CN114019172A - 一种基于肽和抗体的疾病蛋白标志物的检测试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于肽和抗体的疾病蛋白标志物的检测试剂盒及其应用,属于蛋白检测技术领域。一种基于肽和抗体的疾病蛋白标志物的检测试剂盒,包括以下组分:包被于固相载体的蛋白标志物抗体、肽的生物探针材料Pep/PtPd@ZrN@COF。根据检测原理不同,分为基于电化学生物传感器检测和ELISA检测。本发明提供的两种生物传感器都具有较低的成本、较高的灵敏度、较宽的检测范围、较低的检出限和操作较方便等特点。
Description
技术领域
本发明属于蛋白检测技术领域,具体涉及一种基于肽和抗体的疾病蛋白标志物的检测试剂盒及其应用。
背景技术
对于很多常见重大疾病而言,早期诊断至关重要。近年来随着免疫学、分子生物学和基因组学技术的发展,寻找和发现可靠的早期诊断生物标记物已经成为目前的一个研究热点。目前在多种疾病中已经明确筛选得到多种早期诊断标志物。例如,英国谢菲尔德大学(University ofSheffield)的研究人员通过对超过19000篇与血液中癌症生物标记物有关的研究的筛选,找出了 786种血液中与癌症相关的生物标记物。这些生物标记物可能被用于开发针对大众的早期癌症筛选测试。阿尔茨海默病已成为大脑研究的焦点,血浆中包含有丰富的蛋白质、激素、RNA和炎性标志物等。有些蛋白质,比如许多参与炎性反应的蛋白质,都可以被鉴定作为阿尔兹海默氏症的潜在诊断标志物。Aβ肽类被认为是阿尔兹海默氏症检测结果,且已经得到了大量研究。胰岛素自身抗体对1型糖尿病而言是一种可靠的生物标志物。生物标志物 LRRK2在遗传性帕金森病中发挥着作用。心型脂肪酸结合蛋白(H-FABP) 是早期确定和排除急性心肌梗死(AMI)的重要依据,同时心肌肌钙蛋白 (cTnI)是检测急性心肌梗死的黄金标志物。
目前,疾病的生物标记物根据检测方法的差异进行了分类,比如微小 RNA和游离DNA可以通过PCR或者测序的方式检测到,而蛋白类的生物标记物则需要电化学发光、表面等离振子共振、引导模式共振、微流控技术、免疫测试(ELISA等)或者质谱(MassSpectroscopy)的方式来检测。这些技术大多数都依赖于大型仪器,这些仪器昂贵、灵敏度低且耗时。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种基于肽和抗体的疾病蛋白标志物的检测试剂盒及其应用,具有检测灵敏度高、检测成本低的特点。
本发明提供了一种基于肽和抗体的疾病蛋白标志物的检测试剂盒,包括以下组分:
包被于固相载体的蛋白标志物抗体、肽的生物探针材料 Pep/PtPd@ZrN@COF。
优选的,基于ELISA检测原理,所述包被于固相载体的蛋白标志物抗体中固相载体为微孔板。
优选的,所述肽的生物探针材料Pep/PtPd@ZrN@COF的制备方法,包括以下步骤:
1)将ZrCl4和尿素络合,得到溶胶在惰性气体下600~1000℃下煅烧钝化,得到ZrNNPs;
2)将三(四苯甲醛基)磷、对苯二胺、步骤1)中所述ZrN NPs、1,4-二恶烷和均三甲苯混合,在乙酸作用下,经完全脱气,在100~180℃下反应,得到ZrN@COF;
3)在水合肼催化作用下,将PdCl2、Na2PtCl4、PVP进行反应,获得的铂钯纳米花溶液PtPd ANFs和步骤2)中所述ZrN@COF混合,得到 PtPd@ZrN@COF;
4)将步骤3)中所述PtPd@ZrN@COF的分散液结合蛋白标志物特异性肽,得到Pep/PtPd@ZrN@COF。
优选的,基于电化学生物传感器检测原理,所述包被于固相载体的蛋白标志物抗体中固相载体为金纳米粒子负载的聚苯胺包覆的氧化铈 Au@PDA@BCN复合物电极。
优选的,所述金纳米粒子负载的聚苯胺包覆的氧化铈Au@PDA@BCN 复合物电极的制备方法,包括以下步骤:
1)将Ce(NO3)2·6H2O和NH3·H2O反应,得到CeO2;
2)在引发剂的作用下将步骤1)中所述CeO2和苯胺单体混合反应,得到聚苯胺包覆的氧化铈材料PANI@CeO2;
3)将步骤2)中聚苯胺包覆的氧化铈材料PANI@CeO2和金纳米粒子混合反应,得到金纳米粒子负载的聚苯胺包覆的氧化铈Au@PDA@BCN复合物;
4)将步骤3)所述金纳米粒子负载的聚苯胺包覆的氧化铈Au@PDA@BCN复合物分散在抛光的碳电极上,封闭,得到Au@PDA@BCN 复合物电极。
优选的,步骤1)中Ce(NO3)2·6H2O的质量和NH3·H2O的体积比为 100~600mg:1.5~10.5m。
优选的,步骤2)中CeO2和苯胺单体的质量体积比为100~1000mg: 1~8ml。
优选的,步骤3)中PANI@CeO2和金纳米粒子的质量体积比为 0.5~10mg:2~10ml。
优选的,所述肽的生物探针材料Pep/PtPd@ZrN@COF为结合有甲苯胺蓝的Pep/PtPd@ZrN@COF。
本发明提供了所述检测试剂盒在非诊断目标的检测疾病生物标志物中的应用。
本发明提供的基于肽和抗体的疾病蛋白标志物的检测试剂盒,包括包被于固相载体的蛋白标志物抗体、肽的生物探针材料Pep/PtPd@ZrN@COF。其中利用包被于固相载体的蛋白标志物抗体与待检测蛋白标志物发生特异性结合,同时肽的生物探针材料中的肽与待待检测蛋白标志物发生特异性结合形成“肽-抗原-抗体三明治型检测结构;同时肽的生物探针材料 Pep/PtPd@ZrN@COF中引入双金属铂钯纳米花(PtPdNFs)作为锚定生物识别物质特异性肽的位点,增加肽的结合稳定性,为准确检测提供了基础。本发明用蛋白标志物特异性肽代替常规的抗体,相比抗体,肽具有更短的生产周期、更低的成本等优点,具有较高的检测灵敏度。
进一步的,本发明所述检测试剂盒具体限定了根据检测原理不同,分为基于电化学生物传感器检测和ELISA检测,其中电化学生物传感器检测试剂盒是以ZrN作为原料,使用原位生长的方法合成了核壳形貌的富含磷基的 COF纳米复合物ZrN@COF,同时利用电化学表征的方法筛选出了COF与 ZrN的最佳比例,然后引入双金属铂钯纳米花(PtPdNFs)作为锚定生物识别物质特异性肽的位点,并以电活性物质甲苯胺蓝(TB)作为信号物质,合成了探针材料Pep/TB/PtPd@ZrN@COF,以AuNPs负载的聚苯胺改性的氧化铈纳米粒子(Au@PANI@CeO2)作为基底材料,构建了用于检测蛋白标志物的“肽-抗原-抗体”三明治型生物传感器,基底材料Au@PANI@CeO2具有优越的导电性能及稳定性,能够有效地提高生物传感器的灵敏度。以检测心肌肌钙蛋白为例,电化学生物传感器的检测范围为0.00001~50ng·mL-1,检出限(LOD)达到了3.3fg/mL(S/N=3)。
同时,ELISA检测试剂盒中以PtPd@ZrN@COF对硼氢化钠催化降解TB 的反应为基础,合成了Pep/PtPd@ZrN@COF生物复合材料作为信号探针,使用微孔板成功构建了三明治型ELISA,也实现了对蛋白标志物的检测。 ELISA的检测范围为0.00001~5ng·mL-1,LOD值为3.3fg/mL(S/N=3),表现出了较高的灵敏度。可见本发明提供的检测试剂盒为心肌肌钙蛋白的检测提供了一个廉价、快速、灵敏的方法。
此外,本发明提供的检测试剂盒还具有以下特点:
(1)本发明构建的使用亲和性肽和抗体的夹心型检测心肌肌钙蛋白的生物传感器,具有操作简单,成本低,检测迅速,高灵敏度等优点,可以用于实际样品的快速检测。
(2)本发明使用了对信号分子具有优良富集作用并且具有较高稳定性的共价有机框架材料来构建电化学信号放大的传感器,能够催化电化学反应从而来提高电信号。
(3)本发明使用了导电性优良的Au@PANI@CeO2纳米复合材料作为电化学生物传感器的基底材料,为传感器的稳定性提供了基础。
(4)本发明将夹心型免疫分析常用的抗体换为心肌肌钙蛋白特异性肽,相比抗体,肽的合成周期较短,较稳定,且成本较低,能够减少免疫传感器的成本并且提高稳定性。
(5)本发明可将电化学法与ELISA相结合,用来检测心肌肌钙蛋白。该方法具有较高的灵敏度、较宽的检测范围,较快的检测速度及较低的检测限,较高的选择性和操作方便等优点,有望成为检测标记物的重要方法。
附图说明
图1为不同纳米复合材料的电镜图,其中图1A为CeO2的TEM图;图 1B为PANI@CeO2的TEM图;图1C为Au@PANI@CeO2的TEM图;图1D 为Au NPs的粒径分布图;图1E为CeO2的SEM图;图1F为PANI@CeO2的SEM图;
图2为不同生物复合材料的电镜图,图2A为ZrN、图2B为COF和图 2C为ZrN@COF的TEM图像;图2D为COF;图2E和图2F为ZrN的SEM 图;
图3为不同修饰电极的检测结果,其中图3A为不同修饰电极的CV图,图3B为阻抗图;
图4为利用电化学生物传感器检测cTnI的结果,其中图4A为不同浓度 cTnI修饰电极的DPV图和图4B为标准曲线;
图5为利用ELISA检测试剂盒检测cTnI的结果,其中图5A为ELISA 的可行性和图5B为标准曲线;
图6为利用电化学生物传感器和ELISA检测试剂盒检测cTnI的结果,其中图6A为不同浓度cTnI修饰电极的标准曲线和图6B为ELISA检测试剂盒的标准曲线;
图7为不同封闭剂的空白值比较,OVA表示卵白蛋白;Lz表示溶菌酶。
具体实施方式
本发明提供了一种基于肽和抗体的疾病蛋白标志物的检测试剂盒,包括以下组分:包被于固相载体的蛋白标志物抗体、肽的生物探针材料 Pep/PtPd@ZrN@COF。
在本发明中,基于ELISA检测原理,所述包被于固相载体的蛋白标志物抗体中固相载体优选为微孔板。ELISA检测试剂盒包括包被有蛋白标志物抗体的微孔板、肽的生物探针材料Pep/PtPd@ZrN@COF。本发明对所述蛋白标志物的种类不做特殊限制,采用本领域所熟知的蛋白标志物即可,例如心肌肌钙蛋白、糖基化血红蛋白、前列腺特异性抗原、C反应蛋白等。本发明对所述抗体的种类没有特殊限制,采用本领域所熟知的蛋白标志物对应的特异性抗体即可。在本发明实施例中,所述心肌肌钙蛋白抗体购自Abcam 公司,型号为ab52862。本发明对包被的方法没有特殊限制,采用本领域所熟知的微孔板的包被方法即可。所述包被后优选进行封闭。本发明对所述封闭的方法没有特殊限制,采用本领域所熟知的封闭方法即可,例如采用BSA 溶液封闭过夜。
在本发明中,所述肽的生物探针材料Pep/PtPd@ZrN@COF的制备方法,包括以下步骤:
1)将ZrCl4和尿素络合,得到溶胶在惰性气体下600~1000℃下煅烧钝化,得到ZrNNPs;
2)将三(四苯甲醛基)磷、对苯二胺、步骤1)中所述ZrN NPs、1,4-二恶烷和均三甲苯混合,在乙酸作用下,经完全脱气,在100~180℃下反应,得到ZrN@COF;
3)在水合肼催化作用下,将PdCl2、Na2PtCl4、PVP进行反应,获得的铂钯纳米花溶液PtPd ANFs和步骤2)中所述ZrN@COF混合,得到 PtPd@ZrN@COF;
4)将步骤3)中所述PtPd@ZrN@COF的分散液结合蛋白标志物特异性肽,得到Pep/PtPd@ZrN@COF。
在本发明中,将ZrCl4和尿素络合,得到溶胶在惰性气体下600~1000℃下煅烧钝化,得到ZrN NPs。所述ZrCl4和尿素的质量比优选为1~3:1~8,更优选为1:6。所述ZrCl4以乙醇溶液的形式与尿素混合。所述络合的时间优选10~14h,更优选为12h。本发明对所述惰性气体没有特殊限制,采用本领域所熟知的惰性气体即可。所述惰性气体优选为氩气。所述煅烧的温度优选为800℃。所述煅烧的时间优选为3h。所述钝化的时间优选为0.5~4h,更优选为2h。
得到ZrN NPs后,本发明将三(四苯甲醛基)磷、对苯二胺、所述ZrN NPs、 1,4-二恶烷和均三甲苯混合,在乙酸作用下,经完全脱气,在100~180℃下反应,得到ZrN@COF。
在本发明中,所述三(四苯甲醛基)磷、对苯二胺、所述ZrN NPs、1,4- 二恶烷和均三甲苯的质量体积比为优选为5~20mg:1~12mg:1~8mg: 0.5~5ml:0.5~5ml,更优选为10.4mg:4.8mg:4.0mg:0.5ml:1.5ml。所述完全脱气优选三次冷冻-真空-解冻循环。所述反应的温度优选为120℃,所述反应的时间优选为3d。得到反应产物后,优选进行纯化,所述纯化的方法优选分别采用DMF和四氢呋喃洗涤3~4次。
得到ZrN@COF后,本发明在水合肼催化作用下,将PdCl2、Na2PtCl4、 PVP进行反应,获得的铂钯纳米花溶液PtPdANFs和所述ZrN@COF混合,得到PtPd@ZrN@COF。
在本发明中,所述反应时有水参与。所述PdCl2、Na2PtCl4、PVP和水的体积比优选为0.25:1.5:1.0:7.3。所述PdCl2的浓度优选为50.0mM。所述Na2PtCl4的浓度优选为25mM。PVP的浓度优选为50.0mg·mL-1。所述反应的体系pH值优选为8.5~9.5,更优选为9.0。所述水合肼的质量浓度优选为85%。所述水合肼的体积优选为每1ml的PVP溶液,添加0.2ml的水合肼溶液。所述反应的温度优选为30~80℃,更优选为50℃。所述反应的时间优选为1~12h,更优选为5h。所述铂钯纳米花溶液PtPdANFs和所述ZrN@COF 的体积比为2:1。所述铂钯纳米花溶液PtPdANFs的浓度优选为2.0mg·mL-1。所述混合的温度优选为20~28℃,更优选为23~25℃。所述混合的时间优选为10~14h,更优选为12h。混合后,所得反应产物优选进行离心。所述离心的转速优选为10000rpm。所述离心的时间优选为15min。所述离心的次数优选为3次。所述离心后所得沉淀优选在1.0ml的双蒸水中分散。
得到PtPd@ZrN@COF后,本发明将PtPd@ZrN@COF和蛋白标志物的特异性肽混合,得到Pep/PtPd@ZrN@COF。
在本发明中,Pep/PtPd@ZrN@COF的PBS溶液和蛋白标志物的特异性肽的体积比优选为0.1:1。所述Pep/PtPd@ZrN@COF的PBS溶液的浓度优选为2.0mg·mL-1。所述蛋白标志物的特异性肽的浓度优选为1mg·mL-1。以cTnI 为蛋白标志物时,cTnI的特异性肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1 (CGGGGREKKKKILAERRKVL)所示。所述蛋白标志物的特异性肽的浓度优选为1.0mg·mL-1。
本发明制备的以ZrN作为原料,使用原位生长的方法合成了核壳形貌的富含磷基的COF纳米复合物ZrN@COF,同时利用电化学表征的方法筛选出了COF与ZrN的最佳比例,然后引入双金属铂钯纳米花(PtPd NFs)作为锚定生物识别物质特异性肽的位点,合成了肽的生物探针材料Pep/PtPd@ZrN@COF。
在本发明中,作为对照材料,本发明还制备了单种贵金属纳米粒子(Pt NPs和PdNPs)与ZrN@COF的复合物(Pt@ZrN@COF和Pd@ZrN@COF),并测试了其对MB还原的催化活性。结果表明:PtPd@ZrN@COF对MB的电化学催化活性要优于Pt@ZrN@COF和Pd@ZrN@COF(见图3)。
在本发明中,所述ELISA检测试剂盒优选包括样品稀释液、洗涤液、底物显色液,终止液等。本发明对所述样品稀释液、洗涤液、底物显色液,终止液的组成没有特殊限制,采用本领域所熟知的ELISA检测试剂盒的组分即可。
在本发明中,基于电化学生物传感器检测原理,所述包被于固相载体的蛋白标志物抗体中固相载体优选为金纳米粒子负载的聚苯胺包覆的氧化铈 Au@PDA@BCN复合物电极。电化学生物传感器检测试剂盒优选包括包被有蛋白标志物抗体的金纳米粒子负载的聚苯胺包覆的氧化铈复合物电极。所述金纳米粒子负载的聚苯胺包覆的氧化铈Au@PDA@BCN复合物电极的制备方法,优选包括以下步骤:1)将Ce(NO3)2·6H2O和NH3·H2O反应,得到 CeO2;
2)在引发剂的作用下将步骤1)中所述CeO2和苯胺单体混合反应,得到聚苯胺包覆的氧化铈材料PANI@CeO2;
3)将步骤2)中聚苯胺包覆的氧化铈材料PANI@CeO2和金纳米粒子混合反应,得到金纳米粒子负载的聚苯胺包覆的氧化铈Au@PDA@BCN复合物;
4)将步骤3)所述金纳米粒子负载的聚苯胺包覆的氧化铈 Au@PDA@BCN复合物分散在抛光的碳电极上,封闭,得到Au@PDA@BCN 复合物电极。
在本发明中,将Ce(NO3)2·6H2O和NH3·H2O反应,得到CeO2。所述 Ce(NO3)2·6H2O的质量和NH3·H2O的体积比优选为50~400mg:1~12ml,更优选为540mg:7.5ml。所述Ce(NO3)2·6H2O的浓度优选为360mg/ml。所述反应的温度优选为20~28℃,更优选为23~25℃。所述反应的时间优选为22~26h,更优选为24h。所述反应后,所得反应产物经过水洗涤后真空干燥得到CeO2。
得到CeO2后,本发明在引发剂的作用下将所述CeO2和苯胺单体混合反应,得到聚苯胺包覆的氧化铈材料PANI@CeO2。
在本发明中,CeO2和苯胺单体的质量体积比优选为100~1000mg:1~8ml,更优选为100mg:1ml。所述CeO2优选以浓度为2.5mg/ml CeO2的HCl溶液的形式进行反应。所述引发剂优选为过硫酸铵溶液。所述过硫酸铵溶液优选为0.25M。所述反应的温度优选为4℃。所述反应的时间优选为10~14h。所述反应后,优选将反应产物进行水洗涤后,真空干燥备用。
得到聚苯胺包覆的氧化铈材料PANI@CeO2,本发明将聚苯胺包覆的氧化铈材料PANI@CeO2和金纳米粒子混合反应,得到金纳米粒子负载的聚苯胺包覆的氧化铈Au@PDA@BCN复合物。
在本发明中,聚苯胺包覆的氧化铈材料PANI@CeO2和金纳米粒子的质量体积比优选为0.5~10mg:2~10ml,更优选为2.0mg:10ml。本发明对金纳米粒子的制备方法没有特殊限制,采用本领域所熟知的氯金酸还原为纳米金溶液即可。
得到金纳米粒子负载的聚苯胺包覆的氧化铈Au@PDA@BCN复合物,本发明将所述金纳米粒子负载的聚苯胺包覆的氧化铈Au@PDA@BCN复合物分散在抛光的碳电极上,封闭,得到Au@PDA@BCN复合物电极。
在本发明中,所述封闭优选采用溶菌酶溶液进行封闭,所述溶菌酶溶液的浓度优选为1~5mg·mL-1,更优选为2.5mg·mL-1。本发明采用所述溶菌酶 (Lz)作为封闭剂进行封闭,较其他种类封闭剂如牛血清蛋白(BSA)的封闭方法的优势是:在中性pH值附近溶菌酶带正电而使斥力增加,其作为封闭剂的引入可有效减少大部分中性pH条件下带正电的非特异性蛋白的吸附,从而有效降低背景信号(图6)。
本发明对所述抛光的碳电极的处理方法没有特殊限制,采用本领域所熟知的碳电极的抛光方法即可。所述碳电极优选为玻璃碳电极。所述玻璃碳电极相较于其他电极,有稳定、使用广泛、成本低等优势。
在本发明中,所述肽的生物探针材料Pep/PtPd@ZrN@COF优选为结合有甲苯胺蓝的Pep/PtPd@ZrN@COF。结合有甲苯胺蓝的 Pep/PtPd@ZrN@COF的制备方法在上述Pep/PtPd@ZrN@COF制备方法的基础上在蛋白标志物的特异性肽混合前,添加甲苯胺蓝混合和水洗涤。
在本发明中,所述电化学生物传感器检测试剂盒,优选还包括洗涤液。所述洗涤液优选为pH=7.0的0.1M磷酸盐缓冲液。
本发明提供了所述检测试剂盒在非诊断目标的检测疾病生物标志物中的应用。
在本发明中,所述非诊断目标的检测疾病生物标志物的方法,优选包括电化学传感器检测试剂盒的检测方法和ELISA检测试剂盒的检测方法。
所述电化学传感器检测试剂盒的检测方法,优选包括以下步骤:
将待检测的样品溶液点滴到包被有蛋白标志物抗体的金纳米粒子负载的聚苯胺包覆的氧化铈复合物电极上,室温孵育,洗涤,晾干;
将处理的电极置于肽的生物探针材料(Pep/TB/PtPd@ZrN@COF)中孵育,洗涤,晾干;
将上述处理的电极作为工作电极,铂丝电极为对电极,饱和甘汞电极为参比电极,在10mL浓度为0.1M的pH=7.0的磷酸盐缓冲液中进行测试;
利用差分脉冲伏安法(DPV)对目标物进行检测,扫描电压为0.0~-0.5V,脉冲振幅为0.05V,脉冲宽度为0.05s,记录电流峰值;根据电流标准曲线,计算样品中蛋白标志物的浓度。
本发明对所述ELISA检测试剂盒的检测方法没有特殊限制,采用本领域所熟知的检测方法即可。
在本发明中,可以同时采用电化学传感器检测试剂盒和ELISA检测试剂盒对未知样品进行检测,实现样品的双信号检测。
下面结合实施例对本发明提供的一种基于肽和抗体的疾病蛋白标志物的检测试剂盒及其应用进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种基于肽和抗体的心肌肌钙蛋白双信号检测方法,具体步骤如下:
(1)将玻璃碳电极(GCE)分别用0.3和0.05μm的三氧化二铝(Al2O3) 粉抛光,并分别用乙醇溶液(50%)、硝酸溶液(50%)和去离子水(DW)分别超声3min,用N2干燥备用;
(2)将10μL 1.0mg·mL-1的金纳米粒子负载的聚苯胺包覆的氧化铈复合物(Au@PANI@CeO2)分散液滴在步骤(1)中处理好的电极上上并干燥;
(3)将步骤(2)处理好的电极浸入10μg·mL-1的心肌肌钙蛋白抗体(Ab1) 溶液中并于4℃孵育过夜,孵育完成后用pH=7.0的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗电极表面,晾干;
(4)将10μL 2.5mg·mL-1的溶菌酶(LZ)溶液滴加到步骤(3)处理好的电极表面,在室温下孵育45min,孵育完成后用pH=7.0的PBS清洗电极表面,晾干;
(5)将浓度为0.00001ng·mL-1的心肌肌钙蛋白溶液(cTnI)分别滴加到步骤(4)处理好的电极表面,在室温下孵育1h,孵育完成后用pH=7.0的PBS 清洗电极表面,晾干;
(6)将步骤(5)处理好的电极置于2.0mg·mL-1肽的生物探针材料 (Pep/TB/PtPd@ZrN@COF)中孵育1h,孵育完成后用pH=7.0的PBS清洗电极表面,晾干,得到检测不同浓度的cTnI的夹心型电化学免疫传感器。
(7)将100μL的1.0μg·mL-1Ab1加入到96孔板中,并在冰箱中孵育过夜,然后用PBS溶液洗去未结合的Ab1。
(8)将100μL 1%的牛血清蛋白添加到步骤(7)处理好的96孔板中,在25℃下孵育45min。孵育结束后,将板用PBS洗涤并干燥。
(9)在步骤(8)处理好的板中加入100μL 0.00001ng·mL-1的cTnI,在 25℃下孵育1h,然后用PBS洗涤并干燥。
(10)在步骤(9)处理好的板中加入100μL的0.2mg·mL-1 Pep/PtPd@ZrN@COF生物探针材料,并在相同条件下孵育1h,并将未结合的物质用PBS去除。
(11)将100μL的0.1M NaBH4和相同体积的150μM TB快速添加到步骤(10)处理好的板中,用微量酶标仪测量其在635nm处的吸光度值。
其中,步骤(2)的金纳米粒子负载的聚苯胺包覆的氧化铈复合物(Au@PDA@BCN)分散液的制备方法,具体步骤如下:
(1)Au NPs的制备:在50mL DW中加入500μL浓度为23.46mM的 HAuCl4溶液,在110℃条件下加热5min,然后迅速加入5mL浓度为14.55 mM的新鲜制备的柠檬酸钠溶液,在110℃条件下沸腾回流30min直至溶液变为酒红色,冷却至室温后得到金纳米粒子分散液,在4℃下储存备用;
(2)CeO2的制备:在1.5mLDW中添加540.0mg Ce(NO3)2·6H2O,然后超声15min使其溶解。随后,向混合物中添加7.5mLNH3·H2O并在室温下搅拌一天。最后,将产物用DW洗涤三次并进行真空干燥。
(3)PANI@CeO2的制备:将500.0mg步骤(2)合成的CeO2分散于200.0 mL的1.0M HCl溶液中并在冰浴中超声处理1h。然后,向混合物中添加5.0 mL的苯胺单体并在冰浴下搅拌1h,之后在搅拌下添加等体积的0.25M过硫酸铵溶液并在4℃下保持12h。用DW洗涤产物,真空干燥产物备用。
(4)Au@PANI@CeO2的制备:称取2.0mg步骤(3)制备好的 PANI@CeO2并配成1.0mL2.0mg·mL-1均匀分散的溶液。在溶液中添加10.0 mL的AuNPs溶液并在4℃下剧烈搅拌4h,随后,以8000rpm的转速离心混合物并用DW洗涤三次以除去多余的AuNPs,最后在1.0mLDW中再悬浮,将材料储存在4℃下备用。
步骤(6)的肽的生物探针材料(Pep/TB/PtPd@ZrN@COF)的制备方法,具体步骤如下:
(1)ZrN NPs的制备:将500.0mg ZrCl4粉末分散在1.0mL乙醇中以形成均匀且透明的溶液。随后,添加相同量的尿素并搅拌使其溶解。将上述混合物老化过夜,使锆被完全络合,得到无色透明的溶胶。最后,在氩气流保护下将所得溶胶在800℃下煅烧3h,然后钝化2h以获得黑色粉末ZrN NPs。
(2)ZrN@COF的制备:将10.4mg 4,4’,4”-phosphinidynetris-benzaldehyde、4.8mg对苯二胺和不同质量的ZrN NPs分别加入10.0mL的高压烧瓶中,然后分别添加0.5mL的1,4-二恶烷和 1.5mL的均三甲苯,超声处理1h。随后,添加0.6mL 6M的乙酸,将容器快速经过三次冷冻-真空-解冻循环使其完全脱气,并置于120℃的油浴锅中反应三天。最后,将产物分别用DMF和四氢呋喃洗涤数次,真空干燥得到不同比例的ZrN@COF。
(3)PtPd@ZrN@COF的制备:在圆底烧瓶中分别加入0.25mL 50.0mM 的PdCl2、1.5mL25.0mM的Na2PtCl4、1.0mL 50.0mg·mL-1PVP和7.3mL 的DW,并在35℃下搅拌半小时。然后用稀的碱溶液将上述混合溶液的pH 调节至9.0左右,之后快速加入0.2mL的水合肼(85%)并在50℃下剧烈搅拌5h。反应完成后,将所获得的铂钯纳米花溶液(PtPdANFs)放在4℃下储存。对于PtPd@ZrN@COF的制备,将1.0mL 2.0mg·mL-1的ZrN@COF 与2.0mLPtPdANFs溶液混合,并在室温下搅拌过夜。最后将混合溶液在 10000rpm下离心15min并洗涤三次,分散在1.0mL DW中,在4℃下储存以备将来使用。
(4)Pep/TB/PtPd@ZrN@COF生物探针的制备:在1.0mL 2.0mg·mL-1的 PtPd@ZrN@COF分散液中加入1.0mL 2.5mg·mL-1的甲苯胺蓝(TB)溶液,在室温下搅拌12h以充分结合,然后用DW洗涤以除去未结合的TB。将混合物重新分散在1.0mL的PBS中。之后,将100μL1.0mg·mL-1的cTnI 特异性肽加入上述混合溶液中并在4℃条件下搅拌过夜。用PBS洗掉游离的肽后,将混合物分散在1.0mL的PBS中以获得2.0mg·mL-1的 Pep/TB/PtPd@ZrN@COF生物探针材料,将其储存在4℃备用。
步骤(10)中的Pep/PtPd@ZrN@COF生物探针材料的制备与步骤(6)的肽的生物探针材料的制备方法相同,只是在过程中不加入TB溶液。
本发明所述使用特异性肽和抗体的的心肌肌钙蛋白双信号检测方法,具体步骤如下:
(1)使用电化学工作站,在三电极体系中,以所制备的特异性肽和抗体的夹心型检测心肌肌钙蛋白的电化学免疫传感器为工作电极,铂丝电极为对电极,饱和甘汞电极为参比电极,在10mL浓度为0.1M的pH=7.0的磷酸盐缓冲液中进行测试;
(2)利用差分脉冲伏安法(DPV)对目标物进行检测,扫描电压为 0.0~-0.5V,脉冲振幅为0.05V,脉冲宽度为0.05s,记录电流峰值;
(3)记录不同浓度下的心肌肌钙蛋白对应的电流峰值;
(4)利用工作曲线法,检测不同浓度的心肌肌钙蛋白溶液,结果表明检测范围为0.00001~50ng·mL-1,检出限(LOD)达到了3.3fg·mL-1(S/N=3)。
(5)使用酶标仪在635nm处测量检测cTnI的ELISA分析液,结果表明检测范围为0.00001~5ng·mL-1,LOD值为3.3fg·mL-1(S/N=3)。通过加标回收法,在人工血清中加入1ng·mL-1的cTnI,用所构建的电化学传感器实际测得cTnI的浓度为1.0537ng·mL-1,回收率为105.37%,表明传感器有优异的检测效果。
实施例2
一种基于肽和抗体的心肌肌钙蛋白双信号检测方法的具体步骤如下:
(1)将玻璃碳电极(GCE)分别用0.3和0.05μm的三氧化二铝(Al2O3) 粉抛光,并分别用乙醇溶液(50%)、硝酸溶液(50%)和去离子水(DW)分别超声3min,用N2干燥备用;
(2)将10μL 1.0mg·mL-1的金纳米粒子负载的聚苯胺包覆的氧化铈复合物(Au@PANI@CeO2)分散液滴在步骤(1)中处理好的电极上上并干燥;
(3)将步骤(2)处理好的电极浸入10μg·mL-1的心肌肌钙蛋白抗体(Ab1)溶液中并于4℃孵育过夜,孵育完成后用pH=7.0的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗电极表面,晾干;
(4)将10μL2.5 mg·mL-1的溶菌酶(LZ)溶液滴加到步骤(3)处理好的电极表面,在室温下孵育45min,孵育完成后用pH=7.0的PBS清洗电极表面,晾干;
(5)将浓度为1ng·mL-1的心肌肌钙蛋白溶液(cTnI)分别滴加到步骤(4) 处理好的电极表面,在室温下孵育1h,孵育完成后用pH=7.0的PBS清洗电极表面,晾干;
(6)将步骤(5)处理好的电极置于2.0mg·mL-1肽的生物探针材料 (Pep/TB/PtPd@ZrN@COF)中孵育1h,孵育完成后用pH=7.0的PBS清洗电极表面,晾干,得到检测不同浓度的cTnI的夹心型电化学免疫传感器。
(7)将100μL的1.0μg·mL-1Ab1加入到96孔板中,并在冰箱中孵育过夜,然后用PBS溶液洗去未结合的Ab1。
(8)将100μL 1%的牛血清蛋白添加到步骤(7)处理好的96孔板中,在 25℃下孵育45min。孵育结束后,将板用PBS洗涤并干燥。
(9)在步骤(8)处理好的板中加入100μL1 ng·mL-1的cTnI,在25℃下孵育1h,然后用PBS洗涤并干燥。
(10)在步骤(9)处理好的板中加入100μL的0.2mg·mL-1 Pep/PtPd@ZrN@COF生物探针材料,并在相同条件下孵育1h,并将未结合的物质用PBS去除。
(11)将100μL的0.1M NaBH4和相同体积的150μM TB快速添加到步骤 (10)处理好的板中,用微量酶标仪测量其在635nm处的吸光度值。
步骤(2)的金纳米粒子负载的聚苯胺包覆的氧化铈复合物 (Au@PDA@BCN)分散液的制备方法,具体步骤如下:
(1)Au NPs的制备:在50mL DW中加入500μL浓度为23.46mM的 HAuCl4溶液,在110℃条件下加热5min,然后迅速加入5mL浓度为14.55 mM的新鲜制备的柠檬酸钠溶液,在110℃条件下沸腾回流30min直至溶液变为酒红色,冷却至室温后得到金纳米粒子分散液,在4℃下储存备用;
(2)CeO2的制备:在1.5mL DW中添加540.0mg Ce(NO3)2·6H2O,然后超声15min使其溶解。随后,向混合物中添加7.5mLNH3·H2O并在室温下搅拌一天。最后,将产物用DW洗涤三次并进行真空干燥。
(3)PANI@CeO2的制备:将500.0mg步骤(2)合成的CeO2分散于200.0 mL的1.0M HCl溶液中并在冰浴中超声处理1h。然后,向混合物中添加5.0 mL的苯胺单体并在冰浴下搅拌1h,之后在搅拌下添加等体积的0.25M过硫酸铵溶液并在4℃下保持12h。用DW洗涤产物,真空干燥产物备用。
(4)Au@PANI@CeO2的制备:称取2.0mg步骤(3)制备好的 PANI@CeO2并配成1.0mL2.0mg·mL-1均匀分散的溶液。在溶液中添加10.0 mL的AuNPs溶液并在4℃下剧烈搅拌4h,随后,以8000rpm的转速离心混合物并用DW洗涤三次以除去多余的AuNPs,最后在1.0mL DW中再悬浮,将材料储存在4℃下备用。
步骤(6)的肽的生物探针材料(Pep/TB/PtPd@ZrN@COF)的制备方法,具体步骤如下:
(1)ZrN NPs的制备:将500.0mg ZrCl4粉末分散在1.0mL乙醇中以形成均匀且透明的溶液。随后,添加相同量的尿素并搅拌使其溶解。将上述混合物老化过夜,使锆被完全络合,得到无色透明的溶胶。最后,在氩气流保护下将所得溶胶在800℃下煅烧3h,然后钝化2h以获得黑色粉末ZrN NPs。
(2)ZrN@COF的制备:将10.4mg 4,4’,4”-phosphinidynetris-benzaldehyde、4.8mg对苯二胺和不同质量的ZrN NPs分别加入10.0mL的高压烧瓶中,然后分别添加0.5mL的1,4-二恶烷和 1.5mL的均三甲苯,超声处理1h。随后,添加0.6mL 6M的乙酸,将容器快速经过三次冷冻-真空-解冻循环使其完全脱气,并置于120℃的油浴锅中反应三天。最后,将产物分别用DMF和四氢呋喃洗涤数次,真空干燥得到不同比例的ZrN@COF。
(3)PtPd@ZrN@COF的制备:在圆底烧瓶中分别加入0.25mL 50.0mM 的PdCl2、1.5mL25.0mM的Na2PtCl4、1.0mL 50.0mg·mL-1PVP和7.3mL 的DW,并在35℃下搅拌半小时。然后用稀的碱溶液将上述混合溶液的pH 调节至9.0左右,之后快速加入0.2mL的水合肼(85%)并在50℃下剧烈搅拌5h。反应完成后,将所获得的铂钯纳米花溶液(PtPdANFs)放在4℃下储存。对于PtPd@ZrN@COF的制备,将1.0mL 2.0mg·mL-1的ZrN@COF 与2.0mLPtPdANFs溶液混合,并在室温下搅拌过夜。最后将混合溶液在 10000rpm下离心15min并洗涤三次,分散在1.0mL DW中,在4℃下储存以备将来使用。
(4)Pep/TB/PtPd@ZrN@COF生物探针的制备:在1.0mL 2.0mg·mL-1的 PtPd@ZrN@COF分散液中加入1.0mL 2.5mg·mL-1的甲苯胺蓝(TB)溶液,在室温下搅拌12h以充分结合,然后用DW洗涤以除去未结合的TB。将混合物重新分散在1.0mL的PBS中。之后,将100μL1.0mg·mL-1的cTnI 特异性肽加入上述混合溶液中并在4℃条件下搅拌过夜。用PBS洗掉游离的肽后,将混合物分散在1.0mL的PBS中以获得2.0mg·mL-1的 Pep/TB/PtPd@ZrN@COF生物探针材料,将其储存在4℃备用。
步骤(10)中的Pep/PtPd@ZrN@COF生物探针材料的制备与步骤(6) 的肽的生物探针材料的制备方法相同,只是在过程中不加入TB溶液。
本发明所述使用特异性肽和抗体的心肌肌钙蛋白双信号检测方法,具体步骤如下:
(1)使用电化学工作站,在三电极体系中,以所制备的特异性肽和抗体的夹心型检测心肌肌钙蛋白的电化学免疫传感器为工作电极,铂丝电极为对电极,饱和甘汞电极为参比电极,在10mL浓度为0.1M的pH=7.0的磷酸盐缓冲液中进行测试;
(2)利用差分脉冲伏安法(DPV)对目标物进行检测,扫描电压为 0.0~-0.5V,脉冲振幅为0.05V,脉冲宽度为0.05s,记录电流峰值;
(3)记录不同浓度下的心肌肌钙蛋白对应的电流峰值;
(4)利用工作曲线法,检测不同浓度的心肌肌钙蛋白溶液,结果表明检测范围为0.00001~50ng·mL-1,检出限(LOD)达到了3.3fg·mL-1(S/N=3)。
(5)使用酶标仪在635nm处测量检测cTnI的ELISA分析液,通过加标回收法,在人工血清中加入0.1ng·mL-1的cTnI,用所构建的电化学传感器实际测得cTnI的浓度为0.0988ng·mL-1,回收率为98.8%,表明传感器有优异的检测效果。
实施例3
一种基于肽和抗体的心肌肌钙蛋白双信号检测方法,具体步骤如下:
(1)将玻璃碳电极(GCE)分别用0.3和0.05μm的三氧化二铝(Al2O3) 粉抛光,并分别用乙醇溶液(50%)、硝酸溶液(50%)和去离子水(DW)分别超声3min,用N2干燥备用;
(2)将10μL 1.0mg·mL-1的金纳米粒子负载的聚苯胺包覆的氧化铈复合物(Au@PANI@CeO2)分散液滴在步骤(1)中处理好的电极上上并干燥;
(3)将步骤(2)处理好的电极浸入10μg·mL-1的心肌肌钙蛋白抗体(Ab1) 溶液中并于4℃孵育过夜,孵育完成后用pH=7.0的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗电极表面,晾干;
(4)将10μL 2.5mg·mL-1的溶菌酶(LZ)溶液滴加到步骤(3)处理好的电极表面,在室温下孵育45min,孵育完成后用pH=7.0的PBS清洗电极表面,晾干;
(5)将浓度为50ng·mL-1的心肌肌钙蛋白溶液(cTnI)分别滴加到步骤 (4)处理好的电极表面,在室温下孵育1h,孵育完成后用pH=7.0的PBS清洗电极表面,晾干;
(6)将步骤(5)处理好的电极置于2.0mg·mL-1肽的生物探针材料 (Pep/TB/PtPd@ZrN@COF)中孵育1h,孵育完成后用pH=7.0的PBS清洗电极表面,晾干,得到检测不同浓度的cTnI的夹心型电化学免疫传感器。
(7)将100μL的1.0μg·mL-1Ab1加入到96孔板中,并在冰箱中孵育过夜,然后用PBS溶液洗去未结合的Ab1。
(8)将100μL 1%的牛血清蛋白添加到步骤(7)处理好的96孔板中,在 25℃下孵育45min。孵育结束后,将板用PBS洗涤并干燥。
(9)在步骤(8)处理好的板中加入100μL 50ng·mL-1的cTnI,在25℃下孵育1h,然后用PBS洗涤并干燥。
(10)在步骤(9)处理好的板中加入100μL的0.2mg·mL-1 Pep/PtPd@ZrN@COF生物探针材料,并在相同条件下孵育1h,并将未结合的物质用PBS去除。
(11)将100μL的0.1M NaBH4和相同体积的150μM TB快速添加到步骤(10)处理好的板中,用微量酶标仪测量其在635nm处的吸光度值。
步骤(2)的金纳米粒子负载的聚苯胺包覆的氧化铈复合物 (Au@PDA@BCN)分散液的制备方法,具体步骤如下:
(1)Au NPs的制备:在50mL DW中加入500μL浓度为23.46mM的 HAuCl4溶液,在110℃条件下加热5min,然后迅速加入5mL浓度为14.55 mM的新鲜制备的柠檬酸钠溶液,在110℃条件下沸腾回流30min直至溶液变为酒红色,冷却至室温后得到金纳米粒子分散液,在4℃下储存备用;
(2)CeO2的制备:在1.5mLDW中添加540.0mg Ce(NO3)2·6H2O,然后超声15min使其溶解。随后,向混合物中添加7.5mLNH3·H2O并在室温下搅拌一天。最后,将产物用DW洗涤三次并进行真空干燥。
(3)PANI@CeO2的制备:将500.0mg步骤(2)合成的CeO2分散于200.0 mL的1.0M HCl溶液中并在冰浴中超声处理1h。然后,向混合物中添加5.0 mL的苯胺单体并在冰浴下搅拌1h,之后在搅拌下添加等体积的0.25M过硫酸铵溶液并在4℃下保持12h。用DW洗涤产物,真空干燥产物备用。
(4)Au@PANI@CeO2的制备:称取2.0mg步骤(3)制备好的PANI@CeO2并配成1.0mL2.0mg·mL-1均匀分散的溶液。在溶液中添加10.0mL的Au NPs溶液并在4℃下剧烈搅拌4h,随后,以8000rpm的转速离心混合物并用DW洗涤三次以除去多余的AuNPs,最后在1.0mL DW中再悬浮,将材料储存在4℃下备用。
图1为CeO2、PANI@CeO2和Au@PANI@CeO2的透射电镜(TEM)和扫描电镜(SEM)图;其中CeO2具有颗粒状的结构,且颗粒较小;与PANI 原位聚合之后,CeO2的形貌发生了明显变化,表面出现了一层很明显的膜 (图1B);SEM图像也得到了相同的结果:相比CeO2颗粒状的结构,在聚合上PANI之后,其表面变得相对光滑(图1E和图1F)。这些结果也说明PANI 在CeO2表面聚合成功。如图1C所示,可以看到Au NPs均匀地分布在 PANI@CeO2的表面,这些AuNPs的粒径大小约为17nm(图1D)。
步骤(6)的肽的生物探针材料(Pep/TB/PtPd@ZrN@COF)的制备方法,具体步骤如下:
(1)ZrN NPs的制备:将500.0mg ZrCl4粉末分散在1.0mL乙醇中以形成均匀且透明的溶液。随后,添加相同量的尿素并搅拌使其溶解。将上述混合物老化过夜,使锆被完全络合,得到无色透明的溶胶。最后,在氩气流保护下将所得溶胶在800℃下煅烧3h,然后钝化2h以获得黑色粉末ZrN NPs。
(2)ZrN@COF的制备:将10.4mg 4,4’,4”-phosphinidynetris-benzaldehyde、4.8mg对苯二胺和不同质量的ZrN NPs分别加入10.0mL的高压烧瓶中,然后分别添加0.5mL的1,4-二恶烷和 1.5mL的均三甲苯,超声处理1h。随后,添加0.6mL 6M的乙酸,将容器快速经过三次冷冻-真空-解冻循环使其完全脱气,并置于120℃的油浴锅中反应三天。最后,将产物分别用DMF和四氢呋喃洗涤数次,真空干燥得到不同比例的ZrN@COF。
(3)PtPd@ZrN@COF的制备:在圆底烧瓶中分别加入0.25mL 50.0mM 的PdCl2、1.5mL25.0mM的Na2PtCl4、1.0mL 50.0mg·mL-1PVP和7.3mL 的DW,并在35℃下搅拌半小时。然后用稀的碱溶液将上述混合溶液的pH 调节至9.0左右,之后快速加入0.2mL的水合肼(85%)并在50℃下剧烈搅拌5h。反应完成后,将所获得的铂钯纳米花溶液(PtPdANFs)放在4℃下储存。对于PtPd@ZrN@COF的制备,将1.0mL 2.0mg·mL-1的ZrN@COF 与2.0mL PtPdANFs溶液混合,并在室温下搅拌过夜。最后将混合溶液在 10000rpm下离心15min并洗涤三次,分散在1.0mL DW中,在4℃下储存以备将来使用。
(4)Pep/TB/PtPd@ZrN@COF生物探针的制备:在1.0mL 2.0mg·mL-1的 PtPd@ZrN@COF分散液中加入1.0mL 2.5mg·mL-1的甲苯胺蓝(TB)溶液,在室温下搅拌12h以充分结合,然后用DW洗涤以除去未结合的TB。将混合物重新分散在1.0mL的PBS中。之后,将100μL1.0mg·mL-1的cTnI 特异性肽加入上述混合溶液中并在4℃条件下搅拌过夜。用PBS洗掉游离的肽后,将混合物分散在1.0mL的PBS中以获得2.0mg·mL-1的 Pep/TB/PtPd@ZrN@COF生物探针材料,将其储存在4℃备用。
步骤(10)中的Pep/PtPd@ZrN@COF生物探针材料的制备与步骤(6)的肽的生物探针材料的制备方法相同,只是在过程中不加入TB溶液。
本发明所述使用特异性肽和抗体的夹心型检测心肌肌钙蛋白的生物传感器的应用方法,具体步骤如下:
(1)使用电化学工作站,在三电极体系中,以所制备的特异性肽和抗体的夹心型检测心肌肌钙蛋白的电化学免疫传感器为工作电极,铂丝电极为对电极,饱和甘汞电极为参比电极,在10mL浓度为0.1M的pH=7.0的磷酸盐缓冲液中进行测试;
(2)利用差分脉冲伏安法(DPV)对目标物进行检测,扫描电压为 0.0~-0.5V,脉冲振幅为0.05V,脉冲宽度为0.05s,记录电流峰值;
(3)记录不同浓度下的心肌肌钙蛋白对应的电流峰值;
(4)利用工作曲线法,检测不同浓度的心肌肌钙蛋白溶液,结果表明检测范围为0.00001-50ng·mL-1,检出限(LOD)达到了3.3fg·mL-1(S/N=3)。
(5)使用酶标仪在635nm处测量检测cTnI的ELISA分析液,结果表明检测范围为0.00001~5ng·mL-1,LOD值为3.3fg·mL-1(S/N=3)。通过加标回收法,在人工血清中加入0.01ng·mL-1的cTnI,用所构建的电化学传感器实际测得cTnI的浓度为0.00959ng·mL-1,回收率为95.9%,表明传感器有优异的检测效果。
图2为ZrN、COF和ZrN@COF的TEM图像以及SEM图像;其中图(A) 可看出,ZrN NPs具有接近球形的形态,并且具有化学均一性。SEM也可以明显地看出近球形地颗粒结构(图2E,图2F)。图2B和图2D为COF的TEM 和SEM图像,可看到该COF为很薄地纳米片状结构,也认为这是该COF 具有较高比表面积的原因之一;当ZrN与COF复合之后,可清楚地看到ZrN NPs被COF包裹在里面,且在ZrN表面形成一层较薄的膜,证明ZrN@COF 的制备成功(图2C)。
图3为制备的GCE、GCE/Au@PANI@CeO2、 GCE/Au@PANI@CeO2/Ab1、GCE/Au@PANI@CeO2/Ab1/LZ、 GCE/Au@PANI@CeO2/Ab1/LZ/cTnI和 GCE/Au@PANI@CeO2/Ab1/LZ/cTnI/Pep-bioconjuates分别进行CV(电位范围 0.5~-0.3V)和EIS(频率范围为10-1~105Hz)测试,因为可以通过测量修饰电极电流强度和阻抗变化来揭示传感器的电化学行为。CV结果如图3A所示, GCE显示出一对典型的氧化还原峰(曲线a);在电极表面修饰 Au@PANI@CeO2后,由于该材料优良的导电性和对电子的传输能力,电化学相应明显地增加(曲线b);当修饰电极与Ab1进行孵育之后,可观察到电流响应有所减小,这是由于生物基质Ab1不导电引起的(曲线c),这也证明了Ab1被成功修饰到了电极表面;被修饰的的电极在与非导电生物物质LZ 孵育之后,电流响应进一步降低,也证明了非特异性位点被成功结合(曲线 d);当cTnI被固定在LZ/Ab1/Au@PANI@CeO2修饰过的电极表面之后,电流减小到了最小值,这也是由于非导电性的cTnI被固定在电极表面的原因 (曲线e);然而,当cTnI/LZ/Ab1/Au@PANI@CeO2修饰的电极与探针材料 Pep/TB/PtPd@ZrN@COF孵育之后,电流响应急剧增加,这可归因于探针材料与cTnI结合之后,材料上的PtPdNFs和ZrN@COF优良的导电性和对TB 的电催化能力促进了电子转移,进而使电流响应增大(曲线f)。该结果与图3B 的EIS结果相一致:GCE的Rct值大约在1000Ω左右(曲线a);当电极表面被Au@PANI@CeO2修饰过后,由于其优良的导电性,Rct值变得很小(曲线b);当修饰电极固定了Ab1之后,Rct值急剧增加,是由于Ab1的不导电的性质所造成的,也证明了Ab1的固定成功(曲线c);当非特异性位点被 LZ结合之后,其Rct值进一步增大(曲线d);修饰电极与cTnI孵育之后,Rct值则达到了最大值,同时也证明了cTnI的成功固定(曲线e);最后,修饰上探针材料之后,由于材料的导电性和电催化能力,Rct值又减小(曲线 f)。这些结果都证明了所制备的电化学生物传感器的可行性。
将步骤(5)中cTnI溶液的浓度分别为0、0.00001、0.00005、0.0001、0.001、 0.005、0.1、1、20、50ng·mL-1,其它的与实施例3相同,制备得到的电化学免疫传感器的使用方法同实施例3,检测下限(LOD)达到3.3fg·mL-1 (S/N=3)。
实施例3制备得到的10个电化学免疫传感器进行DPV(电位范围 0~-0.5V)测试,如图4A所示,在0.00001~50ng·mL-1的浓度范围内,随着 cTnI浓度的增加,电流响应的值也增加,这归因于在更高浓度的cTnI溶液下,在电极上固定的肽的生物共轭物也越多,具有越多的TB信号分子;如图4B所示,电流强度(I)与logCcTnI之间有良好的线性关系,根据3σ准则, LOD为3.3fg·mL-1(S/N=3);相关系数(R2)为0.991,基于PtPd@ZrN@COF 纳米材料具有较大的孔径和良好的生物相容性,制备的生物传感器具有更强的分析性能、更低的检出限、更高的灵敏度和更宽的线性范围,有助于免疫传感器捕获更多的信号分子,进一步地提高检测灵敏度。
图5为实施例3中步骤(7)-(11)中制备的ELISA的可行性以及标准曲线。图5A验证了ELISA的可行性。在没有目标物的条件下,TB的特征峰几乎没有任何变化;然而加入目标物之后,由于目标物与探针材料的结合,使 TB迅速褪色。该结果初步验证了传感器的构建成功。将所构建的ELISA使用酶标仪在633nm条件下来对不同浓度的cTnI进行检测,以此来降低实验时间所带来的误差。如图5B所示,吸光度与cTnI浓度的对数具有良好的线性关系,相关系数(R2)为0.995,LOD为3.3fg·mL-1(S/N=3),显示出了良好的线性和较低的LOD值。
实施例4
一种基于肽和抗体的前列腺特异性抗原双信号检测方法的具体步骤如下:
(1)将玻璃碳电极(GCE)分别用0.3和0.05μm的三氧化二铝(Al2O3) 粉抛光,并分别用乙醇溶液(50%)、硝酸溶液(50%)和去离子水(DW)分别超声3min,用N2干燥备用;
(2)将10μL 1.0mg·mL-1的金纳米粒子负载的聚苯胺包覆的氧化铈复合物(Au@PANI@CeO2)分散液滴在步骤(1)中处理好的电极上上并干燥;
(3)将步骤(2)处理好的电极浸入10μg·mL-1的前列腺特异性抗原的抗体 (Ab1)溶液中并于4℃孵育过夜,孵育完成后用pH=7.0的磷酸盐缓冲液(PBS) 清洗电极表面,晾干;
(4)将10μL 4mg·mL-1的溶菌酶(LZ)溶液滴加到步骤(3)处理好的电极表面,在室温下孵育45min,孵育完成后用pH=7.0的PBS清洗电极表面,晾干;
(5)将浓度为1ng·mL-1的前列腺特异性抗原溶液(PSA)分别滴加到步骤(4)处理好的电极表面,在室温下孵育1h,孵育完成后用pH=7.0的PBS 清洗电极表面,晾干;
(6)将步骤(5)处理好的电极置于1.5mg·mL-1肽的生物探针材料 (Pep/TB/PtPd@ZrN@COF)中孵育1h,孵育完成后用pH=7.0的PBS清洗电极表面,晾干,得到检测不同浓度的PSA的夹心型电化学免疫传感器。
(7)将100μL的1.0μg·mL-1Ab1加入到96孔板中,并在冰箱中孵育过夜,然后用PBS溶液洗去未结合的Ab1。
(8)将100μL 1%的Lz添加到步骤(7)处理好的96孔板中,在25℃下孵育45min。孵育结束后,将板用PBS洗涤并干燥。
(9)在步骤(8)处理好的板中加入100μL1 ng·mL-1的PSA,在25℃下孵育1h,然后用PBS洗涤并干燥。
(10)在步骤(9)处理好的板中加入100μL的0.2mg·mL-1 Pep/PtPd@ZrN@COF生物探针材料,并在相同条件下孵育1h,并将未结合的物质用PBS去除。
(11)将100μL的0.1M NaBH4和相同体积的150μM TB快速添加到步骤 (10)处理好的板中,用微量酶标仪测量其在635nm处的吸光度值。
步骤(2)的金纳米粒子负载的聚苯胺包覆的氧化铈复合物 (Au@PDA@BCN)分散液的制备方法,具体步骤如下:
(1)Au NPs的制备:在50mL DW中加入500μL浓度为23.46mM的HAuCl4溶液,在110℃条件下加热5min,然后迅速加入5mL浓度为14.55 mM的新鲜制备的柠檬酸钠溶液,在110℃条件下沸腾回流30min直至溶液变为酒红色,冷却至室温后得到金纳米粒子分散液,在4℃下储存备用;
(2)CeO2的制备:在1.5mLDW中添加540.0mg Ce(NO3)2·6H2O,然后超声15min使其溶解。随后,向混合物中添加7.5mLNH3·H2O并在室温下搅拌一天。最后,将产物用DW洗涤三次并进行真空干燥。
(3)PANI@CeO2的制备:将500.0mg步骤(2)合成的CeO2分散于200.0 mL的1.0M HCl溶液中并在冰浴中超声处理1h。然后,向混合物中添加5.0 mL的苯胺单体并在冰浴下搅拌1h,之后在搅拌下添加等体积的0.25M过硫酸铵溶液并在4℃下保持12h。用DW洗涤产物,真空干燥产物备用。
(4)Au@PANI@CeO2的制备:称取2.0mg步骤(3)制备好的 PANI@CeO2并配成1.0mL2.0mg·mL-1均匀分散的溶液。在溶液中添加10.0 mL的AuNPs溶液并在4℃下剧烈搅拌4h,随后,以8000rpm的转速离心混合物并用DW洗涤三次以除去多余的AuNPs,最后在1.0mLDW中再悬浮,将材料储存在4℃下备用。
步骤(6)的肽的生物探针材料(Pep/TB/PtPd@ZrN@COF)的制备方法,具体步骤如下:
(1)ZrN NPs的制备:将500.0mg ZrCl4粉末分散在1.0mL乙醇中以形成均匀且透明的溶液。随后,添加相同量的尿素并搅拌使其溶解。将上述混合物老化过夜,使锆被完全络合,得到无色透明的溶胶。最后,在氩气流保护下将所得溶胶在800℃下煅烧3h,然后钝化2h以获得黑色粉末ZrN NPs。
(2)ZrN@COF的制备:将10.4mg 4,4’,4”-phosphinidynetris-benzaldehyde、4.8mg对苯二胺和不同质量的ZrN NPs分别加入10.0mL的高压烧瓶中,然后分别添加0.5mL的1,4-二恶烷和 1.5mL的均三甲苯,超声处理1h。随后,添加0.6mL 6M的乙酸,将容器快速经过三次冷冻-真空-解冻循环使其完全脱气,并置于120℃的油浴锅中反应三天。最后,将产物分别用DMF和四氢呋喃洗涤数次,真空干燥得到不同比例的ZrN@COF。
(3)PtPd@ZrN@COF的制备:在圆底烧瓶中分别加入0.25mL 50.0mM 的PdCl2、1.5mL25.0mM的Na2PtCl4、1.0mL 50.0mg·mL-1PVP和7.3mL 的DW,并在35℃下搅拌半小时。然后用稀的碱溶液将上述混合溶液的pH 调节至9.0左右,之后快速加入0.2mL的水合肼(85%)并在50℃下剧烈搅拌5h。反应完成后,将所获得的铂钯纳米花溶液(PtPdANFs)放在4℃下储存。对于PtPd@ZrN@COF的制备,将1.0mL 2.0mg·mL-1的ZrN@COF 与2.0mL PtPdANFs溶液混合,并在室温下搅拌过夜。最后将混合溶液在 10000rpm下离心15min并洗涤三次,分散在1.0mL DW中,在4℃下储存以备将来使用。
(4)Pep/TB/PtPd@ZrN@COF生物探针的制备:在1.0mL 2.0mg·mL-1的 PtPd@ZrN@COF分散液中加入1.0mL 2.5mg·mL-1的甲苯胺蓝(TB)溶液,在室温下搅拌12h以充分结合,然后用DW洗涤以除去未结合的TB。将混合物重新分散在1.0mL的PBS中。之后,将100μL1.0mg·mL-1的PSA 特异性肽加入上述混合溶液中并在4℃条件下搅拌过夜。用PBS洗掉游离的肽后,将混合物分散在1.0mL的PBS中以获得2.0mg·mL-1的 Pep/TB/PtPd@ZrN@COF生物探针材料,将其储存在4℃备用。
步骤(10)中的Pep/PtPd@ZrN@COF生物探针材料的制备与步骤(6) 的肽的生物探针材料的制备方法相同,只是在过程中不加入TB溶液。
本发明所述使用特异性肽和抗体的PSA双信号检测方法,具体步骤如下:
(1)使用电化学工作站,在三电极体系中,以所制备的特异性肽和抗体的夹心型检测PSA的电化学免疫传感器为工作电极,铂丝电极为对电极,饱和甘汞电极为参比电极,在10mL浓度为0.1M的pH=7.0的磷酸盐缓冲液中进行测试;
(2)利用差分脉冲伏安法(DPV)对目标物进行检测,扫描电压为 0.0~-0.5V,脉冲振幅为0.05V,脉冲宽度为0.05s,记录电流峰值;
(3)记录不同浓度下的PSA对应的电流峰值;
(4)利用工作曲线法,检测不同浓度的PSA溶液,结果表明检测范围为 0.00001~50ng·mL-1,检出限(LOD)达到了3.3fg·mL-1(S/N=3)(图6中A)。
(5)使用酶标仪在635nm处测量检测PSA的ELISA分析液,通过加标回收法,在人工血清中加入1ng·mL-1的PSA,用所构建的电化学传感器实际测得PSA的浓度为0.975ng·mL-1,回收率为97.5%,表明传感器有优异的检测效果。
实施例5
按照实施例3记载的方法制备cTnI的夹心型电化学免疫传感器,区别仅在于采用牛血清蛋白(BSA)替换溶菌酶(Lz)进行封闭,并对电化学免疫传感器进行DPV(电位范围0~-0.5V)测试。
结果见图7。采用所述溶菌酶(Lz)作为封闭剂进行封闭,较牛血清蛋白(BSA)的封闭具有较大优势,在中性pH值附近溶菌酶带正电而使斥力增加,其作为封闭剂的引入可有效减少大部分中性pH条件下带正电的非特异性蛋白的吸附,从而有效降低背景信号。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 云南大学
<120> 一种基于肽和抗体的疾病蛋白标志物的检测试剂盒及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Cys Gly Gly Gly Gly Arg Glu Lys Lys Lys Lys Ile Leu Ala Glu Arg
1 5 10 15
Arg Lys Val Leu
20
Claims (10)
1.一种基于肽和抗体的疾病蛋白标志物的检测试剂盒,其特征在于,包括以下组分:
包被于固相载体的蛋白标志物抗体、肽的生物探针材料Pep/PtPd@ZrN@COF。
2.根据权利要求1所述检测试剂盒,其特征在于,基于ELISA检测原理,所述包被于固相载体的蛋白标志物抗体中固相载体为微孔板。
3.根据权利要求2所述检测试剂盒,其特征在于,所述肽的生物探针材料Pep/PtPd@ZrN@COF的制备方法,包括以下步骤:
1)将ZrCl4和尿素络合,得到溶胶在惰性气体下600~1000℃下煅烧钝化,得到ZrN NPs;
2)将三(四苯甲醛基)磷、对苯二胺、步骤1)中所述ZrN NPs、1,4-二恶烷和均三甲苯混合,在乙酸作用下,经完全脱气,在100~180℃下反应,得到ZrN@COF;
3)在水合肼催化作用下,将PdCl2、Na2PtCl4、PVP进行反应,获得的铂钯纳米花溶液PtPdANFs和步骤2)中所述ZrN@COF混合,得到PtPd@ZrN@COF;
4)将步骤3)中所述PtPd@ZrN@COF的分散液结合蛋白标志物特异性肽,得到Pep/PtPd@ZrN@COF。
4.根据权利要求1所述检测试剂盒,其特征在于,基于电化学生物传感器检测原理,所述包被于固相载体的蛋白标志物抗体中固相载体为金纳米粒子负载的聚苯胺包覆的氧化铈Au@PDA@BCN复合物电极。
5.根据权利要求4所述检测试剂盒,其特征在于,所述金纳米粒子负载的聚苯胺包覆的氧化铈Au@PDA@BCN复合物电极的制备方法,包括以下步骤:
1)将Ce(NO3)2·6H2O和NH3·H2O反应,得到CeO2;
2)在引发剂的作用下将步骤1)中所述CeO2和苯胺单体混合反应,得到聚苯胺包覆的氧化铈材料PANI@CeO2;
3)将步骤2)中聚苯胺包覆的氧化铈材料PANI@CeO2和金纳米粒子混合反应,得到金纳米粒子负载的聚苯胺包覆的氧化铈Au@PDA@BCN复合物;
4)将步骤3)所述金纳米粒子负载的聚苯胺包覆的氧化铈Au@PDA@BCN复合物分散在抛光的碳电极上,封闭,得到Au@PDA@BCN复合物电极。
6.根据权利要求5所述检测试剂盒,其特征在于,步骤1)中Ce(NO3)2·6H2O的质量和NH3·H2O的体积比为100~600mg:1.5~10.5ml。
7.根据权利要求5所述检测试剂盒,其特征在于,步骤2)中CeO2和苯胺单体的质量体积比为100~1000mg:1~8ml。
8.根据权利要求5所述检测试剂盒,其特征在于,步骤3)中PANI@CeO2和金纳米粒子的质量体积比为0.5~10mg:2~10ml。
9.根据权利要求4~8任意一项所述检测试剂盒,其特征在于,所述肽的生物探针材料Pep/PtPd@ZrN@COF为结合有甲苯胺蓝的Pep/PtPd@ZrN@COF。
10.权利要求1~9任意一项所述检测试剂盒在非诊断目标的检测疾病生物标志物中的应用。
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Date | Code | Title | Description |
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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