CN114891021B - 一种用于线粒体定位荧光染料及其制备方法 - Google Patents

一种用于线粒体定位荧光染料及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114891021B
CN114891021B CN202210518711.2A CN202210518711A CN114891021B CN 114891021 B CN114891021 B CN 114891021B CN 202210518711 A CN202210518711 A CN 202210518711A CN 114891021 B CN114891021 B CN 114891021B
Authority
CN
China
Prior art keywords
dye
fluorescent dye
mitochondrial localization
dichloromethane
dtpo
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210518711.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114891021A (zh
Inventor
高启航
曾珍
曾宪顺
刘畅
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tianjin University of Technology
Original Assignee
Tianjin University of Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tianjin University of Technology filed Critical Tianjin University of Technology
Priority to CN202210518711.2A priority Critical patent/CN114891021B/zh
Publication of CN114891021A publication Critical patent/CN114891021A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114891021B publication Critical patent/CN114891021B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D495/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D495/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D495/04—Ortho-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B57/00—Other synthetic dyes of known constitution
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
    • C09K11/06—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1018—Heterocyclic compounds
    • C09K2211/1025—Heterocyclic compounds characterised by ligands
    • C09K2211/1096—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing other heteroatoms

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明提供了一种用于线粒体定位的荧光染料及其制备方法。该染料由4‑二乙氨基酮酸和3‑甲氧基噻吩缩合而成，且3‑甲氧基噻吩之间发生偶联。该染料的制备原料易得、制备步骤简单。本发明的染料具有高的光学稳定性、宽的pH适用范围、良好的细胞膜透过性和其螺环内酯的羧基可被修饰成相关的生物示踪器。其衍生物对于专一检测细胞中线粒体有极大的发展潜力。本发明提供的线粒体定位的荧光染料可用于新型荧光探针的设计开发。

Description

一种用于线粒体定位荧光染料及其制备方法
技术领域
本发明涉及荧光染料和成像领域，具体涉及一种用于线粒体定位荧光染料的制备方法及生物成像应用。
背景技术
线粒体是一种十分重要的细胞器，被誉为“动力工厂”。这是因为几乎所有生物的主要能量都是由其以三磷酸腺苷(ATP)形式产生的。通过一系列氧化磷酸化过程产生的ATP作为辅酶和能量促进各种细胞活动。研究表明线粒体的代谢紊乱与包括阿尔兹海默症在内的多种疾病的发生发展有着密切联系。因此监测其形态及与多种细胞器的相互作用，对深刻理解复杂的细胞生命活动非常必要。
目前广泛使用的绿色商业线粒体染料为基于花菁染料的MitoTracker Green，花菁染料量子产率低且易被生物体内的单线态氧氧化而淬灭，光稳定性差，无法对活细胞内线粒体动态过程进行长时间示踪。而荧光成像检测技术因其高灵敏度、高时间和空间分辨率、实时原位和非侵入性检测的优点的检测特点，在这类生命科学领域的研究中备受青睐。为了满足可以长时间观察线粒体动态这一需求，故开发一种高稳定性、高灵敏性、用于活细胞线粒体检测的荧光染料显得有尤为迫切。
发明内容
本发明的目的是开发一种高稳定性、高灵敏性、用于活细胞线粒体检测的荧光染料，解决商用线粒体定位荧光染料灵敏度低、光稳定性差的问题，并提供该染料的制备方法，该染料可定位线粒体，并用于生物成像。合成方法所需原料易得、合成步骤简单、成本低且其可衍生化生物相关的示踪物。
为实现上述目的，本发明所采取的解决方案如下：
一种用于线粒体定位的荧光染料，该染料为双噻吩融合氧杂蒽类衍生物，中文名称为：6’-(二乙基氨基)-2’-(3-甲氧基噻吩-2-基)-3H-螺[2-苯并呋喃-1，9’噻吩并[3,2-b]色烯]-3-酮，简称为DTPO，其结构通式如下：
式中：R1为H、甲基、乙基或其他烷基；R2为甲基、乙基、或其它烷基、或丙撑基。
所述用于线粒体定位的荧光染料的制备方法，具体合成路线如下：
制备步骤如下：
1)将4-二乙氨基酮酸和3-甲氧基噻吩加入到装有甲磺酸的圆底烧瓶中，放入到80-100℃油浴锅中密封搅拌12-36h；反应完成后冷却至室温，得到反应液；
2)将上述反应液冷却后倒入去离子水中搅拌，并用饱和NaHCO3溶液进行中和至pH＝7，用二氯甲烷萃取三次，有机相用无水硫酸钠干燥后旋转蒸馏除去二氯甲烷得到粗产品，粗产品用二氯甲烷/乙醇(v/v20-10：1)柱层层析硅胶分离纯化得到目标产物为黑色固体DTPO。
所述4-二乙氨基酮酸和3-甲氧基噻吩的摩尔比为1：1-3。
所述4-二乙氨基酮酸和3-甲氧基噻吩的总重量与溶剂甲磺酸的重量比为1：8-12。
所述反应液与去离子水的用量体积比为1：15-25；所述反应液与二氯甲烷的用量体积比为1：10-15。
本发明所述的用于线粒体定位的荧光染料是由4-二乙氨基酮酸与3-甲氧基噻吩缩合得到，且噻吩之间发生偶联，因其螺环内酯的存在，故该染料可以实现“开-关”机制。
本发明的优点和有益效果如下：
本发明所提供的一种用于线粒体定位荧光染料DTPO，具有对pH稳定、光稳定性好、较好的水溶性、良好的细胞膜通透性及优良的线粒体定位性能。并且荧光染料DTPO的螺环内酯的羧基易被修饰成生物相关的示踪物，可设计多种荧光探针。同时本发明提供的该染料的制备方法简单易行、成本低，经济技术效果明显。
附图说明
图1为染料DTPO(10μM)在加入0.2％甲磺酸后的不同溶剂的紫外吸收图。
图2为染料DTPO(10μM)在加入0.2％甲磺酸后的不同溶剂的荧光发射图，激发波长：560nm；狭缝：2.5nm，5nm)。
图3为染料DTPO(1μM)与海拉细胞培养30分钟细胞成像图。a)红色通道：染料DTPO，激发波长：559nm；收集波段：605-705nm；标尺：b)细胞的明场图c)红色通道和明场叠加图。(标尺：30μM)
图4为染料DTPO(0.5μM)与线粒体定位剂(0.2μM)共培养荧光成像图。a)绿色通道：商用线粒体定位剂，激发波长：488nm；收集波段：500-545nm；b)红色通道：染料DTPO，激发波长：559nm；收集波段：605-705nm；c)绿色通道、红色通道和明场叠加图；d)绿色通道和红色通道重叠荧光强度点状图；e)绿色通道和红色通道感兴趣区域线状图。(标尺：30μM)。
具体实施方式
为了更好的理解本发明的技术方案，以下通过附图和具体的实施例作进一步详细叙述：
1)实施例1
染料DTPO的合成
将4-二乙氨基酮酸(0.78g,2.5mmol)和3-甲氧基噻吩(0.53mL,5mmol)加入到装有10mL甲磺酸的圆底烧瓶中，放入到90℃油浴锅中密封搅拌24h。反应完成后冷却至室温，得到反应液。
将上述反应液倒入250mL的去离子水中搅拌，并用饱和NaHCO3溶液进行中和至pH＝7，并用二氯甲烷萃取(50mL)三次，有机相用无水硫酸钠干燥，旋转蒸馏除去二氯甲烷得到粗产品，粗产品用二氯甲烷/乙醇(v/v20-10：1)柱层层析硅胶进行分离纯化得到目标产物，为黑色固体DTPO(127.83mg，产率为10.4％)。
高分辨质谱(HRMS):理论的m/z[M]+＝489.6058；计算得到[M]+:490.1170。染料的核磁结果如下：1H NMR(400MHz,CDCl3,ppm):δ8.01(d,1H,J＝7.6Hz),7.66(t,1H,J＝7.6Hz),7.61(t,1H,J＝7.6Hz),7.29(d,1H,J＝7.6Hz),7.12(d,1H,J＝5.2Hz),6.83(d,1H,J＝5.6Hz),6.61(d,1H,J＝8.8Hz),6.46(s,1H),6.41(d,1H,J＝8.8Hz),3.89(s,3H),3.39-3.34(m,4H),1.17(t,6H,J＝7.2Hz)；13C NMR(100MHz,CDCl3,ppm):δ169.130,154.730,153.476,152.039,151.344,149.504,136.630,134.647,129.792,128.618,127.190,125.104,124.186,123.064,116.620,114.204,111.799,110.584,108.990,104.832,97.778,58.873,44.556,12.518。
实施例2
染料DTPO的合成
将4-二乙氨基酮酸(0.78g,2.5mmol)和3-甲氧基噻吩(0.26mL,2.5mmol)加入到装有8mL甲磺酸的圆底烧瓶中，放入到80℃油浴锅中密封搅拌12h。反应完成后冷却至室温，得到反应液。
将上述反应液倒入120mL的去离子水中搅拌，并用饱和NaHCO3溶液进行中和至pH＝7，并用二氯甲烷萃取(30mL)三次，有机相用无水硫酸钠干燥，旋转蒸馏除去二氯甲烷得到粗产品，粗产品用二氯甲烷/乙醇(v/v20-10：1)柱层层析硅胶进行分离纯化得到目标产物，为黑色固体DTPO(98.91mg，产率为8.1％)。
实施例3
染料DTPO的合成
将4-二乙氨基酮酸(0.78g,2.5mmol)和3-甲氧基噻吩(0.79mL,7.5mmol)加入到装有15mL甲磺酸的圆底烧瓶中，放入到100℃油浴锅中密封搅拌36h。反应完成后冷却至室温，得到反应液。
将上述反应液倒入300mL的去离子水中搅拌，并用饱和NaHCO3溶液进行中和至pH＝7，并用二氯甲烷萃取(70mL)三次，有机相用无水硫酸钠干燥，旋转蒸馏除去二氯甲烷得到粗产品，粗产品用二氯甲烷/乙醇(v/v20-10：1)柱层层析硅胶进行分离纯化得到目标产物，为黑色固体DTPO(111.56mg，产率为9.1％)。
2)染料DTPO在不同溶剂中的紫外和荧光光谱
将上述制得的DTPO在二甲基亚砜(DMSO)中制成5×10-3M的DTPO母液放于棕色瓶中且避光保存备用；
测试液中分别取3mL的不同有机溶剂(DIO、DMF、DMSO、THF、acetone、CH2Cl2、MeOH、CHCl3、H2O、EtOH、MeCN、EtOAc)，加入6μL的DTPO染料母液并加入0.2％的甲磺酸，使得染料的浓度为10μM，进行紫外吸收和荧光发射的光谱性能研究。结果如图1，图2所示。
3)染料DTPO在细胞中的成像
将适当密度的HeLa细胞接种到6孔的培养皿中，在37℃含5％CO2的培养箱中培养；待细胞贴壁后，加入荧光染料DTPO(浓度为1μM)孵育半小时后进行荧光成像(激发波长559nm，收集波段605-705nm)，成像结果如图3所示。
4)染料DTPO与商品化试剂盒对线粒体进行共定位
将适当密度的HeLa细胞接种到35mm的培养皿中，在37℃含5％CO2的培养箱中培养；待细胞贴壁后，向培养皿中同时加入荧光染料DTPO和商品化线粒体试剂盒Mito-Tracker Green，使染料的最终浓度为0.5μM，线粒体试剂盒最终浓度为0.5μM。培养半小时后，弃掉培养基，用10mM PBS(pH＝7.4)缓冲液淋洗细胞3次，随后进行荧光成像(染料为红色通道，激发波长559nm，收集波段605-705nm；线粒体试剂盒为绿色通道，激发波长488nm,收集波段500-545nm)，结果如图4所示。其中，a)为线粒体试剂盒Mito-Tracker Green在绿色通道的荧光；b)为染料DTPO在红色通道的荧光；c)为a)和b)的在明场的叠加图；d)为探针与线粒体试剂盒Mito-Tracker Green荧光强度散点图；e)为染料与线粒体试剂盒Mito-Tracker Green感兴趣区域荧光强度线状图。从图4可知，染料与Mito-Tracker Green的发光位置高度一致，共定位系数为0.97。说明染料DTPO主要集中在线粒体内，因而本发明的染料可以用来定位细胞中的线粒体。

Claims (5)

1.一种用于线粒体定位的荧光染料，其特征在于，所述染料为双噻吩融合氧杂蒽类衍生物，中文名称为：6’-(二乙基氨基)-2’-(3-甲氧基噻吩-2-基)-3H-螺[2-苯并呋喃-1，9’噻吩并[3,2-b]色烯]-3-酮，简称为DTPO，结构通式如下所示：
2.一种权利要求1所述的用于线粒体定位的荧光染料的制备方法，其特征在于具体制备路线如下：
具体步骤如下：
1)将4-二乙氨基酮酸和3-甲氧基噻吩加入到装有甲磺酸的容器中，放入到80-100℃油浴锅中密封搅拌12-36h；反应完成后冷却至室温，得到反应液；
2)将上述反应液冷却后倒入去离子水中搅拌，并用饱和NaHCO3溶液进行中和至pH＝7，用二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥后旋转蒸馏除去二氯甲烷得到粗产品，粗产品用体积比v/v20-10：1的二氯甲烷/乙醇柱层析硅胶分离纯化得到目标产物为黑色固体DTPO。
3.根据权利要求2所述的用于线粒体定位的荧光染料的制备方法，其特征在于步骤1)中所述4-二乙氨基酮酸和3-甲氧基噻吩的摩尔比为1：1-3。
4.根据权利要求2所述的用于线粒体定位的荧光染料的制备方法，其特征在于步骤1)中所述4-二乙氨基酮酸和3-甲氧基噻吩的总重量与溶剂甲磺酸的重量比为1：8-12。
5.根据权利要求2所述的用于线粒体定位的荧光染料的制备方法，其特征在于步骤2)中所述反应液与去离子水的用量体积比为1：15-25；所述反应液与二氯甲烷的用量体积比为1：10-15。
CN202210518711.2A 2022-05-13 2022-05-13 一种用于线粒体定位荧光染料及其制备方法 Active CN114891021B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210518711.2A CN114891021B (zh) 2022-05-13 2022-05-13 一种用于线粒体定位荧光染料及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210518711.2A CN114891021B (zh) 2022-05-13 2022-05-13 一种用于线粒体定位荧光染料及其制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114891021A CN114891021A (zh) 2022-08-12
CN114891021B true CN114891021B (zh) 2023-09-12

Family

ID=82722656

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210518711.2A Active CN114891021B (zh) 2022-05-13 2022-05-13 一种用于线粒体定位荧光染料及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114891021B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104356681A (zh) * 2014-11-21 2015-02-18 天津理工大学 一种pH稳定氧杂蒽染料荧光探针的制备方法及其应用
CN108822575A (zh) * 2018-08-01 2018-11-16 中南大学 一种线粒体定位近红外荧光染料THX-Ba及其制备方法与应用
CN110078714A (zh) * 2019-05-16 2019-08-02 济南大学 一种定位线粒体的双光子粘度探针及其制备方法和应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104356681A (zh) * 2014-11-21 2015-02-18 天津理工大学 一种pH稳定氧杂蒽染料荧光探针的制备方法及其应用
CN108822575A (zh) * 2018-08-01 2018-11-16 中南大学 一种线粒体定位近红外荧光染料THX-Ba及其制备方法与应用
CN110078714A (zh) * 2019-05-16 2019-08-02 济南大学 一种定位线粒体的双光子粘度探针及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN114891021A (zh) 2022-08-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107603269B (zh) 一类基于萘酰亚胺的荧光染料、其制备方法及应用
CN108822019B (zh) 一种检测脂滴极性的荧光探针及其制备方法和应用
CN107501170A (zh) 一类光谱可调的聚集诱导发光型荧光材料及其制备方法和应用
CN104710815B (zh) 一种大斯托克斯位移和近红外荧光发射的新型罗丹荧类荧光染料及其合成方法
CN114149441B (zh) 一种氨基取代色烯并喹啉型荧光标记物及其制备和应用
CN109912634B (zh) 一类聚集诱导发光型荧光材料及制备方法和应用
CN114891021B (zh) 一种用于线粒体定位荧光染料及其制备方法
CN113651834A (zh) 基于双噻吩并苯衍生物的荧光探针及其在细胞脂滴成像中的应用
CN104327537A (zh) 一种具有生物膜透性潜能的氧杂蒽类荧光染料及其制备方法
CN111793371A (zh) 一种3，5位不对称修饰bodipy类近红外荧光染料及其制备方法
CN111961072B (zh) 一种溶酶体靶向的红外二窗发射荧光染料及其制备方法和应用
CN114436947B (zh) 一种对粘度和硝基还原酶双响应的荧光探针及其制备方法和应用
CN109678888B (zh) 噁嗪类化合物及其用途
CN113416196A (zh) 一种苯并噻二唑-tb类化合物及其合成方法和应用
CN113501836A (zh) 一种星型bodipy近红外荧光染料及其制备方法
CN112110887A (zh) 一种3位甲酰基取代的2h-色烯衍生物的合成方法及其应用
Xu et al. Photoswitchable spiropyran molecules for specific sensing of thiols and fluorescent inks
CN110862405A (zh) 实时检测细胞内nadh/nad+的荧光探针材料及制备方法和应用
US20240353433A1 (en) Amino-substituted chromenoquinoline-based fluorescent marker, and preparation and use thereof
CN118084975A (zh) 氟硼吡咯类化合物及其合成方法和用途
CN115477654B (zh) 一种大Stokes位移的近红外罗丹明染料及其合成方法
CN110776460B (zh) Led可见光诱导释放一氧化氮的荧光化合物及其制备与应用
CN114853665B (zh) 一种荧光化合物及其制备方法和应用
CN113773292B (zh) 一种免洗型靶向脂滴的AIEgen荧光探针及其制备方法和应用
CN118440062A (zh) 一种线粒体和脂滴成像的荧光探针及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant