアジン−２−イル−５−アミノフルオレセイン、
   Ｎ−４−メトキシ−６−（ｍ−〔１−カルバミル−３−
   （ジイソプロピルアミノ）−１−（２−ピリジル）プロ
   ピル〕アニリノ）トリアジン−２−イル−６−アミノフ
   ルオレセイン、Ｎ−（ｍ−〔１−カルバミル−３−（ジ
   イソプロピルアミノ）−１−（２−ピリジル）プロピル
   〕フェニル）−６−カルバミルフルオレセインより成る
   群から選ばれた化合物の製造方法。 ６、試料中のジソピラミドの濃度を測定する方法に於て
   、（ａ）試料をｐ−又はｍ−アミノジソピラミド抗血清
   と接触させ； （ｂ）得られた溶液をｐ−又はｍ−アミノジソピラミド
   抗血清の存在に対して測定可能な螢光偏光応答を生じさ
   せ且つ均質な試験溶液を形成させ得るフルオレセイン−
   ｐ−又はｍ−アミノジソピラミド誘導体と接触させ；（
   ｃ）均質な試験溶液に平面偏光を通して螢光偏光応答を
   得； （ｄ）測定された螢光偏光応答を標準試料について得ら
   れたものと比較して、試料中のジソピラミドの濃度を求
   めることを特徴とするジソピラミド濃度の測定方法。 ７、フルオレセイン−ｐ−又はｍ−アミノジソピラミド
   誘導体が、Ｎ−４−クロロ−６−（ｐ−〔１−カルバミ
   ル−３−（ジイソプロピルアミノ）−１−（２−ピリジ
   ル）フロピル〕アニリノ）トリアジン−２−イル−５−
   アミノフルオレセイン；Ｎ−４−クロロ−６−（ｐ−（
   １−カルバミル−３−（ジイソプロピルアミノ）−１−
   （２−ピリジル）プロピル〕アニリノ）トリアジン−２
   −イル−６−アミノフルオレセイン；Ｎ−４−メトキシ
   −６−（ｐ−〔１−カルバミル−３−（ジイソプロピル
   アミノ）−１−（２−ピリジル）プロピル〕アニリノ）
   トリアジン−２−イル−５−アミノフルオレセイン；Ｎ
   −４−メトキシ−６−（ｐ−〔１−カルバミル−３−（
   ジイソプロピルアミノ）−１−（２−ピリジル）プロピ
   ル〕アニリノ）トリアジン−２−イル−６−アミノフル
   オレセイン；及びＮ−（ｐ−〔１−カルバミル−３−（
   ジイソプロピルアミノ）−１−（２−ピリジノ）プロピ
   ル〕フェニル）−６−カルバミルフルオレセインより成
   る群から選ばれたものである特許請求の範囲第６項記載
   の方法。