CN106588846A - 一种双比率型多功能高灵敏羧酸酯酶检测荧光探针的制备方法及应用 - Google Patents

一种双比率型多功能高灵敏羧酸酯酶检测荧光探针的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种双比率型（紫外/荧光）多功能（比色/荧光/紫外）高灵敏羧酸酯酶检测荧光探针的制备方法及应用。首先，由2,4‑二羟基苯甲醛、戊烯二酸二乙酯和无水哌啶在乙醇中反应制得产物1，产物1与乙酸酐在无水吡啶中反应得产物2，产物2与四氧化锇、高碘酸钠在四氢呋喃反应得产物3，产物3与无水碳酸钾在甲醇中反应得产物4；其次，由甲基吡啶和碘甲烷在无水乙醚反应得产物5；再次，将产物4和产物5溶解于绝对乙醇中，加入哌啶反应得产物6；最后，将产物6溶解于乙酸酐中，加入无水乙酸钠，即得双比率型多功能羧酸酯酶检测荧光探针。适用于生物样本中羧酸酯酶的定性、定量分析，检测灵敏、准确、快捷；可应用于分析化学、生命有机分析化学、疾病预诊及医学临床检测等相关领域。

Description

一种双比率型多功能高灵敏羧酸酯酶检测荧光探针的制备方 法及应用
技术领域
本发明属于分析化学领域，涉及一种双比率型多功能羧酸酯酶检测荧光探针的制备方法及应用。
背景技术
羧酸酯酶在生物体内，特别是细胞中起着重要的生理调节作用，其浓度的高低可反映出机体或某些细胞的疾病状态，同时也与一些病变或代谢紊乱有着密切的关系。当前，关于羧酸酯酶检测方法的研究并不多见，所报导的检测方法多以荧光分子探针检测法为主。虽然这些方法有着各自的优点，但总的来说其检测限（0.5~1 μg/ml）还有待改善，定量方式均为荧光单一定量，并且没有双比率较正的功能。这会导致现有检测方法的检测限度低、结果定量不准确、检测方式单一、不利于肉眼监测等问题。这些问题对于细胞中痕量羧酸酯酶的检测来说是非常受限制的。（代表性文献Biosensors and BioelectronicsVolume 65, 15 March 2015, Pages 9–15； Sensors and Actuators B: ChemicalVolume 205, 15 December 2014, Pages 151–157）。
发明内容
本发明针对现有技术不足，提供本发明涉及一种双比率型（紫外/荧光）多功能（比色/荧光/紫外）高灵敏羧酸酯酶检测荧光探针的制备方法，制备得到的比率型荧光探针可应用于生物样本细胞微环境中羧酸酯酶检测，具精密度高、现象明显易观察、准确度高等优点，设备便捷易操作，可操作性强，特别适合大批量样本组合筛选等大数据研究。
本发明技术方案如下：
一种双比率型多功能羧酸酯酶检测荧光探针的制备方法，首先，由2,4-二羟基苯甲醛、戊烯二酸二乙酯和无水哌啶在乙醇中反应制得产物1，产物1与乙酸酐在无水吡啶中反应得产物2，产物2与四氧化锇、高碘酸钠在四氢呋喃反应得产物3，产物3与无水碳酸钾在甲醇中反应得产物4；其次，由甲基吡啶和碘甲烷在无水乙醚反应得产物5；再次，将产物4和产物5溶解于绝对乙醇中，加入哌啶反应得产物6；最后，将产物6溶解于乙酸酐中，加入无水乙酸钠，即得双比率型多功能羧酸酯酶检测荧光探针。
所述的双比率型多功能羧酸酯酶检测荧光探针的制备方法，具体步骤为：
（1）将2,4-二羟基苯甲醛（2,4-Dihydroxybenzaldehyde）溶解于乙醇中，溶解浓度0.02～0.06g/mL，然后加入戊烯二酸二乙酯（Diethyl glutaconate），溶解浓度0.067g/mL，混合均匀后滴加无水哌啶 2~5 mL，回流24h，冷却，析出黄色固体，固体用无水乙醇重结晶，得产物1；
（2）将产物1溶解于无水吡啶中，溶解浓度0.025g/mL，然后加入乙酸酐，加入浓度为1mol/L，搅拌0.5h，加入40倍质量的碎冰，搅拌10min后析出灰白色固体，固体用体积比1:5的乙腈-二氯甲烷洗脱剂洗脱，旋蒸，得产物2；
（3）将产物2溶解于四氢呋喃中，溶解浓度0.011 g/mL，然后加入质量分数4%的四氧化锇水溶液，搅拌0.5h，然后加入高碘酸钠，加入浓度为0.017g/mL，室温下搅拌5～6天，减压蒸馏除去四氢呋喃加入二氯甲烷100/mL，水洗，有机层干燥除水，得到白色固体，固体用体积比为从1:0～5的二氯甲烷-乙腈体系洗脱剂梯度洗脱，旋蒸，得产物3；
（4）将产物3溶解于甲醇中，溶解浓度0.012 g/mL，然后加入无水碳酸钾，溶解浓度0.015 g/mL，室温下搅拌0.5h，TLC分析原料消耗完毕后，加入1当量浓度的盐酸调节pH至3～4，析出黄色固体，过滤，滤饼用水洗涤，真空干燥，得产物4；
（5）将甲基吡啶（Methyl propyl carbonate）和碘甲烷（Iodomethane）溶解于无水乙醚中，溶解浓度分别为1mol/L和0.6mol/L，遮光搅拌3～4h，析出粉红色固体，过滤，滤饼用无水乙醚洗涤，烘干，用二氯甲烷重结晶，得产物5；
（6）将产物4和产物5溶解于绝对乙醇中，溶解浓度分别为0.0048 g/mL和0.0059 g/mL，混合均匀，加入哌啶，加入浓度0.1 mol/L，回流12h，旋蒸除去溶剂，固体用体积比2:1的二氯甲烷-甲醇洗脱剂洗脱，收集产物，旋蒸，得产物6；
（7）将产物6溶解于乙酸酐中，溶解浓度0.017g/mL，然后加入无水乙酸钠，加入浓度0.028g/mL，氮气保护下，80℃油浴1h，终止反应，减压蒸馏，加入乙酸酐同体积的二氯甲烷重结晶，有黄色晶体析出，过滤，真空干燥，即得双比率型多功能羧酸酯酶检测荧光探针。
所述双比率型多功能羧酸酯酶检测荧光探针效果判断指标如下：
检测灵敏度: 检测限0.12μg/mL；
吸收波长改变：检测时吸收向红光区移动110 nm；
颜色变化：日光灯下表现为由棕红变为紫色；紫外灯下表现为绿色向黄色转变；
双重定量校正：兼具荧光比率定量功能及紫外吸收峰比率定量功能；
光学机理指标：兼具荧光比率功能及吸收红移功能。
上述方法制备的双比率型多功能羧酸酯酶检测荧光探针的应用：适用于生物样本中羧酸酯酶的定性、定量分析，检测灵敏、准确、快捷；其中生物样本主要包括血清、活细胞等，可应用于分析化学、生命有机分析化学、疾病预诊及医学临床检测等相关领域。
本发明双比率型多功能羧酸酯酶检测荧光探针定量分析生物样本中羧酸酯酶时，适用于检测血清中羧酸酯酶含量。
本发明双比率型多功能羧酸酯酶检测荧光探针检测血清中羧酸酯酶含量的方法，步骤包括：
1）配制溶液
探针储备液：准确称取双比率型多功能羧酸酯酶检测荧光探针溶于无水乙腈，配制为浓度60µM的探针储备液；
羧酸酯酶储备液：准确称取待测目标物0.0050g羧酸酯酶溶于1000ml蒸馏水中，配制为浓度5×10-5g/mL的羧酸酯酶储备液；
2）建立血清-羧酸酯酶标准品的线性方程
将步骤1）配制的羧酸酯酶储备液用蒸馏水稀释得到梯度浓度为0～15g/mL的羧酸酯酶标准溶液，然后分别取200 µL羧酸酯酶标准溶液与100µL步骤1）配制的探针储备液和650µL血清储备液混合后，加入50 µL 浓度为10 mM、 pH7.46的Tris-盐酸缓冲液，充分振荡，使体系混合均匀，在25℃下放置50min，然后经荧光分光光度计检测，建立血清-羧酸酯酶浓度与荧光信号强度的线性方程，或经紫外分光光度计检测，建立血清-羧酸酯酶浓度与紫外吸收信号强度的线性方程；
3）荧光或紫外检测待测血清样品中羧酸酯酶的含量
a）荧光检测待测样品：将1000µL待测样品加入到石英比色皿后，在荧光检测仪内进行扫描检测，收集荧光发射位置的强度数据代入血清-羧酸酯酶浓度与荧光信号强度的线性方程，计算得待测血清样品中羧酸酯酶含量；
b）紫外检测待测样品：将1000µL待测样品加入到石英比色皿后，在紫外分光光度计中，收集最大吸收波长位置的强度，得出反应前后最大吸收峰强度比率并代入血清-羧酸酯酶浓度与紫外吸收信号强度的线性方程，计算得待测血清样品中羧酸酯酶含量。
步骤2）中，所述的血清储备液 以全血进行低温不抗凝低速离心分离即得。
进一步地，上述方法检测待测血清样品时，分别以荧光检测和紫外检测的方法对待测物进行多次平行检测（n=10），并用羧酸酯酶标准品溶液进行校准，得到荧光和紫外检测的最优检测范围，从而根据不同样品所含待测物的浓度范围来选择荧光或紫外检测手段进行定量。
本发明所述的双比率型多功能羧酸酯酶检测荧光探针检测血清中羧酸酯酶含量的方法，检测范围优选为荧光0～15µg/mL，紫外0～45µg/mL。
本发明双比率型多功能羧酸酯酶检测荧光探针定性检测生物样本中小分子羧酸酯酶时，适用于血清样品中羧酸酯酶的检测和活细胞内羧酸酯酶的检测。
所述的血清样品中羧酸酯酶的检测，方法为：待测血清样品与无水乙腈按体积比5:1混合后，5000 rpm离心20min，取出上清液过透析膜进行处理，然后取200μL透析后上清液依次加入100μL探针储备液和200 µL羧酸酯酶储备液，用pH7.46的Tris-盐酸缓冲液定容至1000μL后，于25℃保存50min，根据颜色判断血清样品中是否含有羧酸酯酶，判断标准为：紫外灯下为黄绿色则血清样品中含有羧酸酯酶。
所述的探针储备液和羧酸酯酶储备液与双比率型多功能羧酸酯酶检测荧光探针检测血清中羧酸酯酶含量的方法中步骤1）相同。
所述的活细胞内羧酸酯酶的检测，方法为：将待测活细胞样品在培养基中培育18～26h，待测活细胞接种量为2×10 7～9×10 7个/mL，然后加入双比率型多功能羧酸酯酶检测荧光探针，探针浓度为20 µM，于25 ℃培育10～12h，以pH 7.46的Tris-盐酸缓冲液洗3～5次，然后于荧光显微镜下观察细胞成像，根据发光情况判断待测活细胞中是否含有羧酸酯酶，判断标准为：紫外灯下为绿色则活细胞样品中含有羧酸酯酶。
优选地，所述的活细胞为Hela 细胞，所述的培养基为DMEM培养基。
本发明成功合成一个新型高准确度、高灵敏双比率多功能荧光探针，并用于检测羧酸酯酶，并且系统地在试管中和细胞体内进行研究。探针设计思路为合成7-羟基香豆素（7-Hydroxycoumarin）作为基础母体环，先后引入醛基并接碘化甲基吡啶盐（1,4-dimethylpyridin-1-ium iodide）形成比率型荧光分子（(E)-4-(2-(7-hydroxy-2-oxo-2H-chromen-3-yl)vinyl)-1-methylpyridin-1-ium iodide），最后引入乙酰基构成酯键作为检测基团得到探针分子ACM（(E)-4-(2-(7-acetoxy-2-oxo-2H-chromen-3-yl)vinyl)-1-methylpyridin-1-ium iodide）。实施检测时，加入待测物羧酸酯酶后，探针分子ACMI的酯基被剪切，释放强荧光分子，同时伴随由棕红色至蓝紫色的变化（紫外吸收红移）及荧光发射光谱红移。该探针呈现出优秀的特异性、灵敏度、准确性，并可进行高分辨荧光成像。此外，该探针已应成功用于检测羧酸酯酶在细胞环境中动态监测。这些特征都使所得分子探针成为探索生命体系酶代谢过程的重要工具。
本发明制备的双比率型多功能羧酸酯酶检测荧光探针检测机理（如图1所示）：
利用酯基中氧的吸电子能力使ACMI使的荧光发生一定程度淬灭；同时该淬灭基团对待测物羧酸羧酸酯酶具备良好的反应特性，反应后要求产物的酯基离解变为供电子的羟基，从而增强强荧光信号并提高灵敏度；另外前线轨道能量差值应有所增大，以使吸收波长红移，从而显示出可见光颜色为肉眼观测提供保证。
本发明技术方案有益效果为：1）提高检测的灵敏性：在不加任何其他附加材料的条件下，提高了检测灵敏性，并且避免了填加附加材料，减少附加材料的消耗以及减少了在检测中的误差来源；2）生物样品成像多种多样化：本发明在检测中成功检测了待测物在血清、活细胞中的成像，这种方法是在之前的方法中没有能够做到的。成像的实现对于小分子酶这一生物标志物的深入研究起到很大的推动作用。
附图说明
图为本发明制备的双比率型多功能羧酸酯酶检测荧光探合成路线；
图 2 为本发明实施例1制备的双比率型多功能羧酸酯酶检测荧光探针的H谱；
图 3为本发明实施例1制备的双比率型多功能羧酸酯酶检测荧光探针的C谱；
图 4为荧光比率定量与吸收比率定量的线性方程；
图 5为日光灯、紫外灯下探针随待测物浓度增长的颜色变化；
图 6 为细胞成像实验；
图 7 为探针用量优化实验；
图 8 为双比率型多功能羧酸酯酶检测荧光探针(60µM)与羧酸酯酶（5µg/ml）的荧光动力学研究；
图 9为双比率型多功能羧酸酯酶检测荧光探针(60 µM)与羧酸酯酶 (5µg/ml)在pH 范围为5.23~9.42内的荧光响应；
图 10 为温度对双比率型多功能羧酸酯酶检测荧光探针（60µM）与羧酸酯酶（5µg/ml）反应的荧光信号影响；
图 11 为双比率型多功能羧酸酯酶检测荧光探针对待测目标物羧酸酯酶梯度浓度的紫外响应图（羧酸酯酶密度：0～45µg/mL）；
图 12 为双比率型多功能羧酸酯酶检测荧光探针对待测目标物羧酸酯酶梯度浓度的荧光响应图（羧酸酯酶密度：0～15µg/mL）；
图 13为双比率型多功能羧酸酯酶检测荧光探针对待测物羧酸酯酶及其他物质选择性对照实验（其他物质)。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明技术方案，在围绕本发明所描述述技术思想情况下，根据一般的技术知识和通常用的技术手段研究的多种方式替换或变更，都属于本发明的范围内。
本发明下述实施例中：
荧光检测是利用日立Hitachi F-7000 荧光光谱仪来进行，激发波长为450nm，发射波长为460 nm和536nm，激发和发射狭缝宽度均为 10.0 nm，电压700V，扫描速度2400纳米/分；
紫外可见光谱是通过Cary 300 Bio紫外可见光谱仪来进行，扫描范围为350-700纳米；
荧光成像观测是通过Olympus, FV1100(Japan) 荧光共聚焦显微镜来进行；
化合物的分离提纯是采用薄层色谱硅胶柱来实现。
实施例1：制备小分子羧酸酯酶比率型探针
（1）将2,4-二羟基苯甲醛（2,4-Dihydroxybenzaldehyde）溶解于乙醇中，溶解浓度0.048g/mL，然后加入戊烯二酸二乙酯（Diethyl glutaconate），溶解浓度0.067g/mL，混合均匀后滴加无水哌啶4 mL，回流24h，冷却，析出黄色固体，固体用无水乙醇重结晶，得产物1；
（2）将产物1溶解于无水吡啶中，溶解浓度0.025g/mL，然后加入乙酸酐，加入浓度为1mol/L，搅拌0.5h，加入100g碎冰，搅拌10min后析出灰白色固体，固体用体积比1:5的乙腈-二氯甲烷洗脱剂洗脱，旋蒸，得产物2；
（3）将产物2溶解于四氢呋喃中，溶解浓度0.011 g/mL，然后加入质量分数4%的四氧化锇水溶液，搅拌0.5h，然后加入高碘酸钠，加入浓度为0.017g/mL，室温下搅拌5～6天，减压蒸馏除去四氢呋喃加入二氯甲烷100/mL，水洗，有机层干燥除水，得到白色固体，固体用体积比为从1:0～5的二氯甲烷-乙腈体系洗脱剂梯度洗脱，旋蒸，得产物3；
（4）将产物3溶解于甲醇中，溶解浓度0.012 g/mL，然后加入无水碳酸钾，溶解浓度0.015 g/mL，室温下搅拌0.5h，TLC分析原料消耗完毕后，加入1当量浓度的盐酸调节pH至3～4，析出黄色固体，过滤，滤饼用水洗涤，真空干燥，得产物4；
（5）将甲基吡啶（Methyl propyl carbonate）和碘甲烷（Iodomethane）溶解于无水乙醚中，溶解浓度分别为1mol/L和0.6mol/L，遮光搅拌3～4h，析出粉红色固体，过滤，滤饼用无水乙醚洗涤，烘干，用二氯甲烷重结晶，得产物5；
（6）将产物4和产物5溶解于绝对乙醇中，溶解浓度分别为0.0048 g/mL和0.0059 g/mL，混合均匀，加入哌啶，加入浓度0.1 mol/L，回流12h，旋蒸除去溶剂，固体用体积比2:1的二氯甲烷-甲醇洗脱剂洗脱，收集产物，旋蒸，得产物6；
（7）将产物6溶解于乙酸酐中，溶解浓度0.017g/mL，然后加入无水乙酸钠，加入浓度0.028g/mL，氮气保护下，80℃油浴1h，终止反应，减压蒸馏，加入乙酸酐同体积的二氯甲烷重结晶，有黄色晶体析出，过滤，真空干燥，即得双比率型多功能羧酸酯酶检测荧光探针。
制备得到的双比率型多功能羧酸酯酶检测荧光探针的C谱及H谱图见图2和图3，效果判断指标如下：
检测灵敏度: 检测限0.12µg/mL；
吸收波长改变：检测时吸收向红光区移动110 nm；
双重定量校正：兼具荧光比率定量功能及吸收峰比率定量功能；
光学机理指标：兼具荧光比率功能及吸收红移功能。
实施例1制备的探针与羧酸酯酶反应可行性验证：取0.1克双比率型多功能羧酸酯酶检测荧光探针溶于80mL乙腈中，向其中加入2倍当量羧酸酯酶并在室温下搅拌1h，得产物。
实施例2：实施例1制备的双比率型多功能羧酸酯酶检测荧光探针定量分析生物样本中羧酸酯酶：检测血清中羧酸酯酶含量
1）配制溶液
探针储备液：准确称取双比率型多功能羧酸酯酶检测荧光探针溶于无水乙腈，配制为浓度60µM的探针储备液；
羧酸酯酶储备液：准确称取待测目标物0.0050g羧酸酯酶溶于1000ml蒸馏水中，配制为浓度5×10-5g/mL的羧酸酯酶储备液；
2）建立血清-羧酸酯酶标准品的线性方程
将步骤1）配制的羧酸酯酶储备液用蒸馏水稀释得到梯度浓度为0～15g/mL的羧酸酯酶标准溶液，然后分别取200 µL羧酸酯酶标准溶液与100µL探针储备液和650µL血清储备液（以全血进行低温不抗凝低速离心分离即得）混合后，加入50 µL 浓度为10 mM、 pH7.46的Tris-盐酸缓冲液，充分振荡，使体系混合均匀，在25℃下放置50min，然后经荧光分光光度计检测，建立血清-羧酸酯酶浓度与荧光信号强度的线性方程（图4-A），再经紫外分光光度计检测，建立血清-羧酸酯酶浓度与紫外吸收信号强度的线性方程（图4-B）；
3）荧光或紫外检测待测血清样品中羧酸酯酶的含量
a）荧光检测待测样品：将1000µL待测样品加入到石英比色皿后，在荧光检测仪内进行扫描检测，收集荧光发射位置的强度数据代入血清-羧酸酯酶浓度与荧光信号强度的线性方程，计算得待测血清样品中羧酸酯酶含量；
b）紫外检测待测样品：将1000µL待测样品加入到石英比色皿后，在紫外分光光度计中，收集最大吸收波长位置的强度，得出反应前后最大吸收峰强度比率并代入血清-羧酸酯酶浓度与紫外吸收信号强度的线性方程，计算得待测血清样品中羧酸酯酶含量。
将检测待测血清样品，分别以荧光检测和紫外检测的方法对待测物进行10次平行检测，并用羧酸酯酶标准品溶液进行校准，得到荧光和紫外检测的最优检测范围分别为荧光0～15µg/mL，紫外0～45µg/mL，从而根据不同样品所含待测物的浓度范围来选择荧光或紫外检测手段进行定量。
本实施例待测血清样品含待测物的浓度范围为 3～20 µg/mL，比较可知由荧光和紫外进行双重校准能使结果更为准确，并且可比荧光单一定量手段适用性更广，最终测定结果为待测血清样品中羧酸酯酶含量 6 µg/mL。
实施例3：定性检测生物样本中小分子羧酸酯酶
血清样品中羧酸酯酶的检测，方法为：待测血清样品与无水乙腈按体积比5:1混合后，5000 rpm离心20min，取出上清液过透析膜进行处理，然后取200μL透析后上清液依次加入100μL探针储备液和200 µL羧酸酯酶储备液，用pH7.46的Tris-盐酸缓冲液定容至1000μL后，于25℃保存50min，紫外灯下颜色为黄绿色，可由此判断血清样品中含有羧酸酯酶。
本实施例探针储备液和羧酸酯酶储备液与实施例2中步骤1）相同。日光灯、紫外灯下探针随待测物浓度增长的颜色变化如图5所示。
实施例4：定性检测生物样本中小分子羧酸酯酶
活细胞内羧酸酯酶的检测，方法为：将Hela 细胞置入DMEM培养基中培育24h，等到Hela细胞在培养基中接种量为2×10 7～9×10 7个/mL，然后加入60 µM的双比率型多功能羧酸酯酶检测荧光探针于25℃共培育12h，用缓冲液（Tris-盐酸）pH:7.46洗涤三次，置入荧光共聚焦显微镜下观测成像，探针的荧光颜色为：绿色，可由此判断血清样品中含有羧酸酯酶。
图6a-图6e分别是增加羧酸酯酶的浓度，该图中的1.2.3.4分别是400～460nm收集光区图；500nm-560nm收集光区图；明场图；MERGE图。
对比试验分析：在紫外波长激发下，Hela 细胞（如图11所示）分别与空白、探针(60 μM)和羧酸酯酶(5ug/ml)共培育后，进行检测，并未检测出荧光发射, 这表明探针对于细胞中的各种物质对荧光没有造成干扰。而后，加入10倍量的待测物小分子酶，在紫外灯下检测，检测出明显的发射效果，绿色荧光的成像得以顺利观察到。这说明探针可以应用于细胞成像方面。
本发明技术方案实验条件优化试验
1、探针用量优化
探针用量的多少影响到检测的灵敏度性以及试剂消耗量等重要数据，通常做为检测优化的首要影响因素来进行调查研究。结合本发明的探针的发光特点，在实际检测中选择20～100 µM 的浓度范围来进行探究探针的用量。实验结果表明，在待测物酶浓度为5µg/ml时，浓度为60µM的探针具有最高的响应度。把浓度60µM的探针将带入到后续优化实验过程（图7）。
2、反应时间优化
探针分子与待测物羧酸酯酶的反应效率与反应程度在一定程度上受到反应时间的影响，反应时间也将决定最终信号的强度与稳定性。因此，在研究之后探索出探针最佳浓度后，要对反应的时间进行优化。从图8中可以看出，在反应前50分钟内，荧光信号是上升趋势后至平台期，从而可确定最佳反应时间为50分钟。
3、反应体系pH值的优化
一般而言，pH 值影响有机分子探针的荧光性质，因而在反应中一般利用缓冲溶液加以调节pH从而适应实验的要求。针对本发明要探测的羧酸酯酶本身特点，研究了在生理环境下可能达到的pH值 （5.23~9.42）。从图9中可见，在生理环境范围内pH值的波动对于目标酶与探针的混合溶液所表现的荧光强度响应产生了一定的影响。因此，在一般的生物环境体系中，当 pH值为7.46时，探针与酶的反应达到最优化。
4、反应温度的优化
在化学反应中，温度的影响是非常重要，对于本发明所研究的生物样本如活细胞、组织体系更是如此。不同温度下探针对待测目标物有较好的反应是整个实验成败的关键。如下图10所示，对温度在20～45 ℃范围的反应具有的荧光响应进行了研究。由实验很容易发现，本发明所研究的探针在25℃时与待测物反应具有比较好的荧光反应，因此，能够更好地应用于生物样本的检测。
5、光学性质与机理验证
本发明旨在制备一种具备新颖发光机理的多功能分子探针。探针对待测目标物羧酸酯酶梯度浓度0～45µg/mL的荧光响应如图 11所示；探针对待测目标物羧酸酯酶梯度浓度0～15µg/mL的荧光响应如图12所示。
6、探针分子检测小分子羧酸酯酶的选择性分析
下述物质储备液配制方法：分别用蒸馏水溶解CE1, a-CT, 胰蛋白酶,胃蛋白酶, BSA,PBS, HAS, AChE, BChE, PON-1. PON-2, FAP, Ca2+, Zn2+, Mn2+, Co2+, Mg2+, Fe2+, Cu2+,K+, Al3+，Na+，Cl+，得到上述各种酶的储备液（上述各物质溶液依次对应图13中标号1-23），后续实验中所需低浓度各种酶溶液均在储备液基础上稀释制得，结果如图13所示。
首先，相比较待测物羧酸酯酶而言，探针对其他各种酶未表现出响应，这是由于羧酸酯酶具有不同于其他酶的结构所导致的。其次，通过pH滴定实验发现，在pH值为5.4～7.4的区间范围，荧光的强度在7.46时达到最强，这表明该探针在生物环境即pH为7.46时是完全适用的。同时，温度实验证实了本发明的探针非常适用于生物样品。

Claims (10)

1.一种双比率型多功能羧酸酯酶检测荧光探针的制备方法，其特征在于：首先，由2,4-二羟基苯甲醛、戊烯二酸二乙酯和无水哌啶在乙醇中反应制得产物1，产物1与乙酸酐在无水吡啶中反应得产物2，产物2与四氧化锇、高碘酸钠在四氢呋喃反应得产物3，产物3与无水碳酸钾在甲醇中反应得产物4；其次，由甲基吡啶和碘甲烷在无水乙醚反应得产物5；再次，将产物4和产物5溶解于绝对乙醇中，加入哌啶反应得产物6；最后，将产物6溶解于乙酸酐中，加入无水乙酸钠，即得双比率型多功能羧酸酯酶检测荧光探针。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤为：
（1）将2,4-二羟基苯甲醛溶解于乙醇中，溶解浓度0.02～0.06g/mL，然后加入戊烯二酸二乙酯，溶解浓度0.067g/mL，混合均匀后滴加无水哌啶 2～5 mL，回流24h，冷却，析出黄色固体，固体用无水乙醇重结晶，得产物1；
（2）将产物1溶解于无水吡啶中，溶解浓度0.025g/mL，然后加入乙酸酐，加入浓度为1mol/L，搅拌0.5h，加入40倍质量的碎冰，搅拌10min后析出灰白色固体，固体用体积比1:5的乙腈-二氯甲烷洗脱剂洗脱，旋蒸，得产物2；
（3）将产物2溶解于四氢呋喃中，溶解浓度0.011 g/mL，然后加入质量分数4%的四氧化锇水溶液，搅拌0.5h，然后加入高碘酸钠，加入浓度为0.017g/mL，室温下搅拌5～6天，减压蒸馏除去四氢呋喃加入二氯甲烷100/mL，水洗，有机层干燥除水，得到白色固体，固体用体积比为从1:0～5的二氯甲烷-乙腈体系洗脱剂梯度洗脱，旋蒸，得产物3；
（4）将产物3溶解于甲醇中，溶解浓度0.012 g/mL，然后加入无水碳酸钾，溶解浓度0.015 g/mL，室温下搅拌0.5h，TLC分析原料消耗完毕后，加入1当量浓度的盐酸调节pH至3～4，析出黄色固体，过滤，滤饼用水洗涤，真空干燥，得产物4；
（5）将甲基吡啶和碘甲烷溶解于无水乙醚中，溶解浓度分别为1mol/L和0.6mol/L，遮光搅拌3～4h，析出粉红色固体，过滤，滤饼用无水乙醚洗涤，烘干，用二氯甲烷重结晶，得产物5；
（6）将产物4和产物5溶解于绝对乙醇中，溶解浓度分别为0.0048 g/mL和0.0059 g/mL，混合均匀，加入哌啶，加入浓度0.1 mol/L，回流12h，旋蒸除去溶剂，固体用体积比2:1的二氯甲烷-甲醇洗脱剂洗脱，收集产物，旋蒸，得产物6；
（7）将产物6溶解于乙酸酐中，溶解浓度0.017g/mL，然后加入无水乙酸钠，加入浓度0.028g/mL，氮气保护下，80℃油浴1h，终止反应，减压蒸馏，加入乙酸酐同体积的二氯甲烷重结晶，有黄色晶体析出，过滤，真空干燥，即得双比率型多功能羧酸酯酶检测荧光探针。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述双比率型多功能羧酸酯酶检测荧光探针效果判断指标如下：
检测灵敏度: 检测限0.12μg/mL；
吸收波长改变：检测时紫外吸收向红光区移动110 nm；
颜色变化：日光灯下表现为由棕红变为紫色；紫外灯下表现为绿色向黄色转变；
双重定量校正：兼具荧光比率定量功能及紫外吸收峰比率定量功能；
光学机理指标：兼具荧光比率功能及吸收红移功能。
4.根据权利要求1或2所述方法的双比率型多功能羧酸酯酶检测荧光探针的应用，其特征在于：适用于生物样本中羧酸酯酶的定性、定量分析；其中生物样本包括血清、活细胞，可应用于分析化学、生命有机分析化学、疾病预诊及医学临床检测相关领域。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：双比率型多功能羧酸酯酶检测荧光探针定量分析生物样本中羧酸酯酶时，适用于检测血清中羧酸酯酶含量；定性检测生物样本中羧酸酯酶时，适用于血清样品中羧酸酯酶的检测和活细胞内羧酸酯酶的检测。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：检测血清中羧酸酯酶含量的方法，步骤包括：
1）配制溶液
探针储备液：准确称取双比率型多功能羧酸酯酶检测荧光探针溶于无水乙腈，配制为浓度60µM的探针储备液；
羧酸酯酶储备液：准确称取待测目标物0.0050g羧酸酯酶溶于1000ml蒸馏水中，配制为浓度5×10-5g/mL的羧酸酯酶储备液；
2）建立血清-羧酸酯酶标准品的线性方程
将步骤1）配制的羧酸酯酶储备液用蒸馏水稀释得到梯度浓度为0～15g/mL的羧酸酯酶标准溶液，然后分别取200 µL羧酸酯酶标准溶液与100µL步骤1）配制的探针储备液和650µL血清储备液混合后，加入50 µL 浓度为10 mM、 pH7.46的Tris-盐酸缓冲液，充分振荡，使体系混合均匀，在25℃下放置50min，然后经荧光分光光度计检测，建立血清-羧酸酯酶浓度与荧光信号强度的线性方程，或经紫外分光光度计检测，建立血清-羧酸酯酶浓度与紫外吸收信号强度的线性方程；
3）荧光或紫外检测待测血清样品中羧酸酯酶的含量
a）荧光检测待测样品：将1000µL待测样品加入到石英比色皿后，在荧光检测仪内进行扫描检测，收集荧光发射位置的强度数据代入血清-羧酸酯酶浓度与荧光信号强度的线性方程，计算得待测血清样品中羧酸酯酶含量；
b）紫外检测待测样品：将1000µL待测样品加入到石英比色皿后，在紫外分光光度计中，收集最大吸收波长位置的强度，得出反应前后最大吸收峰强度比率并代入血清-羧酸酯酶浓度与紫外吸收信号强度的线性方程，计算得待测血清样品中羧酸酯酶含量。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：检测待测血清样品时，分别以荧光检测和紫外检测的方法对待测物进行多次平行检测，并用羧酸酯酶标准品溶液进行校准，得到荧光和紫外检测的最优检测范围，从而根据不同样品所含待测物的浓度范围来选择荧光或紫外检测手段进行定量。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：检测范围为荧光0～15µg/mL，紫外0～45µg/mL。
9.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：血清样品中羧酸酯酶的检测，方法为：待测血清样品与无水乙腈按体积比5:1混合后，5000 rpm离心20min，取出上清液过透析膜进行处理，然后取200μL透析后上清液依次加入100μL探针储备液和200 µL羧酸酯酶储备液，用pH7.46的Tris-盐酸缓冲液定容至1000μL后，于25℃保存50min，根据颜色判断血清样品中是否含有羧酸酯酶，判断标准为：紫外灯下为黄绿色则血清样品中含有羧酸酯酶。
10.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：活细胞内羧酸酯酶的检测，方法为：将待测活细胞样品在培养基中培育18～26h，待测活细胞接种量为2×10 7～9×10 7个/mL，然后加入双比率型多功能羧酸酯酶检测荧光探针，探针浓度为20 µM，于25 ℃培育10～12h，以pH 7.46的Tris-盐酸缓冲液洗多次，然后于荧光显微镜下观察细胞成像，根据发光情况判断待测活细胞中是否含有羧酸酯酶，判断标准为：紫外灯下为绿色则活细胞样品中含有羧酸酯酶；所述的活细胞优选为Hela 细胞，培养基优选为DMEM培养基。
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