CN115477654B - 一种大Stokes位移的近红外罗丹明染料及其合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及有机荧光染料技术领域，具体公开了一种高稳定性和大Stokes位移的近红外罗丹明染料，结构式为：其中，R1为C1‑4烷基或取代烷基、环烷基、取代环烷基、芳基、取代芳基、杂芳基或取代杂芳基，R2为C1‑4烷基、取代烷基、环烷基、取代环烷基、芳基、取代芳基、杂芳基或取代杂芳基，R3为氨基、C1‑4取代氨基、环烷氨基、取代环烷氨基、芳氨基、取代芳氨基、杂芳氨基或取代杂芳氨基，R4为H或甲基。本发明的高稳定性和大Stokes位移的近红外罗丹明染料，以罗丹明染料支架为母体，引入喹喔啉衍和金刚烷衍生物基团合成了系列罗丹明染料，具有高稳定性、大Stokes位移和近红外发射波长，具有良好的细胞成像稳定性以及优异的线粒体靶向功能。

Description

一种大Stokes位移的近红外罗丹明染料及其合成方法
技术领域
本发明属于有机荧光染料技术领域，特别涉及一种高稳定性和大Stokes位移的近红外罗丹明染料及其合成方法。
背景技术
荧光成像技术因其高灵敏度，高的时空分辨率和无创性，受到科学家们广泛的关注，而荧光染料是荧光成像技术和荧光分析技术的基石。常用的有机荧光染料有香豆素类、1,8-萘酰亚胺、罗丹明类、花菁类、氟硼二吡咯(BODIPY)类等，有机荧光染料一般具有高的荧光量子产率、高的摩尔消光系数、结构易于修饰等优点而被广泛运用于生物成像和活体检测。此外，在真核细胞中，线粒体不仅在能量的产生中发挥关键作用，而且在各种其他细胞事件中发挥关键作用，包括细胞凋亡、Ca2+稳态以及血红素、氨基酸和磷脂的生物合成。因此，开发具有优异光谱性能且具备靶向线粒体能力的荧光染料有重要意义。
罗丹明染料是众多有机荧光染料发现较早，应用较为广泛的一种以氧杂蒽环为母体的有机荧光染料，经典罗丹明类染料虽然具有优良的光谱性能、好的水溶性以及好的生物相容性。但是，经典罗丹明染料的斯托克斯位移小，一般都低于30nm，斯托克斯位移小的有机荧光染料其吸收光谱和发射光谱有着很大的重叠，这将导致在荧光成像时染料本身会产生自吸收效应，极大的降低了荧光成像时的信噪比、检出限和清晰度。此外经典的罗丹明的发射波长都在可见光区，一般都低于600nm，短发射波长的罗丹明染料在荧光成像时组织穿透能力差，难以进行深层组织成像，且容易造成细胞损伤，基于这些缺陷很大程度限制了罗丹明类染料在荧光成像领域的广泛应用。因此，开发大Stokes位移和近红外发射的新型罗丹明染料具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高稳定性和大Stokes位移的近红外罗丹明染料，克服现有经典罗丹明染料斯托克斯位移小、光稳定性差难以应用于长时间生物成像缺陷。
为实现上述目的，本发明提供了一种高稳定性和大Stokes位移的近红外罗丹明染料，结构式为：
其中，R1为C1-4烷基、取代烷基、环烷基、取代环烷基、芳基、取代芳基、杂芳基或取代杂芳基，R2为C1-4烷基、取代烷基、环烷基、取代环烷基、芳基、取代芳基、杂芳基或取代杂芳基，R3为氨基、C1-4取代氨基、环烷氨基、取代环烷氨基、芳氨基、取代芳氨基、杂芳氨基或取代杂芳氨基，R4为H或甲基。
优选的，上述高稳定性和大Stokes位移的近红外罗丹明染料中，所述R1为甲基、乙基、丙基、丁基、2,2-二甲基丙基、2-甲基丁基、环戊烷基或环己烷基，R2为甲基、乙基、丙基、丁基、2,2-二甲基丙基、2-甲基丁基、环戊烷基或环己烷基，R3为二甲基氨基、二乙基氨基、二丙基氨基、乙基氨基、羟基、氨基、八氢-2H-喹啉基、氮杂环丁烷基、1,1-二甲基哌嗪基氨基、1,1-二氧化物硫代吗啉基或(1s,4s)-7-氮杂双环[2.2.1]庚烷基。
一种上述的高稳定性和大Stokes位移的近红外罗丹明染料的合成方法，包括以下步骤：
(1)中间体1的合成
在冰浴条件下，将2-金刚烷酮溶于甲醇和水的混合溶剂中，在保护气氛下加入氢氧化钾，反应2～4h；然后滴加N-甲基-N-亚硝基对甲苯磺酰胺的甲醇溶液，滴加完后继续反应10～12h，萃取干燥得有机相，真空蒸馏得到粗产物；将粗产物与二氧化硒在1,4-二氧六环和水的混合溶剂中混合溶解，加热至80～100℃，在气氛保护下反应2～4h，得到中间体1；
(2)中间体2的合成
将5-甲氧基-2-硝基苯胺加入甲醇中溶解，加入雷尼镍和还原剂进行反应，反应完后过滤得滤液，旋干得到无色油状物，即为中间体2；
(3)中间体3的合成
将中间体2溶于乙腈中，然后加入中间体1，在50～70℃下搅拌反应2～3h，分离、提纯得到中间体3；
(4)中间体4的合成
将中间体3加入甲醇和乙酸的混合溶剂中，在70～90℃回流2～3min，加入氰基硼氢化钠，反应10～12h，萃取、洗涤、旋干有机相，即为中间体4；
(5)中间体5的合成
将中间体4溶于N,N-二甲基甲酰胺，加入氢氧化钠和碘化钾，加热至50～60℃，加入卤代烷，在保护气氛下反应2～3h，得到中间体5；
(6)罗丹明染料的合成
2-(4-(R3)-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸和中间体5溶于甲烷磺酸中，升温至80～90℃，反应5～9h，萃取、洗涤有机相，减压蒸馏得到粗产物；将粗产物进行梯度洗脱，得到高稳定性和大Stokes位移的近红外罗丹明染料。
优选的，上述合成方法中，所述步骤(1)中，金刚烷酮与混合溶剂的摩尔体积比为1mmol:1.8～2.5mL，混合溶剂中水与甲醇的体积比为1:5～6，2-金刚烷酮与氢氧化钾的摩尔比为1:10～12；
2-金刚烷酮与N-甲基-N-亚硝基对甲苯磺酰胺的摩尔比为1:2.0～2.2，N-甲基-N-亚硝基对甲苯磺酰胺的甲醇溶液中N-甲基-N-亚硝基对甲苯磺酰胺与甲醇的摩尔体积比为1mmol:1.7～2.0mL；
粗产物与二氧化硒的摩尔比为1:1～1.2，1,4-二氧六环和水的体积比为18～20:1，粗产物与1,4-二氧六环和水的混合溶剂的摩尔体积比为1mmol:0.6～1mL。
优选的，上述合成方法中，所述步骤(2)中，5-甲氧基-2-硝基苯胺与甲醇的摩尔体积比为1mmol:2～3mL，5-甲氧基-2-硝基苯胺与还原剂的摩尔比为1:4～6，所述还原剂为硼氢化钠、氢气或还原铁粉。
优选的，上述合成方法中，所述步骤(3)中，中间体2与乙腈的摩尔体积比为1mmol:1.0～1.2mL，中间体2与中间体1的摩尔比为1～1.2:1～1.2。
优选的，上述合成方法中，所述步骤(4)中，中间体3与混合溶剂的摩尔体积比为1mmol:4～5mL，混合溶剂中甲醇与乙酸的体积比为1:1～1.2，中间体3与氰基硼氢化钠的摩尔比为1:10～12。
优选的，上述合成方法中，所述步骤(5)中，中间体4与N,N-二甲基甲酰胺的质量比为1mmol:0.6～0.8mL，中间体4与氢氧化钠的摩尔比为1:3～4，中间体4与卤代烷的摩尔比为1:2.2～2.5。
优选的，上述合成方法中，所述步骤(6)中，2-(4-(R3)-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸和中间体5的摩尔比为1～1.2:1～1.2，中间体5与甲烷磺酸的摩尔体积比为1mmol:20～22mL。
上述的高稳定性和大Stokes位移的近红外罗丹明染料在细胞成像中的应用。
上述的高稳定性和大Stokes位移的近红外罗丹明染料在细胞线粒体定位中的应用。
与现有的技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明的高稳定性和大Stokes位移的近红外罗丹明染料，以罗丹明染料支架为母体，引入喹喔啉衍和金刚烷衍生物基团合成了系列罗丹明染料，具有高稳定性、大Stokes位移和近红外发射波长，具有良好的细胞成像稳定性以及优异的线粒体靶向功能。
附图说明
图1是本发明实施例1中的罗丹明染料JG-2的核磁氢谱。
图2是本发明实施例1中的罗丹明染料JG-2的核磁碳谱。
图3是本发明实施例1中的罗丹明染料JG-3的核磁氢谱。
图4是本发明实施例1中的罗丹明染料JG-3的核磁碳谱。
图5是本发明应用例1中的罗丹明染料JG-2的紫外吸收谱图。
图6是本发明应用例2中的罗丹明染料JG-2的荧光发射谱图。
图7是本发明应用例1中的罗丹明染料JG-3的紫外吸收谱图。
图8是本发明应用例2中的罗丹明染料JG-3的荧光发射谱图。
图9是本发明应用例3中的罗丹明染料JG-2在HeLa细胞中成像稳定性图：a)细胞成像图；b)信号强度变化曲线图。
图10是本发明应用例4中的罗丹明染料JG-3在HeLa细胞中成像稳定性图：a)细胞成像图；b)信号强度变化曲线图。
图11是本发明应用例5中的罗丹明染料细胞线粒体定位图：(a)JG-2；(b)JG-3。图12是本发明应用例5中的罗丹明染料JG-2和JG-3细胞线粒体定位稳定性测试结果图：(a)反复定位成像图；(b)信号强度变化曲线图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
实施例1
一种高稳定性和大Stokes位移的近红外罗丹明染料JG-2，结构式为：
本实施例还提供一种高稳定性和大Stokes位移的近红外罗丹明染料的合成方法，包括以下步骤：
(1)中间体1的合成
合成线路为：
合成步骤为：在0℃冰浴条件下，将52.8mmol 2-金刚烷酮溶于甲醇(88mL)和水(16mL)的混合液中，待原料搅拌均匀充分溶解后，在氮气保护下分三次加入585.5mmol氢氧化钾，反应3h；将111.6mmolN-甲基-N-亚硝基对甲苯磺酰胺溶于200mL甲醇，缓慢滴加至反应体系中，滴加时间为2h，滴加完后继续反应12h；然后将反应混合物用浓盐酸调节pH至10，用乙醚(3×100mL)萃取，用无水硫酸钠干燥萃取所得的有机相，将有机相真空蒸馏后得白色固体粗产物；随后将52.8mmol白色固体粗产物与52.8mmol二氧化硒在1,4-二氧六环(35mL)和水(1.8mL)中混合，将反应液加热至90℃，在氮气保护下反应3h，得到中间体1。
(2)中间体2的合成
合成线路为：
合成步骤为：将14mmol 5-甲氧基-2-硝基苯胺置于100mL圆底烧瓶中，再加入甲醇(40mL)充分溶解，而后加入12滴雷尼镍，常温搅拌下分三次加入70mmol硼氢化钠，每次将硼氢化钠加入反应体系中至有大量气泡冒出即可，反应液由黄色到无色即反应完成，将反应混合液过滤将固体不溶物滤除，旋干得无色油状物，即为中间体2。
(3)中间体3的合成
合成线路为：
合成步骤为：将14mmol中间体2溶于15mL乙腈中，而后再加入14mmol中间体1至反应体系中，并在60℃下搅拌反应3h，分离、提纯得到中间体3。
(4)中间体4的合成
合成线路为：
合成步骤为：将4.6mmol中间体3加入到甲醇(10mL)与乙酸(10mL)混合液中，在80℃加热下冷凝回流搅拌2min，将46mmol氰基硼氢化钠15min内分批次加入，反应12h；待反应液冷却后，将其倒入水(200mL)中，用二氯甲烷(3×100mL)萃取，再用饱和食盐水反复洗涤萃取所得的二氯甲烷，随后将所得有机相用无水硫酸钠干燥，真空旋干有机相，最后得黄褐色油状物，即为中间体4。
(5)中间体5的合成
合成线路为：
合成步骤为：将6mmol中间体4溶于4mL N,N-二甲基甲酰胺中，搅拌5min使其充分溶解后，再加入18mmol氢氧化钠以及催化量碘化钾，在60℃加热下均匀搅拌2min；而后将13.52mmol碘乙烷加入反应体系中，在氮气保护下反应3h，得中间体5。
(6)罗丹明染料JG-2的合成
合成线路为：
合成步骤为：称取0.1mmol 2-(4-(二乙氨基)-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸和0.1mmol和化合物5放入10mL反应瓶中，再加入2mL甲烷磺酸将其溶解，将温度升高至90℃反应8h；待反应液冷却后将其倒入水中，用适量二氯甲烷萃取三次后再用饱和食盐水洗涤有机相两次，减压蒸馏二氯甲烷后，得到深色固体粗产物；然后配置二氯甲烷与乙醇不同比例的混合物作为洗脱液，通过硅胶色谱法将粗产物进行快速梯度洗脱，得到罗丹明染料JG-2。罗丹明染料JG-2的核磁氢谱与碳谱如图1和图2所示。
实施例2
一种高稳定性和大Stokes位移的近红外罗丹明染料JG-3，结构式为：
本实施例高稳定性和大Stokes位移的近红外罗丹明染料JG-3的合成方法同实施例1，不同在于，步骤(6)中采用2-(4-(乙基氨基)-2-羟基-5-甲基苯甲酰基)苯甲酸替换2-(4-(二乙氨基)-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸，得到的罗丹明染料JG-3的核磁氢谱与碳谱如图3和图4所示。
实施例3
一种高稳定性和大Stokes位移的近红外罗丹明染料，结构式为：
本实施例高稳定性和大Stokes位移的近红外罗丹明染料JG-1的合成方法同实施例1，不同在于，步骤(5)中采用2-(4-(二甲氨基)-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸替换2-(4-(二乙氨基)-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸。
实施例4
一种高稳定性和大Stokes位移的近红外罗丹明染料，结构式为：
本实施例高稳定性和大Stokes位移的近红外罗丹明染料JG-4的合成方法同实施例1，不同在于，步骤(6)中采用2-(8-羟基久洛利定)-9-羰基苯甲酸替换2-(4-(二乙氨基)-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸。
实施例5
一种高稳定性和大Stokes位移的近红外罗丹明染料，结构式为：
本实施例高稳定性和大Stokes位移的近红外罗丹明染料JG-5的合成方法同实施例1，不同在于，步骤(5)中采用碘甲烷替代碘乙烷。
实施例6
一种高稳定性和大Stokes位移的近红外罗丹明染料，结构式为：
本实施例高稳定性和大Stokes位移的近红外罗丹明染料JG-6的合成方法同实施例1，不同在于，步骤(5)中采用溴丙烷替代碘乙烷。
实施例7
一种高稳定性和大Stokes位移的近红外罗丹明染料，结构式为：
本实施例高稳定性和大Stokes位移的近红外罗丹明染料JG-7的合成方法同实施例1，不同在于，步骤(5)中采用正溴丁烷替代碘乙烷合成中间体5。
应用例1
将JG-2和JG-3染料分别用二氯甲烷(DCM)、乙醇(EtOH)、乙腈(CH3CN)、二甲基亚砜(DMSO)和H2O(50％EtOH)配制成浓度为10-3mol/L的母液，再取适量母液用DCM、EtOH、CH3CN、DMSO和H2O(50％EtOH)分别定容在2mL此时浓度为10-5mol/L，测试其紫外吸收值，得到紫外吸收光谱，JG-2染料的紫外吸收光谱如图5所示，JG-3染料的紫外吸收光谱如图7所示。
应用例2
将JG-2和JG-3染料分别用DCM、EtOH、CH3CN、DMSO和H2O(50％EtOH)配制成浓度为10-3mol/L的母液，再取适量母液分别DCM、EtOH、CH3CN、DMSO和H2O(50％EtOH)分别定容在2mL此时浓度为10-5mol/L，测定其荧光光谱，JG-2染料的荧光光谱如图6所示，JG-3染料的荧光光谱如图8所示。
应用例3JG-2细胞成像稳定性
将5μM的JG-2染料与5μM的罗丹明B(RhB)以及罗丹明6G(Rh6G)分别与HeLa细胞孵育15分钟，在激光共聚焦连续成像30分钟后，细胞成像图如图9(a)；观察其信号强度变化，强度变化如图9(b)，从图中可以看出，相较于RhB和Rh6G，本发明的JG-2染料具有好的细胞成像稳定性。
应用例4JG-3细胞成像稳定性
将5μM的JG-3与5μM的RhB以及Rh6G分别与HeLa细胞孵育15分钟，在激光共聚焦连续成像30分钟后，细胞成像图如图10(a)；观察其信号强度变化，信号强度变化曲线如图10(b)，从图中可以看出，相较于RhB和Rh6G，本发明的JG-3染料具有好的细胞成像稳定性。
应用例5JG-2、JG-3细胞线粒体定位
在HeLa，A549，MCF-7和LO2细胞中分别将JG-2(0.05μM)(如图11(a))、JG-3(0.05μM)(如图11(b))与商业线粒体定位探针Mito-Tracker Green(0.05μM)共同孵育15分钟后成像(如图11)，从图中可以看出JG-2和JG-3具有优异的线粒体靶向功能。
应用例6JG-2、JG-3细胞线粒体定位稳定性测试
在HeLa细胞中分别将MitoTracker Green FM(50nM)、Rhodamine123(50nM)、Mito-Trakcer Deep Red(50nM)、Mito-Tracker Red CMXRos(50nM)、JG-2(50nM)和JG-3(50nM)反复定位成像(如图12(a))，信号强度变化结果如图12(b)所示，有图可知，本发明的染料JG-2和JG-3具有优异的细胞线粒体定位稳定性。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (10)

1.一种大Stokes位移的近红外罗丹明染料，其特征在于，结构式为：
，
其中，R1为甲基、乙基、丙基或丁基，R2甲基、乙基、丙基或丁基，R3二甲基氨基、二乙基氨基或乙基氨基，R4为H或甲基。
2.一种大Stokes位移的近红外罗丹明染料，其特征在于，结构式为：
。
3. 一种如权利要求1所述的大Stokes位移的近红外罗丹明染料的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）中间体1的合成
在冰浴条件下，将2-金刚烷酮溶于甲醇和水的混合溶剂中，在保护气氛下加入氢氧化钾，反应2~4h；然后滴加N-甲基-N-亚硝基对甲苯磺酰胺的甲醇溶液，滴加完后继续反应10~12h，萃取干燥得有机相，真空蒸馏得到粗产物；将粗产物与二氧化硒在1,4-二氧六环和水的混合溶剂中混合溶解，加热至80~100℃，在气氛保护下反应2~4h，得到中间体1；
（2）中间体2的合成
将5-甲氧基-2-硝基苯胺加入甲醇中溶解，加入雷尼镍和还原剂进行反应，反应完后过滤得滤液，旋干得到无色油状物，即为中间体2；
（3）中间体3的合成
将中间体2溶于乙腈中，然后加入中间体1，在50~70℃下搅拌反应2~3h，分离、提纯得到中间体3；
（4）中间体4的合成
将中间体3加入甲醇和乙酸的混合溶剂中，在70~90℃回流2~3min，加入氰基硼氢化钠，反应10~12h，萃取、洗涤、旋干有机相，即为中间体4；
（5）中间体5的合成
将中间体4溶于N,N-二甲基甲酰胺，加入氢氧化钠和碘化钾，加热至50~60℃，加入卤代烷，在保护气氛下反应2~3h，得到中间体5；
（6）罗丹明染料的合成
2-(4-(R3)-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸和中间体5溶于甲烷磺酸中，升温至80~90℃，反应5~9h，萃取、洗涤有机相，减压蒸馏得到粗产物；将粗产物进行梯度洗脱，得到所述近红外罗丹明染料。
4.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，所述步骤（1）中，2-金刚烷酮与混合溶剂的摩尔体积比为1mmol:1.8~2.5mL，混合溶剂中水与甲醇的体积比为1:5~6，2-金刚烷酮与氢氧化钾的摩尔比为1:10~12；
2-金刚烷酮与N-甲基-N-亚硝基对甲苯磺酰胺的摩尔比为1:2.0~2.2，N-甲基-N-亚硝基对甲苯磺酰胺的甲醇溶液中N-甲基-N-亚硝基对甲苯磺酰胺与甲醇的摩尔体积比为1mmol:1.7~2.0mL；
粗产物与二氧化硒的摩尔比为1:1~1.2，1,4-二氧六环和水的体积比为18~20:1，粗产物与1,4-二氧六环和水的混合溶剂的摩尔体积比为1 mmol:0.6~1 mL。
5.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，所述步骤（2）中，5-甲氧基-2-硝基苯胺与甲醇的摩尔体积比为1mmol:2~3mL，5-甲氧基-2-硝基苯胺与还原剂的摩尔比1:4~6，所述还原剂为硼氢化钠、氢气或还原铁粉。
6.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，所述步骤（3）中，中间体2与乙腈的摩尔体积比为1mmol:1.0~1.2mL，中间体2与中间体1的摩尔比为1~1.2:1~1.2。
7.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，所述步骤（4）中，中间体3与混合溶剂的摩尔体积比为1mmol:4~5mL，混合溶剂中甲醇与乙酸的体积比为1:1~1.2，中间体3与氰基硼氢化钠的摩尔比为1:10~12；所述步骤（5）中，中间体4与N,N-二甲基甲酰胺的质量比为1mmol:0.6~0.8mL，中间体4与氢氧化钠的摩尔比为1:3~4，中间体4与卤代烷的摩尔比为1:2.2~2.5。
8.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，所述步骤（6）中，2-(4-(R3)-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸和中间体5的摩尔比为1~1.2:1~1.2，中间体5与甲烷磺酸的摩尔体积比为1mmol:20~22mL。
9.根据权利要求1或2所述的大Stokes位移的近红外罗丹明染料在细胞成像中的应用。
10.根据权利要求1或2所述的大Stokes位移的近红外罗丹明染料在细胞线粒体定位中的应用。
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