CN111721931A - 一种固相时间分辨荧光免疫标记物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种固相时间分辨荧光免疫标记物及其制备方法和应用，所述固相时间分辨荧光免疫标记物包括蛋白质标记的β‑二酮体类螯合剂、稀土金属离子和生物特异性结合反应物。该固相时间分辨荧光免疫标记物无需加入增强液或生物素‑亲和素体系进行信号放大，即可直接参与免疫反应并可直接用于检测，操作简单，用时短，具有可重复性，克服了现有技术中时间分辨分析法需添加增强液导致污染、操作繁琐、反应时间长、且标记物生产一致性差的问题。且该标记物可于4℃下保存，或通过冻干工艺，制成粉状，于常温干燥条件下稳定保存。

Description

一种固相时间分辨荧光免疫标记物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于体外诊断技术领域，具体涉及一种固相时间分辨荧光免疫标记物及其制备方法和应用，尤其涉及一种灵敏度高、准确度高、生产一致性好、操作简便、风险小的固相时间分辨荧光免疫标记物及其制备方法和应用。
背景技术
时间分辨荧光免疫分析(Time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA)技术是一种新型的以镧系稀土元素络合物作为标记物，测量其发射荧光强度的体外超微量分析技术。由于时间分辨荧光免疫分析法相对于其他放射免疫分析法来说，具有更高的灵敏度和准确度，近年来该技术在临床检测、生命科学、医学等研究领域中的应用越来越广泛，已成为一种极具发展前景的分析手段。
TRFIA利用具有独特荧光特性的三价稀土元素离子及其络合物作为示踪物，得益于稀土络合物荧光寿命长、激发光谱带宽、发射光谱窄及Stokes位移大等荧光特性。稀土元素作为金属离子，不能直接与抗原抗体结合，因此在标记过程中需使用具有双功能基团的络合配体，实现与稀土元素离子形成配位，同时在不影响荧光强度的前提下与生物分子共价结合。TRFIA技术在30多年的演化和发展过程中，国内外学者对荧光稀土络合配体进行了大量研究，如多氨基多羧基类络合物、芳香羧酸类络合物及β-二酮体类络合物等。
CN105911041A公开了一种时间分辨荧光检测方法，把特异反应体系的一株生物原料包被在磁珠上，将包被生物原料的磁珠与被测样本反应，清洗后加入另一株已标记β-二酮类稀土配合物的特异性生物原料，发生免疫反应，使磁珠、被测样本和荧光示踪物形成复合物，清洗后再加入荧光增强物，最后用时间分辨荧光仪检测，获得被测样本的浓度等信息。
CN106053783A公开了一种适用于结核感染T细胞检测的快速时间分辨荧光免疫分析试剂盒，本发明的试剂盒采用了γ-干扰素体外释放法，联合采用了生物素亲和素法，双抗体夹心时间分辨荧光免疫法，实验方法简单快速，可自动化操作，检测系统为开放式操作系统。
目前TRFIA可分为均相分析法和固相分析法，前者需要使稀土金属离子从络合物中解离下来，与增强液中的增效剂形成新的可产生荧光的络合物，用于仪器测量。但是由于增强液中存在过量的β-NTA，使其极其容易被环境中的稀土金属离子污染，造成背景信号的升高，操作及保存都需非常小心。后者应用FIAgen系统，利用4,7-二氯磺基苯-1,10-二氮杂菲-2,9-二羧酸螯合剂(BCPDA)螯合稀土金属离子经紫外光激发，发出荧光信号。该体系在生物素-亲和素体系信号放大的基础上，有效弥补了BCPDA检测灵敏度的不足(10-11mol/L)。但该体系需进行两步或多步反应，反应过程长，且试剂组成复杂。后者还可直接使用生物特异性结合反应物与β-二酮体类螯合剂结合的标记物，但该种标记物一致性较差，灵敏度差，仅可在-20℃保存，使用过程繁琐。
因此，开发一种操作简便，灵敏度高且风险小的固相标记物是非常有意义的。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种固相时间分辨荧光免疫标记物及其制备方法和应用，尤其提供一种灵敏度高、准确度高、生产一致性好、操作简便、风险小的固相时间分辨荧光免疫标记物及其制备方法和应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种固相时间分辨荧光免疫标记物，所述固相时间分辨荧光免疫标记物包括蛋白质标记的β-二酮体类螯合剂、稀土金属离子和生物特异性结合反应物。
本发明所涉及的固相时间分辨荧光免疫标记物中创造性地用蛋白质对β-二酮体类螯合剂进行标记，再应用偶联剂使生物特异性结合反应物与其结合，成为偶联复合物，最后加入稀土金属离子与β-二酮体类螯合剂稳定结合。因β-二酮体类螯合剂被蛋白质标记使其具备水可溶性性质，进而与稀土金属离子的结合率和稳定性显著提高，无需加入增强液或生物素-亲和素体系进行信号放大，该标记物即可直接参与免疫反应并可直接用于检测，操作简单，用时短，具有可重复性，克服了现有技术中时间分辨分析法需添加增强液导致污染、操作繁琐、反应时间长、且标记物生产一致性差的问题。且该标记物可于4℃下保存，或通过冻干工艺，制成粉状，于常温干燥条件下稳定保存。
优选地，所述蛋白质标记的β-二酮体类螯合剂与稀土金属离子通过螯合作用结合，所述生物特异性结合反应物与β-二酮体类螯合剂上标记的蛋白质通过交联作用结合，蛋白质与β-二酮体类螯合剂通过酰胺键连接。
优选地，所述蛋白质包括酪蛋白、小牛血清蛋白、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶或苹果脱酸氢酶。
优选地，所述β-二酮体类螯合剂包括BCOT、BCDOT、BHHCT、BTBCT或BCTOT。
优选地，所述稀土金属离子为三价稀土金属离子，例如铕(Eu)离子、钐(Sm)离子、铽(Tb)离子、镝(Dy)离子等。
优选地，所述生物特异性结合反应物包括抗体、抗原、半抗原或链霉亲和素。
优选地，所述蛋白质与β-二酮体类螯合剂的摩尔比为1:10-1:300，例如1:10、1:50、1:100、1:150、1:200、1:250或1:300等，上述数值范围内的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。优选1:(30-150)。
优选地，所述β-二酮体类螯合剂上的标记蛋白质与生物特异性结合反应物的摩尔比为1:10-10:1，例如1:10、1:5、1:1、5:1或10:1等，上述数值范围内的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述β-二酮体类螯合剂与稀土金属离子的摩尔比为1:10-10:1，例如1:10、1:5、1:1、5:1或10:1等，上述数值范围内的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
本发明所涉及的标记物中蛋白质、β-二酮体类螯合剂、生物特异性结合反应物和稀土金属离子之间的摩尔配比是特定选择的，在上述摩尔配比范围内，才能使标记效率最大化，在β-二酮体类螯合剂一定的情况下，若蛋白质的含量过高会标记物荧光信号值过低，若蛋白质的含量过低会蛋白质变性；若生物特异性结合反应物的含量过高会造成标记物非特异性结合概率升高，若生物特异性结合反应物的含量过低会造成标记物特异性结合亲和度降低；若稀土金属离子的含量过高会造成蛋白质及生物特异性结合反应物变性，若稀土金属离子的含量过低会造成标记物荧光信号值偏低。
第二方面，本发明提供一种如上所述的固相时间分辨荧光免疫标记物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将蛋白质与β-二酮体类螯合剂混合反应，得到结合物A；
(2)使用交联剂a活化结合物A，得到待结合物A；使用交联剂b活化生物特异性结合反应物，得到待结合物B；
(3)将待结合物A和待结合物B进行交联反应，得到交联物C；
(4)将交联物C与稀土金属盐混合，得到所述固相时间分辨荧光免疫标记物。
本发明所涉及的固相时间分辨荧光免疫标记物的制备方法简单易操作，适用于工业化生产。
优选地，步骤(1)所述蛋白质与β-二酮体类螯合剂的质量比为1:10-1:300，例如1:10、1:50、1:100、1:150、1:200、1:250或1:300等，上述数值范围内的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。优选1:(30-150)。
上述蛋白质与β-二酮体类螯合剂的摩尔比特定选择为1:10-1:300的范围，因为摩尔比过高会标记效率低，过低会导致蛋白质变性，其中1:30-1:150是效果最佳的范围。
优选地，步骤(1)所述混合前将蛋白质溶解于缓冲液中，浓度为0.02-1％，例如0.02％、0.05％、0.07％、0.1％、0.2％、0.5％、0.6％、0.8％、0.9％或1％等，上述数值范围内的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述缓冲液包括碳酸缓冲液，浓度为0.01-0.5M，例如0.01M、0.02M、0.05M、0.1M、0.2M、0.3M或0.5M等，pH值为7-9，例如pH＝7、pH＝8或pH＝9等，上述数值范围内的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，步骤(1)所述混合前将β-二酮体类螯合剂溶解于有机溶剂中，浓度为0.02-1％，例如0.02％、0.05％、0.07％、0.1％、0.2％、0.5％、0.6％、0.8％、0.9％或1％等，上述数值范围内的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述溶剂包括无水乙醇、无水甲醇、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺或苯乙烯中的任意一种或至少两种的组合；所述至少两种的组合例如无水乙醇与二甲基亚砜的组合等，其他任意的组合方式均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，步骤(1)所述反应的温度为4-50℃，例如4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、37℃或45℃等，时间为0.5-2h，例如0.5h、1h、1.5h或2h等，上述数值范围内的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，步骤(2)所述交联剂a包括羟基琥珀酰亚胺交联剂。
优选地，所述羟基琥珀酰亚胺交联剂包括3-马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯、琥珀酸辛二酸戊二酸盐、琥珀酸辛二酸二亚胺或琥珀酰亚胺4-[P-苯基马来酰亚胺]-丁酸。
优选地，所述结合物A与交联剂a的摩尔比为1:(50-5000)，例如1:50、1:100、1:200、1:500、1:800、1:1000、1:2000、1:3000、1:4000或1:5000等，上述数值范围内的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述，优选1:(50-500)。
上述结合物A与交联剂a的摩尔比特定选择为1:(50-5000)，因为超过此范围会使结合物A不稳定，小于此范围会无法充分活化结合物A，其中1:(50-500)是效果最佳的范围。
优选地，所述交联剂a活化结合物A的温度为4-37℃，例如4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃或37℃等，时间为0.5-2h，例如0.5h、1h、1.5h或2h等，上述数值范围内的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
因蛋白在高温条件下不稳定，因此反应温度通常在4-37℃。
优选地，步骤(2)所述交联剂b包括巯基交联剂。
优选地，所述巯基交联剂包括二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦或乙醇胺。
优选地，所述生物特异性结合反应物与交联剂b的摩尔比为1:(50-5000)，例如1:50、1:100、1:200、1:500、1:800、1:1000、1:2000、1:3000、1:4000或1:5000等，上述数值范围内的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述，优选1:(50-500)。
上述生物特异性结合反应物与交联剂b的摩尔比特定选择为1:(50-5000)，因为超过此范围会使结合物B不稳定，小于此范围会无法充分活化结合物B，其中1:(50-500)是效果最佳的范围。
优选地，所述交联剂b活化生物特异性结合反应物的温度为4-37℃，例如4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃或37℃等，时间为0.5-2h，例如0.5h、1h、1.5h或2h等，上述数值范围内的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，步骤(3)所述交联反应的温度为4-37℃，例如4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃或37℃等，时间为5-300min，例如5min、10min、100min、150min、200min、250min或300min等，上述数值范围内的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述，优选10-200min。
优选地，步骤(3)所述进行交联反应前，将待结合物A和待结合物B进行纯化。
优选地，所述纯化的方式包括超滤纯化、脱盐纯化或透析纯化。
优选地，步骤(4)所述混合前将稀土金属盐溶解于缓冲液中，浓度为0.02-5mg/mL，例如0.02mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL或5mg/mL等，上述数值范围内的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述，优选1-3mg/mL。
优选地，所述缓冲液包括Tris缓冲液，浓度为0.05-0.5M，例如0.05M、0.1M、0.2M、0.3M或0.5M等，pH值为7-9，例如pH＝7、pH＝8或pH＝9等，上述数值范围内的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，步骤(4)所述混合的温度为4-37℃，例如4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃或37℃等，时间为5-300min，例如5min、10min、100min、150min、200min、250min或300min等，上述数值范围内的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
第三方面，本发明提供一种如上所述的固相时间分辨荧光免疫标记物在制备诊断用试剂或诊断用试剂盒中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明所涉及的固相时间分辨荧光免疫标记物中创造性地用蛋白质对β-二酮体类螯合剂进行标记，再应用偶联剂使生物特异性结合反应物与其结合，成为偶联复合物，最后加入稀土金属离子与β-二酮体类螯合剂稳定结合。因β-二酮体类螯合剂被蛋白质标记使其具备水可溶性性质，再与生物特异性结合反应物交联，最后螯合稀土金属离子，使最终标记物的结合率和稳定性显著提高，无需加入增强液或生物素-亲和素体系进行信号放大，该标记物即可直接参与免疫反应并可直接用于检测，操作简单，用时短，具有可重复性，克服了现有技术中时间分辨分析法需添加增强液导致污染、操作繁琐、反应时间长、且标记物生产一致性差的问题。且该标记物可于4℃下保存，或通过冻干工艺，制成粉状，于常温干燥条件下稳定保存。
附图说明
图1是实施例1制备得到的固相时间分辨荧光免疫标记物检测50例罗氏临床样本的线性拟合图；
图2是实施例2制备得到的固相时间分辨荧光免疫标记物检测50例罗氏临床样本的线性拟合图；
图3是实施例3制备得到的固相时间分辨荧光免疫标记物检测50例罗氏临床样本的线性拟合图；
图4是实施例4制备得到的固相时间分辨荧光免疫标记物检测50例罗氏临床样本的线性拟合图；
图5是实施例5制备得到的固相时间分辨荧光免疫标记物检测50例罗氏临床样本的线性拟合图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
本实施例提供一种固相时间分辨荧光免疫标记物，其制备方法如下：
(1)称取酪蛋白使用缓冲液(碳酸缓冲液，0.3M，pH＝8)溶解，浓度为0.5％，再称取BCOT(β-二酮体类螯合剂)使用无水乙醇溶解，浓度为0.5％；以酪蛋白与BCOT的摩尔比为1:100、，将上述两种溶液混匀后，在37℃下震荡反应1h，再使用5mL 7K的脱盐柱(Millipore公司)进行纯化，得到结合物A。
(2)在缓冲液环境(磷酸盐冲液，0.2M，pH＝7)中加入PCT抗体(降钙素原抗体)与巯基交联剂二硫苏糖醇(溶解于超纯水，浓度为0.5mg/mL)，以PCT抗体与二硫苏糖醇的摩尔比为1:200在37℃下进行活化反应1h，再使用15mL 30KD截留分子量的超滤管(Millipore公司)以磷酸盐冲液(0.2M，pH＝7)作为换液缓冲液，超滤3遍，除去多余的二硫苏糖醇以及反应副产物，得到待结合物B。
(3)在缓冲液环境(磷酸盐冲液，0.2M，pH＝7)中加入结合物A与交联剂3-马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯(溶解于二甲基亚砜，浓度为0.5mg/mL)，以结合物A与交联剂的摩尔比为1:200，在37℃下进行活化反应1h，再使用15mL30KD截留分子量的超滤管(Millipore公司)以磷酸盐冲液(0.2M，pH＝7)作为换液缓冲液，超滤3遍，除去多余的3-马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯以及反应副产物，得到待结合物A。
(4)将上述得到的待结合物B和待结合物A混合在37℃下进行交联反应150min，其中待结合物B和待结合物A的摩尔比为1:20，使用Protein G亲和柱(GE公司)纯化反应物，得到交联物C。
(5)将氯化铕用缓冲液(Tris缓冲液，0.3M，pH＝8)稀释，浓度为2mg/mL，再与交联物C混合在37℃下反应30min，其中氯化铕与交联物C的摩尔比为200:1，得到PCT固相时间分辨标记物。
实施例2
本实施例提供一种固相时间分辨荧光免疫标记物，其制备方法如下：
(1)称取小牛血清蛋白使用缓冲液(碳酸缓冲液，0.2M，pH＝8)溶解，浓度为0.2％，再称取BCDOT使用二甲基亚砜溶解，浓度为0.5％；以小牛血清蛋白与BCDOT的摩尔比为1:80，将上述两种溶液混匀后，在37℃下震荡反应0.5h，再使用5mL 7K的脱盐柱(Millipore公司)进行分离纯化，得到结合物A。
(2)在缓冲液环境(磷酸盐冲液，0.2M，pH＝7)中加入PCT抗体(降钙素原抗体)与三(2-羧乙基)膦(溶解于超纯水，浓度为0.5mg/mL)，以PCT抗体与三(2-羧乙基)膦的摩尔比为1:150在37℃下进行活化反应1h，再使用15mL30KD截留分子量的超滤管(Millipore公司)以磷酸盐冲液(0.2M，pH＝7)作为换液缓冲液，超滤3遍，除去多余的三(2-羧乙基)膦以及反应副产物，得到待结合物B。
(3)在缓冲液环境(磷酸盐冲液，0.2M，pH＝7)中加入结合物A与4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(溶解于超纯水，浓度为0.5mg/mL)，以结合物A与4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐的摩尔比为1:200，在37℃下进行活化反应1h，再使用15mL 30KD截留分子量的超滤管(Millipore公司)以磷酸盐冲液(0.2M，pH＝7)作为换液缓冲液，超滤3遍，除去多余的4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐以及反应副产物，得到待结合物A。
(4)将上述得到的待结合物B和待结合物A混合在37℃下进行交联反应300min，其中待结合物B和待结合物A的摩尔比为1:10，使用Protein G亲和柱(GE公司)纯化反应物，得到交联物C。
(5)将氯化铕用缓冲液(Tris缓冲液，0.3M，pH＝8)稀释，浓度为1mg/mL，再与交联物C混合在37℃下反应60min，其中氯化铕与交联物C的摩尔比为200:1，得到PCT固相时间分辨标记物。
实施例3
本实施例提供一种固相时间分辨荧光免疫标记物，其制备方法如下：
(1)称取β-半乳糖苷酶使用缓冲液(碳酸缓冲液，0.2M，pH＝8)溶解，浓度为0.5％，再称取BTBCT使用二甲基亚砜溶解，浓度为1％；以β-半乳糖苷酶与BTBCT的摩尔比为1:120，将上述两种溶液混匀后，在37℃下震荡反应2h，再使用5mL 7K的脱盐柱(Millipore公司)进行分离纯化，得到结合物A。
(2)在缓冲液环境(磷酸盐冲液，0.2M，pH＝7)中加入PCT抗体(降钙素原抗体)与乙醇胺(溶解于超纯水，浓度为0.5mg/mL)，以PCT抗体与乙醇胺的摩尔比为1:150在37℃下进行活化反应1h，再使用15mL 30KD截留分子量的超滤管(Millipore公司)以磷酸盐冲液(0.2M，pH＝7)作为换液缓冲液，超滤3遍，除去多余的乙醇胺以及反应副产物，得到待结合物B。
(3)在缓冲液环境(磷酸盐冲液，0.2M，pH＝7)中加入结合物A与琥珀酸辛二酸二亚胺(溶解于N,N-二甲基甲酰胺，浓度为0.5mg/mL)，以结合物A与琥珀酸辛二酸二亚胺的摩尔比为1:150，在37℃下进行活化反应1h，再使用15mL 30KD截留分子量的超滤管(Millipore公司)以磷酸盐冲液(0.2M，pH＝7)作为换液缓冲液，超滤3遍，除去多余的琥珀酸辛二酸二亚胺以及反应副产物，得到待结合物A。
(4)将上述得到的待结合物B和待结合物A混合在25℃下进行交联反应120min，其中待结合物B和待结合物A的摩尔比为1：5，使用Protein G亲和柱(GE公司)纯化反应物，得到交联物C。
(5)将氯化铕用缓冲液(Tris缓冲液，0.3M，pH＝8)稀释，浓度为1mg/mL，再与交联物C混合在25℃下反应120min，其中氯化铕与交联物C的摩尔比为100:1，得到PCT固相时间分辨标记物。
实施例4
本实施例提供一种固相时间分辨荧光免疫标记物，其制备方法与实施例1的区别仅在于：步骤(1)中酪蛋白与β-二酮体类螯合剂的摩尔比为1:150，其他条件均保持一致。
实施例5
本实施例提供一种固相时间分辨荧光免疫标记物，其制备方法与实施例1的区别仅在于：步骤(1)中酪蛋白与β-二酮体类螯合剂的质量比为1:10，其他条件均保持一致。
应用例1
利用实施例1-5制备得到的固相时间分辨荧光免疫标记物用于检测50例罗氏临床样本，操作如下：
(1)使用移液器分别将各组PCT固相时间分辨标记物、样本依次加入PCT包被的反应孔中，每孔50μL PCT固相时间分辨标记物溶液(浓度为2μg/mL)，每孔50μL样本，在37℃下震荡10min；
(2)使用多通道洗板机清洗步骤(1)的PCT包被反应孔，清洗次数为5次，将清洗后的PCT包被反应孔转移至酶标检测仪进行检测，检测参数为330nm激发光，延时150μsec检测。
(Ⅰ)线性相关性评价：
以样本的罗氏值为横坐标，检测信号值为纵坐标作图，检测50例PCT样本，并进行拟合。
实施例1的结果如图1所示，拟合方程为：y＝121863x+88019，R2＝0.9925，表明检测相关性很好。
实施例2的结果如图2所示，拟合方程为：y＝71829x+88055，R2＝0.9881，表明检测相关性好。
实施例3的结果如图3所示，拟合方程为：y＝69406x+53543，R2＝0.984，表明检测相关性好。
实施例4的结果如图4所示，拟合方程为：y＝48102x+6286.5，R2＝0.9884，表明检测相关性较好。
实施例5的结果如图5所示，拟合方程为：y＝26623x+30564，R2＝0.9693，表明检测相关性较好。
(Ⅱ)各实施例标记物的最低检出限(LoD)如表1所示：本发明所涉及的固相时间分辨荧光免疫标记物的检出限较低，比较实施例1、4、5的检出限值可知，实施例1仅为0.016ng/mL，实施例4和5的检出限稍高，说明酪蛋白与β-二酮体类螯合剂的质量比会影响标记物的检出限。
表1
标记物 检出限(ng/mL)
实施例1 0.016
实施例2 0.022
实施例3 0.025
实施例4 0.045
实施例5 0.057
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种固相时间分辨荧光免疫标记物及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (10)

1.一种固相时间分辨荧光免疫标记物，其特征在于，所述固相时间分辨荧光免疫标记物包括蛋白质标记的β-二酮体类螯合剂、稀土金属离子和生物特异性结合反应物。
2.如权利要求1所述的固相时间分辨荧光免疫标记物，其特征在于，所述蛋白质标记的β-二酮体类螯合剂与稀土金属离子通过螯合作用结合，所述和β-二酮体类螯合剂标记的蛋白质与生物特异性结合反应物通过交联作用结合。
3.如权利要求1或2所述的固相时间分辨荧光免疫标记物，其特征在于，所述蛋白质包括酪蛋白、小牛血清蛋白、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶或苹果脱酸氢酶；
优选地，所述β-二酮体类螯合剂包括BCOT、BCDOT、BHHCT、BTBCT或BCTOT；
优选地，所述稀土金属离子为三价稀土金属离子；
优选地，所述生物特异性结合反应物包括抗体、抗原、半抗原或链霉亲和素。
4.如权利要求1-3中任一项所述的固相时间分辨荧光免疫标记物，其特征在于，所述蛋白质与β-二酮体类螯合剂的摩尔比为1:10-1:300，优选1:30-1:150；
优选地，所述β-二酮体类螯合剂上的标记蛋白质与生物特异性结合反应物的摩尔比为1:10-10:1；
优选地，所述β-二酮体类螯合剂与稀土金属离子的摩尔比为1:10-10:1。
5.如权利要求1-4中任一项所述的固相时间分辨荧光免疫标记物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将蛋白质与β-二酮体类螯合剂混合反应，得到结合物A；
(2)使用交联剂a活化结合物A，得到待结合物A；使用交联剂b活化生物特异性结合反应物，得到待结合物B；
(3)将待结合物A和待结合物B进行交联反应，得到交联物C；
(4)将交联物C与稀土金属盐混合，得到所述固相时间分辨荧光免疫标记物。
6.如权利要求5所述的固相时间分辨荧光免疫标记物的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述蛋白质与β-二酮体类螯合剂的摩尔比为1:10-1:300，优选1:30-1:150；
优选地，步骤(1)所述混合前将蛋白质溶解于缓冲液中，浓度为0.02-1％；
优选地，所述缓冲液包括碳酸缓冲液，浓度为0.01-0.5M，pH值为9-11；
优选地，步骤(1)所述混合前将β-二酮体类螯合剂溶解于有机溶剂中，浓度为0.02-1％；
优选地，所述溶剂包括无水乙醇、无水甲醇、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺或苯乙烯中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，步骤(1)所述反应的温度为4-50℃，时间为0.5-2h。
7.如权利要求5或6所述的固相时间分辨荧光免疫标记物的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述交联剂a包括羟基琥珀酰亚胺交联剂；
优选地，所述羟基琥珀酰亚胺交联剂包括3-马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯、琥珀酸辛二酸戊二酸盐、琥珀酸辛二酸二亚胺或琥珀酰亚胺4-[P-苯基马来酰亚胺]-丁酸；
优选地，步骤(2)所述结合物A与交联剂a的摩尔比为1:(50-5000)，优选1:(50-500)；
优选地，步骤(2)所述交联剂a活化结合物A的温度为4-37℃，时间为0.5-2h；
优选地，步骤(2)所述交联剂b包括巯基交联剂；
优选地，所述巯基交联剂包括二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦或乙醇胺；
优选地，步骤(2)所述生物特异性结合反应物与交联剂b的摩尔比为1:(50-5000)，优选1:(50-500)；
优选地，步骤(2)所述交联剂b活化生物特异性结合反应物的温度为4-37℃，时间为0.5-2h。
8.如权利要求5-7中任一项所述的固相时间分辨荧光免疫标记物的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述交联反应的温度为4-50℃，时间为5-300min，优选10-200min；
优选地，步骤(3)所述进行交联反应前，将待结合物A和待结合物B进行纯化；
优选地，所述纯化的方式包括超滤纯化、脱盐纯化或透析纯化。
9.如权利要求5-8中任一项所述的固相时间分辨荧光免疫标记物的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述混合前将稀土金属盐溶解于缓冲液中，浓度为0.02-5mg/mL，优选1-3mg/mL；
优选地，所述缓冲液包括Tris缓冲液，浓度为0.05-0.5M，pH值为7-9；
优选地，步骤(4)所述混合的温度为4-37℃，时间为5-500min。
10.如权利要求1-4中任一项所述的固相时间分辨荧光免疫标记物在制备诊断用试剂或诊断用试剂盒中的应用。
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