CN105330635B - 色原酮类衍生物和作为荧光染料的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一类色原酮类衍生物和作为荧光染料的用途，具体涉及如通式(I)所示的色原酮类衍生物、其制备方法及其作为荧光分子的用途。这类荧光分子最大激发光谱与发射光谱为：λex～350nm，λem～450nm,为蓝色荧光；在pH5‑8的生物缓冲液中具有较高荧光量子产率和荧光强度，在pH>8的生物缓冲液中具非常高的荧光量子产率和荧光强度；其分子量较小，化合物非常稳定，且有较好的水溶性。可广泛应用于生命科学与基础医学研究，如细胞成像及生化反应定性和定量等。
Description
技术领域
本发明涉及一类新的色原酮类衍生物、其制备方法及其作为荧光染料的用途，如生命科学与基础医学研究领域。
背景技术
荧光分子是指吸收某一波长的光波后能发射出大于吸收光波长的物质，荧光分子化合物通常含有苯环或共轭杂环体系。荧光分子可用于活细胞成像、分子探针的合成、核酸研究、高通量筛选、疾病诊断。由于荧光染料灵敏度高，操作方便，因而其广泛应用于荧光免疫，荧光探针，细胞染色及活体染色等。因此被广泛应用在生命科学、基础医学、信息科学和环境科学等方面。随着应用范围越来越广泛,荧光染料的研究发展迅速且受到了更多的重视。
已有的荧光染料已基本覆盖了由紫外到可见光及红外的整个光谱范围。尽管对于荧光染料的需要越来越多，但是目前的荧光分子种类并不是很多，主要包括以下几大种类：氧杂蒽类(罗丹明、荧光素)，萘类(丹磺酰氯)，香豆素类(7-氨基-4-甲基香豆素)，蒽类(蒽醌)，芘类，噁嗪类(尼罗红、尼罗蓝)，吖啶类(原黄素)，四吡咯(卟啉)。其中普遍用于生物学研究的荧光染料主要是罗丹明类，荧光素类，丹磺酰氯和香豆素类。各种荧光分子的母核决定其具有不同的物理及化学性质，所以不同的荧光分子适合不同的生物研究环境。目前的荧光分子均具有一些不足之处，所以，制备发现不同母核的荧光分子具有重大的意义。
发明内容
本专利中制备的荧光分子化合物在生物缓冲液中(pH>5)时能够释放出很强的荧光，可以广泛地用于生命科学、基础医学、疾病诊断与环境科学中。这类荧光分子可以用来标记蛋白或抗体，用于蛋白或抗体的组织或细胞的免疫成像；可以作为荧光标签与活性化合物设计成分子探针，用于活细胞的细胞成像以及相互作用蛋白的鉴定研究；可以作为荧光标签，用于生物化学筛选中，如酶活性、蛋白相互作用、生物大分子的相互作用的定量定性筛选；可以作为荧光标签，用于临床检测试剂盒的设计中；可以设计成荧光探针，用于环境监测，如苯硫污染水源。
具体而言，本发明包括式I所示的化合物或其盐：
R1独立地选自1-6个碳的烷基、2-6个碳的烯基、2-6个碳的炔基或任选地被1-4个R3基团取代的1-6个碳的烷基、2-6个碳的烯基、炔基；
在每种情况下，R3独立地选自OR4、NR4R5、羧基、醛基、叠氮基、卤素、顺丁烯二酰亚胺、酰肼、羟氨、巯基、三氮唑、生物素、苯环或任选地被1-5个R6基团取代的苯环；
R4和R5独立地选自H、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂环基和杂芳基；
R6独立地选自OR4、NR4R5、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、羧基、醛基、叠氮基、卤素、酰肼、羟氨、巯基、三氮唑、生物素；
n是0或1；
n＝0时，R2选自C3-6环烷基或3-8元饱和的或部分饱和的杂环，其中杂环可任选地被取代并且其含有0-2个选自N、O和S的其它杂原子；
n＝1时，R2选自1-6个碳的烷基、2-6个碳的烯基、炔基或任选地被1-4个R3基团取代的1-6个碳的烷基、2-6个碳的烯基、炔基；R3独立地选自OR4、NR4R5、羧基、醛基、叠氮基、卤素、顺丁烯二酰亚胺、酰肼、羟氨、巯基、三氮唑、生物素、苯环或任选地被1-5个R6基团取代的苯环；R4和R5独立地选自H、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂环基和杂芳基；R6独立地选自OR4、NR4R5、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、羧基、醛基、叠氮基、卤素、酰肼、羟氨、巯基、三氮唑、生物素。
优选的通式I所示的化合物，包括但不限定于，如通式IA所示的化合物
其中：
n是0或1；
n＝0时，R2选自C3-6环烷基或3-8元饱和的或部分饱和的杂环，其中杂环可任选地被取代并且其含有0-2个选自N、O和S的杂原子；
n＝1时，R2选自1-6个碳的烷基、2-6个碳的烯基、炔基或任选地被1-4个R3基团取代的1-6个碳的烷基、2-6个碳的烯基、炔基；R3独立地选自OR4、NR4R5、羧基、醛基、叠氮基、卤素、顺丁烯二酰亚胺、酰肼、羟氨、巯基、三氮唑、苯环或任选地被1-5个R6基团取代的苯环、生物素；
R4和R5独立地选自H、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂环基和杂芳基；R6独立地选自OR4、NR4R5、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、羧基、醛基、叠氮基、卤素、酰肼、羟氨、巯基、三氮唑、生物素。
优选的通式I所示的化合物，包括但不限定于，如通式IB所示的化合物
其中：
R1独立地选自2-6个碳的烷基、2-6个碳的烯、炔基或任选地被1-4个R3基团取代的1-6个碳的烷基、2-6个碳的烯、炔基；
在每种情况下，R3独立地选自OR4、NR4R5、羧基、醛基、叠氮基、卤素、顺丁烯二酰亚胺、酰肼、羟氨、巯基、三氮唑、苯环或任选地被1-5个R6基团取代的苯环、生物素；
R4和R5独立地选自H、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂环基和杂芳基；
R6独立地选自OR4、NR4R5、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、羧基、醛基、叠氮基、卤素、酰肼、羟氨、巯基、三氮唑、生物素；
m是0、1、2或3。
最优选的化合物选自如下群组：
本发明还公开了本发明化合物色原酮结构的合成方法：
氩气保护下，将三氟化硼乙醚溶液(2mL)缓慢滴入试剂I(1eq,5mmol),试剂II(1eq,5mmol)的混合物中，油浴加热110℃，两小时后，薄层层析板检测原料反应完全，移至室温，缓慢滴入甲磺酰氯(1.2mL)，二甲基甲酰胺(2.5mL)溶液，滴毕后，移至油浴加热回流3-5小时，薄层层析板检测反应完全。将反应液倾入冰水中，乙酸乙酯萃取、饱和氯化钠溶液洗涤、硫酸钠干燥，蒸出溶剂。硅胶柱层析分离最终产物，二氯甲烷:甲醇＝100：1。
本发明首先通过测定本发明色原酮衍生物光物理常数(包括但不限定于：摩尔消光系数与最大吸收波长、最大荧光激发波长和荧光吸收波长、以及荧光量子产率)对本专利中荧光分子的光物理性能进行评估，发现本发明的荧光分子在生命科学领域与基础医学领域具有应用前景。
研究发现本发明的荧光分子具有pH依赖的荧光强度。随着pH的增加，本发明荧光分子显示出pH依赖的荧光强度增强。在pH5-8的缓冲溶液中，其显示出的中等荧光强度，这种荧光强度已经足以满足各类生物试验的要求。当pH大于8时，该类荧光分子显示出非常强的荧光量子产率与荧光强度。
本发明的荧光分子在黑白相机下显示出非常强烈的光亮度。在黑白相机下，本发明的荧光分子较商业荧光对照化合物7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)显示出更加明显的荧光亮度。考虑到黑白相机在生物成像(荧光显微镜)中的广泛应用，这更加有利于本专利中的荧光分子在生物成像中的应用。
进一步的研究发现，本发明的荧光分子能用于荧光成像来检测目标化合物在细胞内分布。首先，将目标化合物(含有能够与荧光分子反应的基团，如炔基)与细胞共同孵育，从而使目标化合物特异定位于细胞内，之后将细胞固定。采用荧光分子(含有反应基团，如叠氮基团)，通过化学反应方法(如点击化学)将荧光分子与目标化合物连接到一起形成稳定的化学键(如三氮唑类结构)。之后用0.1M Tris-HCl,pH8.0的缓冲液洗掉没有反应的荧光分子，在倒置显微镜下观察到部分细胞结构发蓝色荧光，也即荧光分子能够特异性的标记目标化合物。
本发明的荧光分子能用于组织样品的荧光成像来检测目标化合物在组织细胞内的分布。组织样品的荧光染色对于荧光染料的要求较高，这是因为组织样品通常对于荧光染料有非特异性的吸附，所以需要荧光染料具有非常强烈的亮度。肿瘤组织的石蜡切片脱蜡后和本发明的荧光染料通过化学反应标记组织细胞内的目标化合物，洗去没有反应的荧光染料后在正置荧光显微镜观察，到肿瘤组织中细胞器结构是显示染蓝色荧光，说明本发明的荧光分子能用于组织的荧光成像。
附图说明
图1，不同pH值下荧光分子IA-1的荧光
图2，本专利中荧光分子IA-1到IA-5与异黄酮类天然产物及商业染料AMC在黑白相机中的成像的比较。第1行的三个孔分别为异黄酮类天然产物(大豆素、芒柄花黄素和黄豆黄素)；第2孔第1孔为商业染料7-氨基-4甲基香豆素(AMC)，第3行5个孔为本专利中的荧光分子IA-1到IA-5。
图3，荧光分子IA-5特异性标记细胞核DNA中的EdU，即细胞核特异性荧光染色
图4，采用荧光染料IA-5标记肿瘤组织细胞核DNA中插入的EdU。
具体实施方式
下面通过实施例来说明本专利的可实施性，本领域的技术人员应该理解，根据现有技术的指导，对相应技术特征进行修改或替换，仍然属于本发明要求保护的范围。
实施例
色原酮结构的合成通法，实施例中所列举的化合物中色原酮结构均参照下述操作合成：
氩气保护下，将三氟化硼乙醚溶液(2mL)缓慢滴入试剂Ⅰ(1eq,5mmol),试剂Ⅱ(1eq,5mmol)的混合物中，油浴加热110℃，两小时后，薄层层析板监测原料试剂反应完全，移至室温，缓慢滴入甲磺酰氯(1.2mL)，二甲基甲酰胺(2.5mL)溶液，滴毕后，移至油浴加热回流3-5小时，薄层层析板监测反应完全。将反应液倾入冰水中，乙酸乙酯萃取、饱和氯化钠溶液洗涤、硫酸钠干燥，蒸出溶剂。硅胶柱层析分离最终产物，二氯甲烷:甲醇＝100：1。
本专利中个别化合物是在已经制备的色原酮类似物的基础上进一步修饰，详见具体的实施例。
实施例1：3-丁基-7-羟基-6-甲氧基-4H-色烯-4-酮化合物(IA-1)
以4-甲氧基-1,3-苯二酚、正己酸为原料，按照合成通法的操作，制备得白色固体434mg。1H NMR(400MHz,DMSO)δ＝10.49(s,1H),8.07(s,1H),7.36(s,1H),6.89(s,1H),3.86(s,3H),2.34(t,J＝7.5Hz,2H),1.56-1.41(m,2H),1.36-1.19(m,2H),0.89(t,J＝7.3Hz,3H)；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ＝180.77,157.90,157.33,157.27,151.93,127.81,120.95,109.52,108.05,61.01,35.52,29.99,27.07,18.98；HRMS(ESI)计算C14H17O4[M+H]+249.11214,获得:249.11201.
实施例2：3-己基-7-羟基-6-甲氧基-4H-色烯-4-酮化合物(IA-2)
以4-甲氧基-1,3-苯二酚、正辛酸为原料，按照合成通法的操作，制备得白色固体46mg。1H NMR(400MHz,Acetone)δ＝10.49(s,1H),8.07(s,1H),7.35(s,1H),6.88(s,1H),3.86(s,3H),2.32(t,J＝7.5,2H),1.47(m,2H),1.28(m,6H),0.86(t,J＝6.6,3H).MS(ESI)C16H21O4[M+H]+277.15.
实施例3：3-(4-氯丁基)-7-羟基-6-甲氧基-4H-色烯-4-酮化合物(IA-3)
以4-甲氧基-1,3-苯二酚、6-氯己酸为原料，按照合成通法的操作，制备得白色固体455mg。1H NMR(300MHz,DMSO)δ＝10.49(s,1H),8.13(s,1H),7.32(s,1H),6.85(s,1H),3.85(s,3H),3.77(t,J＝6.0,2H),2.32(t,J＝7.0,2H),1.82–1.51(m,4H)；MS(ESI)[M+H]+283.07.
实施例4：3-(4-溴丁基)-7-羟基-6-甲氧基-4H-色烯-4-酮化合物(IA-4)
以4-甲氧基-1,3-苯二酚、6-溴己酸为原料，按照合成通法的操作，制备得白色固体489mg。1H NMR(300MHz,DMSO)δ＝10.51(s,1H),8.11(s,1H),7.36(s,1H),6.89(s,1H),3.86(s,3H),3.65(t,J＝6.4Hz,2H),2.37(t,J＝7.1Hz,2H),1.84-1.53(m,4H)；13C NMR(101MHz,DMSO)δ＝175.96,153.18,152.79,152.52,147.19,122.61,116.16,104.74,103.30,56.24,45.64,32.09,25.90,24.75；HRMS(ESI)计算C14H16O4Br[M+H]+327.02265，获得:327.02219.
实施例5：3-(4-叠氮丁基)-7-羟基-6-甲氧基-4H-色烯-4-酮(IA-5)
将3-(4-溴丁基)-7-羟基-6-甲氧基-4H-色烯-4-酮(IA-4)溶于DMF，加入叠氮化钠，室温搅拌24小时，减压蒸去DMF溶剂，经硅胶柱纯化得白色固体19.4mg。1H NMR(300MHz,CD3OD)δ＝8.00(s,1H),7.50(s,1H),6.89(s,1H),3.96(s,3H),3.37-3.29(m,2H),2.54-2.45(m,2H),1.72-1.61(m,4H)；13C NMR(101MHz,MeOD)δ＝177.54,153.45,153.28,152.84,147.03,122.70,115.88,103.54,102.47,55.15,50.81,28.12,25.62,24.77；HRMS(ESI)计算C14H16O4N3[M+H]+290.11325,获得:290.11353.
实施例6：4-(7-羟基-6-甲氧基-4-氧-4H-色烯-3-基)丁酸(IA-6)
将3-(4-溴丁基)-7-羟基-6-甲氧基-4H-色烯-4-酮(IA-4)溶于DMF，加入氰化钠，室温搅拌24小时，小心地将反应液慢慢加入到1mol/L的盐酸水溶液中，室温搅拌过夜，二氯甲烷提取，无水硫酸镁干燥，过滤浓缩得粗产物，经硅胶柱纯化得白色固体55mg。1H NMR(300MHz,CD3OD)δ＝7.14(s,1H),7.00(s,1H),6.79(s,1H),3.86(s,3H),2.38–2.42(m,2H),2.29–2.31(m,2H),1.48–1.52(m,2H)，1.26–1.29(m,2H)；MS(ESI)[M+H]+293.09.
实施例7：3-(4-羟基丁基)-7-羟基-6-甲氧基-4H-色烯-4-酮化合物(IA-7)
将3-(4-溴丁基)-7-羟基-6-甲氧基-4H-色烯-4-酮化合物(IA-4)加入到1mol/L氢氧化钠水溶液中，室温搅拌24小时后，用浓盐酸将反应液PH调到强酸性，二氯甲烷提取，无水硫酸镁干燥，过滤浓缩得粗产物，经硅胶柱纯化得白色固体27mg。1H NMR(300MHz,DMSO)δ＝8.13(s,1H),7.32(s,1H),6.91(s,1H),3.82(s,3H),3.61(t,J＝5.9,2H),2.32(t,J＝6.8,2H),1.62–1.82(m,4H)；MS(ESI)[M+H]+265.10.
实施例8：4-(7-羟基-6-甲氧基-4-氧-4H-色烯-3-基)丁醛(IA-8)
将干燥得DMSO(2eq)混溶于无水二氯甲烷，冷却至-65℃，滴加三氟乙酸酐(1.5eq)的无水二氯甲烷溶液，搅拌半小时后，将3-(4-羟基丁基)-7-羟基-6-甲氧基-4H-色烯-4-酮化合物(IA-7)混溶于无水二氯甲烷中滴入反应体系，同温搅拌半小时后，滴加三乙胺后自然升温至室温，然后二氯甲烷提取，水洗，无水硫酸镁干燥，过滤浓缩得粗产物，经硅胶柱纯化得白色固体11mg。1H NMR(300MHz,DMSO)δ＝9.77(s,1H),8.15(s,1H),7.33(s,1H),6.88(s,1H),3.80(s,3H),2.38–2.44(m,4H),1.70-1.72(m,2H),；MS(ESI)[M+H]+263.09.
实施例9：4-(7-羟基-6-甲氧基-4-氧-4H-色烯-3-基)丁胺(IA-9)
将3-(4-溴丁基)-7-羟基-6-甲氧基-4H-色烯-4-酮化合物(IA-5)加入到液氨中，维持外温-50℃搅拌12小时，升至室温后，反应残余物用二氯甲烷提取，水洗，无水硫酸镁干燥，过滤浓缩得粗产物，经硅胶柱纯化得白色固体106mg。1H NMR(300MHz,CD3OD)δ＝7.10(s,1H),6.99(s,1H),6.78(s,1H),3.82(s,3H),2.55–2.47(m,2H),2.30–2.33(m,2H),1.46–1.49(m,2H)，1.27–1.31(m,2H)；MS(ESI)[M+H]+264.13.
实施例10：4-(7-羟基-6-甲氧基-4-氧-4H-色烯-3-基)丁酰肼(IA-10)
将4-(7-羟基-6-甲氧基-4-氧-4H-色烯-3-基)丁酸(IA-6)与BOC酸酐(5eq)溶于无水二氯甲烷，室温搅拌3小时。将反应体系水洗后，无水硫酸镁干燥，浓缩后溶于二氯亚砜，回流1小时后将过量二氯亚砜蒸除。向反应体系中加入过量水合肼，室温搅拌5小时进行羧基肼化反应，然后二氯甲烷提取，水洗，酸洗(反复振摇)，再水洗，无水硫酸镁干燥，过滤浓缩得粗产物，经硅胶柱纯化得白色固体31mg。1H NMR(300MHz,CD3OD)δ＝8.02(brs,1H),7.12(s,1H),7.00(s,1H),6.81(s,1H),3.83(s,3H),2.37–2.40(m,2H),2.29–2.32(m,2H),1.46–1.50(m,2H)，1.25–1.27(m,2H)；MS(ESI)[M+H]+307.12.
实施例11：3-(4-(二甲胺基)丁基)-7-羟基-6-甲氧基-4-氧-4H-色烯-4-酮(IA-11)
将4-(7-羟基-6-甲氧基-4-氧-4H-色烯-3-基)丁胺(IA-9)与甲基碘(2当量)，经过硅胶柱纯化得白色固体89mg。1H NMR(500MHz,DMSO)δ＝8.07(s,1H),7.35(s,1H),6.89(s,1H),3.86(s,3H),2.34(dd,J＝8.7,5.3,4H),2.21(s,6H),1.53–1.40(m,4H).MS(ESI)[M+H]+292.15.
实施例12：(E)-3-(2-丁烯基)-7-羟基-6-甲氧基-4H-色烯-4-酮(IA-12)
以4-甲氧基-1,3-苯二酚、(E)-4-己烯酸为原料，按照合成通法的操作，制备得白色固体310mg。1H NMR(300MHz,CD3OD)δ＝7.11(s,1H),6.99(s,1H),6.79(s,1H),5.40–5.45(m,2H),3.82(s,3H),2.62–2.66(m,2H),2.05(d,J＝6.4,2H)；MS(ESI)[M+H]+245.09.
实施例13：3-(4-戊炔基)-7-羟基-6-甲氧基-4H-色烯-4-酮(IA-13)
以4-甲氧基-1,3-苯二酚、6-庚炔酸为原料，按照合成通法的操作，制备得白色固体268mg。1H NMR(300MHz,CD3OD)δ＝7.07(s,1H),6.96(s,1H),6.82(s,1H),3.82(s,3H),2.85(t,J＝3.0,1H)，2.42–2.53(m,4H),1.48–1.55(m,2H)；MS(ESI)[M+H]+259.11.
实施例14：3-(乙酰硫代丁基)-7-羟基-6-甲氧基-4H-色烯-4-酮(IA-14)
以4-甲氧基-1,3-苯二酚、6-乙酰硫代己酸为原料，按照合成通法的操作，制备得白色固体128mg。1H NMR(500MHz,DMSO)δ＝8.25(s,1H),8.09(d,J＝8.7,1H),7.48(d,J＝2.1,1H),7.26(dd,J＝8.7,2.1,1H),2.41–2.35(m,2H),2.33(s,3H),1.49(dt,J＝12.7,7.5,2H),1.31(dt,J＝14.6,7.4,2H),0.90(t,J＝7.3,3H)；MS(ESI)[M+H]+323.14.
实施例15：3-环己基-7-羟基-6-甲氧基-4H-色烯-4-酮(IA-15)
以4-甲氧基-1,3-苯二酚、2-环己基乙酸为原料，按照合成通法的操作，制备得白色固体141mg。1H NMR(300MHz,CD3OD)δ＝7.16(s,1H),6.98(s,1H),6.81(s,1H),3.84(s,3H),1.58–1.63(m,6H)，1.10–1.14(m,5H)；MS(ESI)[M+H]+275.12.
实施例16：7-羟基-6-甲氧基-3-苯甲基-4H-色烯-4-酮(IA-16)
以4-甲氧基-1,3-苯二酚、3-苯基丙酸为原料，按照合成通法的操作，制备得白色固体81mg；1H NMR(400MHz,DMSO)δ＝10.53(s,1H),8.20(s,1H),7.34(s,1H),7.31-7.23(m,4H),7.16(t,J＝6.9Hz,1H),6.90(s,1H),3.84(s,3H),3.68(s,2H)；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ＝180.41,158.24,158.04,157.34,152.03,145.12,133.74,133.41,131.19,127.62,120.97,109.58,108.11,61.00,35.94；HRMS(ESI)计算C17H15O4[M+H]+283.09649,获得:283.09628.
实施例17：7-羟基-6-甲氧基-3-苯乙基-4H-色烯-4-酮(IA-17)
以4-甲氧基-1,3-苯二酚、苯丁酸为原料，按照合成通法的操作，制备得白色固体488mg。1H NMR(400MHz,DMSO)δ＝10.52(s,1H),7.98(s,1H),7.39(s,1H),7.31-7.25(m,2H),7.21-7.15(m,3H),6.88(s,1H),3.87(s,3H),2.82(t,J＝7.6Hz,2H),2.64(t,J＝7.6Hz,2H)；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ＝180.73,157.98,157.64,157.26,151.99,146.64,133.57,133.53,131.10,126.99,120.96,109.52,108.08,61.02,39.22,32.38；HRMS(ESI)计算C18H17O4[M+H]+297.11214,获得:297.11191.
实施例18：4-(3-(7-羟基-6-甲氧基-4-氧代-4H-色烯-3-基)丙基)四氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-2(3H)-酮(IA-18)
以4-甲氧基-1,3-苯二酚、生物素为原料，按照合成通法的操作，制备得白色固体16mg。1H NMR(400MHz,DMSO)δ＝10.50(s,1H),8.06(s,1H),7.36(s,1H),6.89(s,1H),6.43(s,1H),6.35(s,1H),4.44-4.26(m,1H),4.20-4.12(m,1H),3.86(s,3H),3.20-3.09(m,1H),2.83(dd,J＝12.4,4.9Hz,1H),2.58(d,J＝12.4Hz,1H),2.37(t,J＝6.7Hz,2H),1.68-1.43(m,4H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ＝175.39,162.58,152.60,152.19,151.92,146.60,122.01,115.59,104.18,102.71,60.97,59.08,55.67,55.16,40.11,27.85,27.47,24.92；HRMS(ESI)计算C18H21O5N2S[M+H]+377.11657,获得:377.11627.
实施例19：7-羟基-6-甲氧基-3-(4-(4-苯基-1H-1,2,3-三氮唑-1-基)丁基)--4H-色烯-4-酮(IA-19)
将3-(4-叠氮丁基)-7-羟基-6-甲氧基-4H-色烯-4-酮(IA-5)与苯乙炔在点击化学的条件下(碘化亚铜，DMF为溶剂)的条件下反应，采用减压蒸走DMF，之后经硅胶柱层析纯化得到白色化合物34mg。1H NMR(500MHz,DMSO)δ＝10.51(s,1H),8.59(s,1H),8.11(s,1H),7.85(s,1H),7.83(s,1H),7.51–7.40(m,3H),7.39–7.30(m,2H),6.89(s,1H),4.42(d,J＝6.5,2H),3.86(s,2H),2.40(s,2H),1.88(s,2H),1.52(s,2H).MS(ESI)[M+H]+392.10.
实施例20：3-(2-环辛炔基)乙基-7-羟基-6-甲氧基-4H-色烯-4-酮(IA-20)
以4-甲氧基-1,3-苯二酚、2-环辛炔基丁酸为原料，按照合成通法的操作，制备得白色固体45mg。1H NMR(300MHz,CD3OD)δ＝7.08(s,1H),6.95(s,1H),6.83(s,1H),3.85(s,3H),2.50-2.52(m,1H),1.96–1.99(m,4H),1.24–1.46(m,10H)；MS(ESI)[M+H]+327.15.
实施例21：3-吗啉丁基-7-羟基-6-甲氧基-4H-色烯-4-酮(IA-21)
将3-(4-溴丁基)-7-羟基-6-甲氧基-4H-色烯-4-酮化合物(IA-4)与吗啉按照1：1当量溶于DMF中，在Na2CO3及碘化钾的存在，80℃反应8个小时之后，将DMF采用低压蒸馏的方式去除，采用硅胶柱层析的方法分离，制备得白色固体45mg。1H NMR(500MHz,DMSO)δ＝10.58(s,1H),8.13(s,1H),7.35(s,1H),6.93(s,1H),3.94(d,J＝12.5,2H),3.86(s,3H),3.74(t,J＝11.6,2H),3.38(d,J＝9.7,2H),3.16–2.93(m,4H),2.38(t,J＝7.2,2H),1.73–1.63(m,2H),1.59–1.49(m,2H).MS(ESI)[M+H]+202.08.
实施例22：3-(N-甲基哌嗪)丁基-7-羟基-6-甲氧基-4H-色烯-4-酮(IA-22)
将3-(4-溴丁基)-7-羟基-6-甲氧基-4H-色烯-4-酮化合物(IA-4)与N-甲基哌嗪按照1：1当量溶于DMF中，在Na2CO3及碘化钾的存在下，80℃反应8个小时之后，将DMF采用低压蒸馏的方式去除，采用硅胶柱层析的方法分离，制备得白色固体23mg。1H NMR(400MHz,Acetone)δ＝10.57(br.s,1H),8.10(s,1H),7.35(s,1H),6.92(s,1H),3.86(s,3H),2.92(m,6H),2.68(m,2H),2.24(m,7H),1.51(m,4H)；MS(ESI)[M+H]+347.19.
实施例23：3-对羟基苯甲基-7-羟基-6-甲氧基-4H-色烯-4-酮(IA-23)
将3-(4-溴丁基)-7-羟基-6-甲氧基-4H-色烯-4-酮化合物(IA-4)与对羟基苯丙酸按照1：1当量溶于DMF中，在Na2CO3及碘化钾的存在下，80℃反应8个小时之后，将DMF采用低压蒸馏的方式去除，采用硅胶柱层析的方法分离，制备得白色固体49mg。1H NMR(400MHz,DMSO)δ＝10.52(s,1H),9.14(s,1H),8.09(s,1H),7.34(s,1H),7.07(d,J＝8.4,2H),6.89(s,1H),6.64(d,J＝8.4,2H),3.85(s,3H),3.56(s,2H).MS(ESI)[M+H]+299.08.
实施例24：3-对碘苯甲基-7-羟基-6-甲氧基-4H-色烯-4-酮(IA-24)
将3-(4-溴丁基)-7-羟基-6-甲氧基-4H-色烯-4-酮化合物(IA-4)与4-碘苯丙酸按照1：1当量溶于DMF中，在Na2CO3及碘化钾的存在下，80℃反应8个小时之后，将DMF采用低压蒸馏的方式去除，采用硅胶柱层析的方法分离，制备得白色固体78mg。1H NMR(400MHz,DMSO)δ＝10.55(s,1H),8.23(s,1H),7.61(d,J＝8.0,2H),7.33(s,1H),7.11(d,J＝8.0,2H),6.90(s,1H),3.84(s,3H),3.63(s,2H).MS(ESI)[M+H]+408.98.
试验例
试验例1：光物理常数测定的具体操作
(1)摩尔消光系数与最大吸收波长的测定
将测定的化合物溶于0.1M Tris-HCl,pH8.0至终浓度为10μM,以0.1MTris-HCl,pH8.0溶液为参比，采用SHIMADU UV-2700紫外分光光度计扫描测定化合物在200-700nm之间的最大吸收波长，以及在最大吸收波长下的吸光值从而计算摩尔消光系数。
(2)最大荧光吸收波长和发射波长
采用0.1M Tris-HCl,pH8.0的缓冲溶液溶解测定的化合物为终浓度0.5μg/ml,采用HITACHI F-7000荧光分光光度计，首先设定激发波长为350nm，扫描化合物的最大发射波长并记录，之后设定发射波长为460nm，扫描化合物的最大荧光激发波长并记录。
(3)荧光量子产率的测定
以硫酸奎宁(Ф＝0.54,0.1M H2SO4)为参比，采用HITACHI F-7000荧光分光光度计，测定计算化合物的荧光量子产率。将硫酸奎宁与待测化合物分别溶解于0.1M H2SO4与0.1M Tris-HCl,pH8.0的缓冲溶液，最终的浓度为0.5μg/ml。首先测量他们在345nm下的吸光值,之后测定这些化合物在激发波长为345nm，发射光从365nm-600nm的积分值，计算这类化合物的荧光量子产率。计算公式如下：
ФX＝ФST(ASTFx/AXFST)(nX/nST)2
其中X和ST分别代表测试化合物与参比化合物，Ф指荧光量子产率，A指激发波长下的光吸收值，F指发射光谱的积分值，n指溶剂的折射率。
最后，采用紫外分光光度计扫描这类化合物(10μM在0.1M Tris-HCl,pH8.0的缓冲液)在200nm至700nm之间的最大紫外吸收波长以及在最大吸收波长下的摩尔消光系数。
本发明中所列的化合物在0.1M Tris-HCl,pH8.0缓冲溶液中的荧光量子产率均在0.3到0.5之间，其摩尔消光系数在1-2×105M-1·cm-1之间。均适合用具体的生物测试中，具体数值见表1。
表1：色原酮衍生物的物理常数测定
(4)化合物荧光强度的pH依赖性
用MeOH：H2O(1：1)的溶液调节不同的pH值(1-12)。将化合物IA-1分别溶于上述溶液中，至最终浓度为0.5μg/ml。采用HITACHI F-7000荧光分光光度计，设定激发波长为345nm，分别扫描化合物IA-1在不同pH溶液中的荧光强度。实验结果如(图1)所示。
随着pH的增加，荧光分子IA-1显示出pH依赖的荧光强度增强。在pH5-8的缓冲溶液中，其显示出中等荧光强度。当pH大于8时，该类荧光分子显示出非常强的荧光量子产率与荧光强度。
(5)化合物在黑白相机下荧光亮度的比较
将异黄酮类天然产物(大豆素、芒并花黄素和黄豆黄素)，商业荧光对照化合物7-氨基-4甲基香豆素(AMC)，本专利中的荧光分子IA-1，IA-2，IA-3，IA-4，IA-5分别溶于0.1MTris-HCl,pH8.0的缓冲溶液中，最终浓度为10μM。在345nm的紫外激发灯下，采用黑白相机拍取照片。
实验结果如图2所示，第1行的三个孔分别为异黄酮类天然产物(大豆素、芒柄花黄素和黄豆黄素)；第2孔第1孔为商业染料7-氨基-4甲基香豆素(AMC)，第3行5个孔为本专利中的荧光分子IA-1到IA-5。
实验结果显示：以荧光分子IA-1到IA-5为例，这类荧光分子在黑白相机成像的照片。在黑白相机下，本专利所制备的荧光分子展示出比商业染料AMC更加强的荧光亮度。
试验例2：化合物IA-5在生命科学与基础科学中的应用示例
(1)化合物IA-5在细胞荧光成像中的应用
首先，将5-乙炔基-2-脱氧尿苷(EdU)与HepG2细胞共同孵育12小时，EdU随着细胞生长而插入到DNA中。采用PBS缓冲液洗去培养基之后采用4％的多聚甲醛固定细胞10分钟，PBS缓冲液洗2次。采用1％的Triton X-100通透细胞5分钟，PBS洗2次。将含有叠氮基团的荧光分子IA-5溶于点击化学反应液(2mol％CuSO4,10mol％抗坏血酸钠)至终浓度为5μM，室温孵育30分钟，荧光分子IA-5与EdU连接到一起形成三氮唑类化合物。之后用0.1M Tris-HCl,pH8.0的缓冲液洗掉没有反应的荧光分子IA-5。在倒置显微镜下观察到荧光分子能够特异性的标记细胞核，也即证明了EdU特异性插入DNA中(图3)。
(2)化合物IA-5在组织荧光成像中的应用
将1×106lewis肺癌细胞皮下种植于成年雌性C57BL鼠。肿瘤细胞生长10天后成为肿瘤组织，小鼠腹下注射50mg/kg体重的EdU，继续饲养2天后，将小鼠处死，取出肿瘤组织。将肿瘤组织采用4％的多聚甲醛固定一晚，之后采用石蜡包埋，之后切割成5-10μM的组织切片。
将切好的石蜡切片脱蜡后，加入5μM的荧光染料IA-5于点击化学反应液(2mol％CuSO4,10mol％抗坏血酸钠)中，并加入覆盖在石蜡切片之上。反应30min之后，采用0.1MTris-HCl,pH8.0的缓冲液洗去没有反应的荧光染料IA-5，之后在正置荧光显微镜观察。
在正置荧光显微镜观察到肿瘤组织中部分细胞核是显示染蓝色荧光(图4)。
参考文献
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Claims (7)
1.式I所示的化合物或其盐：
其中：
R1独立地选自1-6个碳的烷基、2-6个碳的烯基、2-6个碳的炔基或被1-4个R3基团取代的1-6个碳的烷基、2-6个碳的烯基、2-6个碳的炔基；
在每种情况下，R3独立地选自OR4、NR4R5、羧基、醛基、叠氮基、卤素、顺丁烯二酰亚胺、酰肼、羟氨、巯基、三氮唑、生物素、苯环或被1-5个R6基团取代的苯环；
R4和R5独立地选自H；
R6独立地选自OR4、NR4R5、羧基、醛基、叠氮基、卤素、酰肼、羟氨、巯基、三氮唑、生物素；
n是0或1；
n＝0时，R2选自C3-6环烷基或3-8元饱和的或部分饱和的杂环，其中杂环含有0-2个选自N、O和S的杂原子；
n＝1时，R2选自1-6个碳的烷基、2-6个碳的烯基、2-6个碳的炔基或被1-4个R3基团取代的1-6个碳的烷基、2-6个碳的烯基、2-6个碳的炔基。
2.根据权利要求1的化合物或其盐，其特征在于，如通式IA所示
其中：
n是0或1；
n＝0时，R2选自C3-6环烷基或3-8元饱和的或部分饱和的杂环，其中杂环含有0-2个选自N、O和S的杂原子；
n＝1时，R2选自1-6个碳的烷基、2-6个碳的烯基、2-6个碳的炔基或被1-4个R3基团取代的1-6个碳的烷基、2-6个碳的烯基、2-6个碳的炔基；R3独立地选自OR4、NR4R5、羧基、醛基、叠氮基、卤素、顺丁烯二酰亚胺、酰肼、羟氨、巯基、三氮唑、生物素、苯环或被1-5个R6基团取代的苯环；
R4和R5独立地选自H；R6独立地选自OR4、NR4R5、羧基、醛基、叠氮基、卤素、酰肼、羟氨、巯基、三氮唑、生物素。
3.化合物选自如下群组：
4.如通式IB所示的化合物或其盐，
其中：
R1独立地选自2-6个碳的烷基、2-6个碳的烯基、2-6个碳的炔基或被1-4个R3基团取代的1-6个碳的烷基、2-6个碳的烯基、2-6个碳的炔基；
在每种情况下，R3独立地选自OR4、NR4R5、羧基、醛基、叠氮基、卤素、顺丁烯二酰亚胺、酰肼、羟氨、巯基、三氮唑、生物素、苯环或被1-5个R6基团取代的苯环；
R4和R5独立地选自H；
R6独立地选自OR4、NR4R5、羧基、醛基、叠氮基、卤素、酰肼、羟氨、巯基、三氮唑、生物素；
m是0、1、2或3。
5.化合物选自如下群组：
6.权利要求1-5中任一项的化合物在制备荧光染料中的用途。
7.根据权利要求6的用途，其特征在于，所述的用途是在生命科学与基础医学的研究中的应用。
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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