CN103645330A

CN103645330A - 检测尿液中纤维连接蛋白浓度的试剂盒及其制备方法

Info

Publication number: CN103645330A
Application number: CN201310724374.3A
Authority: CN
Inventors: 朱晓敏; 刘颖成; 刘颖冰; 杨杰
Original assignee: SHANGHAI BEIJIA BIOCHEMICAL REAGENT CO Ltd
Current assignee: SHANGHAI BEIJIA BIOCHEMICAL REAGENT CO Ltd
Priority date: 2013-12-24
Filing date: 2013-12-24
Publication date: 2014-03-19

Abstract

本发明公开了一种检测尿液中纤维连接蛋白浓度的试剂盒，包括酶标记的纤维连接蛋白的抗体或者酶标记的纤维连接蛋白的单克隆抗体或者酶标记的纤维连接蛋白的多克隆抗体；包被有纤维连接蛋白的抗体或者纤维连接蛋白的单克隆抗体或者纤维连接蛋白的多克隆抗体的载体；纤维连接蛋白校准品；化学发光底物和洗涤液。还提供了上述试剂盒的制备方法。本发明的试剂盒具有高特异性、高灵敏度、高精确性、高准确性、简便快速等优点，并且使用成本低，更易推广应用。

Description

检测尿液中纤维连接蛋白浓度的试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明属于免疫分析及生物医学领域，尤其涉及一种检测试剂盒及其制备方法，特别是一种采用化学发光免疫分析法检测尿液中纤维连接蛋白又称纤维结合蛋白（FN）浓度的试剂盒及其制备方法。

背景技术

纤维连接蛋白又称纤维结合蛋白（Fibronectin，简称FN），有两条相类似的多肽链亚基组成，亚基的分子量为220-250KD。现有技术中采用免疫扩散法和ELISA双抗体夹心技术测定尿液中纤维连接蛋白（FN）浓度，其缺点为操作繁琐、工作强度大、保持时间长，一般需8-48小时、其定量的精确度差。

因尿液中纤维连接蛋白（FN）的浓度低，所以国内外至今未见有用试剂盒及方法的报导。本发明申请的测定尿液中纤维连接蛋白（FN）浓度的试剂盒及方法可用于泌尿系统的肿瘤早期筛查。

化学发光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay,CLIA)于1977年问世，1985年第一代化学发光免疫分析试剂盒研制成功并投放市场。进入九十年代，化学发光免疫分析试剂盒的研制和自动化测量仪的生产取得了突破性进展，从而进入高速发展阶段。化学发光免疫分析是继荧光、放射性同位素和酶免疫分析之后发展起来的一项新的免疫分析技术，根据大量的实验结果及临床应用资料，从实用性、稳定性、准确性及发展前景来看，在非放射性标记分析技术中化学发光免疫分析处于领先地位，它不仅具有免疫反应的特异性，而且具有高灵敏性和稳定性。

化学发光免疫分析技术具有灵敏度高、快速、准确、重复性好、效期长并安全无毒无污染等优点，成为取代放射免疫分析和酶免疫分析技术的首选。

发明内容

针对现有技术中存在的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种检测尿液中纤维连接蛋白浓度的试剂盒及其制备方法，本发明将化学发光技术与纤维连接蛋白（FN）的免疫分析学有效地结合，提供了一种高特异性、高灵敏度、高精确性、高准确性、简便快速地检测尿液中纤维连接蛋白（FN）的浓度的试剂盒，该试剂盒适于在产业上能有效地推广应用。

本发明一种检测尿液中纤维连接蛋白浓度的试剂盒，包括：酶标记的纤维连接蛋白（FN）的抗体或者酶标记的纤维连接蛋白（FN）的单克隆抗体或者酶标记的纤维连接蛋白（FN）的多克隆抗体；包被有纤维连接蛋白（FN）的抗体或者纤维连接蛋白（FN）的单克隆抗体或者纤维连接蛋白（FN）的多克隆抗体的载体；纤维连接蛋白（FN）校准品；化学发光底物和洗涤液。

进一步的，所述载体为聚苯乙烯微孔板、聚苯乙烯珠或管或磁性颗粒。

进一步的，所述的洗涤液为1,2-二氧乙烷类衍生物，所述的1,2-二氧乙烷类衍生物为（金刚烷）-1，2_二氧乙烷、或者3-(2'-螺旋金刚烷)-4_甲氧基-4-(3'-磷酰氧基）苯基-1，2-二氧乙烷、精制的二磷酸胞苷（CDP-Star）。

进一步的，所述化学发光底物为包含有缓冲液，每升缓冲液中含有24gTris、160gNaCl、4g KC1、15mL HCl、lml Proclin300和200ml的3-（2'-螺旋金刚烷）-4-曱氧基-4-（3'-磷酰氧基）苯基-1，2-二氧乙烷，余量为双蒸水。

本发明还提供了上述试剂盒的制备方法，包括一个制备包被有纤维连接蛋白（FN）的抗体或者纤维连接蛋白（FN）的单克隆抗体或者纤维连接蛋白（FN）的多克隆抗体的载体的步骤，一个用碱性磷酸酶标记纤维连接蛋白（FN）的抗体或者纤维连接蛋白（FN）的单克隆抗体或者纤维连接蛋白（FN）的多克隆抗体的步骤；还包括一个以纤维连接蛋白（FN）纯品配制纤维连接蛋白（FN）校准品的步骤，一个配制洗涤液的步骤，一个配制化学发光底物的步骤，以及分装上述各组份并组装为成品的步骤。

进一步的，在一个制备包被有纤维连接蛋白（FN）的抗体或者纤维连接蛋白（FN）的单克隆抗体或者纤维连接蛋白（FN）的多克隆抗体的载体的步骤中，首先将纤维连接蛋白（FN）的抗体或者纤维连接蛋白（FN）的单克隆抗体或者纤维连接蛋白（FN）的多克隆抗体用0.05MpH为7.2的磷酸盐緩冲液配制成所需浓度（如10ug/ml）的包被液；然后进行包被，在包被的过程中采用生理盐水洗涤2-5次；最后使用pH值为7.0～7.5的磷酸盐封闭液进行封闭。

进一步的，在一个用碱性磷酸酶标记纤维连接蛋白（FN）的抗体或者纤维连接蛋白（FN）的单克隆抗体或者纤维连接蛋白（FN）的多克隆抗体的步骤中，所述的碱性磷酸酶标记是采用戊二醛法进行标记。

进一步的，所述的酶可以为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。

其中，所述纤维连接蛋白（FN）校准品为标准级，纯度不低于90%、抗体包被板为48或96孔的微孔板条、酶标记纤维连接蛋白（FN）为偶联碱性磷酸酶、化学发光底物液为AMPPD、浓缩洗涤液为Tris-HCl。

本发明的试剂盒可以准确地定量检测出人尿液中纤维连接蛋白（FN）的含量。它具有高特异性、高灵敏度、高精确性、高准确性、简便快速等优点。该尿纤维连接蛋白（FN）测定试剂盒（化学发光法）的各项指标均达到或超过透射（散射）比浊免疫分析法。并且，根据本发明的检测系统为开放式操作，简便快速，不需要昂贵的全自动化学发光测量仪，特别适合广大的中小医院推广使用，为临床诊断和科研工作提供一种非常有价值的检测手段。根据本发明的试剂盒，酶标记的纤维连接蛋白（FN）抗体与载体上包被的纤维连接蛋白（FN）抗体和被测样品的纤维连接蛋白（FN）抗原形成“双抗体夹心”结构，因此本发明采用的“双抗体夹心一步法”反应模式，既有效地利用了化学发光技术原理、又确保了检测的灵敏性。

本发明的试剂盒应用的是酶催化发光底物，通过检测发光底物产生的光信号代替酶联免疫分析中的显色底物，因而具有与透射（散射）比浊免疫分析法同等的特异性，而灵敏度大大提高，比现今的透射（散射）比浊免疫分析法分析灵敏度提高约10倍，可为临床诊断提供更为特异、快速、可靠的依据。

在本发明的研究过程中，本发明的发明人首先对所用的原材料进行了筛选实验和质量鉴定，包括标记抗体与包被抗体的活性、载体（如不透光的白色微孔板）的吸附性能和变异大小、ALP的活性、化学发光底物的发光强度及发光持续时间等。然后对包被方法进行了研究，用不同的包被緩冲液和保护液进行实验，选择出最适合的包被緩沖液和保护液，通过抗体不同包被浓度实验找到最佳的浓度条件。对于ALP的标记可以有不同的方法，通过反复探索和对比实验最终找到了简便、产率高、成本低、质量可靠的标记方法，并对不同的酶稀释液进行了长期的考察实验，配制出了能够使酶标记物长期保持活性稳定的稀释液。

本发明与已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明将化学发光技术与纤维连接蛋白（FN）的免疫分析学有效地结合，提供了一种高特异性、高灵敏度、高精确性、高准确性、简便快速地检测尿液中纤维连接蛋白（FN）的浓度的化学发光免疫分析定量测定试剂盒，本发明的试剂盒可应用于开放式的化学发光测量仪，使用成本低，更易推广应用。

附图说明

图1检测100例正常人尿液样本中纤维连接蛋白（FN）浓度（mg/L）。

图2是本试剂盒的线性范围实验结果。

具体实施方式

实施例1本发明的试剂盒的制备方法

一、酶标抗体制备

纤维连接蛋白（FN）抗体用戊二醛法与碱性磷酸酶偶联，对PBS充分透析，加等体积甘油，-2(TC以下保存。

酶标单抗稀释液配制称量12.12g的Tris,5g BSA和lml Proclin300,将上述试剂称量好放入洁净容器中，加双蒸水至1L，溶解混匀。

采用方阵法选择酶标抗体的工作浓度大于1:5000。

二、纤维连接蛋白（FN）校准品的制备

用纤维连接蛋白（FN）纯品配制，分装0、20、40、60、100mg/L共5瓶。

三、固相包被板的制备

(1)包被：称量2.20g的NaH₂P0₄·2H₂0，12.90g的Na₂HP0₄·12H₂0和9.0g的NaCl于1L的洁净容器中，加入1L的双蒸水溶解混匀后，PH为7.2,加入适量纤维连接蛋白（FN）抗体混匀，然后加入微孔板各孔中，每孔100ul,4℃24h。

(2)洗涤：用生理盐水洗三次。

(3)封闭称量0.2g的NaH₂P0₄·2H₂0,2.9g的Na₂HP0₄·12H₂0、l0gBSA、和lml Proclin300,将上述试剂称量好放入洁净容器中，加双蒸水至1L,溶解混匀，测定pH值为7.0。

每孔分别加入封闭液100ul,室温放置3小时。甩掉封闭液，在吸水纸上拍干。室温除湿干燥24小时。立即进行封袋。贴签后置2-8℃保存。

四、化学发光底物液

称量24g Tris、160g NaCl、4g KCl、15ml HC1、200ml3-(2'-螺旋金刚烷）-4-曱氧基-4-(3'-磷酰氧基）苯基-1，2-二氧乙烷和lml Proclin300,将上述试剂称量好放入洁净容器中，加双蒸水至1L，溶解混匀。

五、洗涤液

称量24g Tris,160g NaCl,4g KC1和15ml HC1于洁净容器中，加双蒸水至1L,溶解混匀，调整PH至7.4。

六、半成品及成品组成

上述步骤所得产品分装即为半成品。抽出三份经过特异性、精密性、灵敏度及稳定性检定合格才能组装成纤维连接蛋白（FN）定量测定试剂盒（化学发光法）。组装成试剂盒后还需抽检合格后才能出厂。

综上，本发明的发明人还对试剂盒的反应模式和反应条件进行了实验研究，最终确定了双抗体夹心一步法反应模式，并就不同的反应时间对实验结果的影响进行了实验，确定最适合的反应时间。通过对化学发光底物液发光持续时间的测定及不同发光时间对测定值的影响实验表明：在加入化学发光底物液后30-90分钟之间进行测量为最佳，其结果也较为准确。

实施例2～3本发明试剂盒的制备方法

除分别以聚苯乙烯珠、管作为载体、封闭液的pH值为7.5，其余均以与实施例1相同的方法制备纤维连接蛋白（FN）定量测定试剂盒。

实施例4本发明试剂盒的制备方法

除以磁性颗粒作为载体，用戊二醛将纤维连接蛋白（FN）的包被抗体与磁颗粒偶联外，其余均以与实施例1相同的方法制备纤维连接蛋白（FN）定量测定定剂盒。

实施例5本发明的试剂盒的使用方法

以上实施例1制备的尿液中纤维连接蛋白（FN）的浓度的化学发光免疫分析定量测定试剂盒的具体操作如下:

1)自4℃冰箱中取出试剂盒，室温平衡15分钟。

2)取出包被板条，插入板架上。

3）加样，每孔加样100ul，

4）用微量震荡器充分振荡混匀，用封板膜封板37℃水浴30分钟。

5）用稀释后的洗涤液洗板5次，最后在干净的吸水纸上扣干。

6）加酶标记物，每孔100ul，

7）重复4）至5）

8）加化学发光底物工作液100ul

9）用微量震荡器充分振荡混合均匀，室温（20-27℃)避光反应30分钟。

10）测量必须于加化学发光底物液后的第30-90分钟内测量，在化学发光测量仪上依序测量各孔的发光强度（RLU)，测量时间0.2-1.0秒/孔。以校准品浓度为横坐标，RLU值为纵坐标绘出标准曲线，以各待测尿液RLU值在标准曲线上查出该尿液的纤维连接蛋白（FN）的浓度。

图1是检测100例正常人尿液样本中纤维连接蛋白（FN）浓度（mg/L）的数据，说明采用本发明的试剂盒和方法测定的尿液中纤维连接蛋白（FN）的浓度是准确的和可靠的。

实施例6本发明的试剂盒的方法学鉴定

按照本领域中常规的制造及检定规程对实施例1中制备的试剂盒进行检定。

(1)试剂盒分析灵敏度实验（见表1）

具有定量含义的分析灵敏度通常以生物检测限或功能灵敏度表示。某样品单次检测可能具有的最小响应量刚大于空白检测低限响应量，该样品内含有的分析物浓度或其他量值为生物检测限。

本发明尿液中纤维连接蛋白（FN）的浓度的化学发光免疫分析定量测定试剂盒生物检测限表达该试剂盒的分析灵敏度。估算采用

以保证99.7%的可能性。

实验设计：

1.1试剂：尿纤维连接蛋白（FN）化学发光免疫分析定量测定试剂盒，批号：20120316

1.2样品：浓度分别为0mg/L、20mg/L、40mg/L、600mg/L、100mg/L

1.3方法：各样品连续检测12次，读取各浓度样品的吸光度值并计算

表1试剂盒分析灵敏度检测结果

1.4确定分析灵敏度--生物检测限：由上表得以

计算，0mg/L样品组的RLU有99.7%的可能性可高达335.1。20mg/L样品组有99.7%的可能出现的最小RLU为28328.8，超出0mg/L样品组可能出现的最高RLU335.1，即20mg/L样品的吸光度有99.7%的可能大于0mg/L样品的吸光度,符合生物检测限的定义。且符合本试剂盒的线性范围（20mg/L--100mg/L）。

结论：拟定本产品分析灵敏度为20mg/L浓度点。本试剂盒能定量报告尿液样品含纤维连接蛋白（FN）浓度的最低限值为20mg/L。

(2)试剂盒线性范围（见图2）

由图2可知，本试剂盒线性范围为20mg/l---100mg/l，R=0.9999

(3)试剂盒精密性实验批内变异

取低、中、高三份质控血清样品分别进行10孔平行实验，计算测定值的平均值（^)和标准差（s）。按公式CV=s/ix100%计算变异系数，批内变异系数CV分别为2.05%，2.01%，2.87%。批间变异

选择5份不同浓度的尿液样品对每份血清进行3次重复测定，计算其批间变异系数（CV%）,批间变异CV在3.1～5.04%之间。

(4)试剂盒准确性实验

将高浓度的校准品原料，用正常人尿液稀释成四个不同浓度值，每个浓度做5

孔平行实验，分别计算回收率在95-103%范围内。

(5)试剂盒稳定性实验

试剂盒保存温度为2-8℃,经过15个月的测定试剂盒的各项指标均满足要求，考虑到运输和使用过程中对试剂盒的影响，我们进行37℃7天的加速实验，实验结果表明试剂盒的各项指标完全符合要求。

说明“纤维连接蛋白（FN）化学发光免疫分析定量测定试剂盒”的灵敏度、特异性、精密性、准确性和稳定性是完全合格的。

实施例7正常人的尿液中纤维连接蛋白（FN）临界值的确定

1.分析灵敏度：

定义：具有定量含义的分析灵敏度通常以生物检测限或功能灵敏度表示。某样品单次检测可能具有的最小响应量刚大于空白检测低限响应量，该样品内含有的分析物浓度或其他量值为生物检测限。（参见冯仁丰，上海市临床检验中心，《分析灵敏度（检测限）》.上海医学检验杂志2002年第17卷第三期.）。

本公司尿纤维连接蛋白（FN）化学发光免疫分析定量测定试剂盒”的灵敏度、特异性、精密性、准测定试剂盒为定量测定试剂盒，因此采用具有定量含义的生物检测限表达该试剂盒的分析灵敏度。估算采用

以保证99.7%的可能性。

实验设计：

1.1试剂：尿纤维连接蛋白（FN）化学发光免疫分析定量测定试剂盒，批号：

20120316

1.2样品：浓度分别为0mg/L、20mg/L、40mg/L、60mg/L、100mg/L

1.4确定分析灵敏度--生物检测限：由上表得以

计算，0mg/L样品组的吸光度有99.7%的可能性可高达0.0512A。20mg/L样品组有99.7%的可能出现的最小吸光度为0.0406A，包含在0mg/L样品组可能出现的最高吸光度0.0512A范围内。40mg/L样品组有99.7%的可能性出现的最小吸光度为0.0562A，超出0mg/L样品组可能出现的最高吸光度0.0512A范围，即40mg/L样品的吸光度有99.7%的可能大于0mg/L样品的吸光度,符合生物检测限的定义。且符合本试剂盒的线性范围（20mg/L--100mg/L）。

尿样本经离心分离后收集上清液。如在24小时之内检测，2-8℃保存，否则-20℃以下保存，避免反复冻融。

Claims

1.一种检测尿液中纤维连接蛋白浓度的试剂盒，其特征在于包括：酶标记的纤维连接蛋白的抗体或者酶标记的纤维连接蛋白的单克隆抗体或者酶标记的纤维连接蛋白的多克隆抗体；包被有纤维连接蛋白的抗体或者纤维连接蛋白的单克隆抗体或者纤维连接蛋白的多克隆抗体的载体；纤维连接蛋白校准品；化学发光底物和洗涤液。

2.如权利要求1所述的一种检测尿液中纤维连接蛋白浓度的试剂盒，其特征在于：所述载体为聚苯乙烯微孔板、聚苯乙烯珠或管或磁性颗粒。

3.如权利要求1所述的一种检测尿液中纤维连接蛋白浓度的试剂盒，其特征在于：所述的洗涤液为1,2-二氧乙烷类衍生物，所述的1,2-二氧乙烷类衍生物为（金刚烷）-1，2_二氧乙烷、或者3-(2'-螺旋金刚烷)-4_甲氧基-4-(3'-磷酰氧基）苯基-1，2-二氧乙烷、或者CSPD、或者CDP-Star。

4.如权利要求1所述的一种检测尿液中纤维连接蛋白浓度的试剂盒，其特征在于：所述化学发光底物为缓冲液，每升缓冲液中含有24gTris、160gNaCl、4g KC1、15mL HCl 、lml Proclin 300和200ml的3-（2'-螺旋金刚烷）-4-曱氧基-4-（3'-磷酰氧基）苯基-1，2-二氧乙烷，余量为双蒸水。

5.权利要求1所述的试剂盒的制备方法，其特征在于：包括一个制备包被有纤维连接蛋白的抗体或者纤维连接蛋白的单克隆抗体或者纤维连接蛋白的多克隆抗体的载体的步骤，一个用碱性磷酸酶标记纤维连接蛋白的抗体或者纤维连接蛋白的单克隆抗体或者纤维连接蛋白的多克隆抗体的步骤；还包括一个以纤维连接蛋白纯品配制纤维连接蛋白校准品的步骤，一个配制洗涤液的步骤，一个配制化学发光底物的步骤，以及分装上述各组份并组装为成品的步骤。

6.如权利要求5所述的试剂盒的制备方法，其特征在于：在一个制备包被有纤维连接蛋白的抗体或者纤维连接蛋白的单克隆抗体或者纤维连接蛋白的多克隆抗体的载体的步骤中，首先将纤维连接蛋白的抗体或者纤维连接蛋白的单克隆抗体或者纤维连接蛋白的多克隆抗体用0.05M、pH为7.2的磷酸盐緩冲液配制成所需浓度的包被液；然后进行包被，在包被的过程中采用生理盐水洗涤2-5次；最后使用pH值为7.0~ 7.5的磷酸盐封闭液进行封闭。

7.如权利要求5所述的试剂盒的制备方法，其特征在于：在一个用碱性磷酸酶标记纤维连接蛋白的抗体或者纤维连接蛋白的单克隆抗体或者纤维连接蛋白的多克隆抗体的步骤中，所述的碱性磷酸酶标记是采用戊二醛法进行标记。

8.如权利要求5所述的试剂盒的制备方法，其特征在于：所述的酶可以为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。