CN110229660A - 一种羧酸酯酶-pH连续双比率双光子线粒体锁定荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明为一种羧酸酯酶‑pH连续双比率双光子线粒体锁定荧光探针及其制备方法和应用。2,4‑二羟基苯甲醛、戊二酸二乙酯和哌啶在乙醇中反应得产物1，产物1与乙酸酐在吡啶中反应得产物2，产物2与OsO4、NaIO4反应得产物3，产物3与K2CO3在甲醇中反应酸化得产物4；4‑甲基吡啶和1,4‑双（氯甲基）苯在甲苯中反应得产物5，产物4和产物5、哌啶在乙醇中反应得HMT；产物5、HMT和NaOAc在Ac2O中反应得羧酸酯酶‑pH连续双比率双光子线粒体锁定荧光探针CEMT。该探针采用连续双响应机制，在双光子荧光基团提供的强穿透性条件下对CE和pH进行连续双响应定量分析，并能够锁定线粒体，防止酸性条件下探针自线粒体的脱落，从而对其进行原位检测，应用在酶介导的酸化监测体系中。

Description

一种羧酸酯酶-pH连续双比率双光子线粒体锁定荧光探针及 其制备方法和应用
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体涉及一种羧酸酯酶-pH连续双比率双光子线粒体锁定荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
羧酸酯酶在生物体内，特别是细胞中起着重要的生理调节作用，其浓度的高低可反映出机体或某些细胞的疾病状态，同时也与一些病变或代谢紊乱有着密切的关系。在给药期间，线粒体的酸化往往是由药物经羧酸酯酶carboxylesterase (CE)代谢后的产物所导致，因此我们需要分别响应CE和pH的分子探针来实现，现阶段近年来，研究者已经开发了若干CE响应以及pH响应的分子探针，但并没有同时对二者分别或连续响应的分子探针，研究能够连续地响应CE和pH的变化的荧光探针，能更直接地说明pH的改变是由CE所介导的。此外，根据我们的要求，线粒体的原位酸化信息是我们更加关注的。而此探针具有能对线粒体进行锁定来实现原位检测的优点，操作过程简便，因此开发能够连续地响应CE和pH的变化、以及能对线粒体进行锁定来实现原位检测的荧光探针具有重要意义。
发明内容
针对现有技术不足，本发明提供一种羧酸酯酶-pH连续双比率双光子线粒体锁定荧光探针及其制备方法和应用，本发明中的探针能够连续地响应羧酸酯酶（CE）和pH的变化、以及能对线粒体进行锁定来实现原位检测。
一种羧酸酯酶-pH连续双比率双光子线粒体锁定荧光探针，所述的荧光探针结构式如式CEMT所示：
。
一种羧酸酯酶-pH连续双比率双光子线粒体锁定荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)将4-甲基吡啶和1,4-双（氯甲基）苯在甲苯中溶解，搅拌，加热回流，得产物5;
(2)将产物5和产物4在乙醇中溶解，加入无水哌啶反应得产物HMT；
(3)将产物5、HMT和NaOAc混合溶于Ac2O，反应得羧酸酯酶-pH连续双比率双光子线粒体锁定荧光探针CEMT；
。
优选地，步骤（1）中所述的产物5的制备方法为将50mmol 4-甲基吡啶和55 mmol1,4-双（氯甲基）苯在甲苯中溶解，室温下搅拌4小时，加热回流30分钟后冷却、过滤，用无水乙醚洗涤得产物5。
优选地，步骤（2）所述的产物HMT的制备方法为将1mmol产物5和0.5mmol产物4加入到50mL乙醇中溶解，加入0.05mL干燥的哌啶，加热回流12小时，缓慢冷却至室温，再冷却到-20℃，过滤，用乙醇洗涤，使用体积比为1:2的CH3OH：CH2Cl2 混合溶剂进行色谱纯化。
优选地，步骤（3）所述的CEMT的制备方法为将1mmol产物5、0.6mmol HMT和2.04mmol NaOAC混合溶于6mLAc2O中，在Ar气氛中、80℃条件下搅拌7小时，减压浓缩得粗品，粗品溶于DCM中提纯得CEMT。
优选地，所述的产物4的制备方法为：
a) 将2,4-二羟基苯甲醛溶解于乙醇中，溶解浓度0.02～0.06g/mL，然后加入戊烯二酸二乙酯，溶解浓度0.067g/mL，混合均匀后滴加无水哌啶 2～5 mL，回流24h，冷却，过滤，固体用无水乙醇重结晶，得产物1；
b) 将产物1溶解于无水吡啶中，溶解浓度0.025g/mL，然后加入乙酸酐，加入浓度为1mol/L，搅拌0.5h，后于冰中继续搅拌10 min，析出灰白色固体，用水和NaCl饱和溶液洗涤，Na2SO4干燥并减压除去溶剂，使用体积比为1:5的CH3CN:CH2Cl2混合溶剂色谱纯化，得到白色固体即为产物2；
c) 将产物2溶解于四氢呋喃中，溶解浓度0.011 g/mL，然后加入质量分数4%的四氧化锇水溶液 2 mL，搅拌0.5h，然后加入高碘酸钠，加入浓度为0 .017g/mL，室温下搅拌5～6天，减压蒸馏除去THF，加入二氯甲烷和水溶液分层，有机层干燥，得到白色固体，固体用体积比为从1:0～5的二氯甲烷-乙腈体系洗脱剂梯度洗脱，旋蒸，得产物3；
d) 将产物3溶解于甲醇中，溶解浓度0.012 g/mL，然后加入无水碳酸钾，溶解浓度0.015 g/mL，室温下搅拌0.5h，TLC分析原料消耗完毕后，加入pH至3～4的盐酸进行酸化，析出固体，过滤，滤饼用水洗涤，真空干燥，得产物4；
具体合成路线图如下:
。
一种羧酸酯酶-pH连续双比率双光子线粒体锁定荧光探针在原位检测羧酸酯酶介导的线粒体酸化的应用。
优选地，所述的羧酸酯酶-pH连续双比率双光子线粒体锁定荧光探针应用于生命体或细胞中原位检测羧酸酯酶介导的线粒体酸化的应用。
优选地，所述的羧酸酯酶-pH连续双比率双光子线粒体锁定荧光探针连续地响应羧酸酯酶和pH的变化、并对线粒体进行锁定来实现原位实时检测。
本发明制备的荧光探针检测机理:产物5中带有线粒体靶向的正电荷又具备可以共价键锁定线粒体的苄基氯，可保证在pH改变的环境下，探针不脱离线粒体从而保证原位线粒体检测，因此选取产物5作为反应基团；双光子荧光环7-羟基-2-氧代-2H-色烯-3-甲醛（产物4）在发射波长前后呈现比率关系，因此便于对其进行定性定量的检测；将产物5与该双光子荧光环（产物4）进行接合，所得HMT能够以可逆方式对pH进行比率响应，继而将其变成羧酸酯，来构成在酶水解后能对pH进行响应的探针CEMT。CEMT进入细胞后将靶向并锁定线粒体，受其周围高浓度的CE触发转变成HMT，该过程伴随的比率的改变可用于指示CE的含量高低，而所得的HMT则可以对随之来的酸化进行响应，从而带来线粒体原位的pH信息。本发明的连续识别机制如图1所示。
产物5结构中带有线粒体靶向的正电荷又具备可以共价键锁定线粒体的苄基氯，可保证在pH改变的环境下，探针不脱离线粒体从而保证原位线粒体检测，该物质与光双子荧光环7-羟基-2-氧代-2H-色烯-3-甲醛（产物4）接合所得HMT能够以可逆方式对pH进行比率响应，继而将其变成羧酸酯，来构成在酶水解后能对pH进行响应的探针CEMT。
本发明的发明目的是提供上述羧酸酯酶-pH连续双比率双光子线粒体锁定荧光探针的制备与应用，该探针CEMT存在对CE和pH的连续双响应机制，不仅能够靶向并锁定线粒体，被CE触发后转化成HMT由比率的改变用于指示CE的含量，而且所得的HMT可对随之来的酸化进行响应，从而带来线粒体原位的pH信息。探针检测时可原位检测、对细胞损害性小、以及检测过程简单易操作等优点，可以应用于给药期间对CE介导的线粒体酸化的检测，这对于探索酶参与的细胞器异变有着重要意义。
与传统检测技术相比，该荧光探针弥补了其他探针不能连续检测CE和pH变化的缺陷，具有连续双比率双响应体系、可锁定线粒体进行原位检测、操作简便容易等优点，因此适合广泛应用于生命体或细胞中对CE介导酸化过程的检测。
有益效果：
（1）连续双响应：本发明探针CEMT在进入细胞后可靶向并锁定线粒体，被触发后转化为HMT，此过程可通过对发射波长前后的比率的改变来定量指示CE的含量；而HMT 又能够对之后的酸化过程做出相应的响应，实现了所需要的对CE和pH的连续检测，实现了对CE介导的酸化过程进行检测。
（2）双比率响应：双光子荧光环7-羟基-2-氧代-2H-色烯-3-甲醛在接触发射波长前后能够呈现比率关系，因此使得荧光探针CEMT在被CE触发以及酸化导致细胞环境pH的变化情况下，通过比率响应的方式实现对该过程的定量分析。
（3）双光子吸收效应：双光子荧光环7-羟基-2-氧代-2H-色烯-3-甲醛具有双光子吸收的特征，具有良好的空间选择性，对生物体伤害较小，并且具有高穿透性能。
（4）原位检测：在PBS缓冲溶液中，CEMT与Mito Tracker Deep Red（MTDR，一种线粒体靶向深红染料）的共定位实验表明，二者的皮尔森相关系数达到0.91，因此本发明探针CEMT可以对线粒体进行准确靶向；探针CEMT中还存在可以通过共价键方式锁定线粒体的苄机氯，这样就可以避免酸化使探针脱落，从而达到原位检测的目的。
（5）监测CE 介导的酸化：一般情况下，在药物代谢期间，CE活性会浓度下降同时酸性代谢产物将导致细胞酸化，而该过程会导致细胞器异变。该探针CEMT在进入细胞后靶向并锁定线粒体，受CE触发转变成HMT，通过该过程的比率的改变指示CE的含量，而HMT则可以对酸化过程进行响应，从而带来线粒体原位的pH信息，便于对给药期间CE介导的线粒体酸化进行原位实时监测。
附图说明
图1探针CEMT对羧酸酯酶（CE）和pH的连续识别机制示意图；
图2.1 HMT核磁共振的H谱图
图2.2 HMT核磁共振的C谱图；
图3.1 CEMT核磁共振的H谱图
图3.2 CEMT核磁共振的C谱图
图4细胞的共聚焦成像图；
图5干扰离子对荧光探针CEMT（10 μM）荧光强度的影响；
图6不同浓度荧光探针对细胞活性测定图；
图7 HMT的pH可逆性研究；
图8 CEMT和HMT的时间依赖性荧光图；
图9 CEMT和HMT的光学特性；
图10 HMT和MTDR在HepG2细胞中的共定位细胞图。
具体实施方式
通过结合更加具体实施例描述本发明的荧光分子探针，在围绕本发明所描述技术思想情况下，根据一般的技术知识和通常用的技术手段研究的多种方式替换或变更，都属于本发明的范围内。
本发明实施例中是利用Hitachi F-7000分光光度计进行的（HITACHI，Japan），在激发波长为410 nm或530 nm，激发和发射狭缝宽度均为10.0 nm，电压700 V，扫描速度2400nm/min。在Cary 300 Bio（VARIAN，USA）的UV-vis分光光度计上收集UV-可见光谱；用Bruker上升500（500.1 MHz，1H；125.8 MHz，13C）仪器测量1HNMR和13CNMR光谱，仪器以表示的光谱仪频率操作，以兆赫兹（MHz）给出。化学位移以相对于四甲基硅烷（TMS）的百万分率（ppm）给出，作为1H和13C-NMR谱的外标，并针对溶剂残留峰进行校准。HR-MS谱在maxis超高分辨率-TOF MS系统（Bruker Co.，Ltd.，Germany）上获得。使用TRITURUS酶标仪进行MTT测定。用培养箱MCO-15AC（SANYO，Japan）维持HepG2细胞。使用Leica DMI3000B（德国）获得共定位实验图像。使用LSM 880共聚焦激光扫描显微镜（Zeiss Co.，Ltd.，Germany）拍摄双光子荧光图像。用pH-3c数字pH计（Shanghai Lei Ci Device Works，Shanghai，China）进行pH测量。在硅胶板上进行TLC分离，并在硅胶（筛网300-400）上进行柱色谱，两者均购自江油化学公司（Yan Tai，China）。在生理条件下使用10μM CEMT和HMT在B-R缓冲溶液（H2O；pH = 7.4、40mM）中评估所有光学性质。
实施例1
(1)产物5制备：将50 mmol4-甲基吡啶和55 mmol 1,4-双（氯甲基）苯溶解在圆底烧瓶的甲苯中，使用磁力搅拌器搅拌4 h，然后加热回流30 min，将反应液冷却并过滤，用无水乙醚洗涤产品，获得白色粉末即为产物5；
(2)产物1制备：将5.36mmol 2,4-二羟基苯甲醛溶解在装有15 mL 乙醇的圆底烧瓶中，加入5.65 mmol 戊二酸二乙酯，加入无水哌啶4mL，并将反应液加热回流24 h，缓慢冷却至室温，后冷却至-20℃，过滤，将所得粗产品用乙醇洗涤两次，使用体积比为1:20的CH3CN:CH2Cl2混合溶剂色谱纯化，所得黄色结晶为产物1；
（3）产物2制备：将0.77mmol 产物1溶于4 mL无水吡啶中，加入4 mL乙酸酐，室温下搅拌0.5 h后于冰中继续搅拌10 min，析出灰白色固体，用水和NaCl饱和溶液洗涤，Na2SO4 干燥并减压除去溶剂，使用体积比为1:5的CH3CN:CH2Cl2混合溶剂色谱纯化，得到白色固体即为产物2；
（4）产物3制备：将7.28 mmol产物2溶解在200 mL THF中，加入2 mL OsO4水溶液（ 4％w/ w水溶液），搅拌0.5 h，然后加入16 mmol NaIO4，室温下搅拌6天，减压蒸馏除去THF，加入二氯甲烷和水溶液分层，有机层干燥，得到白色固体，固体用体积比为从1:0～5的二氯甲烷-乙腈体系洗脱剂梯度洗脱，旋蒸，得产物3；
（5）产物4制备：将2.15 mmol 产物3溶于40 mL 甲醇中，加入4.31 mmol无水K2CO3，室温下搅拌30 min后加入HCl溶液（pH:3-4）进行酸化，过滤，固体用水洗涤两次并干燥，用体积比为1:10的CH3OH:CH2Cl2混合溶液进行色谱纯化，得到黄色固体，为产物4；
（6）HMT的合成：将0.5 mmol产物5和0.5 mmol产物4加入50 mL乙醇中溶解，加入0.05mL无水哌啶，将反应液回流 12 h，缓慢冷却至室温后，然后冷却至-20℃，过滤，将粗产物用乙醇洗涤两次，使用体积比为1:2的CH3OH:CH2Cl2混合溶液进行色谱纯化快速色谱，得到红色晶体，为产品HMT，图2.1和图2.2分别为HMT的核磁共振的H谱和C谱；
（7）羧酸酯酶-pH连续双比率双光子线粒体锁定荧光探针（CEMT）制备：将1 mmol 产物5，0.6 mmol HMT和2.04 mmol NaOAc混合后溶于6 mLAc2O，在80℃、Ar气氛下搅拌7h，搅拌完后减压蒸发溶剂，得到的粗产品溶于DCM，过滤浓缩，得到的粉红色结晶即为羧酸酯酶-pH连续双比率双光子线粒体锁定荧光探针（CEMT），图3.1和图3.2分别为CEMT的核磁共振的H谱和C谱。
实施例2
荧光探针的应用
细胞内成像分析
图4为HepG2细胞的荧光图像。其中（1）用CEMT（10 μM）预处理20 min的HepG2细胞；（2）在用CEMT（10 μM）培养20 min之前用BNPP（500 μM）预处理的HepG2细胞；（3）在用CEMT（10 μM）培养20 min之前用乙酸乙烯酯（500 μM）预处理的HepG2细胞；（4）在用乙酸乙烯酯（500 μM）培养20 min之前，用BNPP（500 μM）预处理HepG2细胞，然后与CEMT（10 μM）培养20 min；（5）在用B-R缓冲液（pH = 4.98，40 mM）培养20 min之前，用BNPP（500 μM）预处理HepG2细胞，然后将CEMT（10 μM）培养20 min；（6）将HepG2细胞用乙酰水杨酸盐（500 μM）预处理20min，然后与CEMT（10 μM）培养20 min。使用810 nm捕获图像用于双光子激发。双光子荧光发射窗口：（a）明场；（b）绿色通道（400-500 nm）；（c）黄色通道（500-570 nm）；（d）红色通道（570-710 nm）；（e）比率成像：Iyellow/ Igreen；（f）比率成像：Ired/ Iyellow；
对照组（第1组），如4-1所示，黄色通道呈现荧光，表明CEMT检测到了线粒体附近的CE，同时红色通道荧光指示了当前的pH。所构成的比率分别为为R1（I550/I480）为4.2，R2 （I610/I550）为2.9。接着，第2组为向平行细胞样中加入酶抑制剂BNPP，如4-2所示，相比对照组，绿色通道荧光明显增强而黄色通道则极其微弱，相应地红色通道也极弱。这一结果表明BNPP有效地抑制了CE的活性，也反证了对照组中黄色通道荧光是由于CE活性所致。第3组中，我们加入了公认的CE介导式酸化试剂乙酸乙烯酯（vinyl acetate）来调研该探针的对CE和pH的响应模式，如4-3所示，相比于第1组，处理后的细胞中，绿色通道荧光强度明显增强，表明由于乙酸乙烯酯的代谢导致此时CE的实际活度有所下降。而同时黄色通道荧光却略有增强，红色通道的强度较弱，这应该是由于酸度的显著增大所致。这一现象从两通道的比率表现：R1（I550/I480）上升(5.5)、R2 （I610/I550）下降（1.8）可得到证实。此结果表明乙酸乙烯酯代谢物导致了R1上升、R2下降的模式。为验证这一现象，我们向酶抑制剂BNNP处理后的细胞再次用乙酸乙烯酯进行培养。从4-4可见，相比第3组，绿色通道荧光增强，黄色通道几乎没有信号。显然，3和4组结果的对比表明了乙酸乙烯酯CE介导的作用。为进一步证实酸化是CE介导所致的结果，我们在经抑制剂BNNP处理后的细胞内添加PBS致其pH下降至5.0。从图4-5可以看出，相比于第3组，绿色通道明显强烈，但黄色通道荧光很弱，红色通道几乎观察不到，显然这是由CE介导的缺失所致。因此，CEMT可以通过双比率的逻辑信号来检测CE介导的线粒体酸化。最后，我们检测了退热药乙酰水杨酸酯经CE代谢后所致的酸化，如图4-6所示，与第1组对照细胞相比，第6组细胞的绿色通道荧光强度明显增强，说明CE介导了退热药乙酰水杨酸酯的代谢导致其活性下降。同时黄色通道荧光却略有增强，红色通道的强度较弱，表明其代谢物使线粒体酸性增强。而且，最终显示的R1（I550/I480）上升、R2 （I610/I550）下降进一步证实了退热药乙酰水杨酸酯经CE代谢后致线粒体酸化。
我们可以看出本发明的荧光探针CEMT成功地在给药期间CE调节的线粒体及组织酸化进行了成像。
实施例3
荧光探针选择性的研究
图5为探针CEMT 和HMT在含有测试化合物的B-R缓冲溶液的荧光强度图。其中（A）为探针CEMT（10.0 μM）在含有测试化合物的B-R缓冲溶液（pH = 7.42，40 mM）中的荧光比（I550/I460），包括1.a-CT(5 μg/mL);2. Trypsin(5 μg/mL);3. Pepsin(5 μg/mL);4. BSA(50 μg/mL);5. PBS(50 mM);6. HAS(50 μg/mL);7. AChE(5 μg/mL);8. BChE(20 U/L);9. PON-1(5 μg/mL);10. PON-2(5 μg/mL);11. FAP(5 μg/mL);12. Ca2+(100 mM);13. Zn2+(100mM);14. Carboxylesterase(5 μg/mL);15. Mn2+(100 mM);16. Co2+(100 mM);17. Mg2+(100 mM);18. Fe2+(100 mM);19. Cu2+(100 mM);20. K+(100 mM);21. Al3+(100 mM);22.Na+(100 mM);23. Cl-(100 mM);24. human plasma(10 mM);25. glucose(10 mM);26.H2O2(10 mM);27. TBHP (10 mM);28. OCl- (10 mM);29. O2 - (10 mM);30. OtBu(10 mM);31. OH (10 mM);32. ONOO- (10 mM);33. Cys (1 mM);34. Glu (1 mM);35. Gly (1mM);36. Val (1 mM);37. Thr (1 mM);38. Tyr (1 mM);39. Trp (1 mM);40. Ser (1mM);41. Phe (1 mM);42. Met (1 mM);43. Leu (1 mM);44. Ile (1 mM);45. Asp (1mM);46. Lys (1 mM)；（B）为探针HMT（10.0 μM）在含有测试化合物的B-R（pH = 4.98）的各种溶液中的荧光比（I620/I550），包括1.空白（仅B-R); 2.Li+(20 mM); 3. Na+(20 mM); 4. K+(20 mM); 5. Mg2+ (20 mM); 6. Ca2+(20 mM); 7. Ba2+(20 mM ); 8. Sr2+(20 mM ); 9.Fe2+(1 mM); 10. Fe3+(0.1 mM); 11. Co2+(1 mM);1 2. Ni2+(20 mM ); 13. Cu2+(1 mM);14. Zn2+(20 mM); 15. Cr3+(0.1 mM ; 16. Mn2+(20 mM ); 17. Hg2+ (20 mM); 18. F-(20mM); 19. Cl-(20 mM); 20. Br-(20 mM); 21. I-(20 mM); 22. HCO3 -(20 mM); 23. NO2 -(1 mM); 24. NO3 -(1 mM); 25. N3-(1 mM); 26. OAC-(1 mM); 27. PO4 3-(20 mM); 28.SO4 2-(20 mM); 29. S2-(20 mM); 30. SO3 2-(20 mM); 31. H2O2(0.1 mM); 32. Hcy(1 mM);33. GSH(1 mM); 34. Cys(1 mM) .
由图5-A可以看出，在加入羧酸酯酶后，待测的B-R缓冲溶液的荧光强度有明显增强，而加入其它物质并未引起荧光强度的明显增强。由此可以得出，荧光探针CEMT对羧酸酯酶具有很强的选择性。
实施例4
细胞活性的测定
图6是用不同浓度（0 mM，5 mM，10 mM，20 mM，30 mM和50 mM）探针CEMT和HMT处理的HepG2细胞在新鲜培养基中培养24 h的细胞存活率图。可以看出，当加入50 mM CEMT和HMT24 h时，超过92％的细胞仍然存活，由此说明，此探针具有低毒性，适合于活体细胞成像，具有较大开发意义。
实施例5
反应体系pH的优化
图7是在探针CEMT（10.0μM）与CE（0，3，6，9，12 和 15μM/mL）在B-R缓冲溶液（pH =7.42，50mM）中的荧光比（I536 / I460）图以及将B-R缓冲液加入到所得混合物所得pH图。由图可知，pH为4.98-9.07，当pH=7.4时也具有较强的荧光强度，因此该探针可适用于在生理pH（7.4）下进行检测。
实施例6
反应时间的优化
探针分子与待测物的反应效率与反应程度在一定程度上受到反应时间的影响，反应时间也决定最终信号的强度和稳定性。图8为（A）BR缓冲溶液（pH = 7.42，40 mM）中探针CEMT（10 μM）与CE（15 μg/mL）的反应时间的荧光比图像（黑色信号：CEMT + CE；白色信号：仅限CEMT）；（B）荧光比率与探针HMT（10 μM）与H+的反应时间关系图（黑色信号：B-R缓冲液，pH =9.07；白色信号：B-R缓冲液，pH = 4.98）。由图可以看出10 μM的CEMT与15μg/mL的CE的反应在12 min后达到稳定。
实施例7
光学性质
图9-A为荧光探针CEMT（10μM）与不同浓度CE（0-15μM/mL）反应后的吸收光谱变化图。由图可以看出，随CE增加，CEMT在490 nm处的发射强度逐渐下降，同时在550 nm处的发射强度随之增强，并且比率I550/I490呈现出良好的线性。这一结果表明CEMT可以比率响应的方式对CE进行量化。
图9-C 为HMT（10 μM）在pH为5.0-9.0的范围内的吸收光谱变化图。随pH的升高，HMT在550 nm处的荧光强度下降，而同时在610 nm处的荧光逐渐增强，并且比率I610/I550呈现出良好的线性相关。这一结果表明HMT可在pH= 5.0-9.0范围内对pH的变化进行可逆定量报告。
图9-B为在37℃下B-R缓冲溶液（pH = 7.42，40 mM）中，CE（0-15 μg）存在时CEMT（10 μM）的吸收率（A463/A353）关系图。结果表明CE浓度在0-50 μM浓度范围内呈现良好的线性关系（R2 =0.9928）。
图9-D为在40 mM B-R缓冲溶液中，在pH= 5.0-9.0的各种pH环境下，HMT（10 μM）的吸收率（A475/A375）关系图。结果表明pH在5.0-9.0范围内呈现良好的线性关系（R2=0.9842）。
根据检测限计算公式：3 SD/ k(其中k是曲线方程的斜率，SD表示探针对羧酸酯酶的荧光强度响应的标准偏差)I550/I460=0.3876×[CE]+1.1472(R2=0.9932) ; LOD= 3×0.01551/0.3876=0.12 μg/mL. 实验表明，荧光探针CEMT具有高灵敏性，可以应用于对生物样品中CE介导酸化的原位定量检测。
实施例8
共定位实验
图10是将细胞与HMT（10 μM）在37℃不同pH（图中a：pH = 7.40；图中b：pH = 4.98）温育20 min，并用含有MTDR（0.1 μM）的新鲜培养基替换培养基并培养15 min，后使用633 nm和488 nm的发射波长记录MTDR（1）和HMT（2）的图像（收集波长为660-740 nm、500-570 nm）。其中（3）为（1）和（2）的合并图像，（4）为明亮的领域图像，（5）为（3）中红色和绿色通道之间的相关性图像，（6）为（3）中箭头的像素相关图像。由图可知a组皮尔森相关系数为0.91，b组皮尔森相关系数为0.89，表明本发明探针CEMT可以对线粒体进行准确靶向。

Claims (9)

1.一种羧酸酯酶-pH连续双比率双光子线粒体锁定荧光探针，其特征在于，荧光探针结构式如式CEMT所示：
。
2.一种权利要求1所述的羧酸酯酶-pH连续双比率双光子线粒体锁定荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将4-甲基吡啶和1,4-双（氯甲基）苯在甲苯中溶解，搅拌，加热回流，得产物5;
(2)将产物5和产物4在乙醇中溶解，加入无水哌啶反应得产物HMT；
(3)将产物5、HMT和NaOAc混合溶于Ac2O，反应得羧酸酯酶-pH连续双比率双光子线粒体锁定荧光探针CEMT；
。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述的产物5的制备方法为将50mmol 4-甲基吡啶和55 mmol 1,4-双（氯甲基）苯在甲苯中溶解，室温下搅拌4小时，加热回流30分钟后冷却、过滤，用无水乙醚洗涤得产物5。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述的产物HMT的制备方法为将1mmol产物5和0.5mmol产物4加入到50mL乙醇中溶解，加入0.05mL无水哌啶，加热回流12小时，缓慢冷却至室温，再冷却到-20℃，过滤，用乙醇洗涤，使用体积比为1:2的CH3OH:CH2Cl2混合溶剂进行色谱纯化。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述的CEMT的制备方法为将1mmol产物5、0.6mmol HMT和2.04mmol NaOAC混合溶于6mLAc2O中，在Ar气氛中、80℃条件下搅拌7小时，减压浓缩得粗品，粗品溶于DCM中提纯得CEMT。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的产物4的制备方法为：
a) 将2 ,4-二羟基苯甲醛溶解于乙醇中，溶解浓度0.02～0.06g/mL，然后加入戊烯二酸二乙酯，溶解浓度0.067g/mL，混合均匀后滴加无水哌啶 2～5 mL，回流24 小时，冷却，过滤，固体用无水乙醇重结晶，得产物1；
b) 将产物 1 溶解于无水吡啶中，溶解浓度0.025g/mL，然后加入乙酸酐，加入浓度为1mol/L，搅拌0.5 小时，后于冰中继续搅拌10 分钟，析出灰白色固体，用水和NaCl饱和溶液洗涤，Na2SO4干燥并减压除去溶剂，使用体积比为1:5的CH3CN:CH2Cl2混合溶剂色谱纯化，得到白色固体即为产物2；
c) 将产物 2 溶解于四氢呋喃中，溶解浓度0.011 g/mL，然后加入质量分数4%的四氧化锇水溶液 2 mL，搅拌0.5 小时，然后加入高碘酸钠，加入浓度为0.017g/mL，室温下搅拌5～6天，减压蒸馏除去THF，加入二氯甲烷和水溶液分层，有机层干燥，得到白色固体，固体用体积比为从1:0～5的二氯甲烷-乙腈体系洗脱剂梯度洗脱，旋蒸，得产物3；
d) 将产物3溶解于甲醇中，溶解浓度0.012 g/mL，然后加入无水碳酸钾，溶解浓度0.015 g/mL，室温下搅拌0.5 小时，TLC分析原料消耗完毕后，加入pH至3～4的盐酸进行酸化，析出固体，过滤，滤饼用水洗涤，真空干燥，得产物4；
具体合成路线图如下：
。
7.一种权利要求1所述的羧酸酯酶-pH连续双比率双光子线粒体锁定荧光探针在原位检测羧酸酯酶介导的线粒体酸化的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的羧酸酯酶-pH连续双比率双光子线粒体锁定荧光探针应用于生命体或细胞中原位检测羧酸酯酶介导的线粒体酸化的应用。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的羧酸酯酶-pH连续双比率双光子线粒体锁定荧光探针连续地响应羧酸酯酶和pH的变化、并对线粒体进行锁定来实现原位实时检测。
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