CN104479670A - 一种氧杂蒽荧光染料分子荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

一种氧杂蒽荧光染料分子荧光探针及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

一种氧杂蒽荧光染料分子荧光探针，在不同的酸碱条件下，荧光染料在单个螺环开环和双螺环开环的异构体之间转化，这种结构转化使染料的共轭体系发生改变，对应溶液颜色、吸收和发射峰的波长及荧光强度发射变化，利用氧杂蒽荧光染料制备氧杂蒽染料酯化衍生物，可作为荧光分子探针材料实现NADH的荧光检测检测。本发明的优点是：该分子荧光探针具有双螺环的六元环稠合体系，染料光学信号的释放受到双螺环结构的控制，螺环结构的开关调控整个分子结构中荧光团氧杂蒽环共轭体系，拓展其吸收和发射波长，使光学信号强度发生相应变化；该探针材料对NADH响应快、选择性高、具有好的生物膜透性，其制备方法简单易行、成本低，经济技术效果明显。

Description

一种氧杂蒽荧光染料分子荧光探针及其制备方法和应用
技术领域
 本发明涉及染料分子荧光探针技术领域，特别是一种氧杂蒽荧光染料分子荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
荧光分析技术作为现代分析化学中的一种重要方法，它是利用荧光分子探针作为光学信号试剂，通过探针材料与目标物的结合使荧光强度或波长等荧光光学信号发生改变的分析检测技术。随着计算机科学、光学成像技术及新型探针标记技术等方面的快速发展，极大推动了荧光分析技术在分子生物学、细胞生物学、医药和新药开发等领域的发展，而该技术的关键就是设计并合成满足各种检测目的的荧光分子探针材料。通过对荧光分子探针的特殊设计而实现高灵敏度、高选择性和原位实时检测等性能，可将微环境生化作用等变化信息转变为光信号，方便微环境性能的分析检测。探针的特性将直接影响到检测结果的准确性、灵敏性。因而，开发适用于荧光标识的探针材料以满足不同检测领域的需求将对化学和生物分析检测具有重要的意义。
基于荧光探针的荧光成像技术由于简单、直观、选择性好、灵敏度高及信息量丰富等特点而广泛应用于化学和生物检测。在细胞和活体组织内的小分子物种检测中，为了获取真实、准确的检测信息，发射波长在近红外区域650 - 900 nm的荧光探针受到了研究者的重视，近红外光检测比可见光检测具有明显的优势，如信噪比高、光信号穿透性强、检测灵敏度高及成像分辨率好等。
目前，许多种类的荧光染料被应用于荧光分析检测领域中，如：荧光素类、罗丹明类、香豆素类、菁染料、氟硼荧类和邻苯二甲醛类化合物等。但是罗丹明类荧光染料的吸收和发射光谱的峰形较狭窄，同时Stokes位移也较小，使其在活体荧光成像中的应用受到限制。同时，荧光受样品背景干扰相对较大、荧光量子产率对酸碱度敏感、在生物体内的生理环境下荧光量子产率降低、对光敏感，在强光检测下容易发生光漂白作用、亲脂性差，不易渗入细胞，因而用于细胞的研究效果差、特异选择性差。虽然具有近红外吸收和发射的菁染料被广泛的应用于细胞成像，但菁染料仍然存在量子产率低、易光漂白的不足。
因此，开发结构新颖的双螺环结构的氧杂蒽染料并拓展其发射波长达到650 nm以上，并利用在不同条件下，荧光染料在单个螺环开环和双螺环开环的异构体之间转化，这种结构转化使染料的共轭体系发生改变，对应溶液颜色、吸收和发射峰的波长及荧光强度发生变化，这种结构转化所产生的丰富光学信号变化信息对满足生物体内小分子检测和活体荧光成像标记具有非常重要的科学意义和实用价值。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术存在的不足，提供一种氧杂蒽荧光染料分子荧光探针及其制备方法和应用，该分子荧光探针具有双螺环的六元环稠合体系，可在无荧光光学信号的螺环内酯异构体和具有荧光光学信号的开环共轭异构体之间转化；该分子荧光探针具有两个酯化基团，具有良好的生物膜透性，对检测NADH响应快、选择性高；其制备方法简单易行、成本低，易于推广应用。
本发明的技术方案：
一种氧杂蒽荧光染料分子荧光探针，化学式为11,13-(3’,3’’-二氧代螺异苯并呋喃)-3,8-二(二乙氨基)苯并吡喃-呫吨1及其类似物13,15-(3’,3’’-二氧代螺异苯并呋喃)-3,9-二(二乙氨基)苯并吡喃-(21,22)-苯撑-呫吨2 和13,15-(3’,3’’-二氧代螺异苯并呋喃)-3,9-二(二乙氨基)苯并吡喃-(21,22)-苯撑-呫吨3，其化学结构式为：
一种所述氧杂蒽荧光染料分子荧光探针的制备方法，步骤如下：
1)将浓度为98wt%的硫酸逐滴加入冰水浴冷却的2-(4-二乙氨基-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸和1,4-二羟基苯的混合液、2-(4-二乙氨基-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸和1,5-二羟基萘的混合液或2-(4-二乙氨基-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸和2，6-二羟基萘的混合液中，避光油浴加热，在温度为80-90 ℃下反应4-6小时，然后冷却至室温，得到反应液；
2) 将上述反应液倒入去离子水中，搅拌并用饱和碳酸氢钠水溶液调节至中性，用乙酸乙酯萃取、干燥后减压蒸馏，除去溶剂后得到粗产品；
3）用硅胶柱层析分离提纯，得到目标产物11,13-(3’,3’’-二氧代螺异苯并呋喃)-3,8-二(二乙氨基)苯并吡喃-呫吨1,按相同分离方法，获得类似物2和3。
所述2-(4-二乙氨基-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸与1,4-二羟基苯、1,5-二羟基萘或2，6-二羟基萘的摩尔比均为2:1；
所述2-(4-二乙氨基-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸和1,4-二羟基苯的混合液或1,5-二羟基萘和2，6-二羟基萘的混合液与98wt%的硫酸的重量比为1:22-30；
所述反应液与去离子水的用量体积比为1：15-25；所述反应液与乙酸乙酯的用量体积比为1：10-15。
本发明所述的氧杂蒽荧光染料分子荧光探针，其核心为双螺环结构的六元稠合体系，在不同的酸碱条件下，荧光染料在单个螺环开环和双螺环开环的异构体之间转化，这种结构转化使染料的共轭体系发生改变，对应溶液颜色、吸收和发射峰的波长及荧光强度发射变化。
一种氧杂蒽荧光染料分子荧光探针的应用，利用氧杂蒽荧光染料制备氧杂蒽染料酯化衍生物，用于NADH的检测。
所述氧杂蒽染料酯化衍生物的制备方法，氧杂蒽染料酯化衍生物4，5和6化学结构式如下：
制备步骤是：
1) 将上述制得的氧杂蒽荧光染料1、2或3、浓度为98wt%的浓硫酸和无水乙醇按照1：4 :200的摩尔比加入到圆底烧瓶中，避光回流加热24-28小时后冷却至室温，得到反应液；
2) 将上述反应液倒入去离子水中，加入固体NaCl，然后用饱和NaHCO3水溶液中和至中性，并用乙酸乙酯萃取干燥，减压蒸馏除去溶剂得到粗产品，通过硅胶柱层析提纯，得到目标产物蓝色固体苯并吡喃-呫吨酯4、5或6，所述反应液与去离子水的用量体积比为1：15-25；反应液与NaCl的摩尔比为1：4；反应液与乙酸乙酯的用量体积比为1：10-15。
所述氧杂蒽染料酯化衍生物用于NADH的检测的方法是：将氧杂蒽染料酯化衍生物作为荧光探针材料，配制成浓度为5×10-3 M的溶液，将探针溶液加到检测对象中，使探针的浓度保持在10×10-6 M，混合均匀之后，用520 nm波长的光激发，测定溶液在580-590 nm 和650 nm以上波长的发射光谱强度，根据标准曲线确定NADH这类物质的含量。
本发明所述的氧杂蒽染料酯化衍生物，其核心为双螺环酯化结构的分子探针，该类氧杂蒽染料酯化衍生物在原始状态下650 nm以上具有较强的荧光发光强度，当探针和NADH作用时发生电子转移反应，形成新的中性分子在650 nm波长以上不发光，而在580-590 nm处荧光强度保持不变。该反应是通过酯化结构与NADH相互作用，发生电子转移从而引起结构间相互转化，促使氧杂蒽染料共轭体系的转化产生相应的光学信号变化，达到荧光检测NADH的目的。
本发明的优点和有益效果是：
氧杂蒽荧光染料为具有近红外发光特征的新型氧杂蒽染料，该染料是一个具有双螺环的六元环稠合体系，染料光学信号的释放受到双螺环结构的控制，螺环结构的开关调控整个分子结构中荧光团氧杂蒽环共轭体系，拓展其吸收和发射波长，使光学信号强度发生相应变化；通过氧杂蒽荧光染料制得的氧杂蒽荧光染料酯化衍生物可作为荧光分子探针材料实现NADH的荧光检测，该探针材料对NADH响应快、选择性高、具有好的生物膜透性，其制备方法简单易行、成本低，经济技术效果明显。
附图说明
图1是该分子探针连续滴定的荧光光谱。
具体实施方式
实施例1：
一种氧杂蒽荧光染料分子荧光探针3的制备路线如下所示：
，
具体制备步骤如下：
1)将10 mL浓度为98wt%的硫酸逐滴加入冰水浴冷却的2-(4-二乙氨基-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸626 mg( 2 mmol)和1,5-二羟基萘160 mg(1 mmol)的混合液中，避光油浴加热，在温度为85 ℃下反应5小时，然后冷却至室温，得到反应液；
2) 将上述反应液倒入150 mL去离子水中，搅拌并用饱和碳酸氢钠水溶液调节至中性，用120 mL乙酸乙酯萃取三次、无水硫酸钠干燥后有机相减压蒸馏，除去溶剂后得到粗产品；
3）用硅胶柱层析分离提纯，得到目标产物13,15-(3’,3’’-二氧代螺异苯并呋喃)-3,9-二(二乙氨基)苯并吡喃-(21,22)-苯撑-呫吨3, 为紫色固体536 mg，产率为75%；熔点： > 300 ℃。
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz, ppm) 8.48 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 8.41 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 8.25 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.81 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 7.8174 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 7.40 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.32-7.12 (m, J = 7.6 Hz, 9H),3.65 (d, J = 7.2 Hz, 8H), 1.16 (t, J = 4.4 Hz, 12H); 13C (DMSO-d6, 100 MHz, ppm) 172.50, 167.21, 167.15, 133.89, 131.73, 130.94, 125.35, 125.18, 125.12, 119.93, 117.08, 116.09, 114.23, 113.24, 47.95, 20.43, 11.75。
该氧杂蒽荧光染料分子荧光探针3的应用，利用氧杂蒽荧光染料制备氧杂蒽染料酯化衍生物，用于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)分子子的检测。所述氧杂蒽染料肼化衍生物的制备方法，氧杂蒽染料酯化衍生物5化学结构式如下：
，
其制备步骤如下：
1) 将上述制得的氧杂蒽荧光染料3714 mg （1mmol）、浓度为98wt%的浓硫酸2 mL和无水乙醇15 mL加入到圆底烧瓶中，避光回流加热25小时后冷却至室温，得到反应液；
2) 将上述反应液倒入255 mL去离子水中，加入固体4.5 g NaCl，然后用饱和NaHCO3水溶液中和至中性，并用200 mL乙酸乙酯萃取三次，干燥，减压蒸馏除去溶剂得到粗产品，通过硅胶柱层析提纯，得到目标产物蓝色固体苯并吡喃-呫吨酯5。熔点： > 300 ℃。
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz, ppm) 7.92 (2H), 7.67 (2H), 7.42 (4H), 7.27 (2H), 7.25 (2H), 6.90 (2H), 6.52 (2H),5.73 (2H), 4.29 (4H), 1.41 (8H), 1.33 (6H), 1.13 (12H);  13C (DMSO-d6, 100 MHz, ppm) 163.58, 149.72, 137.21, 134.32, 128.54, 124.55, 123.49, 116.78, 114.20, 88.40, 42.91, 10.06。
所述氧杂蒽染料酯化衍生物用于NADH的检测的方法是：将上述制得的7.7 mg氧杂蒽染料酯化衍生物5，溶解在2 mL的 N,N-二甲基甲酰胺中制成5×10-3 M的蓝色溶液，取200 μL上述溶液到100 mL容量瓶中，再加入去离子水溶液定容到100 mL而获得1×10-5 M的溶液。在12个3 mL样品瓶中分别加入1×10-5 M的溶液3 mL，然后依次加入0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.4、2.2、3.2、4.4、5.8、7.4、9.2当量的NADH并混合均匀。采用520 nm的激发波长激发测定其荧光光谱。然后用583 nm/653 nm处的荧光发射强度变化比值对[NADH]/[主体5]作图而得到标准工作曲线。根据标准曲线确定NADH的含量。图中表明：在520 nm光激发下，化合物5自身荧光不强，随着NADH的加入，653 nm处的荧光逐渐降低，583 nm处的荧光基本保持不变，并在[NADH]/[主体5] < 9.2时, 583 nm/653 nm处的荧光发射强度变化比值呈线性增强的关系。
如图1所示探针连续滴定的荧光光谱，主体(10 μM)在蒸馏水中加入不同浓度的NADH得到的荧光光谱，插图为探针5在583 nm和653 nm出的发射峰荧光强度比值随NADH浓度变化的曲线图，激发波长为520 nm。
实施例2：
一种氧杂蒽荧光染料分子荧光探针1的制备路线如下所示：
具体制备步骤如下：
1)将10 mL浓度为98wt%的硫酸逐滴加入冰水浴冷却的2-(4-二乙氨基-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸626 mg(2 mmol)和对羟基苯酚110 mg(1 mmol)的混合液中，避光油浴加热，在温度为85 ℃下反应5小时，然后冷却至室温，得到反应液；
2) 将上述反应液倒入150 mL去离子水中，搅拌并用饱和碳酸氢钠水溶液调节至中性，用120 mL乙酸乙酯萃取三次、无水硫酸钠干燥后有机相减压蒸馏，除去溶剂后得到粗产品；
3）用硅胶柱层析分离提纯，得到目标产物1,为紫色固体478 mg，产率为72%；熔点： > 300 ℃。
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz, ppm) 8.17 (2H), 7.77 (4H), 7.39 (2H), 7.39 (2H), 7.34 (H), 7.19 (2H), 7.09 (2H), 3.60 (8H), 1.09 (12H); 13C (DMSO-d6, 100 MHz, ppm) 167.38, 148.04, 134.49, 131.48, 130.99, 128.82, 128.71, 128.44, 127.39, 127.32, 125.51, 118,10, 117.08, 116.09, 115.66, 114.23, 113.24, 48.87, 20.43, 11.40。
该氧杂蒽荧光染料分子荧光探针1的应用，利用氧杂蒽荧光染料制备氧杂蒽染料酯化衍生物，用于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)分子的检测。所述氧杂蒽染料肼化衍生物的制备方法，氧杂蒽染料酯化衍生物4化学结构式如下：
，
其制备方法，具体步骤如下：
1) 将上述制得的氧杂蒽荧光染料1（664 mg）、浓度为98wt%的浓硫酸（2 mL）和无水乙醇(15 mL)按照1：4 :200的摩尔比加入到圆底烧瓶中，避光回流加热24小时后冷却至室温，得到反应液；
2) 2) 将上述反应液倒入255 mL去离子水中，加入固体4.5 g NaCl，反应液与NaCl的摩尔比为1：4，然后用饱和NaHCO3水溶液中和至中性，并用200 mL乙酸乙酯萃取三次，干燥，减压蒸馏除去溶剂得到粗产品，通过硅胶柱层析提纯，得到目标产物蓝色固体苯并吡喃-呫吨酯4。熔点： > 300 ℃。
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz, ppm) 7.92 (2H), 7.67 (2H), 7.42 (1H), 7.27 (2H), 6.52 (1H),4.73 (2H), 4.29 (4H), 1.33 (6H), 1.13 (3H);  13C (DMSO-d6, 100 MHz, ppm) 163.58, 150.72,148.51, 137.21, 136.42,134.32, 128.54, 124.55, 123.49, 116.78, 114.20, 88.40, 42.91, 10.43。
所述氧杂蒽染料酯化衍生物4用于NADH的检测的方法与实施例1相同。
实施例3：
一种氧杂蒽荧光染料分子荧光探针2的制备路线如下所示：
，
具体制备步骤如下：
1)将10 mL浓度为98wt%的硫酸逐滴加入冰水浴冷却的2-(4-二乙氨基-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸626 mg( 2 mmol)和2,6-二羟基萘160 mg( 1 mmol)的混合液中，避光油浴加热，在温度为85 ℃下反应5小时，然后冷却至室温，得到反应液；
2) 将上述反应液倒入180 mL去离子水中，搅拌并用饱和碳酸氢钠水溶液调节至中性，用140 mL乙酸乙酯萃取三次、无水硫酸钠干燥后有机相减压蒸馏，除去溶剂后得到粗产品；
3）用硅胶柱层析分离提纯，得到目标产物氧杂蒽荧光染料2，为紫色固体621 mg，产率为87%；熔点： > 300 ℃。
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz, ppm) 8.24 (2H), 8.03 (2H), 7.67-7.58 (10H), 7.27 (s, 2H), 6.90 (2H), 4.15 (8H),1.22 (12H)；13C (DMSO-d6, 100 MHz, ppm) 172.58, 167.72, 154.21, 152.33, 135.12, 134.99, 131.55, 130.77, 129.14, 128.49, 119.48, 119.23, 119.21, 118.44, 114.42, 114.17, 48.40, 11.06。
该氧杂蒽荧光染料分子荧光探针2的应用，利用氧杂蒽荧光染料制备氧杂蒽染料酯化衍生物，用于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)分子子的检测。所述氧杂蒽染料肼化衍生物的制备方法，氧杂蒽染料酯化衍生物6化学结构式如下：
其制备方法，具体步骤如下：
1) 将上述制得的715 mg氧杂蒽荧光染料2、浓度为98wt%的浓硫酸2 mL和无水乙醇15 mL加入到圆底烧瓶中，避光回流加热28小时后冷却至室温，得到反应液；
2) 将上述反应液倒入280 mL去离子水中，加入4.5 g NaCl，反应液与NaCl的摩尔比为1：4，然后用饱和NaHCO3水溶液中和至中性，并用200 mL乙酸乙酯萃取三次，干燥，减压蒸馏除去溶剂得到粗产品，通过硅胶柱层析提纯，得到目标产物蓝色固体苯并吡喃-呫吨酯6。熔点： > 300 ℃。熔点： > 300 ℃。
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz, ppm) 7.95 (2H), 7.72 (2H), 7.47 (4H), 7.35 (2H), 7.23 (2H), 6.87 (2H), 6.59 (2H),5.78 (2H), 4.21 (4H), 1.45 (8H), 1.37 (6H), 1.16 (12H);  13C (DMSO-d6, 100 MHz, ppm) 163.58,158.21 148.72, 138.22, 136.53, 134.11, 129.56, 126.87, 124.49, 117.22, 114.34, 87.16, 45.98, 11.24。
所述氧杂蒽染料酯化衍生物6用于NADH的检测的方法与实施例1相同。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干简单推演或替换,都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种氧杂蒽荧光染料，其特征在于：化学式为11,13-(3’,3’’-二氧代螺异苯并呋喃)-3,8-二(二乙氨基)苯并吡喃-呫吨1及其类似物13,15-(3’,3’’-二氧代螺异苯并呋喃)-3,9-二(二乙氨基)苯并吡喃-(21,22)-苯撑-呫吨2 和13,15-(3’,3’’-二氧代螺异苯并呋喃)-3,9-二(二乙氨基)苯并吡喃-(21,22)-苯撑-呫吨3，其化学结构式为：
。
2.一种如权利要求1所述氧杂蒽荧光染料的制备方法，其特征在于步骤如下：
1)将浓度为98wt%的硫酸逐滴加入冰水浴冷却的2-(4-二乙氨基-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸和1,4-二羟基苯的混合液、2-(4-二乙氨基-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸和1,5-二羟基萘的混合液或2-(4-二乙氨基-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸和2，6-二羟基萘的混合液中，避光油浴加热，在温度为80-90 ℃下反应4-6小时，然后冷却至室温，得到反应液；
2) 将上述反应液倒入去离子水中，搅拌并用饱和碳酸氢钠水溶液调节至中性，用乙酸乙酯萃取、干燥后减压蒸馏，除去溶剂后得到粗产品；
3）用硅胶柱层析分离提纯，得到目标产物11,13-(3’,3’’-二氧代螺异苯并呋喃)-3,8-二(二乙氨基)苯并吡喃-呫吨1,按相同分离方法，获得类似物2和3。
3.根据权利要求2所述氧杂蒽荧光染料的制备方法，其特征在于：所述2-(4-二乙氨基-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸与1,4-二羟基苯、1,5-二羟基萘或2，6-二羟基萘的摩尔比均为2:1；2-(4-二乙氨基-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸和1,4-二羟基苯的混合液或1,5-二羟基萘和2，6-二羟基萘的混合液与98wt%的硫酸的重量比为1:22-30；反应液与去离子水的用量体积比为1：15-25；所述反应液与乙酸乙酯的用量体积比为1：10-15。
4.一种如权利要求1所述氧杂蒽荧光染料分子荧光探针的应用，其特征在于：利用氧杂蒽荧光染料制备氧杂蒽染料酯化衍生物，用于NADH的检测。
5.根据权利要求4所述氧杂蒽荧光染料分子荧光探针的应用，其特征在于：所述氧杂蒽染料酯化衍生物的制备方法，氧杂蒽染料酯化衍生物4，5和6化学结构式如下：
制备步骤是：
1) 将上述制得的氧杂蒽荧光染料1、2或3、浓度为98wt%的浓硫酸和无水乙醇按照1：4 :200的摩尔比加入到圆底烧瓶中，避光回流加热24-28小时后冷却至室温，得到反应液；
2) 将上述反应液倒入去离子水中，加入固体NaCl，然后用饱和NaHCO3水溶液中和至中性，并用乙酸乙酯萃取干燥，减压蒸馏除去溶剂得到粗产品，通过硅胶柱层析提纯，得到目标产物蓝色固体苯并吡喃-呫吨酯4、5或6，所述反应液与去离子水的用量体积比为1：15-25；反应液与NaCl的摩尔比为1：4；反应液与乙酸乙酯的用量体积比为1：10-15。
6.根据权利要求4所述氧杂蒽荧光染料分子荧光探针的应用，其特征在于：所述氧杂蒽染料酯化衍生物用于NADH的检测的方法是：将氧杂蒽染料酯化衍生物作为荧光探针材料，配制成浓度为5×10-3 M的溶液，将探针溶液加到检测对象中，使探针的浓度保持在10×10-6 M，混合均匀之后，用520 nm波长的光激发，测定溶液在580-590 nm 和650 nm以上波长的发射光谱强度，根据标准曲线确定NADH这类物质的含量。
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